JPH0515372A

JPH0515372A - 固定化酵素

Info

Publication number: JPH0515372A
Application number: JP16558191A
Authority: JP
Inventors: Kazuyuki Oishi; 和之大石
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1991-07-05
Filing date: 1991-07-05
Publication date: 1993-01-26

Abstract

(57)【要約】【構成】疎水性架橋重合体粒子の表面に、親水性重合体
の層が形成された被覆重合体でなる担体に、酵素が直接
にあるいはスペーサーを介して間接的に固定化された固
定化酵素。この親水性重合体は、固定化酵素における酵
素またはスペーサーを固定化できる官能基（例えば、水
酸基、カルボニル基、アミノ基、グリシジル基、シアノ
基、アルデヒド基）を有する重合体である。【効果】本発明の固定化酵素に用いられる担体は耐圧性
に優れ、膨潤および収縮の度合が少なく、さらにタンパ
ク質の非特異的吸着がない。この担体を用いることによ
り、従来よりも酵素活性が高く、物理的強度が改善され
た固定化酵素が得られる。この固定化酵素は高流速、大
容量の処理に耐え得るため工業用、臨床化学用など多方
面に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、固定化酵素に関する。

【０００２】

【従来の技術】固定化酵素とは、ある一定の空間内に閉
じ込められた状態にある酵素のことであり、さらに、連
続的に酵素反応を行うことができ、反応後酵素を回収
し、再利用できる状態にある酵素のことである。従っ
て、何らかの手段よって水不溶性とした酵素は上記の固
定化酵素としての条件をいずれも満足するものである。

【０００３】反応効率の良い固定化酵素の条件として
は、単位体積または面積当たりの酵素活性が高いこと、
操作条件下での酵素の安定性が優れていること、反応器
内での操作性に優れていることなどが挙げられる。

【０００４】これらの条件を満たすため、従来から各種
固相への固定化法に工夫が凝らされてきた。固定化法に
は大きく分けて３種類あり、それぞれ、担体結合法、架
橋法、包括法と呼ばれている（「固定化酵素」千畑一郎
編、講談社、1975、pp6〜8）。最も一般的な方法は担体
結合法であり、その利点は、酵素と担体の結合が、特に
共有結合の場合には強固であり、酵素が担体から容易に
溶出しない点にある。この方法によって酵素を固定化す
る場合には、担体の選択に十分な注意が必要である。な
ぜなら、使用する担体によって酵素の結合量が大きく異
なり、酵素活性に影響を及ぼす場合が多いためである。
担体の選択においては、粒子である場合にはその大き
さ；表面積の広さ；親水性部位の量；化学組成；
などについて十分に検討する必要がある。

【０００５】従来から用いられている固定化酵素用担体
としては、無機系および有機系の担体がある。無機系の
担体としては、例えば、多孔性アルキルアミンガラス
（Corning Glass Works社）がある。有機系の担体のう
ち天然系の担体としては、天然多糖類誘導体であるセル
ロース、デキストラン（商品名：Sephadex）、アガロー
ス（商品名：Sepharose）などがあり；合成系の担体と
しては、ポリアクリルアミド（商品名：Bio-gel;Enzacr
yl;特開昭61-17469に開示の担体など）、スチレン系誘
導体（ポリアミノスチレン、またはアミノスチレンとメ
タクリル酸との共重合体）、無水マレイン酸系重合体
（エチレン、スチレンなどとの共重合体）、ナイロンチ
ューブ、ポリアクリロニトリル（特開昭63-22802）など
が報告もしくは市販されている（「固定化酵素」、前
出、pp11〜41）。

【０００６】これらの担体のうち最も汎用されているも
のは、多糖類系の担体であり、その理由はその優れた親
水性のためである。しかし、物理的強度が十分でなく、
耐圧性に乏しいので、高流速化、カラムの大容量化は困
難である（特開昭62-23437）。他方、合成高分子系の担
体は一般に親水性に劣り、試料中の生体関連物質（タン
パクなど）の非特異的吸着の起こる可能性がある。親水
性を付与しようとすると、必然的に物理的強度が低下す
る。さらに強度を付与するためには多孔性の度合を低く
することが必要となり、その結果表面積が減少する。

【０００７】固定化酵素に用いられる酵素は多数にのぼ
り、工業用あるいは臨床化学分析に実用化されている
（「医療機能材料」高分子学会編、1990,p341〜349）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題を解決するものであり、その目的とするところは、
担体結合型の固定化酵素であって、物理的強度に優れる
ため高流速、大容量の処理に耐え得る固定化酵素を提供
することにある。本発明の他の目的は、タンパクなどの
非特異的吸着のない担体上に固定化され、従って高効率
で酵素反応を行うことの可能な（つまり酵素活性の高
い）固定化酵素を提供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明の固定化酵素は、
疎水性架橋重合体粒子の表面部分に、親水性重合体の層
が形成された被覆重合体でなる担体に、酵素が直接にま
たはスペーサーを介して間接的に固定化されており、そ
のことにより上記目的が達成される。

【００１０】本発明の固定化酵素に用いられる担体は、
疎水性架橋重合体を骨格とし、親水性重合体で該疎水性
架橋重合体粒子の表面部分が被覆された、二層構造の重
合体である。該疎水性架橋重合体粒子の素材としては、
疎水性架橋性単量体を（共）重合されて得られる（共）
重合体、または疎水性架橋性単量体と疎水性非架橋性単
量体との共重合体が挙げられ。これらの（共）重合体
は、疎水性架橋性単量体の単独重合体、あるいは２種以
上の架橋性単量体よりなる共重合体である。さらに必要
に応じて、１種以上の疎水性非架橋性単量体を添加する
こともできる。

【００１１】上記担体に使用される疎水性架橋性単量体
としては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アク
リレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレ
ート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、
ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレートなど
のジ（メタ）アクリル酸エステル；テトラメチロールメ
タントリ（メタ）アクリレート、テトラメチロールメタ
ンテトラ（メタ）アクリレートなどの多価アルコールの
ポリ（メタ）アクリル酸エステル；ジビニルベンゼン、
ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルナフタ
レンなどの２個以上のビニル基を有する芳香族化合物な
どが挙げられる。必要に応じて加えられ得る疎水性非架
橋性単量体としては、例えば、メチル（メタ）アクリレ
ート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）
アクリレート、イソプロピル（メタ）アクリレート、ブ
チル（メタ）アクリレート、t-ブチル（メタ）アクリレ
ートなどの（メタ）アクリル酸エステル；酢酸ビニル、
プロピオン酸ビニル、酪酸ビニル、カプロン酸ビニルな
どのカルボン酸ビニル類；およびスチレン、メチルスチ
レンなどのスチレン系単量体が挙げられる。上記架橋性
および非架橋性単量体を混合して用いる場合には、架橋
性単量体が全単量体１００重量部に対して１重量部以
上、好ましくは１０重量部以上となるように使用され
る。この疎水性架橋重合体粒子の粒径は、通常、２〜１
０００μｍ、好ましくは、５〜５００μｍである。

【００１２】上記担体に使用される疎水性架橋重合体粒
子を被覆する親水性重合体は、酵素固定化のために用い
られ得る官能基を有する親水性単量体を、重合して得ら
れる。酵素の固定化（直接またはスペーサを介しての固
定化）に用いられ得る官能基としては、例えば、次の基
が挙げられる；-OH基、-COOH基、-NH₂基、グリシジル
基、-CN基、-CHO基。分子内に同一の官能基を２個以上
有する単量体、および／または異なる官能基を２種以上
有する単量体も使用可能である。-OH基を有する親水性
単量体としては、2-ヒドロキシメチル（メタ）アクリレ
ート、2-ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリ
セロールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリ
コールモノ（メタ）アクリレートなどが挙げられる。-C
OOH基を有する親水性単量体としては、（メタ）アクリ
ル酸、クロトン酸、マレイン酸、フタル酸、2-カルボキ
シエチル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。-NH₂
基を有する親水性単量体としては、（メタ）アクリルア
ミド、マレイン酸アミド、フマル酸アミド、アリルアミ
ンなどが挙げられる。グリシジル基を有する親水性単量
体としては、グリシジル（メタ）アクリレート、オキシ
ラニルメチル（メタ）アクリレート、オキシラニルノニ
ル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。-CN基を有
する親水性単量体としては、（メタ）アクリロニトリ
ル、シアノアクリレートなどが挙げられる。-CHO基を有
する単量体としては、（メタ）アクロレイン、クロトン
アルデヒドなどが挙げられる。

【００１３】上記親水性単量体は、必要に応じて２種以
上が混合して用いられ得る。親水性単量体の使用量は単
量体の種類によって異なるが、被覆すべき疎水性架橋重
合体粒子１００重量部に対して５〜５０重量部の割合で
ある。

【００１４】化学反応により上記官能基に変換し得る官
能基を有する単量体も使用可能である。これらの単量体
としては、メチル（メタ）アクリレート、プロピル（メ
タ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレートなどの
アルキル（メタ）アクリレート類；酢酸ビニル、プロピ
オン酸ビニル、酪酸ビニルなどのカルボン酸ビニル類な
どは加水分解により、-COOH基または-OH基に変換され得
る。ジアセトンアクリルアミドカルボニルなどカルボニ
ル基をもつ単量体は、このカルボニル基の還元により-O
H基に、あるいは末端にメトキシ基をもつ単量体はハロ
ホルム反応によって-COOH基に変換され得る。塩化アリ
ルは、含水エタノール中でアルカリ金属のシアン化物を
反応させることにより、末端に-CN基を持つシアン化ニ
トリルに変換され得る。

【００１５】これらの単量体を用いた場合は、上記の化
学反応はあくまで固定化用官能基に変換するためのみに
作用し、疎水性架橋重合体そのものを分解しない条件で
行う必要がある。例えば、アクリル酸メチルを疎水性架
橋重合体粒子の存在下で重合させて、該粒子の表面に重
合体の被覆層が形成された場合には、アルカリ性の条件
下で加水分解すれば形成されたアクリル酸メチル重合体
は容易にアクリル酸重合体に変換される。しかし、疎水
性架橋重合体中にエステル結合が存在する場合は、この
エステル結合までも開裂する恐れがあるため、疎水性架
橋重合体粒子の素材として、非加水分解性のスチレン、
ビニルベンゼンなどを選択することが好ましい。

【００１６】次に、本発明の固定化酵素に用いられる担
体を調製するための代表的な製造方法について説明す
る。但し、この担体の調製は、下記の方法に限定されな
い。

【００１７】本発明の固定化酵素用の担体を調製するに
は、最初に疎水性架橋重合体粒子が調製される。まず、
上記疎水性単量体（疎水性架橋性単量体、および必要に
応じて疎水性非架橋性単量体）と、重合開始剤とを希釈
剤に溶解させる。この場合に用いられる重合開始剤およ
び得られた疎水性架橋重合体粒子に含浸させる重合開始
剤（後述）は、ラジカルを発生する触媒であり、疎水性
であること以外は限定されない。例えば、ベンゾイルパ
ーオサイド、アセチルパーオキサイドなどの有機過酸化
物；アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソブチロ
アミドのようなアゾ化合物；などの既知のラジカル発生
触媒のいずれもが使用され得る。上記希釈剤は多孔形成
剤として添加するものであり、上記単量体を溶解させ、
かつその重合体を溶解させない有機溶媒のいずれもが使
用可能である。例えば、トルエン、キシレン、ジエチル
ベンゼン、ドデシルベンゼンのような芳香族炭化水素
類；ヘキサン、ヘプタン、オクタン、デカンのような飽
和炭化水素類；イソアミルアルコール、ヘキシルアルコ
ール、オクチルアルコールのようなアルコール類；が挙
げられる。その使用量は限定されないが、上記単量体混
合物１００重量部に対して１５〜２００重量部の割合で
あることが好ましい。

【００１８】上記単量体混合物（単量体、重合開始剤、
および希釈剤）を、ポリビニルアルコール、リン酸カル
シウムなどの懸濁安定剤を溶解した水相に添加し、窒素
置換後、攪拌しながら４０〜１００℃に加熱することに
より懸濁重合を行う。希釈剤を添加して重合を行った場
合は、得られた重合体粒子中には希釈剤である有機溶媒
が分散して存在するので、重合終了後に有機溶媒を除去
することにより多孔性の球状粒子が得られる。希釈剤と
して上記疎水性単量体混合物と相溶性の異なる種々の有
機溶媒を使用することにより、多孔性重合体の細孔の大
きさを任意に変化させることが可能である。次に、得ら
れた疎水性架橋重合体粒子に重合開始剤を含浸させる。
重合開始剤を含浸させるには、この重合開始剤を、低沸
点でかつ疎水性架橋重合体と親和性の良い溶媒に溶解さ
せ、これに上記の疎水性架橋重合体粒子浸漬する。この
ことにより重合開始剤が粒子中に浸透する。これを必要
に応じて重合開始剤の分解点以下の温度で加熱して溶媒
を除去することにより、その内部に重合開始剤を含有す
る疎水性架橋重合体粒子を得る。この重合開始剤含有粒
子を、上記親水性単量体を溶解させた水性分散媒中に分
散させ、あるいは、この粒子を分散させた水性分散媒中
に上記親水性単量体を添加し、溶解させて、窒素置換
後、攪拌しながら加熱して重合を行う。この重合によ
り、親水性単量体が疎水性架橋重合体粒子の表面で重合
して、粒子表面を被覆する。上記の水性分散媒には疎水
性架橋重合体の分散性を安定させるため、カルボキシメ
チルセルロース、ポリビニルアルコールなどの分散安定
剤を添加することもできる。重合の温度および時間は、
反応させる親水性単量体の種類と重合開始剤の種類によ
っても異なるが、４０〜１００℃で０．５〜４０時間程
度である。以上の方法により上記の二層構造の重合体粒
子が調製される。

【００１９】上記の重合開始剤を含浸させた架橋重合体
粒子を親水性単量体の重合反応に供する方法の他、疎水
性架橋重合体粒子の調製に引き続いて親水性単量体を反
応させる連続法によっても上記二層構造の重合体粒子が
調製され得る。この方法においては、まず上記疎水性架
橋重合体粒子を調製するための重合反応を開始させる。
重合がある程度進行し、かつ未反応の重合開始剤が残存
しているときに上記親水性単量体を反応系に加える。こ
のような状態においては、系内の有機相および生成した
疎水性架橋重合体粒子内部に重合剤が存在するため、引
き続いて親水性単量体の重合が起こり、しかもこの疎水
性架橋重合体粒子の表面部分を被覆する形で親水性重合
体の層が形成される。従ってこの連続法によっても、上
記と同様の重合体粒子が得られる。

【００２０】上記各々の反応においては、被覆層の平均
厚みが１０〜３００オングストロームとなるように、単
量体の量、反応条件などが調整されることが好ましい。
被覆層が３００オングストロームを越えると、被覆層部
の膨潤および収縮の度合が無視できないほど大きくな
る。そのため、例えば、得られた固定化酵素をカラムに
充填し、酵素反応を行うべき物質をこのカラムに流す
と、酵素反応の効率が低下したり、圧力が上昇すること
がある。さらに、この被覆層は疎水性架橋重合体の表面
を完全に被覆するように反応条件などをコントロールす
る必要がある。疎水性架橋重合体が露出している部分が
あると、その部分に非特異的な吸着がおこる可能性があ
る。

【００２１】上記の各々の方法で得られた重合体粒子を
熱水および有機溶媒で十分に洗浄し、粒子に含有されて
いるか、あるいは付着している懸濁安定剤、溶媒および
残存単量体などを除去する。さらに、必要に応じて粒子
を分級して固定化酵素用の担体を得る。

【００２２】このようにして得られた担体微粒子の粒
径、被覆層の厚み、均一性などについての観察および測
定は次のようにして行われる。試料とする担体粒子から
ミクロトームによって厚さ１０００オングストローム以
下の切片を作成する。この切片を、試料中の官能基に特
異的なラベル化剤または染色試薬を用いて処理し、透過
型電子顕微鏡で観察する。

【００２３】本発明の固定化酵素を得るためには、上記
担体の表面の官能基に、酵素を直接またはスペーサーを
介して固定化する。固定化され得る酵素としては、例え
ばプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、
アデニルデアミナーゼ、アミノアシラーゼ、ラクター
ゼ、インベルターゼ、グルコースオキシダーゼ、および
パーオキシダーゼが挙げられるが、これらに限定される
ことはなくほとんど全ての酵素が使用され得る。

【００２４】これらの酵素の担体への固定化法として
は、従来の公知の方法が用いられる。例えば、表面に-O
H基を有する担体に、酵素を固定化する場合には、CNBr
法がよく用いられている。この方法によれば、まず担体
をアルカリ性下でCNBrにより処理して、単量体に存在す
る官能基を活性化させ（イミドカルボネート；C=NHが生
成する）、得られた活性化担体に弱アルカリ性下で酵素
を作用させる。活性化部位と酵素のアミノ基が反応し、
C-N結合（一部C=N結合）により、該酵素が固定化され
る。他の方法には、-COOH基と-NH₂基の縮合試薬（カル
ボジイミド）を用いる方法、分子の両末端に担体および
酵素と反応可能な官能基を有するスペーサーを導入する
方法がある（「医療機能材料」前出、p344）。スペーサ
ーの例としては、分子両末端にアミノ基を有するエチレ
ンジアミン、ヘキシルジアミンなどのアルキルジアミン
類；分子の一方の末端にアミノ基、他方の末端にカルボ
キシル基を有するε-アミノカプロン酸などのアミノ脂
肪酸類；が挙げられる。

【００２５】

【作用】本発明の固定化酵素は、上記のように、疎水性
架橋重合体微粒子を核粒子とし、親水性重合体でこの粒
子の表面が被覆された二層構造の重合体粒子でなる担体
に、酵素が直接にあるいはスペーサーを介して間接的に
固定化されてなる。担体の核となる部分に架橋度の高い
重合体が用いられるため、機械強度が極めて大きい耐圧
性に優れた固定化酵素を得ることができる。この担体の
核部分には親水性基が存在しないので膨潤および収縮の
度合が極めて小さい。表面は親水性の重合体で被覆され
ているのでタンパク質などの非特異的吸着が起こること
なく目的とする酵素のみが結合した固定化酵素が得られ
る。上記担体用に適当な親水性単量体を選択することに
より、粒子表面に所望の官能基を付与することができる
ので、酵素またはスペーサの種類に応じて所望の固定化
酵素が得られる。このようにして得られた固定化酵素
は、従来よりも酵素活性が高い。さらに、物理的強度が
改善され、高流速、大容量の処理に耐え得える。

【００２６】

【実施例】以下に本発明を実施例につき説明する。

【００２７】以下の実施例および比較例において得られ
た担体の物性測定および性能評価方法は次の通りであ
る。

【００２８】（担体粒子の被覆層の厚さの測定方法）試
料とする担体粒子をエポキシ樹脂に包埋後、Reichert-J
ung社製ミクロトーム ULTRACUTE を用いて９００オング
ストロームの切片を作成する。得られた切片のうち、-C
OOH基を有する担体の切片は硝酸銀溶液（容量分析用、
和光純薬工業（株）製）を用いてラベル化をする。-NH₂
基および-OH基を有する担体切片はオスミウム酸溶液
（電子顕微鏡用、和光純薬工業（株）製）を用いて染色
し、日本電子（株）製透過型電子顕微鏡 JEM100S にて
観察および写真撮影して、親水性基の分布状態および被
覆層の厚さを測定する。

【００２９】（担体粒子の耐圧性および耐膨潤性の評
価）担体粒子を、内径６ｍｍおよび長さ７５ｍｍのステ
ンレス製カラムに充填し、耐圧性および水に対する膨潤
性を調べる。充填は精製水３０ｍｌに充填剤２ｇを取り
１０分間攪拌した後、２．０ｍｌ／分で定流量充填する
ことにより行う。耐圧性は、種々の流速でカラムに精製
水を通し、流速と圧力損失との関係を調べることにより
測定する。膨潤性は、イオン強度の異なる液を流したと
きのカラム圧の変化を調べることにより測定する。

【００３０】（固定化酵素の活性測定法）得られた固定
化酵素１ｇを取り、含有される酵素の活性を測定する。
グルコースオキシダーゼ１単位とは、グルコースを基質
として用いたとき、１分間に１０μｇのグルコースを酸
化する活性である。アミノアシラーゼ１単位とは、アセ
チル−ＤＬ−メチオニンを基質として用いたとき、３０
分間で１μｍｏｌのＬ−メチオニンを生成する活性であ
る。

【００３１】（固定化酵素からの酵素の溶出試験）得ら
れた固定化酵素１ｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５．
６）５０ｍＬに懸濁し、２０℃にて４２時間放置し、溶
液中に溶出された酵素活性を測定する。この測定値およ
びもとの固定化酵素の活性から、担体上に残留している
酵素の活性（活性回収率）を算出する。

【００３２】（固定化酵素の安定性試験）得られた固定
化酵素を、内径３ｍｍ、長さ２０ｍｍのステンレス製カ
ラムに充填する。充填は、緩衝液（ｐＨ６．０）１０ｍ
Ｌに固定化酵素０．１５ｇを分散させ、１０分間攪拌し
た後、２．０ｍＬ／分の定流量で行う。基質として１％
グルコース溶液（０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．
０）を、３７℃にて１０日間、０．１ｍＬ／分で連続的
に通液する。通液後の固定化酵素の活性を測定する。上
記溶出試験により得られた酵素活性を１００％とし、１
０日後の固定化酵素の活性（残存活性率）を算出する。

【００３３】（実施例１）トリエチレングリコールジメ
タクリレート（疎水性架橋性単量体）２５０ｇと、テト
ラメチロールメタンテトラアクリレート（疎水性架橋性
単量体）５０ｇと、ベンゾイルパーオキサド（重合開始
剤）１ｇとをトルエン（希釈剤）２００ｇに溶解させ
た。これを４％ポリビニルアルコール水溶液２．５Ｌに
添加して、攪拌しながら調粒した後、窒素置換下で８０
℃に加熱して懸濁重合を行った。８０℃で８時間重合し
た後、生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥
して微小の疎水性架橋重合体粒子を得た。この疎水性架
橋重合体粒子２００ｇを、ベンゾイルパーオキシド（重
合開始剤）０．５ｇが溶解しているアセトン１Ｌに浸漬
して、この重合開始剤を含浸させた。次に、アセトンを
２０℃において減圧下で留去した。１％ポリビニルアル
コール水溶液２．５Ｌに上記の含浸処理した疎水性架橋
重合体を分散させ、攪拌しながらオクチルエチレングリ
コールモノメタクリレート（親水性単量体）５０ｇを添
加し、窒素置換後、８０℃で５時間重合反応を行った。
生成物を熱水およびアセトンで順次洗浄し、乾燥した。
得られ微小のポリマー粒子を日鉄鉱業（株）製空気分級
機 ELBOW-JET LABO EJ-L-3 型により分級して、粒径が
８〜１２μｍの粒子を集めた。このようにして粒子表面
に-OH基を有する固定化酵素用担体を得た。

【００３４】前述の方法により上記担体の耐圧性および
膨潤性の評価を行った。耐圧性の評価においては、１２
０ｋｇ／ｃｍ²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤
性の評価においては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液
から２００ｍＭのリン酸緩衝液に変えたところ、カラム
圧力の上昇は認められなかった。乾燥状態と精製水に浸
漬した状態での粒径の差も認められなかった。被覆層の
厚さを前述の方法に従って測定したところ約５０オング
ストロームであった。

【００３５】得られた担体に、酵素としてグルコースオ
キシダーゼを次に示すCNBr法により固定化した（「アフ
ィニティクロマトグラフィー」山崎誠、石井信一、岩井
浩一共編、講談社、1967、pp19〜32参照）。まず、担体
を２Ｍ Na₂CO₃溶液に分散させ、これにCNBrのアセトニ
トリル溶液を添加して、２分間室温で攪拌した後、緩衝
液で速やかに洗浄した。次に、固定化すべきグルコース
オキシダーゼ（天野製薬（株）製）47500単位を添加
し、４℃で１５時間攪拌し反応させた。必要に応じて残
存官能基をエタノールアミンなどでブロックし、緩衝液
で十分に洗浄して固定化酵素を得た。上記の方法に従っ
て固定化酵素活性の測定、溶出試験（酵素の活性回収
率）、および固定化酵素の安定性の試験（残存活性率の
算出）を行った。その結果を表１に示す。

【００３６】（実施例２）スチレン（疎水性非架橋性単
量体）１５０ｇと、ジビニルベンゼン（疎水性架橋性単
量性；ｐ−体とｍ−体の混合品４５％およびエチルビニ
ルベンゼン５５％である製品）１５０ｇと、ベンゾイル
パーオキシド（重合開始剤）１ｇとをトルエン（希釈
剤）２００ｇに溶解させた。これを４％ポリビニルアル
コール水溶液２．５Ｌに添加して、攪拌しながら調粒し
た後、窒素置換下で８０℃に加熱して懸濁重合を行っ
た。８０℃で８時間重合した後、生成物を熱水およびア
セトンで順次洗浄し、乾燥して微小の疎水性架橋重合粒
子を得た。この疎水性架橋重合粒子２００ｇとオクタエ
チレングリコールモノメタクリレート（親水性単量体）
５０ｇとを用い、実施例１に準じて担体を調製して、そ
の評価を行った。

【００３７】耐圧性の評価においては、１００ｋｇ／ｃ
ｍ²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性の評価に
おいては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００
ｍＭのリン酸緩衝液に変えたとき、カラム圧力の上昇は
認められなかった。乾燥状態と精製水に浸漬した状態で
の粒径の差も認められなかった。オスミウム溶液で処理
して被覆層厚を測定したところ約１００オングストロー
ムであった。得られた担体に、実施例１に準じてグルコ
ースオキシダーゼを固定化し、得られた固定化酵素の評
価を行った。その結果を表１に示す。

【００３８】（実施例３）この実施例では、疎水性架橋
重合体粒子の調製に続いて親水性単量体を反応させる連
続法を採用した。

【００３９】テトラエチレングリコールジメタクリレー
ト（疎水性架橋性単量体）１５０ｇおよびテトラメチロ
ールメタントリアクリレート（疎水性架橋性単量体）１
５０ｇの混合液にベンゾイルパーオキサド（重合開始
剤）１ｇを溶解し、４％ポリビニルアルコール水溶液
２．５Ｌに添加して、攪拌しながら調粒後、窒素置換下
で８０℃に加熱して重合を行った。８０℃で２時間重合
した後、アクリル酸（親水性単量体）５０ｇを添加し、
さらに８０℃で２時間重合した。得られた生成物を熱水
およびアセトンで順次洗浄し、乾燥して分級した。得ら
れた微小のポリマー粒子を実施例１と同様の方法で評価
した。

【００４０】耐圧性の評価においては、３５０ｋｇ／ｃ
ｍ²以上まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性の評
価においては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２
００ｍＭのリン酸緩衝液に変えたところ、カラムの圧力
上昇は認められなかった。乾燥状態と精製水に浸漬した
状態での粒径の差も認められなかった。オスミウム酸溶
液で処理して被覆層厚を測定したところ、約８０オング
ストロームであった。

【００４１】得られた担体に、実施例１に準じてグルコ
ースオキシダーゼを固定化し、得られた固定化酵素の評
価を行った。その結果を表１に示す。

【００４２】（比較例１）スチレン（疎水性非架橋性単
量体）１００ｇと、ジビニルベンゼン（疎水性架橋性単
量体）２００ｇと、オクタエチレングリコールモノアク
リレートｔ（親水性単量体）１００ｇと、ベンゾイルパ
ーオキサイド（重合開始剤）１ｇとをトルエン（希釈
剤）２７０ｇに溶解し、４％ポリビニルアルコール水溶
液２．５Ｌに添加して攪拌しながら調粒した後、窒素置
換下８０℃で８時間重合反応を行った。重合終了後、生
成物を実施例１と同様の操作により、分級し、充填して
評価を行った。

【００４３】耐圧性の評価においては、５０ｋｇ／ｃｍ
²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性の評価にお
いては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００ｍ
Ｍのリン酸緩衝液に変えたところ、カラム圧力が２０ｋ
ｇ／ｃｍ²上昇した。

【００４４】乾燥状態から精製水に浸漬したところ、平
均粒径が９．３μｍから１２．８μｍに変化していた。
オスミウム酸溶液で処理して被覆厚の測定を試みたとこ
ろ、-OH基は担体粒子の内部にも一様に分布していた。

【００４５】得られた担体に、実施例１に準じてグルコ
ースオキシダーゼを固定化し、得られた固定化酵素の評
価を行った。その結果を表１に示す。表１の結果から、
本比較例の固定化酵素は実施例１〜３の固定化酵素に比
較して有意に活性が低いことがわかる。このことは、本
比較例の固定化酵素に使用した担体表面の親水性が比較
的低いため、目的とする酵素以外の生体物質の非特異的
吸着が起こることによると思われる。

【００４６】（比較例２）トリエチレングリコールジメ
タクリレート（疎水性架橋性単量体）２５０ｇと、テト
ラエチレングリコールトリアクリレート（疎水性架橋性
単量体）５０ｇとを用いて、実施例１に準じて疎水性架
橋重合体を調製した。さらに、オクタエチレングリコー
ルモノアクリレート（親水性単量体）３００ｇを用い
て、実施例１と同様に重合を試みたところ、反応中に凝
集が起こり軟質の微小のポリマー粒子が得られた。

【００４７】該ポリマー粒子を実施例１と同様に分級
し、充填を試みたところ、粒子が軟質のため充填液が流
れず充填できなかった。オスミウム酸溶液で処理後、担
体粒子の被覆層厚を測定すると、約４００オングストロ
ームであった。

【００４８】（比較例３）トリエチレングリコールジメ
タクリレート（疎水性架橋性単量体）２５０ｇと、テト
ラエチレングリコールトリアクリレート（疎水性架橋性
単量体）５０ｇとを用いて、実施例１に準じて疎水性架
橋重合体を調製した。さらに、アクリル酸（親水性単量
体）１０ｇを用いて、実施例１と同様にして担体を得
て、その評価を行った。耐圧性の評価においては、１５
０ｋｇ／ｃｍ²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤
性の評価においては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液
から２００ｍＭのリン酸緩衝液に変えたところ、カラム
圧の上昇は認められなかった。硝酸銀溶液で処理して被
覆層厚を測定すると、約８オングストロームであり、表
面の一部に被覆されていない箇所が観察された。

【００４９】得られた担体に、実施例１に準じてグルコ
ースオキシダーゼを固定化し、得られた固定化酵素の評
価を行った。その結果を表１に示す。表１の結果から、
本比較例の固定化酵素は実施例１〜３の固定化酵素に比
較して有意に活性が低いことがわかる。このことは、本
比較例の固定化酵素に使用した担体表面の親水性が比較
的低いため、目的とする酵素以外の生体物質の非特異的
吸着が起こることによると思われる。

【００５０】（実施例４）トリエチレングリコールジメ
タクリレート（疎水性架橋性単量体）２５０ｇと、テト
ラエチレングリコールトリアクリレート（疎水性架橋性
単量体）５０ｇとを用いて、実施例１に準じて疎水性架
橋重合体を調製した。さらに、アクリル酸（親水性単量
体）５０ｇを用いて、実施例１と同様に操作し、表面に
-COOH基を有する担体を得て、その評価を行った。

【００５１】耐圧性の評価においては、１５０ｋｇ／ｃ
ｍ²まで圧力損失と流速とが比例した。膨潤性の評価に
おいては、溶離液を４０ｍＭのリン酸緩衝液から２００
ｍＭのリン酸緩衝液に変えたところ、カラム圧の上昇は
認められなかった。硝酸銀溶液で処理して被覆層厚を測
定すると、約８０オングストロームであった。

【００５２】次に、スペーサーの導入を試みた。得られ
た担体を水溶性カルボジイミド（1-エチル-3-（3-ジメ
チルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩；和光純
薬製）を用いたカルボジイミド法により活性化した
（「タンパク質化学１」赤堀四郎、金子武夫、成田耕造
共編、共立出版、1979、pp524〜528）。担体約５ｇを
６ｍＭの水溶性カルボジイミド溶液４０ｍＬ中に分散
し、４℃で３０分攪拌した。得られた活性化担体にヘキ
サメチレンジアミン溶液（ｐＨ１０）を添加して４℃で
１２時間攪拌し、末端に-NH₂基を有するＣ₆炭素鎖が結
合した担体を得た。この担体を緩衝液で十分に洗浄し、
グルタールアルデヒドによりグルコースオキシダーゼを
固定化した。得られた固定化酵素の評価の結果を表１に
示す。

【００５３】（実施例５）実施例１で得られた担体に、
アミノアシラーゼ（天野製薬（株）製）を実施例１に準
じて固定化した。固定化酵素１ｇ当たりの活性は2087単
位、活性回収率は１３％であった。この固定化酵素の安
定性の試験をしたところ、２日後に、最初の活性の９０
％が保持されていた。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【発明の効果】本発明によれば、このように、耐圧性に
優れ、膨潤および収縮の度合が少なく、さらにタンパク
質の非特異的吸着がない担体を用いた固定化酵素が得ら
れる。このような固定化酵素は、例えば、カラム充填し
て酵素反応を行ったときに実質的に膨張・収縮すること
がないため、カラム圧が変化することなく安定して酵素
反応を行うことが可能である。さらに酵素活性が高いた
め効果的に酵素反応が行われる。このような固定化酵素
は、例えば、工業用、または臨床化学用の固定化酵素と
して、あるいはバイオリアクターとして広く利用され得
る。

Claims

【特許請求の範囲】【請求項１】疎水性架橋重合体粒子の表面部分に、親水
性重合体の層が形成された被覆重合体でなる担体に、酵
素が直接にまたはスペーサーを介して間接的に固定化さ
れた固定化酵素。