JPH0515439B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0515439B2 JPH0515439B2 JP59123757A JP12375784A JPH0515439B2 JP H0515439 B2 JPH0515439 B2 JP H0515439B2 JP 59123757 A JP59123757 A JP 59123757A JP 12375784 A JP12375784 A JP 12375784A JP H0515439 B2 JPH0515439 B2 JP H0515439B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- luminescent substance
- dna
- stranded
- measured
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の目的〕
（産業上の利用分野）
特定の構造を有するデオキシリボ核酸（DNA）
及びリボ核酸（RNA）の測定は生化学分野にお
いて重要であり、例えば人血清中のDNAを測定
することによつてウイルス感染の検査あるいは遺
伝性疾患の発見などを行なうことができる。本発
明はこのようなDNA及びRNAの特定のものを簡
便かつ正確に測定しうる方法を提供するものであ
る。
及びリボ核酸（RNA）の測定は生化学分野にお
いて重要であり、例えば人血清中のDNAを測定
することによつてウイルス感染の検査あるいは遺
伝性疾患の発見などを行なうことができる。本発
明はこのようなDNA及びRNAの特定のものを簡
便かつ正確に測定しうる方法を提供するものであ
る。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 従来、このDNA又はRNAの測定方法として
は、試料を変性処理して得た一本鎖DNA（Ｓ−
DNA）又は一本鎖RNA（Ｓ−RNA）を固相に結
合させ、この固相にラジオアイソトープを標識し
たＳ−DNA又はＳ−RNAを作用させて固相のＳ
−DNA又はＳ−RNAとハイブリツドを形成させ
てから未反応の標識Ｓ−DNA又はＳ−RNAを除
去し、固相の放射線を測定する方法が行なわれて
いた。この方法は測定の際に固定化、洗浄等数多
くの工程を必要とし、特に試料の固定化に長時間
を要するところから操作の労力及び時間の両方に
問題があつた。
点） 従来、このDNA又はRNAの測定方法として
は、試料を変性処理して得た一本鎖DNA（Ｓ−
DNA）又は一本鎖RNA（Ｓ−RNA）を固相に結
合させ、この固相にラジオアイソトープを標識し
たＳ−DNA又はＳ−RNAを作用させて固相のＳ
−DNA又はＳ−RNAとハイブリツドを形成させ
てから未反応の標識Ｓ−DNA又はＳ−RNAを除
去し、固相の放射線を測定する方法が行なわれて
いた。この方法は測定の際に固定化、洗浄等数多
くの工程を必要とし、特に試料の固定化に長時間
を要するところから操作の労力及び時間の両方に
問題があつた。
一方、最近DNAプローブを短かく切断してそ
の５′端及び３′端にエネルギートランスフアーす
る螢光物質を結合させ、ハイブリツドによりエネ
ルギートランスフアーを起こさせ、それによる螢
光を測定してポリヌクレオチドを測定する技術が
開発された（特開昭58−40099号公報）。しかしな
がら、この方法はDNAプローブを短かく切断す
るために特異性が低下し、また、螢光量が少ない
ために感度が充分でない等の問題があつた。
の５′端及び３′端にエネルギートランスフアーす
る螢光物質を結合させ、ハイブリツドによりエネ
ルギートランスフアーを起こさせ、それによる螢
光を測定してポリヌクレオチドを測定する技術が
開発された（特開昭58−40099号公報）。しかしな
がら、この方法はDNAプローブを短かく切断す
るために特異性が低下し、また、螢光量が少ない
ために感度が充分でない等の問題があつた。
本発明者らはこのような問題のない方法を開発
すべく種々検討の結果、予め標識された一本鎖ポ
リヌクレオチドを固相に結合させておき、この固
相に試料を変性処理させて得た一本鎖ポリヌクレ
オチドを作用させてハイブリツドを形成させ、ハ
イブリツドしたポリヌクレオチドを制限酵素で切
断する方法を案出し、その内容を既に特許出願
（特願昭58−199702号）した。しかしながら、こ
の方法もまだ固相の分離が必要であり、特に大量
の検体を一度に処理する臨床分析等にあつてはこ
の分離操作が煩雑であつた。
すべく種々検討の結果、予め標識された一本鎖ポ
リヌクレオチドを固相に結合させておき、この固
相に試料を変性処理させて得た一本鎖ポリヌクレ
オチドを作用させてハイブリツドを形成させ、ハ
イブリツドしたポリヌクレオチドを制限酵素で切
断する方法を案出し、その内容を既に特許出願
（特願昭58−199702号）した。しかしながら、こ
の方法もまだ固相の分離が必要であり、特に大量
の検体を一度に処理する臨床分析等にあつてはこ
の分離操作が煩雑であつた。
本発明はこのような問題点を解決するものであ
り、測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブ
リツドする一本鎖ポリヌクレオチドに２種の発光
物質を結合させ、その間のエネルギー移動がこの
ポリヌクレオチドの切断によつて変化することを
利用している。
り、測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブ
リツドする一本鎖ポリヌクレオチドに２種の発光
物質を結合させ、その間のエネルギー移動がこの
ポリヌクレオチドの切断によつて変化することを
利用している。
（問題点を解決するための手段）
本発明は、測定対象の一本鎖ポリヌクレオチド
と二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポ
リヌクレオチドに、発光物質１が直接又は間接的
に結合し、かつ発光物質１によつて励起されて発
光する発光物質２が結合している標識ポリヌクレ
オチドに；測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドを
接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；
該二本鎖ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオ
チド制限酵素を作用させて該二本鎖ポリヌクレオ
チドを切断し、その後発光物質１又は発光物質２
の発光を測定することを特徴とするポリヌクレオ
チドの測定方法に関するものである。
と二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポ
リヌクレオチドに、発光物質１が直接又は間接的
に結合し、かつ発光物質１によつて励起されて発
光する発光物質２が結合している標識ポリヌクレ
オチドに；測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドを
接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；
該二本鎖ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオ
チド制限酵素を作用させて該二本鎖ポリヌクレオ
チドを切断し、その後発光物質１又は発光物質２
の発光を測定することを特徴とするポリヌクレオ
チドの測定方法に関するものである。
測定対象は一本鎖ポリヌクレオチド（以下、測
定対象ポリヌクレオチドという。）である。測定
対象ポリヌクレオチドにはDNA及びRNAを含
む。試料中に含まれるポリヌクレオチドが二本鎖
である場合には水酸化ナトリウム溶液の添加など
のアルカリ処理あるいは熱処理などにより一本鎖
にしておく必要がある。試料の種類は問わない
が、例えば人血清、尿、組織抽出物などである。
人血清などのようにポリヌクレオチドが蛋白と結
合しているおそれがある場合には試料をプロテア
ーゼ等で処理して蛋白を分離しておくのがよい。
定対象ポリヌクレオチドという。）である。測定
対象ポリヌクレオチドにはDNA及びRNAを含
む。試料中に含まれるポリヌクレオチドが二本鎖
である場合には水酸化ナトリウム溶液の添加など
のアルカリ処理あるいは熱処理などにより一本鎖
にしておく必要がある。試料の種類は問わない
が、例えば人血清、尿、組織抽出物などである。
人血清などのようにポリヌクレオチドが蛋白と結
合しているおそれがある場合には試料をプロテア
ーゼ等で処理して蛋白を分離しておくのがよい。
この測定対象ポリヌクレオチドと接触させる一
本鎖ポリヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオ
チドという。）は、発光物質１が直接又は間接的
に結合し、かつ発光物質１によつて励起されて発
光する発光物質２が結合し、かつ該測定対象ポリ
ヌクレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成し
うるものである。従つて、この標識ポリヌクレオ
チドは測定対象ポリヌクレオチドに対するプロー
ブである。この標識ポリヌクレオチドは測定対象
ポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチド
をアルカリ処理、熱処理などで変性させて得ても
よく、あるいは測定対象ポリヌクレオチド、
DNase及びDNAポリメラーゼの存在下で各
種ヌクレオチドを次々と結合させて得てもよい。
本鎖ポリヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオ
チドという。）は、発光物質１が直接又は間接的
に結合し、かつ発光物質１によつて励起されて発
光する発光物質２が結合し、かつ該測定対象ポリ
ヌクレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成し
うるものである。従つて、この標識ポリヌクレオ
チドは測定対象ポリヌクレオチドに対するプロー
ブである。この標識ポリヌクレオチドは測定対象
ポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌクレオチド
をアルカリ処理、熱処理などで変性させて得ても
よく、あるいは測定対象ポリヌクレオチド、
DNase及びDNAポリメラーゼの存在下で各
種ヌクレオチドを次々と結合させて得てもよい。
発光物質１は外部からの光を吸収して発光する
螢光物質又はリン光物質であつてもよく、酸化反
応等の化学反応によつて発光する化学発光物質あ
るいは生物発光物質であつてもよい。
螢光物質又はリン光物質であつてもよく、酸化反
応等の化学反応によつて発光する化学発光物質あ
るいは生物発光物質であつてもよい。
発光物質２は発光物質１によつて励起されて発
光するものであり、従つて螢光物質又はリン光物
質である。
光するものであり、従つて螢光物質又はリン光物
質である。
発光物質１及び発光物質２に用いることができ
る螢光物質は通常320nm〜600nm程度の波長で励
起されて螢光を発するものである。このような螢
光物質の例として、フルオレツセイン、ローダミ
ン、ダンシルクロライド、フルオレスクアミン、
クマリン、アクリジン、NADPH，NADH、ベ
ンゾオキサジアゾール、トリアリールメタン、ピ
レン類、これらの誘導体あるいは活性化型のもの
などを挙げることができる。
る螢光物質は通常320nm〜600nm程度の波長で励
起されて螢光を発するものである。このような螢
光物質の例として、フルオレツセイン、ローダミ
ン、ダンシルクロライド、フルオレスクアミン、
クマリン、アクリジン、NADPH，NADH、ベ
ンゾオキサジアゾール、トリアリールメタン、ピ
レン類、これらの誘導体あるいは活性化型のもの
などを挙げることができる。
発光物質１に用いることができる化学発光物質
の例としては、ルミノール、イソルミノール、ア
クリジニウム、ヒドロペルオキシド、ポルフイリ
ン、イントレン−３−イルヒドロペルオキシド、
２，４，５−トリフエニルイミダゾール及びこれ
らの誘導体を挙げることができる。生物発光物質
の例としてはルシフエラーゼによつて発光するル
シフエリンを挙げることができる。
の例としては、ルミノール、イソルミノール、ア
クリジニウム、ヒドロペルオキシド、ポルフイリ
ン、イントレン−３−イルヒドロペルオキシド、
２，４，５−トリフエニルイミダゾール及びこれ
らの誘導体を挙げることができる。生物発光物質
の例としてはルシフエラーゼによつて発光するル
シフエリンを挙げることができる。
発光物質１に化学発光物質又は生物発光物質を
用いる場合には、標識物質にはこれらの発光物質
を直接又は間接的に発光させる物質を結合させる
こともできる。例えば、発光物質１にルシフエリ
ンを用いる場合にはルシフエラーゼ又はその基質
を結合させてこれらの作用によりルシフエリンを
発光させることができる。
用いる場合には、標識物質にはこれらの発光物質
を直接又は間接的に発光させる物質を結合させる
こともできる。例えば、発光物質１にルシフエリ
ンを用いる場合にはルシフエラーゼ又はその基質
を結合させてこれらの作用によりルシフエリンを
発光させることができる。
本発明の方法においては、発光物質１によつて
発光物質２が励起されるのであるから両者の組合
せはこのような関係が成立するものが選択されな
ければならない。このような組合せの例としてフ
ルオレツセインとローダミンを挙げることができ
る。フルオレツセインは430〜530nmの波長の光
により励起され500〜560nmの波長の螢光を発す
る。一方、ローダミンは530〜580nmの波長の光
により励起され560〜620nmの波長の螢光を発す
る。従つて、この両者の混合物に430〜530nmの
光を照射すると500〜560nmの螢光に加えて560〜
620nmの螢光も現われる。
発光物質２が励起されるのであるから両者の組合
せはこのような関係が成立するものが選択されな
ければならない。このような組合せの例としてフ
ルオレツセインとローダミンを挙げることができ
る。フルオレツセインは430〜530nmの波長の光
により励起され500〜560nmの波長の螢光を発す
る。一方、ローダミンは530〜580nmの波長の光
により励起され560〜620nmの波長の螢光を発す
る。従つて、この両者の混合物に430〜530nmの
光を照射すると500〜560nmの螢光に加えて560〜
620nmの螢光も現われる。
発光物質１を直接又はビオチン−アビゼンを介
して間接的に標識ポリヌクレオチドに結合させる
方法、及び発光物質２を標識ポリヌクレオチドに
結合させる方法は、公知の標識DNAの調製法に
よればよく、例えば、モノヌクレオチドに発光物
質を導入して修飾型ヌクレオチドとし、これに未
修飾のモノヌクレオチドを混合してニツクトラン
スレーシヨン法あるいはポリヌクレオチドの化学
的合成法等によつてポリヌクレオチドにすればよ
い。そのほか、ニツクトランスレーシヨン法や大
腸菌を用いるcDNA作製法等によりポリヌクレオ
チドを作製し、一方発光物質を活性化しておいて
その活性基をポリヌクレオチドと反応させてもよ
い。発光物質の結合方法としては、ポリヌクレオ
チドに直接結合させる方法のほか、ビオチン−ア
ビジンのビオチンをポリヌクレオチドに結合さ
せ、アビジンを発光物質に結合させてこのビオチ
ン−アビジンの反応を利用して結合させるような
間接的な方法をとつてもよい。
して間接的に標識ポリヌクレオチドに結合させる
方法、及び発光物質２を標識ポリヌクレオチドに
結合させる方法は、公知の標識DNAの調製法に
よればよく、例えば、モノヌクレオチドに発光物
質を導入して修飾型ヌクレオチドとし、これに未
修飾のモノヌクレオチドを混合してニツクトラン
スレーシヨン法あるいはポリヌクレオチドの化学
的合成法等によつてポリヌクレオチドにすればよ
い。そのほか、ニツクトランスレーシヨン法や大
腸菌を用いるcDNA作製法等によりポリヌクレオ
チドを作製し、一方発光物質を活性化しておいて
その活性基をポリヌクレオチドと反応させてもよ
い。発光物質の結合方法としては、ポリヌクレオ
チドに直接結合させる方法のほか、ビオチン−ア
ビジンのビオチンをポリヌクレオチドに結合さ
せ、アビジンを発光物質に結合させてこのビオチ
ン−アビジンの反応を利用して結合させるような
間接的な方法をとつてもよい。
本発明の方法においては、発光物質１から発光
物質２へエネルギートランスフアーを起こさせる
ところに特徴があり、このエネルギートランスフ
アーを効率よく起こさせるためにポリヌクレオチ
ドにおける発光物質１と発光物質２との間隔を50
Å以下、従つて24〜26塩基以内になるように両者
を結合させることが好ましい。
物質２へエネルギートランスフアーを起こさせる
ところに特徴があり、このエネルギートランスフ
アーを効率よく起こさせるためにポリヌクレオチ
ドにおける発光物質１と発光物質２との間隔を50
Å以下、従つて24〜26塩基以内になるように両者
を結合させることが好ましい。
このような標識ポリヌクレオチドを測定対象ポ
リヌクレオチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオ
チドを形成させる。接触時間は通常は測定対象ポ
リヌクレオチドが標識ポリヌクレオチドと充分に
反応してハイブリツドを形成しうる程度である
が、例えば0.5〜40時間程度が適当である。温度
は20〜70℃程度、PHは５〜９程度がよい。
リヌクレオチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオ
チドを形成させる。接触時間は通常は測定対象ポ
リヌクレオチドが標識ポリヌクレオチドと充分に
反応してハイブリツドを形成しうる程度である
が、例えば0.5〜40時間程度が適当である。温度
は20〜70℃程度、PHは５〜９程度がよい。
二本鎖ポリヌクレオチドを形成させたのちはこ
れに二本鎖ポリヌクレオチド制限酵素（以下、単
に制限酵素という。）を作用させる。この制限酵
素は二本鎖ポリヌクレオチドにのみ特異的に作用
するものがよく、また、認識ポリヌクレオチド鎖
のあまり長くないもののほうが好ましい。制限酵
素は１種のみでなく、２種以上を併用してもよ
い。制限酵素を作用させる時期は通常は測定対象
ポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドとの反
応終了後であるが、測定対象ポリヌクレオチドと
同時あるいはその前に反応系に添加しておいても
よい場合もある。
れに二本鎖ポリヌクレオチド制限酵素（以下、単
に制限酵素という。）を作用させる。この制限酵
素は二本鎖ポリヌクレオチドにのみ特異的に作用
するものがよく、また、認識ポリヌクレオチド鎖
のあまり長くないもののほうが好ましい。制限酵
素は１種のみでなく、２種以上を併用してもよ
い。制限酵素を作用させる時期は通常は測定対象
ポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドとの反
応終了後であるが、測定対象ポリヌクレオチドと
同時あるいはその前に反応系に添加しておいても
よい場合もある。
制限酵素を作用させたのちは発光物質１又は発
光物質２の発光を測定する。測定は通常の螢光光
度計を用いてその強度を測定すればよい。
光物質２の発光を測定する。測定は通常の螢光光
度計を用いてその強度を測定すればよい。
（作用）
標識ポリヌクレオチドは測定対象ポリヌクレオ
チドとハイブリツドを形成する。ハイブリツドを
形成することによつて制限酵素が働いてこの二本
鎖ポリヌクレオチドを切断する。その結果、標識
ポリヌクレオチドに結合されている発光物質１と
発光物質２が分断されて別個に溶液中を動きまわ
るようになり、エネルギートランスフアーが起こ
らなくなる。そこで、発光物質１の発光強度の減
少はなくなり、一方、発光物質２からの発光はな
くなる。
チドとハイブリツドを形成する。ハイブリツドを
形成することによつて制限酵素が働いてこの二本
鎖ポリヌクレオチドを切断する。その結果、標識
ポリヌクレオチドに結合されている発光物質１と
発光物質２が分断されて別個に溶液中を動きまわ
るようになり、エネルギートランスフアーが起こ
らなくなる。そこで、発光物質１の発光強度の減
少はなくなり、一方、発光物質２からの発光はな
くなる。
本発明の方法においては発光物質１から発光物
質２へのエネルギートランスフアーを利用してお
り、発光物質１の発光波長と発光物質２の発光波
長が異なるところから両者の発光を別々に定量で
きる。その結果、先願の方法と異なり固相と液相
の分離及びそれに付随する洗浄操作が不要にな
る。
質２へのエネルギートランスフアーを利用してお
り、発光物質１の発光波長と発光物質２の発光波
長が異なるところから両者の発光を別々に定量で
きる。その結果、先願の方法と異なり固相と液相
の分離及びそれに付随する洗浄操作が不要にな
る。
本発明の方法は従来の方法と異なり、測定対象
ポリヌクレオチドを固相に固定するという煩雑な
操作がなく、先願の方法に比しても固液分離操作
が不要な点でさらに簡便にされている。本発明の
方法に用いる試薬、器具類はキツト化が容易であ
り、このキツトを使用することによつてDNA等
のポリヌクレオチドを実用的かつ簡便に測定する
ことができる。
ポリヌクレオチドを固相に固定するという煩雑な
操作がなく、先願の方法に比しても固液分離操作
が不要な点でさらに簡便にされている。本発明の
方法に用いる試薬、器具類はキツト化が容易であ
り、このキツトを使用することによつてDNA等
のポリヌクレオチドを実用的かつ簡便に測定する
ことができる。
〔実施例〕
(1) HBV−DNAプローブの調製
500mlの慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を
9000rpmで15分間遠心し、得られた上清を４℃
100000×ｇで５時間超遠心してＢ型肝炎ウイルス
（HBV）をペレツトとして集めた。このペレツト
を0.1MNaCl、1mM EDTA、0.1％２−メルカプ
トエタノール及び0.1％BSAを含む0.01Mトリス
−塩酸緩衝液（PH7.5）10mlに溶かし、このウイ
ルス溶液のうち５mlを保存し、残５mlを100000×
ｇで再度５時間超遠心してペレツトを得た。
9000rpmで15分間遠心し、得られた上清を４℃
100000×ｇで５時間超遠心してＢ型肝炎ウイルス
（HBV）をペレツトとして集めた。このペレツト
を0.1MNaCl、1mM EDTA、0.1％２−メルカプ
トエタノール及び0.1％BSAを含む0.01Mトリス
−塩酸緩衝液（PH7.5）10mlに溶かし、このウイ
ルス溶液のうち５mlを保存し、残５mlを100000×
ｇで再度５時間超遠心してペレツトを得た。
このペレツトを0.5％NP−40を含む10mMトリ
ス−塩酸、0.1MNaClPH7.5溶液200μで処理し、
DNAポリメラーゼを活性化した。この溶液に
1mM dATP、1mM dTTP、2.5μM32PdGTP、
2.5μM32PdCTPを含む0.08M MgCl20.2Mトリス
緩衝液（PH7.5）50μを加えて３時間加温した。
この溶液を30％シユークロース溶液の入つた遠心
チユーブに重層し、SW65ローター（ベツクマン
社製）を用い50000rpmで３時間遠心してペレツ
トを得た。このペレツトをプロナーゼで処理し、
得られた溶液をフエノールで２回抽出処理した。
抽出液を５〜20％シユークロースグラジエントで
50000rpmにて３時間遠心して15S32PDNA分画を
集めこれをプールした。この分画から15S32
PDNAをエタノールを用いて沈澱させ、乾燥し
て目的のHBV−DNAを得た。
ス−塩酸、0.1MNaClPH7.5溶液200μで処理し、
DNAポリメラーゼを活性化した。この溶液に
1mM dATP、1mM dTTP、2.5μM32PdGTP、
2.5μM32PdCTPを含む0.08M MgCl20.2Mトリス
緩衝液（PH7.5）50μを加えて３時間加温した。
この溶液を30％シユークロース溶液の入つた遠心
チユーブに重層し、SW65ローター（ベツクマン
社製）を用い50000rpmで３時間遠心してペレツ
トを得た。このペレツトをプロナーゼで処理し、
得られた溶液をフエノールで２回抽出処理した。
抽出液を５〜20％シユークロースグラジエントで
50000rpmにて３時間遠心して15S32PDNA分画を
集めこれをプールした。この分画から15S32
PDNAをエタノールを用いて沈澱させ、乾燥し
て目的のHBV−DNAを得た。
(2) ニツクトランスレーシヨン法による修飾型
HBV−DNAの調製 次に、5mMMgCl2、10mM2−メルカプトエタ
ノール、5μMdTTP、5μMdGTP、5μMdCTP、
5μMdATP、10μMアミノヘキシルdATP及び
10μMアミノヘキシルdCTPを含む50mMトリス
−HCl緩衝液（PH7.5）100μに(1)で得たHBV−
DNA1μg、DNase100pg及びDNAポリメラー
ゼ100pgを加えて15℃で90分間インキユベート
した。この溶液をフエノールで抽出し、
SephadexG−50カラムで精製して修飾型HBV−
DNAを得た。
HBV−DNAの調製 次に、5mMMgCl2、10mM2−メルカプトエタ
ノール、5μMdTTP、5μMdGTP、5μMdCTP、
5μMdATP、10μMアミノヘキシルdATP及び
10μMアミノヘキシルdCTPを含む50mMトリス
−HCl緩衝液（PH7.5）100μに(1)で得たHBV−
DNA1μg、DNase100pg及びDNAポリメラー
ゼ100pgを加えて15℃で90分間インキユベート
した。この溶液をフエノールで抽出し、
SephadexG−50カラムで精製して修飾型HBV−
DNAを得た。
この二本鎖HBV−DNA1mg（１ml）とHBV−
DNAを導入した一本鎖M13−フアジDNA5mg
（２ml）にホルムアミド８mlを加え、５分間この
混合液を沸とうさせた。次に、これに２mlの緩衝
液（0.07モル／ｌ，トリス−HCl ２モル／ｌ
NaCl，1.5mM EDTAPH7.5）を加え、50℃で４
時間そしてさらに60℃で１時間加温した。
DNAを導入した一本鎖M13−フアジDNA5mg
（２ml）にホルムアミド８mlを加え、５分間この
混合液を沸とうさせた。次に、これに２mlの緩衝
液（0.07モル／ｌ，トリス−HCl ２モル／ｌ
NaCl，1.5mM EDTAPH7.5）を加え、50℃で４
時間そしてさらに60℃で１時間加温した。
この反応液をBio−GelA50mでゲル過し、ハ
イブリツドしたDNAと未反応のDNAを分離し
た。ボイド分画の近くに溶出される最初のピーク
を分画し、これにNaClが0.1Mになるように粉末
を加えて溶かした。そして、さらに100％エタノ
ールを溶液１mlに対し２倍の比率（２ml）で加
え、−70℃で２時間放置した。次に、17000×ｇで
10分間遠心し、エタノール沈殿物を50mlの
0.1NNaOH，0.25mM EDTA，0.001％フエノー
ルレツドで溶解した。ただちにこれをBio−
GelA50でゲル過し、目的の一本鎖HBV−
DNAを得た。
イブリツドしたDNAと未反応のDNAを分離し
た。ボイド分画の近くに溶出される最初のピーク
を分画し、これにNaClが0.1Mになるように粉末
を加えて溶かした。そして、さらに100％エタノ
ールを溶液１mlに対し２倍の比率（２ml）で加
え、−70℃で２時間放置した。次に、17000×ｇで
10分間遠心し、エタノール沈殿物を50mlの
0.1NNaOH，0.25mM EDTA，0.001％フエノー
ルレツドで溶解した。ただちにこれをBio−
GelA50でゲル過し、目的の一本鎖HBV−
DNAを得た。
(3) 発光物質の導入
ローダミンイソチオシアネート及びフレオレツ
セインイソチオシアネート各1.0μgを含むDMF溶
液100μにこの(2)で得た一本鎖HBV−
DNA100μgを含む２mlの0.1M炭酸緩衝液PH10.0
を混合し、４℃で18時間反応させた。これをセフ
アデツクスＧ−50でゲル過し、フルオレツセイ
ン及びローダミンを導入した一本鎖標識HBV−
DNA100μgを得た。
セインイソチオシアネート各1.0μgを含むDMF溶
液100μにこの(2)で得た一本鎖HBV−
DNA100μgを含む２mlの0.1M炭酸緩衝液PH10.0
を混合し、４℃で18時間反応させた。これをセフ
アデツクスＧ−50でゲル過し、フルオレツセイ
ン及びローダミンを導入した一本鎖標識HBV−
DNA100μgを得た。
(4) ヒト血清HBV−DNAの測定
HBウイルス性肝炎患者血清100μに
0.5NNaOH100μを加えて室温で10分間攪拌し
た。次に、0.5NHcl100μを加えさらに200μg／
mlのプロテイナーゼＫ溶液200μを加えて70℃
で１時間反応させた。(3)項で調製した発光物質フ
ルオレツセイン及びローダミンが結合した一本鎖
標識HBV−DNA10ngを含む溶液100μを加え
て37℃で一夜放置した。これにｄ−DNA制限酵
素溶液（Bgl，Ava，Hae，Hae，Hap
，Hinc各1U／ml、10mMトリス−Hcl、
7mMMgcl2、70mMNaCl、7mM2−メルカプト
エタノール、PH7.5）を1.0ml加えて37℃で１時間
反応させた。反応物に470nmの光を照射し、
600nmの螢光強度を測定した。
0.5NNaOH100μを加えて室温で10分間攪拌し
た。次に、0.5NHcl100μを加えさらに200μg／
mlのプロテイナーゼＫ溶液200μを加えて70℃
で１時間反応させた。(3)項で調製した発光物質フ
ルオレツセイン及びローダミンが結合した一本鎖
標識HBV−DNA10ngを含む溶液100μを加え
て37℃で一夜放置した。これにｄ−DNA制限酵
素溶液（Bgl，Ava，Hae，Hae，Hap
，Hinc各1U／ml、10mMトリス−Hcl、
7mMMgcl2、70mMNaCl、7mM2−メルカプト
エタノール、PH7.5）を1.0ml加えて37℃で１時間
反応させた。反応物に470nmの光を照射し、
600nmの螢光強度を測定した。
図面は得られた結果を示すものであり、縦軸は
相対螢光強度をそして横軸は血清の希釈度を表わ
している。
相対螢光強度をそして横軸は血清の希釈度を表わ
している。
次に本発明法及び従来のラジオアイソトープを
用いた方法で測定した各種ヒト血清のHBV−
DNA量を示す。 本発明法 従来法 Ａ 100pg 110pg Ｂ ND ND Ｃ 210〃 200〃 Ｄ 890〃 860〃 Ｅ 60〃 70〃
用いた方法で測定した各種ヒト血清のHBV−
DNA量を示す。 本発明法 従来法 Ａ 100pg 110pg Ｂ ND ND Ｃ 210〃 200〃 Ｄ 890〃 860〃 Ｅ 60〃 70〃
図面は本発明法で測定した発光物質２の相対螢
光強度と血清希釈率との関係の一例を示すもので
ある。
光強度と血清希釈率との関係の一例を示すもので
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドと二本鎖
ポリヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポリヌクレ
オチドに、発光物質１が直接又は間接的に結合
し、かつ発光物質１によつて励起されて発光する
発光物質２が結合している標識ポリヌクレオチド
に；測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドを接触さ
せて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；該二本
鎖ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチド制
限酵素を使用させて該二本鎖ポリヌクレオチドを
切断し；その後発光物質１又は発光物質２の発光
を測定することを特徴とするポリヌクレオチドの
測定方法。 ２ 発光物質２が蛍光物質である特許請求の範囲
第１項記載の測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59123757A JPS613063A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59123757A JPS613063A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS613063A JPS613063A (ja) | 1986-01-09 |
| JPH0515439B2 true JPH0515439B2 (ja) | 1993-03-01 |
Family
ID=14868543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59123757A Granted JPS613063A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS613063A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6379888B1 (en) | 1999-09-27 | 2002-04-30 | Becton, Dickinson And Company | Universal probes and methods for detection of nucleic acids |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US5846726A (en) * | 1997-05-13 | 1998-12-08 | Becton, Dickinson And Company | Detection of nucleic acids by fluorescence quenching |
| EP1439222A1 (en) * | 2001-10-26 | 2004-07-21 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of detecting target nucleic acid and nucleic acid probe |
-
1984
- 1984-06-18 JP JP59123757A patent/JPS613063A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6379888B1 (en) | 1999-09-27 | 2002-04-30 | Becton, Dickinson And Company | Universal probes and methods for detection of nucleic acids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS613063A (ja) | 1986-01-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0185547B1 (en) | Polynucleotide hybridization assays employing catalyzed luminescence | |
| JP5453132B2 (ja) | ハイスループット核酸分析のためのビーズ | |
| JPH0378120B2 (ja) | ||
| JPH11504517A (ja) | オリゴヌクレオチドの化学結合による核酸検出及び増幅 | |
| JPH02135100A (ja) | 特異的核酸配列の検出方法 | |
| JPH0811079B2 (ja) | 増幅ハイブリダイゼ−ション検定法 | |
| JPS60144662A (ja) | 核酸プローブ、ポリヌクレオチド配列およびその抗体を検出するための試験方法および試薬系 | |
| JP2939485B2 (ja) | 複製ｒｎａに基づく増幅／検出系 | |
| KR101964746B1 (ko) | dCas9 단백질 및 표적 핵산 서열에 결합하는 gRNA를 이용한 핵산 검출의 민감도 및 특이도 향상용 조성물 및 방법 | |
| JPH05508323A (ja) | 蛍光分極によるｄｎａ／ｒｎａの検出 | |
| IL95537A (en) | A process for replicating nucleic acids using at least two adapters | |
| JP2019519192A (ja) | ジカウイルス検出用組成物および方法 | |
| WO1999002544A1 (en) | Compounds having energy transfer function and method for dna base sequencing by using the same | |
| JPH0515439B2 (ja) | ||
| FR2771751A1 (fr) | Erythrovirus et ses applications | |
| JPH08506011A (ja) | ｃＤＮＡ合成のための方法及び組成物 | |
| KR20080070838A (ko) | 활성화된 분절폴리펩티드 및 이의 생산 방법 및 이의 용도 | |
| KR102366553B1 (ko) | CRISPR-Cas 시스템과 RT-LAMP용 프라이머 세트를 이용한 SARS-CoV-2의 검출 방법 | |
| KR20210113083A (ko) | SARS-CoV-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 SARS-CoV-2의 진단방법 | |
| JP2019502374A (ja) | 断片化核酸を連結するための方法及びキット | |
| JP3071797B2 (ja) | 複製ｒｎａベースの増幅／検出系 | |
| WO2006132022A1 (ja) | メチルシトシンの簡便検出法 | |
| US6228656B1 (en) | Method of cleaving specific nucleic acid sequence | |
| JPH0552199B2 (ja) | ||
| RU2822037C1 (ru) | Способ дифференциации генома вакцинного штамма "ВНИИЗЖ" от полевых изолятов вируса бешенства методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с анализом пиков температур плавления ампликонов и применением асимметричного красителя SYBR Green |