JPH0545360A - 免疫学的測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 液体試料中の特定成分を、簡便な操作で、再
現性良く、正確に定量できる技術を提供することであ
る。 【構成】 抗体（又は抗原）が固定化された吸水体から
なり、この吸水体には凹部が構成されてなる免疫学的測
定装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的測定装置に関
するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。すなわち、ＢｅｒｓｏｎとＹａｌｌｏｗが
放射性同位元素Ｉで標識したウシインシュリンと糖尿病
患者血清中の抗インシュリン抗体を用いて血清中のイン
シュリンを測定することに成功して以来、ラジオアイソ
トープを用いた免疫測定法が広く用いられて来た。そし
て、これ以後、標識物質として放射性同位元素以外のも
のも種々開発されて来た。例えば、酵素、酵素基質、補
酵素、酵素阻害物質、バクテリオファージ、循環反応
体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分子族、化学発
光性反応体及び螢光性分子等が挙げられる。

【０００３】このような免疫学的測定法は、均一免疫測
定法と非均一免疫測定法に大別される。すなわち、抗原
抗体反応生成物（Ｂｏｕｎｄ体）と非反応物（Ｆｒｅｅ
体）との分離（Ｂ／Ｆ分離）が必要な非均一免疫測定法
と、Ｂ／Ｆ分離の必要のない均一免疫測定法とに大別さ
れる。このうち、測定対象物質が高分子である場合に
は、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均一免疫測定法が利用されて
いる。

【０００４】ところで、この非均一免疫測定法は洗浄操
作、試薬の調整が必要であること、標識物質、基質、反
応停止液等の添加が必要であることから操作が煩雑であ
る等の問題がある。これらの問題点に対して各種の技術
が提案されている。例えば、特開昭６４−６３８６３号
公報、特開昭６４−６３８６４号公報、特開平２−８３
４４号公報においては、乾式分析素子を用いることによ
り操作性はかなり簡便になっているものの、簡便性に対
する要求は高まる一方であり、改善が待たれている。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、液体試料中の特定成分
を、簡便な操作で、再現性良く、正確に定量できる技術
を提供することである。この本発明の目的は、抗体（又
は抗原）が固定化された吸水体からなり、この吸水体に
は凹部が構成されてなることを特徴とする免疫学的測定
装置によって達成される。

【０００６】尚、吸水体には標識抗体（又は抗原）が介
在していることが好ましい。本発明の免疫学的測定装置
による測定試料としてはあらゆる形態の溶液、コロイド
溶液などが使用しうるが、好ましくは生物由来の試料、
例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊水、乳、
尿、汗、肉汁等が挙げられる。本発明に用いられる抗体
（又は抗原）に対する標識物質としては、酵素、酵素基
質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファージ、循環
反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠分子族、化
学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げられるが、例え
ばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
タメートデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等の酵素が好ま
しく、これらの酵素を標識物質とする場合、酵素反応
系、発色系は公知のものを使用できる。具体的には、特
開昭６１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０５３
９号公報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開昭６
３−４５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３号明
細書に記載の物質（物質群）が挙げられるが、これらに
限定されるものではない。そして、これら標識物質の抗
体（抗原）への結合は、当業者間で知られている公知の
試薬と方法で行うことができ、例えば石川 栄治、河合
忠、宮井 潔 編「酵素免疫測定法（第２版）、医学
書院、１９７８年」や日本臨床病理学会編「臨床病理」
臨時増刊特集第５３号「臨床検査の為のイムノアッセイ
−技術と応用−、臨床病理刊行会、１９８３年」などに
記載された方法を参考にすることができる。

【０００７】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４〜８
８参照）で精製して用いることができる。あるいは、抗
原で感染した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓細胞
や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブリド
ーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを特定
成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特異性
が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩｇＧ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いることがで
き、或いはこれらの抗体を酵素処理してＦａｂ、Ｆａ
ｂ’又はＦ（ａｂ’）₂ といった活性抗体フラグメント
にして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一で
使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。

【０００８】本発明の免疫測定装置による反応型式とし
ては、競合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げら
れるが、特に限定はされない。又、他の生物活性物質
（例えば、ビオチン、アビジン）を利用した免疫測定方
法も適用できる。本発明で使用する抗原は特異抗体と反
応するものであり、ハプテン及びその誘導体を含有す
る。

【０００９】抗体（又は抗原）は吸水性の素材に固定化
される。このような吸水性の材料としてはアガロース、
セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、
セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、架橋
ポリアクリルアミド、シリカゲル、発泡ポリスチレン等
の発泡樹脂、濾紙、脱脂綿、パルプ、羊毛、麻などの繊
維などが挙げられる。抗体又は抗原は、これらの素材か
らなる吸水体に化学的及び／又は物理的に直接あるいは
間接的に結合させることができる。結合法については１
９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験と応
用 アフィニティクロマトグラフィー」（第１刷）、１
９７５年、講談社発行、山崎誠ほか２名編「アフィニテ
ィクロマトグラフィー」（第１版）を参考にできる。

【００１０】尚、結合反応後、標識抗体（又は抗原）の
非特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に
関与しない蛋白質を担持させることができる。それらの
代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白
質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲ
ン及びそれらの分解物質等が挙げられる。このような非
特異吸着抑制蛋白質は、吸水体に担持させるだけでな
く、免疫反応時にその一定量を液体試料中に添加するこ
とにより、一層非特異吸着の抑制効果が上がる。

【００１１】前記酵素標識抗体（又は抗原）は、免疫反
応時に吸水体に存在しておれば良く、この点から液体試
料の添加時に存在させられても良い訳であるが、予め固
定化抗体（又は抗原）と共に内在させられていること
が、使用時の作業の簡便性から好ましい。前記のような
抗体（又は抗原）が固定化された吸水性の素材（吸水
体）において免疫反応が行われる訳であるが、免疫反応
後には遊離の酵素標識抗体が分析素子側に移行させられ
て、分析が行われる。この分析素子は、例えば酵素基質
が内蔵された吸水体からなる。尚、この分析素子の吸水
体の素材は免疫反応が行われる吸水体と同様な素材を用
いることが出来る。尚、分析素子には他の添加剤、例え
ば緩衝剤、保恒剤、界面活性剤、媒染剤等を目的に応じ
て添加することができる。緩衝剤は、特異的結合反応、
酵素反応、発色反応等に適したｐＨとする為に含有され
る。用いることができる緩衝剤としては日本化学会編
「化学便覧基礎編」（東京、丸善株式会社 １９６６）
ｐｐ１３１２〜１３２０、Ｎ，Ｅ，Ｇｏｏｄ等; Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ ５、ｐ４６７（１９６
６）、今村、斎藤; 化学の領域、Ｖｏｌ３０（２）、ｐ
７９（１９７６）、Ｗ．Ｊ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等 Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ １０４、ｐ３００（１
９８０）等の文献に記載されているものを挙げることが
できる。具体的な例としては、ホウ酸塩、クエン酸塩、
燐酸塩、炭酸塩、トリスバルビツール、グリシン、グッ
ド緩衝剤などが挙げられる。これらの緩衝剤は必要に応
じて単独で層を形成させてもよい。保恒剤は基質発色試
薬の保存安定化の為に含有され、酸化防止剤などがあ
る。その物質としては、日本生化学会編「生化学実験口
座１、蛋白質の化学１」（東京化学同人株式会社 １９
７６) ｐｐ６６，６７、実験と応用「アフィニティクロ
マトグラフィ」ｐｐ１６〜１０４、特開昭６０−１４９
９２７号公報などに記載されているものが挙げられる。
具体的例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、アルブ
ミン、シクロデキストリン類、非還元糖類（シュクロー
ス、トレハロース）、ポリエチレングリコール、アミノ
酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げられる。界面活
性剤としては、トライトンＸ−１００（ロームアンドハ
ース社製、オクチルフェノキシポリエトキシエタノー
ル）、サーファクタント１０Ｇ（オリーン社製、ノニル
フェノキシポリグリシドール）等の非イオン性界面活性
剤が挙げられる。その他に含有される試薬としては、溶
解助剤、ブロッカー試薬などがある。これらの添加剤は
必要に応じて適当量添加する。媒染剤は、酵素活性測定
の為の検出物質を測光部側に集中的に集めたり、検出物
質が色素の場合吸光度係数を高めたり、波長をシフトさ
せる物質であり、検出物質と強い相互作用を示す。カチ
オン性ポリマー、アニオン性ポリマー及びこれらのポリ
マーのラテックスが用いられる。

【００１２】上記のような抗体（又は抗原）が固定化さ
れた吸水体からなる免疫学的測定装置と分析素子とが用
いられて、免疫測定が行われる訳であるが、すなわち抗
体（又は抗原）が固定化された吸水体に液体試料を加え
ることにより固定化抗体（又は抗原）及び酵素標識抗体
（又は抗原）と液体試料中の抗原（又は抗体）とによる
免疫反応を吸水体において行わせ、この後吸水体を分析
素子に接触させて遊離の酵素標識抗体（又は抗原）を分
析素子側に移行させ、その後必要に応じて吸水体と分析
素子とを分離させ、標識酵素を測定することにより液体
試料中の抗原（又は抗体）が分析される訳であるが、吸
水体には凹部（窪み又は中空孔など）が形成され、この
凹部の形成されている側が分析素子に重ね合わせられ
る。そして、このようにすることによって、分析素子と
吸水体とが重ならない部分では傷付きが起きず、すなわ
ち吸水体の凹部に対応する部分の分析素子には傷付きが
起きず、この部分を測光部とすれば、同時再現性が向上
していたのである。

【００１３】標識酵素に起因した信号は、紫外線、可視
光、近赤外光などを利用した吸光度法（比色法) などで
検出することができ、測定法としては信号の経時的変化
を測定するレート測定法または一定時間後の信号を測定
するエンドポイント測定法で測定することができる。

【００１４】

〔実施例１〕

１−（１） β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体
の作成 ＣＲＰ抗体（ウサギＩｇＧフラクション、タウンズ社
製）２０ｍｇを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐ６．５）
２．０ｍｌに溶解し、これにＮ−（ε−マレイミドカプ
ロイルオキシ）スクシンイミド（同仁化学研究所製）が
２．５ｍｇ／ｍｌのジメチルホルムアミド溶液７７μｌ
を加えて、３０℃で２０分間反応後、５ｍＭのＥＤＴＡ
を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平
衡化したセファデックスＧ−２５カラムで精製し、マレ
イミド化したＣＲＰ抗体を得た。

【００１５】次に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（東洋紡
社製）が１０．５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液
１．８ｍｌに、前記マレイミド化したＣＲＰ抗体を１
３．６ｍｇ含む溶液３．２ｍｌを加えて、４℃で４５時
間反応後、０．１Ｍの２−メルカプトエチルアミン１７
５μｌを加えて３０℃で２０分間反応させ、０．１５Ｍ
の塩化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）で平衡化したスーパーローズ６プレップグレ
ード（ファルマシア社製）カラムで分離、精製し、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体を得た。

【００１６】１−（２） 抗ＣＲＰ抗体が固定化され、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を内在（含
浸）した吸水体の作成 図１に示す如くの中心孔１が形成された直径１ｃｍのリ
ング状のパルプ片２を０．１５Ｍの塩化ナトリウムを含
有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４０ｍｌ
中に分散し、これにＣＲＰ抗体（ウサギＩｇＧフラクシ
ョン、タウンズ社製）１２０ｍｇを入れ、４０℃で２０
時間攪拌し、反応させ、固定化した。反応後、０．１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）と０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
８．０）を交互に用い、充分に洗浄した。

【００１７】次いで、洗浄した後、３％スキムミルク添
加の０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）中で４℃で２０時間攪拌した。そし
て、凍結乾燥した後、前記１−（１）で作成したβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体の溶液（１０μｇ
／ｍｌ）５ｍｌ中に浸し、所定時間後に取り出し、凍結
乾燥し、抗ＣＲＰ抗体が固定化され、β−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を含浸した抗原−抗体反応用
の吸水体Ａを作成した。

【００１８】又、比較の為、孔の形成されていない直径
１ｃｍの円板状のパルプを用いて同様に行い、抗原−抗
体反応用の吸水体Ｂを作成した。 １−（３） 分析素子（吸水体）の作成 厚さ１８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタ
レートフィルムの上に、下記の組成の塗布液（１）を塗
布し、乾燥させ、ゼラチン層を作成させた。

【００１９】 塗布液−（１） 脱イオン化ゼラチン ６．０ｇ トライトンＸ−１００ ０．１５ｇ １，２−ビス（ビニルスルホニル）エタン ０．０１ｇ 純水 ５４．０ｇ 次に、塗布液−（２）を前記ゼラチン層の上に塗布し、
乾燥した。

【００２０】 塗布液−（２） 粉末ろ紙Ｃ（東洋濾紙社製） ２１．６ｇ ピロリドン−酢酸ビニル（２対８）共重合体 １１．０ｇ クロロフェニルレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ベーリンガー社製） ３６５ｍｇ ｎ−ブタノール ４９．４ｇ これを１．５ｃｍ×１．５ｃｍの大きさに裁断し、分析
素子Ｃを作成した。

【００２１】１−（４） ＣＲＰの測定 １ｍＭの塩化マグネシウム及び３重量％のウシ血清アル
ブミンを含有する０．３Ｍのビストリス緩衝液５０μｌ
に、ＣＲＰ溶液（０、１、３、１０、３０、１００μｇ
／ｍｌ）５μｌを添加混合し、その３０μｌを前記１−
（２）で作成した吸水体Ａ上に滴下し、１０分間免疫反
応させた。この後、吸水体Ａを分析素子Ｃの上方から接
合させた。そして、３７℃でインキュベートし、５４６
ｎｍの反射濃度を分析素子Ｃの支持体側から測定した。
３分３０秒及び７分の反射濃度差（ΔＤｒ）を用いて検
量線を作成した結果は、図２に示す通りである。

【００２２】そして、吸水体ＡについてＮ＝１０で繰り
返し行い、同時再現性（変動係数）を調べた結果は、下
記の表１に示す通りであった。又、吸水体ＢについてＮ
＝１０で繰り返し行い、同時再現性（変動係数）を調べ
た結果は、下記の表１に示す通りであった。 表 １（変動係数 ％） ＣＲＰ溶液濃度（μｇ／ｍｌ） ０ １ ３ １０ ３０ １００ 吸水体Ａ（本発明） ４．８ ４．２ ４．０ ３．８ ４．０ ２．８ 吸水体Ｂ（比較例） ７．２ ７．３ ５．２ ５．６ ５．０ ４．１

【００２３】

【効果】本発明のものでは、液体試料中の特定成分を、
簡便な操作で、再現性良く、正確に定量できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】免疫学的測定装置の断面図である。

【図２】ＣＲＰ検量線のグラフである。

【符号の説明】

１ 中心孔 ２ リング状のパルプ片 Ａ 吸水体（免疫学的測定装置） Ｃ 分析素子

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗体（又は抗原）が固定化された吸水体
   からなり、この吸水体には凹部が構成されてなることを
   特徴とする免疫学的測定装置。
2. 【請求項２】 吸水体に標識抗体（又は抗原）が介在し
   てなることを特徴とする請求項１の免疫学的測定装置。