JPH0513628B2 - - Google Patents
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- Publication number
- JPH0513628B2 JPH0513628B2 JP5247684A JP5247684A JPH0513628B2 JP H0513628 B2 JPH0513628 B2 JP H0513628B2 JP 5247684 A JP5247684 A JP 5247684A JP 5247684 A JP5247684 A JP 5247684A JP H0513628 B2 JPH0513628 B2 JP H0513628B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hemicellulase
- novel
- range
- phomopsis
- stable
- Prior art date
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は、新規なヘミセルラーゼＡ及びその製
造法更に詳細には、ホモシス（Phomopsis）属に
属する新規ヘミセルラーゼＡ生産菌を培養し、該
培養物より新規ヘミセルラーゼＡを分離、採取す
ることを特徴とする新規ヘミセルラーゼＡの製造
法に関するものである。 本発明において「ヘミセルラーゼＡ」とは、後
述の理化学的性質を有する酵素を指称するものと
する。本発明により得られるヘミセルラーゼＡ
は、主にキシランをランダムに加水分解して、主
にキシロースを生成する基質特異性を有する。こ
のような特徴的な基質特異性を有するヘミセルラ
ーゼは、従来のかび類、細菌類、軟体動物、高等
動物の起源のヘミセルラーゼには見出されていな
い。したがつて本発明のヘミセルラーゼＡは、そ
の基質特異性において新規な酵素である。 以下に、本発明について詳述する。 まず、本発明において用いる微生物は、ヘミセ
ルラーゼＡの生産能を有するホモシス
（Phomopsis）属に属する菌種であり、その一例
として、ホモシス・デンシフローラ・エスピ−
（Phomopsis densiflora sp.）（以下、「ホモシス
属菌」と称する。）と呼称される微生物が挙げら
れる。 前記ホモシス属菌は、松枯をおこした材質内部
から分離されたものであり、工業技術院微生物工
業技術研究所に昭和59年３月17日付寄託のため郵
送された（和光郵便局書留郵便物引受番号829
号）。 前記ホモシス属菌の菌学的性質は次のとおりで
ある。 (a) 各培地における生育状態 ツアペツク寒天培地
造法更に詳細には、ホモシス（Phomopsis）属に
属する新規ヘミセルラーゼＡ生産菌を培養し、該
培養物より新規ヘミセルラーゼＡを分離、採取す
ることを特徴とする新規ヘミセルラーゼＡの製造
法に関するものである。 本発明において「ヘミセルラーゼＡ」とは、後
述の理化学的性質を有する酵素を指称するものと
する。本発明により得られるヘミセルラーゼＡ
は、主にキシランをランダムに加水分解して、主
にキシロースを生成する基質特異性を有する。こ
のような特徴的な基質特異性を有するヘミセルラ
ーゼは、従来のかび類、細菌類、軟体動物、高等
動物の起源のヘミセルラーゼには見出されていな
い。したがつて本発明のヘミセルラーゼＡは、そ
の基質特異性において新規な酵素である。 以下に、本発明について詳述する。 まず、本発明において用いる微生物は、ヘミセ
ルラーゼＡの生産能を有するホモシス
（Phomopsis）属に属する菌種であり、その一例
として、ホモシス・デンシフローラ・エスピ−
（Phomopsis densiflora sp.）（以下、「ホモシス
属菌」と称する。）と呼称される微生物が挙げら
れる。 前記ホモシス属菌は、松枯をおこした材質内部
から分離されたものであり、工業技術院微生物工
業技術研究所に昭和59年３月17日付寄託のため郵
送された（和光郵便局書留郵便物引受番号829
号）。 前記ホモシス属菌の菌学的性質は次のとおりで
ある。 (a) 各培地における生育状態 ツアペツク寒天培地
【表】
ツアペツク・酵母エキス・ペプトン培地
産業別審査基準「微生物と発酵生産物」記載
の菌学的性質の使用培地（ツアペツク寒天培地
を除く。）においては生育が不十分であるため、
以下の培地を用いた。
の菌学的性質の使用培地（ツアペツク寒天培地
を除く。）においては生育が不十分であるため、
以下の培地を用いた。
【表】
松葉煮汁培地
１％キシラン0.7ml0.5M−酢酸緩衝液（PH6.0）
0.8mlに本酵素液１mlを加え、37℃で18時間加温
する。反応終了後、ネルソン−ソモジー法
（Nelson−Somogyl method）で還元糖の定量を
行なう。即ち、反応液0.5mlにソモジー試薬0.5ml
を加え、10分間、100℃で加熱、発色させ、冷却
後、ネルソン試薬を0.5ml加え、５mlの蒸留水で
稀釈する。これを液長660nmで比色定量する。 ヘミセルラーゼＡは、以下に記載する理化学的
性質を有する新規酵素である。 〔酵素の理化学的性質〕 (1) 作用及び基質特異性 主にキシランに作用し、これをランダムに分
解して、主にキシロースの他グルコース、ガラ
クトース等の還元糖を生成するが、セルロース
には作用しない。 (2) 至適PH及び安定PH範囲 PH３〜８はマツキルベン（Mcllvaeine）緩
衝液、またPH８〜11はグリシン（Glycine）緩
衝液を用いて夫々調整した。 ヘミセルラーゼＡの至適PHはPH5.8〜6.0であ
つた。 また、ヘミセルラーゼＡを30℃、60分インキ
ユベートしたときの残存活性を調べたところ、
PH4.0〜9.0に安定PH範囲を有することがわかつ
た。 (3) 力価の測定法 １％キシラン0.7ml、0.5M−酢酸緩衝液（PH
6.0）0.8mlに本酵素液１mlを加え、37℃で18時
間加温、反応させた後、反応液0.5mlにソモジ
ー試薬0.5mlを加え、10分間、100℃で加熱、発
色させ、冷却後、0.5mlのネルソン試薬を加え、
５mlの蒸留水で稀釈する。これを波長660nmで
比色定量する（ネルソン−ソモジー法）。 (4) 作用適温の範囲 ヘミセルラーゼＡの作用適量は30〜７℃の範
囲にある。 (5) PH及び温度による失活の条件 PHによる失活： ヘミセルラーゼＡについて、前記安定PH範囲
の測定と同一の条件でPHによる失活の条件を調
べた結果、PH9.0以上及びPH3.0以下で失活す
る。 温度安定性： ヘミセルラーゼＡについて、PH6.0の条件で
温度を変化させて、温度による失活の条件を調
べた結果、熱失活の始まる温度は50℃である。 (6) 精製方法 前記ホモシス属菌の培養液を硫酸アンモニ
ウム分画（０〜80％）し、遠心分離後、沈澱を
最少量の精製水に溶かし込んだものを集め、
20mMアセテート緩衝液（PH4.5）で透析した。
更に、順次CM−Sephadex Ｃ−50（スウエー
デン・フアルマシア社製）、Sephadex Ｇ−100
のカラムクロマトグラフイーを行つて精製す
る。 (7) 分子量 Sephadex Ｇ−75によるゲル過による分子
量は約15000である。 (8) ヘミセルラーゼＡは、蛋白の結晶を作り難い
ため、結晶構造は不明である。 (9) アミノ酸分析 アミノ酸分析機（日本電子(株)製JOL HA−
６）により、下記のアミノ酸組成が得られた。
0.8mlに本酵素液１mlを加え、37℃で18時間加温
する。反応終了後、ネルソン−ソモジー法
（Nelson−Somogyl method）で還元糖の定量を
行なう。即ち、反応液0.5mlにソモジー試薬0.5ml
を加え、10分間、100℃で加熱、発色させ、冷却
後、ネルソン試薬を0.5ml加え、５mlの蒸留水で
稀釈する。これを液長660nmで比色定量する。 ヘミセルラーゼＡは、以下に記載する理化学的
性質を有する新規酵素である。 〔酵素の理化学的性質〕 (1) 作用及び基質特異性 主にキシランに作用し、これをランダムに分
解して、主にキシロースの他グルコース、ガラ
クトース等の還元糖を生成するが、セルロース
には作用しない。 (2) 至適PH及び安定PH範囲 PH３〜８はマツキルベン（Mcllvaeine）緩
衝液、またPH８〜11はグリシン（Glycine）緩
衝液を用いて夫々調整した。 ヘミセルラーゼＡの至適PHはPH5.8〜6.0であ
つた。 また、ヘミセルラーゼＡを30℃、60分インキ
ユベートしたときの残存活性を調べたところ、
PH4.0〜9.0に安定PH範囲を有することがわかつ
た。 (3) 力価の測定法 １％キシラン0.7ml、0.5M−酢酸緩衝液（PH
6.0）0.8mlに本酵素液１mlを加え、37℃で18時
間加温、反応させた後、反応液0.5mlにソモジ
ー試薬0.5mlを加え、10分間、100℃で加熱、発
色させ、冷却後、0.5mlのネルソン試薬を加え、
５mlの蒸留水で稀釈する。これを波長660nmで
比色定量する（ネルソン−ソモジー法）。 (4) 作用適温の範囲 ヘミセルラーゼＡの作用適量は30〜７℃の範
囲にある。 (5) PH及び温度による失活の条件 PHによる失活： ヘミセルラーゼＡについて、前記安定PH範囲
の測定と同一の条件でPHによる失活の条件を調
べた結果、PH9.0以上及びPH3.0以下で失活す
る。 温度安定性： ヘミセルラーゼＡについて、PH6.0の条件で
温度を変化させて、温度による失活の条件を調
べた結果、熱失活の始まる温度は50℃である。 (6) 精製方法 前記ホモシス属菌の培養液を硫酸アンモニ
ウム分画（０〜80％）し、遠心分離後、沈澱を
最少量の精製水に溶かし込んだものを集め、
20mMアセテート緩衝液（PH4.5）で透析した。
更に、順次CM−Sephadex Ｃ−50（スウエー
デン・フアルマシア社製）、Sephadex Ｇ−100
のカラムクロマトグラフイーを行つて精製す
る。 (7) 分子量 Sephadex Ｇ−75によるゲル過による分子
量は約15000である。 (8) ヘミセルラーゼＡは、蛋白の結晶を作り難い
ため、結晶構造は不明である。 (9) アミノ酸分析 アミノ酸分析機（日本電子(株)製JOL HA−
６）により、下記のアミノ酸組成が得られた。
【表】
以上詳述したように、本発明により、ホモシス
属に属するヘミセルラーゼＡ生産菌を培養し、そ
の培養液より新規酵素のヘミセルラーゼＡを有利
に製造し得るものである。 以下に、本発明方法を実施例により説明する。 実施例 KC l0.5ｇ、MgSO4 0.5ｇ、K2HPO4 1.0ｇ、
NaNO3 2.0ｇ、乳糖 25ｇ、酵母エキス 2.5ｇ、
ペプトン ５ｇ、アピセル ５ｇ、水 １ 前記組成の滅菌培地に前記ホモシス属菌（書留
郵便引受番号829号）を接種し、25℃、４週間平
面静置培養を行なつた。培養後、培養液50を
硫酸アンモニウム分面（０〜80％）し、冷凍遠心
機（日立製）を用い、遠心分離（5000×ｇ、15
分）を行つた。得られた沈澱を最少量の精製水に
溶かし込んだものを集め、20mMアセテート緩衝
液で透析した。次いで、25mMアセテート緩衝液
（PH4.50）で平衝化したCM−セフアデツクスＣ−
50〔CM−Sephadex Ｃ−50：スウエーデン・フ
アルマシア社製〕に吸着させ、０〜0.35M−
NaClの直線濃度勾配で溶出する（カラム径：
φ6.3×40cm、流速：231.8ml／ｈ、フランクシヨ
ン・ボリユーム：15.0ml）。得られた画分80.1〜
0.15M−NaCl）を、50mMアセテート緩衝液
（PH6.0）で平衝化したセフアデツクスG100
〔Sephadex Ｇ−100〕を用い、同一の緩衝液で溶
出し（カラム径：φ2×97cm、流速：2.8ml／ｈ、
フラクシヨンボリユーム：5.0ml）、画分Ｃを得
る。画分Ｃは、その濃縮液について、デイスク電
気泳動を行つたところ、単一のバンドを示し、本
酵素ヘミセルラーゼＡの精製標品が得られた。
属に属するヘミセルラーゼＡ生産菌を培養し、そ
の培養液より新規酵素のヘミセルラーゼＡを有利
に製造し得るものである。 以下に、本発明方法を実施例により説明する。 実施例 KC l0.5ｇ、MgSO4 0.5ｇ、K2HPO4 1.0ｇ、
NaNO3 2.0ｇ、乳糖 25ｇ、酵母エキス 2.5ｇ、
ペプトン ５ｇ、アピセル ５ｇ、水 １ 前記組成の滅菌培地に前記ホモシス属菌（書留
郵便引受番号829号）を接種し、25℃、４週間平
面静置培養を行なつた。培養後、培養液50を
硫酸アンモニウム分面（０〜80％）し、冷凍遠心
機（日立製）を用い、遠心分離（5000×ｇ、15
分）を行つた。得られた沈澱を最少量の精製水に
溶かし込んだものを集め、20mMアセテート緩衝
液で透析した。次いで、25mMアセテート緩衝液
（PH4.50）で平衝化したCM−セフアデツクスＣ−
50〔CM−Sephadex Ｃ−50：スウエーデン・フ
アルマシア社製〕に吸着させ、０〜0.35M−
NaClの直線濃度勾配で溶出する（カラム径：
φ6.3×40cm、流速：231.8ml／ｈ、フランクシヨ
ン・ボリユーム：15.0ml）。得られた画分80.1〜
0.15M−NaCl）を、50mMアセテート緩衝液
（PH6.0）で平衝化したセフアデツクスG100
〔Sephadex Ｇ−100〕を用い、同一の緩衝液で溶
出し（カラム径：φ2×97cm、流速：2.8ml／ｈ、
フラクシヨンボリユーム：5.0ml）、画分Ｃを得
る。画分Ｃは、その濃縮液について、デイスク電
気泳動を行つたところ、単一のバンドを示し、本
酵素ヘミセルラーゼＡの精製標品が得られた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する新規ヘミセルラ
ーゼＡ 作用及び基質特異性 主にキシランに作用し、これを分解して、主
にキシロースの他グルコース、ガラクトース等
の還元糖を生成するが、セルロースには、作用
しない。 至適PH及び安定PH範囲 至適PH範囲は、PH5.8〜6.0、安定PH範囲は、
PH4.0〜9.0である。 作用適温の範囲 PH6.0において、30〜37℃である。 失活の条件 50℃で失活し、PH9.0以上及び3.0以下で失活
する。 分子量 ゲル過法による分子量は、約15000である。 アミノ酸分析 【表】 ２ ホモシス（Phomopsis）属に属する新規ヘミ
セルラーゼＡ生産菌を培養し、該培養物より新規
ヘミセルラーゼＡを分離、採取することを特徴と
する新規ヘミセルラーゼＡの製造法。 ３ ホモシス（Phomopsis）属に属する新規ヘミ
セルラーゼＡ生産菌が、ホモシス・デンシフロー
ラ・エスピー（Phomopsis densiflora sp.）（書
留郵便引受番号829号）である特許請求の範囲第
２項記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5247684A JPS60196188A (ja) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | 新規ヘミセルラ−ゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5247684A JPS60196188A (ja) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | 新規ヘミセルラ−ゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60196188A JPS60196188A (ja) | 1985-10-04 |
| JPH0513628B2 true JPH0513628B2 (ja) | 1993-02-23 |
Family
ID=12915771
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5247684A Granted JPS60196188A (ja) | 1984-03-19 | 1984-03-19 | 新規ヘミセルラ−ゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60196188A (ja) |
-
1984
- 1984-03-19 JP JP5247684A patent/JPS60196188A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60196188A (ja) | 1985-10-04 |
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