JPH05123176A - 高度不飽和脂肪酸リン脂質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 電子出願以前の出願であるので 要約・選択図及び出願人の識別番号は存在しない。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、微生物から高度不飽和脂肪酸リン脂 質を製造する方法に関するものである。該リン脂 質は食品、化粧品、医薬品、農業、水産、化成品 などの分野において有用である。

〔従来の技術〕

リン脂質は、高等動植物をはじめ各種生物中に 含まれ、主として細胞膜の構成物として生体中で 重要な働きをしている。このうち現在、工業的規 模で生産されているリン脂質は、大豆リン脂質と 卵黄リン脂質である。これらは天然界面活性剤で あり、この乳化作用、分散作用、湿潤作用などを 利用して食品、化粧品、医薬品などの分野で使用 されている。しかしながら、かかる大豆および卵 黄リン脂質をはじめとする高等動植物を起源とす るリン脂質は、その構成脂肪酸が炭素数１６〜 １８の飽和脂肪酸及び／又はモノエン脂肪酸を主 成分とするものであり、炭素数１８かつ不飽和結 合２以上の不飽和脂肪酸（以下、高度不飽和脂肪 酸と称す。）リン脂質が工業的に単離された例は 見当たらない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の目的は、高度不飽和脂肪酸リン脂質を 工業的に効率良く、短時間で、容易に得ることの できる製造法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕 本発明者らは、上記の目的に合った製造法を見 出すために鋭意研究の結果、培地中に高度不飽和 脂肪酸及び／又はその誘導体を含む油脂を添加し て培養した微生物の脂質について、次のような知 見を得た。即ち、微生物の総脂質含有量は乾物 換算で６〜１２％と高く、そのうち９０％以上が リン脂質であること、リン脂質の脂肪酸組成を 見ても高度不飽和脂肪酸が１０〜４０％と高いこ と、本発明で用いる微生物の増殖速度は、クロ レラ等藻類に比べて著しく速く、多量の菌体を極 めて短時間のうちに得ることができる。

本発明は、以上の知見に基づいて完成されたも ので、微生物を高度不飽和脂肪酸及び／又はその 誘導体を含む油脂を添加した培地中にて培養し、 次いでこれら培養した微生物から抽出分離するこ とを特徴とする高度不飽和脂肪酸リン脂質の製造 法である。

本発明で用いる高度不飽和脂肪酸及び／又はそ の誘導体を含む油脂としては、好ましくは総脂肪 酸中の高度不飽和脂肪酸の占める割合が１０％以 上のものが良く、このようなものの例をあげると イワシ、サバ、アジ等の青背魚より抽出した油脂、 マグロやカツオ等の大型海産魚の眼窩脂肪由来の 油脂、微生物由来の油脂、イカの肝臓より抽出し た海産物由来の油脂などが好ましい例としてあげ られる。

本発明で使用できる微生物は、特に属、種ある いは株などを限定するものではないが、通常は、 エシェリシア（Escherichia）属、セラチア （Serratia）属、バチルス（Bacillus）属、スタ フェロコッカス（Staphylococcus）属、シュード モナス（Pseudomonas）属、アルテロモナス （Alteromonas）属、シーワネラ（Shewanella）属 などに分類される微生物等を用いることができる。

これらの微生物については公的微生物寄託機関等 にて容易に入手できる。又新種微生物微工研菌寄 第１１６７１号を用いることが出来る。

上記のエシェリアに属する微生物の例として、 エシェリア・コリ（Escherichia coli）ＩＦＯ −３３０１セラチアに属する微生物の例としてセ ラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens） ＩＦＯ−３０５４、バチルスに属する微生物の例 としてバチルス・セレウス（Bacillus sereus） ＩＦＯ−３００１及びバチルス・サブチリス （Bacillus subtilis）ＩＡＭ−１０２６、スタ フィロコッカスに属する微生物の例としてスタフ ィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus ）ＡＴＣＣ−１２６００、シュードモナス に属する微生物の例としてシュードモナス・アエ ルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＩＦＯ−３９
１８、シュードモナス・ピュートリファシ エンス（Peudomonas，putrefaciens）SCRC−2181， （FERMBP−2917），SCRC−2201（FERMBP−2916）， SCRC−2271（FERMBP−2915），SCRC− 2341 （FERMBP−2918），SCRC−2451（FERMBP−2919）， SCRC−2642（FERMBP−2920），SCRC− 2792（FERMB −2921），SCRC−2878（FERMBP−1623），SCRC− 3011（FERMBP−2913），SCRC−3022（ FERMBP− 2914）を挙げることができる。

アルテロモナスに属する微生物の例として、ア ルテロモナス・ピュートリファシエンス （Alteromonas putrefaciens）SCRC−2871 （FERMBP−1624）及びアルテロモナス・ピュート リファシエンス・サブスピーシズ・サガミファシ エンス（Alteromonas putrefaciens subspecies sagamifaciens）SCRC−1162（FERMBP −1626）等を挙げることができる。

シーワネラに属する微生物の例として、シーワ ネラ・ピュートリファシエンス（Shewanella putrefaciens ）SCRC−2874（FERMBP−1625）等を 挙げることができる。

本発明の実施に当たっては、微生物を常法によ り例えば培地で培養し、これを遠心分離法などで 集め、洗浄、乾燥して微生物粉末を得る。この際 の培地としては例えば次の第１表に示す組成の培 地を調整することができる。

又微生物に海洋性細菌を用いる場合には、次の 第２表に示す組成の培地を調整することができる。

培地中に添加する油脂としては、脂肪酸の遊離 型、エステル型、塩等の誘導体を含む油脂を用い る事ができる。より好ましくは高度不飽和脂肪酸 の塩、例えばカリウム塩、ナトリウム塩、カルシ ウム塩等を含む油脂を用いる事ができる。

添加する油脂は、培地に対し０．００１％〜 １０％、好ましくは０．０１％〜１．０％を添加 することが、微生物の増殖及び高度不飽和脂肪酸 の取り込み率から見て望ましい。また微生物の培 養時に乳化剤等を添加しても良い。

この微生物粉末から、有機溶剤などを用いて脂 質抽出を行い、脱溶剤後、アセトン分画を行い、 アセトンに不溶な物質を集めれば、リン脂質の粗 分画物が得ることができる。有機溶剤としては、 リン脂質を溶解する通常の溶剤を単独又は混合し て用いられることができ、例えば、クロロホルム −メタノール系、ｎ−ヘキサン−エタノール−水 系、クロロホルム−ヘキサン系、クロロホルム− エーテル系、クロロホルム−エタノール系などが 挙げられる。

また、分別に用いられる溶剤は、通常、脂質の 分別に用いられる有機溶剤を用いることができる。

例えば、アセトン、酢酸、クロロホルム、エーテ ルなどが挙げられる。また、溶剤にMgCl₂，カル シウムなどを添加し、その共存下、分別を行って もよく、必要に応じて加熱、冷却等を行っても良 い、さらに、得られたすべての画分をカラムクロ マトグラフィーで再分画し、リン脂質の画分を集 めると高純度のリン脂質が高収率で得られる。更 に、通常の方法で精製することにより、単離する ことが出来る。カラムクロマトグラフィーとして は、例えば、疏水性クロマトグラフィー、シリカ 系クロマトグラフィー、トヨパール（商品名 東 ソー（株）製）等のポリマーゲル、シリカゲルに オクタデシル基を結合させたものなどを用いるこ とができる。

このようにして得られるリン脂質は、ＴＬＣ （薄層クロマトグラフィー）でその組成を分析し、 さらに常法によりケン化分解、メチルエステル化 してＧＬＣ（ガスクロマトグラフィー）で分析し て構成脂肪酸組成を求めることができる。

上述の方法により得られるリン脂質の組成物は、 ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファ チジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセ ロール、カルジオリピンなどであり、またその構 成脂肪酸はドコサヘキサエン酸、エイコサペンチ エン酸、アラキドン酸、リノール酸、オレイン酸、 パルミトレイン、パルチミン酸、ミリスチン酸な どである。

実施例 １ エシェリシア・コリ（Escherichia coli） ＩＦＯ−３３０１を酵母エキス０．５％、ペプト ン１％、マグロ眼窩脂肪より抽出して得られた脂 肪酸カリウム塩からなる油脂（ドコサヘキサエン 酸３０％、エイコサペンタエン酸８．４％、含有） ０．１％、グルコース０．５％を含有し、pH７に 調整した培地中で１０ｌ好気培養し、細胞を遠心 分離して集め、洗浄、乾燥して微生物粉末を得た。

微生物の乾燥粉末１００ｇをクロロホルム：メタ ノール＝２：１混合溶剤で抽出し、８ｇの抽出脂 質を得た。この脱溶剤後の総脂質にアセトン400 ｍｌを加え、冷却しながら撹拌を行い、糖脂質、 キノンを分別し濾過によりアセトン不溶分を回収 した。得られたアセトン不溶分をクロロホルムに 溶解し、次にこの溶液をシリカゲルカラムクロマ トグラフィーにかけ、クロロホルム、クロロホル ム：メタノール＝２：１、クロロホルム：メタノ ール＝１：１およびメタノールで順次展開した。

得られた各フラクションをＴＬＣでチェックし、 目的とするリン脂質のフラクションをいくつか見 出し、それらを回収し、脱溶剤したところ約７ｇ のリン脂質が得られた。得られたリン脂質の組成 はＴＬＣ分析の結果、ホスファチジルグリセロー ル（７０％）およびホスファチジルエタノールア ミン（２０％）が主成分であり、またこれらの脂 質の構成高度不飽和脂肪酸はドコサヘキサエン酸 １０．５％、エイコサペンタエン酸4.８％であっ た。

実施例 ２ セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens ）ＩＦＯ−３０５４を上記実施例１と 同様の方法で培養して得た該微生物菌体を実施例 １と同方法にて抽出したところ、リン脂質を得た。

該リン脂質の構成高度不飽和脂肪酸は、ドコサヘ キサエン酸２．５％、エイコサペンタエン酸０％ であった。

実施例 ３ バチルス・セレウス（Bacillus cereus） ＩＦＯ−３００１を上記実施例１と同様の方法で 培養して得た該微生物菌体を実施例１と同方法に て抽出したところ、リン脂質を得た。該リン脂質 の構成高度不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸 ８．９％、エイコサペンタエン酸１２．０％であ った。

実施例 ４ バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis ＩＡＭ−１０２６を上記実施例１と同様の方法で 培養して得た該微生物菌体を実施例１と同方法に て抽出したところ、リン脂質を得た。該リン脂質 の構成高度不飽和脂肪酸は、ドコサヘキサエン酸 ２２．４％、エイコサペンタエン酸１４．９％で あった。

実施例 ５ スタフィロコッカス・オーレウス （Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ−12600 を上記実施例１と同様の方法で培養して得た該微 生物菌体を実施例１と同方向にて抽出したところ、 リン脂質を得た。該リン脂質の構成高度不飽和脂 肪酸は、ドコサヘキサエン酸３．８％、エイコサ ペンタエン酸２．４％であった。

実施例 ６ シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa ）ＩＦＯ−３９１８を上記実施例１と 同様の方法で培養して得た該微生物菌体を実施例 １と同方法にて抽出したところ、リン脂質を得た。

該リン脂質の構成高度不飽和脂肪酸は、ドコサヘ キサエン酸６．９％、エイコサペンタエン酸1.８ ％であった。

実施例 ７ 新種海洋細菌微工研菌寄第１１６７１号を上記 実施例１と同様の方法で培養して得た該微生物菌 体を実施例１と同方法にて抽出したところ、リン 脂質を得た。該リン脂質の構成高度不飽和脂肪酸 は、ドコサヘキサエン酸２０．４％、エイコサペ ンタエン酸１８．４％であった。

実施例 ８ 海洋微生物（Pseudomonas putrefaciens SCRC−2878(FERMBP−1623)）を酵母エキス０．５ ％、ペプトン１％、イワシより抽出した油成分 ０．１％（トリグリセライドを主成分とし、 ＤＨＡを１０％含有）、乳化剤（トコフェロール １５％、Ｄ−ソルビット４５％、グリセリン脂肪 酸エステル３％を含有）０．００３％を含有し、 ｐＨ７に調整した海水培地中で１０ｌ好気培養し、 細胞を遠心分離して集め、洗浄、乾燥して海洋微 生物粉末を得た。海洋微生物の乾燥粉末１００ｇ をクロロホルム：メタノール＝２：１混合溶剤で 抽出し、８ｇの抽出脂質を得た。この脱溶剤後の 総脂質にアセトン４００ｍｌを加え、冷却しなが ら撹拌を行い、糖脂質、キノンを分別をし濾過に よりアセトン不溶分を回収した。得られたアセト ン不溶分をクロロホルムに溶解し、次にこの溶液 をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、 クロロホルム、クロロホルム：メタノール＝２： １、クロロホルム：メタノール＝１：１およびメ タノールで順次展開した。得られた各フラクショ ンをＴＬＣでチェックし、目的とするリン脂質の フラクションをいくつか見出し、それらを回収し、 脱溶剤したところ約７ｇのリン脂質組成物が得ら れた。得られたリン脂質の組成はＴＬＣ分析の結 果、ホスファチジルグリセロールおよびホスファ チジルエタノールアミンが主成分であり、また構 成脂肪酸はＤＨＡ（１７．５％）、ＥＰＡ （６．８％）、オレイン酸（６．２％）、パルミ チン酸（８．６％）、パルミトレイン酸（８．０ ％）などであった。

実施例 ９ 海洋微生物（Alteromonas putrefaciens SCRC−2871（FERMBP−1624)）を上記実施例８と同 様の培地中で培養して細胞を得、遠心集菌、洗浄、 乾燥して海洋微生物粉末を得た。該海洋微生物粉 末１１０ｇをｎ−ヘキサン：エタノール：水＝２ ：０．９：０．１混合溶剤で抽出し、１２ｇの総 脂質を得た。該総脂質にアセトン５００ｍｌを加 え、冷却下に撹拌して、糖脂質、キノンを分別し、 濾過してアセトン不溶分を回収した。得られたア セトン不溶分をブタノールに溶解し、展開溶媒と してブタノール、酢酸および水を用い、実施例１ と同様にシリカゲルカラムクロマトグラフィーで 分画した。各フラクションをＴＬＣでチェックし ながら、リン脂質画分を集め、リン脂質組成物 １０．５ｇを得た。該リン脂質組成物はホスファ チジルグリセロールおよびホスファチジルエタノ ールアミンを主成分とし、また構成脂肪酸は ＤＨＡ（２５．４％）、ＥＰＡ（７．６％）、オ レイン酸（２．４％）、パルミチン酸（６．８％）、 パルミトレイン酸（１１．６％）、ミリスチン酸 （２．５％）、などであった。

〔発明の効果〕

本発明の効果は次のようである。

高度不飽和脂肪酸及び／又はその誘導体を含む 油脂を添加した培地中で培養した微生物の脂質か ら高度不飽和脂肪酸リン脂質を効率良く、短時間 で且つ容易に単離、精製することが可能となった。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:085） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:43） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:445） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:385） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:38）

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 微生物を高度不飽和脂肪酸及び／又はそ
   の誘 導体を含む油脂を添加した培地中にて培養し、 次いでこれら培養した微生物から抽出分離する ことを特徴とする高度不飽和脂肪酸リン脂質の 製造法。
2. 【請求項２】 微生物がエシェリシア（Escherichia）
   属、セ ラチア（Serratia）属、バチルス（Bacillus） 属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、 シュードモナス（Pseudomonas）属、アルテロモ ナス（Alteromonas）属又はシーワネラ （Shewanella）属である特許請求の範囲第(1)項 に記載の製造法。
3. 【請求項３】 微生物が微工研菌寄第１１６７１号であ
   る特 許請求の範囲第(1)項の記載の製造法。
4. 【請求項４】 前記エシェリシア属微生物がエシェリシ
   ア・ コリ（Eschelichia Coli）ＩＦＯ−３３０１ である特許請求の範囲第(2)項に記載の製造法。
5. 【請求項５】 前記セラチア属微生物が、セラチア・マ
   ルセ ッセンス（Serratia marcescens）IFO-3054 である特許請求の範囲第(2)項に記載の製造法。
6. 【請求項６】 前記バチルス属微生物が、バチルス・セ
   レウ ス（Bacillus cereus）ＩＦＯ−３００１又は バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis） ＩＡＭ−１０２６である特許請求の範囲第(2)項 に記載の製造法。
7. 【請求項７】 前記スタフィロコッカス属微生物が、ス
   タフ ィロコッカス・オーレウス（Staphylococcus aureus ）ＡＴＣＣ−１２６００である特許請求 の範囲第(2)項に記載の製造法。
8. 【請求項８】 前記シュードモナス属微生物が、シュー
   ドモ ナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aerceginosa） ＩＦＯ−３９１８である特許請求 の範囲第(2)項に記載の製造法。
9. 【請求項９】 前記シュードモナス属微生物がシュード
   モナ ス・ピュートリファシエンス（Pseudomonas putrefaciens）SCRC−2181，SCRC−2201，SCRC −2271，SCRC−2341，SCRC−2451，SCRC−2642， SCRC−2792，SCRC−2878，SCRC−3011又はSCRC −3022である特許請求の範囲第(2)項に記載の製 造法。
10. 【請求項１０】 前記アルテロモナス属微生物がアルテ
    ロモナ ス・ピュートリファシエンス（Alteromonas putrefaciens ）SCRC−2871又はアルテロモナス ・ピュートリファシエンス・サブスピーシズ・ サガミファシエンス（Alteromonas putrefaciens subspecies sagamifaciens） SCRC−1162である特許請求の範囲第(2)項に記載 の製造法。
11. 【請求項１１】 前記シーワネラ属微生物がシーワネラ
    ・ピュ ートリファシエンス（Shewanella putrefaciens ）SCRC−2874である特許請求の範 囲第(2)に記載の製造法。
12. 【請求項１２】 高度不飽和脂肪酸リン脂質がホスファ
    チジル グリセロール、ホスファチジルエタノールアミ ン及び／又はカルジオリピンを主成分とするも のである特許請求の範囲第(1)項記載の製造法。