JPS613063A - 発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法 - Google Patents
発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法Info
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- JPS613063A JPS613063A JP59123757A JP12375784A JPS613063A JP S613063 A JPS613063 A JP S613063A JP 59123757 A JP59123757 A JP 59123757A JP 12375784 A JP12375784 A JP 12375784A JP S613063 A JPS613063 A JP S613063A
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- polynucleotide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
特定の構造を有するデオキシリ−核酸（ＤＮＡ）及びＩ
Ｊ ｇ核酸（ＲＮＡ）の測定は生化学分野において重要
であり、例えば人血清中のＤＮＡを測定することによっ
てウィルス感染の検査あるいは遺伝性疾患の発見などを
行なうことができる。本発明はこのようなりＮＡ及びＲ
ＮＡの特定のものを簡便かつ正確に測定しうる方法を提
供するものである。
Ｊ ｇ核酸（ＲＮＡ）の測定は生化学分野において重要
であり、例えば人血清中のＤＮＡを測定することによっ
てウィルス感染の検査あるいは遺伝性疾患の発見などを
行なうことができる。本発明はこのようなりＮＡ及びＲ
ＮＡの特定のものを簡便かつ正確に測定しうる方法を提
供するものである。
（従来の技術及び発明が解決しようとする問題点）
従来、このＤＮＡ又けＲＮＡの測定方法としては、試料
を変性処理して得た一本鎖ＤＮＡ （ Ｓ − ＤＮＡ
）又は一本鎖ＲＮＡ （ Ｓ − ＲＮＡ ）を一相
に結合させ、この固相にラノオアイソトーグを標識した
Ｓ−ＤＮＡ又はＳ − ＲＮＡを作用させて固相のＳ
− ＤＮＡ又はＳ − ＲＮＡとハイブリ，ドを形成さ
せてから未反応の標識Ｓ − ＤＮＡ又はＳ − ＲＮ
Ａを除去し、固相の放射線を測定する方法が行なわれて
いた。この方法は測定の際に固定化、洗浄等数多くの工
程を必要とし、特に試料の固定化に長時間を要するとこ
ろから操作の労力及び時間の両方に問題があった。
を変性処理して得た一本鎖ＤＮＡ （ Ｓ − ＤＮＡ
）又は一本鎖ＲＮＡ （ Ｓ − ＲＮＡ ）を一相
に結合させ、この固相にラノオアイソトーグを標識した
Ｓ−ＤＮＡ又はＳ − ＲＮＡを作用させて固相のＳ
− ＤＮＡ又はＳ − ＲＮＡとハイブリ，ドを形成さ
せてから未反応の標識Ｓ − ＤＮＡ又はＳ − ＲＮ
Ａを除去し、固相の放射線を測定する方法が行なわれて
いた。この方法は測定の際に固定化、洗浄等数多くの工
程を必要とし、特に試料の固定化に長時間を要するとこ
ろから操作の労力及び時間の両方に問題があった。
一方、最近ＤＮＡ ｆ ｏ−ブを短かぐ切断してそのツ
端及びＪ端にエネルギートランスファーする螢光物質を
結合させ、ノいｆブリ、ドによりエネルギートランスフ
ァーを起こさせ、それによる螢光を測定してポリヌクレ
オチドを測定する技術が開発された（特開昭５８−４０
０９９号公報）。しかしながら、この方法はＤＮＡ ｆ
Ｄ−ブを短かく切断するために特異性が低下し、壕だ
、螢光量が少ないために感度が充分でない等の問題があ
った。
端及びＪ端にエネルギートランスファーする螢光物質を
結合させ、ノいｆブリ、ドによりエネルギートランスフ
ァーを起こさせ、それによる螢光を測定してポリヌクレ
オチドを測定する技術が開発された（特開昭５８−４０
０９９号公報）。しかしながら、この方法はＤＮＡ ｆ
Ｄ−ブを短かく切断するために特異性が低下し、壕だ
、螢光量が少ないために感度が充分でない等の問題があ
った。
本発明者らはこのような問題のない方法を開発すべく種
々検討の結果、予め標識された一本鎖ノリヌクレオチド
を固相に結合させておき、との固相に試料を変性処理さ
せて得た＝−杢調ポリヌクレオチドを作用させてハイブ
リ、ドを形成させ、ハイブリッドしたポリヌクレオチド
を制限酵素で切断する方法を案出し、その内存を歳に特
許出願（％願昭５８−１９９７０２号）した。しかしな
がら、この方法もまだ同相の分離が必要であり、特に大
量の検体を一度に処理する臨床分析等にあってはこの分
離操作が煩雑であった。
々検討の結果、予め標識された一本鎖ノリヌクレオチド
を固相に結合させておき、との固相に試料を変性処理さ
せて得た＝−杢調ポリヌクレオチドを作用させてハイブ
リ、ドを形成させ、ハイブリッドしたポリヌクレオチド
を制限酵素で切断する方法を案出し、その内存を歳に特
許出願（％願昭５８−１９９７０２号）した。しかしな
がら、この方法もまだ同相の分離が必要であり、特に大
量の検体を一度に処理する臨床分析等にあってはこの分
離操作が煩雑であった。
本発明はこのような問題点を解決するものであり、測定
対象の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリ、ドする一本
鎖ポリヌクレオチドに２種の発光物質を結合させ、その
間のエネルギー移動がこのポリヌクレオチドの切断によ
って変化することを利用している。
対象の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブリ、ドする一本
鎖ポリヌクレオチドに２種の発光物質を結合させ、その
間のエネルギー移動がこのポリヌクレオチドの切断によ
って変化することを利用している。
（問題点を解決するだめの手段）
本発明は、測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、
発光物質１又は発光物質１を直接又は間接的に発光させ
る物質とこの発光物質１■■■によって励起されて発光
する発光物質２とが結合され、かつ該測定対象二本鎖ポ
リヌクレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうる
一本鎖ポリヌクレオチドと接触させて二本鎖ポリヌクレ
オチドを形成させ、該二本鎖ポリヌクレオチドに二本鎖
ポリヌクレオチド制限酵素を作用させてこの二本鎖ポリ
ヌクレオチドを切断し、その後発光物質１又は発光物質
２の発光を測定することを特徴とするｒ１９リヌクレオ
チドの測定方法に関するものである。
発光物質１又は発光物質１を直接又は間接的に発光させ
る物質とこの発光物質１■■■によって励起されて発光
する発光物質２とが結合され、かつ該測定対象二本鎖ポ
リヌクレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうる
一本鎖ポリヌクレオチドと接触させて二本鎖ポリヌクレ
オチドを形成させ、該二本鎖ポリヌクレオチドに二本鎖
ポリヌクレオチド制限酵素を作用させてこの二本鎖ポリ
ヌクレオチドを切断し、その後発光物質１又は発光物質
２の発光を測定することを特徴とするｒ１９リヌクレオ
チドの測定方法に関するものである。
測定対象は一本鎖ポリヌクレオチド（以下、測定対象ポ
リヌクレオチドという。）である。測定対象ポリヌクレ
オチドにはＤＮＡ及びＲＮＡを含む゛。
リヌクレオチドという。）である。測定対象ポリヌクレ
オチドにはＤＮＡ及びＲＮＡを含む゛。
試料中に含まれるポリヌクレオチドが二本鎖である場合
には水酸化ナトリウム溶液の添加などのアルカリ処理あ
るいは熱処理などにより一本鎖にしておく必要がある。
には水酸化ナトリウム溶液の添加などのアルカリ処理あ
るいは熱処理などにより一本鎖にしておく必要がある。
試料の種類は問わないが、例えば人血清、尿１組織抽出
物などである。人血清などのようにポリヌクレオチドが
蛋白と結合しているおそれかある場合には試料をグロテ
アーゼ等で処理して蛋白を分離しておくのがよい。
物などである。人血清などのようにポリヌクレオチドが
蛋白と結合しているおそれかある場合には試料をグロテ
アーゼ等で処理して蛋白を分離しておくのがよい。
この測定対象ポリヌクレオチドと接触させる一本鎖ポリ
ヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオチドという。）
は発光物質ｌ又は発光物質１を直接又は間接的に発光さ
せる物質とこの発光物′Ｘ１■Ｉ■によって励起されて
発光する発光葡〜２とが結合されかつ該測定対象ポリヌ
クレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうるもの
である。
ヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオチドという。）
は発光物質ｌ又は発光物質１を直接又は間接的に発光さ
せる物質とこの発光物′Ｘ１■Ｉ■によって励起されて
発光する発光葡〜２とが結合されかつ該測定対象ポリヌ
クレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうるもの
である。
従って、この標識ポリヌクレオチドは測定対象ポリヌク
レオチドに対するグローブである。この標識ポリヌクレ
オチドは測定対象ポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌ
クレオチドをアルカリ処理。
レオチドに対するグローブである。この標識ポリヌクレ
オチドは測定対象ポリヌクレオチドを含む二本鎖ポリヌ
クレオチドをアルカリ処理。
熱処理などで変性させて得てもよく、あるいは測定対象
ポリヌクレオチド、 ＤＮａｓｅ Ｉ及びＤＮＡポリメ
ラーゼ１の存在下で各種ヌクレオチドを次々と結合させ
て得てもよい。
ポリヌクレオチド、 ＤＮａｓｅ Ｉ及びＤＮＡポリメ
ラーゼ１の存在下で各種ヌクレオチドを次々と結合させ
て得てもよい。
発光物質１は外部からの光を吸収して発光する螢光物質
又はリン光物質であってもよく、酸化反応等の化学反応
によって発光する化学発光物質あるいは生物発光物質で
おってもよい。
又はリン光物質であってもよく、酸化反応等の化学反応
によって発光する化学発光物質あるいは生物発光物質で
おってもよい。
発光物質２は発光物質１■■ｌによって励起されて発光
するものであり、従って螢光物質又はリン光物質である
。
するものであり、従って螢光物質又はリン光物質である
。
発光物質１又は発光物質２に用いることができる螢光物
質は通常３２０ ｎｍ〜６００ｎｍ程度の波長で励起さ
れて螢光を発するものである。このような螢光物質の例
として、フルオレ、セイノ、ローダミン、グ／ジルクロ
ライド、フルオレスクアミン、クマリノ、アクリノン、
ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ベンゾオキサノアゾール、ト
リアリールメタン、ピレン類、これらの誘導体あるいは
活性化型のものなどを挙げることができる。
質は通常３２０ ｎｍ〜６００ｎｍ程度の波長で励起さ
れて螢光を発するものである。このような螢光物質の例
として、フルオレ、セイノ、ローダミン、グ／ジルクロ
ライド、フルオレスクアミン、クマリノ、アクリノン、
ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ベンゾオキサノアゾール、ト
リアリールメタン、ピレン類、これらの誘導体あるいは
活性化型のものなどを挙げることができる。
発光物質１に用いることができる化学発光物質の例とし
ては、ルミノール、イノルミノール、アクリノニウム、
ヒドロにルオキノド、ポルフィリン、イ／トレ／−３−
イルヒドロ″′Ｓ！ルオキシド、２．４．５１リフエニ
ルイミダゾール及びこれらの誘導体を挙げることができ
る。生物発光物質の例としてはルンフェラーゼによって
発光するルノフェリンを挙げることができる。
ては、ルミノール、イノルミノール、アクリノニウム、
ヒドロにルオキノド、ポルフィリン、イ／トレ／−３−
イルヒドロ″′Ｓ！ルオキシド、２．４．５１リフエニ
ルイミダゾール及びこれらの誘導体を挙げることができ
る。生物発光物質の例としてはルンフェラーゼによって
発光するルノフェリンを挙げることができる。
発光物質１に化学発光物質又は生物発光物質を用いる場
合には、標識物質にはこれらの発光物質を直接又は間接
的に発光させる物質を結合させることもできる。例えば
、発光物質■にルンフェリンを用いる場合にはルンフェ
ラーゼ又はその基質全結合させてこれらの作用によりル
ン７エリ／を発光させることができる。
合には、標識物質にはこれらの発光物質を直接又は間接
的に発光させる物質を結合させることもできる。例えば
、発光物質■にルンフェリンを用いる場合にはルンフェ
ラーゼ又はその基質全結合させてこれらの作用によりル
ン７エリ／を発光させることができる。
本発明の方法においては、発光物質】■■−によって発
光物質２が励起されるのであるから両者の組合せはこの
ような関係が成立するものが選択されなければならない
。このような組合せの例としてフルオレ、セイ／とロー
ダミンを挙げることができる。フルオレ、ナインは４３
０〜５３０ ｎｍの波長の光により励起され５００〜５
６０ ｎｍの波長の螢光を発する。一方、ローダミンは
５３０〜５８０ ｎｍの波長の光により励起され５６０
〜６２０ｎ＋’ｎの波長の螢光を発する。従って、この
両者の混合物に４３０〜５３０ ｎｍの光を照射すると
５００〜５６０ｎｍの螢光に加えて５６０〜６２００ｍ
の螢光も現われる。
光物質２が励起されるのであるから両者の組合せはこの
ような関係が成立するものが選択されなければならない
。このような組合せの例としてフルオレ、セイ／とロー
ダミンを挙げることができる。フルオレ、ナインは４３
０〜５３０ ｎｍの波長の光により励起され５００〜５
６０ ｎｍの波長の螢光を発する。一方、ローダミンは
５３０〜５８０ ｎｍの波長の光により励起され５６０
〜６２０ｎ＋’ｎの波長の螢光を発する。従って、この
両者の混合物に４３０〜５３０ ｎｍの光を照射すると
５００〜５６０ｎｍの螢光に加えて５６０〜６２００ｍ
の螢光も現われる。
発光物質１又はこれを直接又は間接的に発光婆せる物質
と発光物ｗ２とを標識ポリヌクレオチドとなる一重鎖ポ
リヌクレオチドに結合させる方法は公知の方法によれば
よく、例えば、モノヌクレオチドに発光物質を導入して
修飾型ヌクレオチド。
と発光物ｗ２とを標識ポリヌクレオチドとなる一重鎖ポ
リヌクレオチドに結合させる方法は公知の方法によれば
よく、例えば、モノヌクレオチドに発光物質を導入して
修飾型ヌクレオチド。
とし、これに未修飾のモノヌクレオチドを混合してニッ
クトラ／スレー／カン法あるいはポリヌクレオチドの化
学的合成法等によってポリヌクレオチドにすればよい。
クトラ／スレー／カン法あるいはポリヌクレオチドの化
学的合成法等によってポリヌクレオチドにすればよい。
そのほか、二、クトラ／スレーンヨン法や太陽菌を用い
るＣＤＮＡ作製法等によりポリヌクレオチドを作製し、
一方発光物質を活性化しておいてその活性基をポリヌク
レオチドと反応させてもよい。発光物質の結合方法とし
ては、ポリヌクレオチドに直接結合させる方法のほか、
ビオチ／又はアビツノを一方をポリヌクレオチドに結合
させもう一方を発光物質に結合させてこのビオチン−ア
ビノンの反応を利用して結合させるような間接的な方式
をとってもよい。
るＣＤＮＡ作製法等によりポリヌクレオチドを作製し、
一方発光物質を活性化しておいてその活性基をポリヌク
レオチドと反応させてもよい。発光物質の結合方法とし
ては、ポリヌクレオチドに直接結合させる方法のほか、
ビオチ／又はアビツノを一方をポリヌクレオチドに結合
させもう一方を発光物質に結合させてこのビオチン−ア
ビノンの反応を利用して結合させるような間接的な方式
をとってもよい。
本発明の方法においては、発光物質１がら発光物質２へ
エネルギートランスファーを起こさせるところに特徴が
あり、このエネルギートランスファーを効率よく起こさ
せるためにポリヌクレオチドにおける発光物質１と発光
物質２との間隔をｓ ＯＸ以下、従って２４〜２６塩基
以内になるように両者を結合させることが好ましい。
エネルギートランスファーを起こさせるところに特徴が
あり、このエネルギートランスファーを効率よく起こさ
せるためにポリヌクレオチドにおける発光物質１と発光
物質２との間隔をｓ ＯＸ以下、従って２４〜２６塩基
以内になるように両者を結合させることが好ましい。
このような標識ポリヌクレオチドを測定対象ポリヌクレ
オチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ
る。接触時間は通常は測定対象ポリヌクレオチドが［２
ポリヌクレオチドと充分に反応して・・イブリッドを形
成しうる程度であるが、例えば０５〜４０時間程度が適
当である。温度は２０〜７０℃程度、ＰＨは５〜９程度
がよい。
オチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ
る。接触時間は通常は測定対象ポリヌクレオチドが［２
ポリヌクレオチドと充分に反応して・・イブリッドを形
成しうる程度であるが、例えば０５〜４０時間程度が適
当である。温度は２０〜７０℃程度、ＰＨは５〜９程度
がよい。
二本鎖＋？ポリヌクレオチド形成させたのちはこれに二
本鎖、ｔ？ ｌ）ヌクレオチド制限酵素（以下、単に制
限酵素という。）を作用させる。この制限酵素ハ二木調
ポリヌクレオチドにのみ特異的に作用するものがよく、
まだ、認識ポリヌクレオチド鎖のあまり長くないものの
ほうが好ましい。制限酵素は１種のみでなく、２種以上
を併用してもよい。
本鎖、ｔ？ ｌ）ヌクレオチド制限酵素（以下、単に制
限酵素という。）を作用させる。この制限酵素ハ二木調
ポリヌクレオチドにのみ特異的に作用するものがよく、
まだ、認識ポリヌクレオチド鎖のあまり長くないものの
ほうが好ましい。制限酵素は１種のみでなく、２種以上
を併用してもよい。
制限酵素を作用させる時期は通常は測定対象ポリヌクレ
オチドと標識ポリヌクレオチドとの反応終了後であるが
、」す定対象ポリヌクレオチドと同時あるいはその前に
反応系に添加しておいてもよい場合もちる。
オチドと標識ポリヌクレオチドとの反応終了後であるが
、」す定対象ポリヌクレオチドと同時あるいはその前に
反応系に添加しておいてもよい場合もちる。
制限啼素を作用させたのちは発光物質】又は発光物質２
０発光を測定する。測定は通常の螢光光度計を用いてそ
の強度を測定すればよい。
０発光を測定する。測定は通常の螢光光度計を用いてそ
の強度を測定すればよい。
（作用）
標Ｒポリヌクレオチドは測定対象ポリヌクレオチドとハ
イブリッドを形成する。ハイブリッドを形成することに
よって制限酵素が働いてこの二本鎖ポリヌクレオチドを
切断する。その結果、標識ポリヌクレオチドに結合され
ている発光物質１と発光物質２が分断されて別個に溶液
中を動き壕わるようになり、エネルギートランスファー
が起こらなくなる。そこで、発光物質１の発光強度の減
少はなくなり、一方、゛発光物質２からの発光はなくな
る。
イブリッドを形成する。ハイブリッドを形成することに
よって制限酵素が働いてこの二本鎖ポリヌクレオチドを
切断する。その結果、標識ポリヌクレオチドに結合され
ている発光物質１と発光物質２が分断されて別個に溶液
中を動き壕わるようになり、エネルギートランスファー
が起こらなくなる。そこで、発光物質１の発光強度の減
少はなくなり、一方、゛発光物質２からの発光はなくな
る。
本発明の方法においては発光物質１から発光物質２への
エネルギートランスファーを利用しており、発光物質ｌ
の発光波長と発光物質２の発光波長が異なるところから
両者の発光を別々に定量できる。その結果、先願の方法
と異なり固相と液相の分離及びそれに付随する洗浄操作
が不要になる。
エネルギートランスファーを利用しており、発光物質ｌ
の発光波長と発光物質２の発光波長が異なるところから
両者の発光を別々に定量できる。その結果、先願の方法
と異なり固相と液相の分離及びそれに付随する洗浄操作
が不要になる。
本発明の方法は従来の方法と異なり、測定対象ポリヌク
レオチドを固相に固定するという煩雑な操作がなく、先
願の方法に比しても固液分離操作が不要な点でさらに簡
便にされている。本発明の方法に用いる試薬、器具類は
キット化が容易であり、とのキットを使用することによ
ってＤＮＡ等のポリヌクレオチド°を実用的かつ簡便に
測定することができる。
レオチドを固相に固定するという煩雑な操作がなく、先
願の方法に比しても固液分離操作が不要な点でさらに簡
便にされている。本発明の方法に用いる試薬、器具類は
キット化が容易であり、とのキットを使用することによ
ってＤＮＡ等のポリヌクレオチド°を実用的かつ簡便に
測定することができる。
（１） ＨＢＶ −ＤＮＡ ｆロープの調製５００ｍ１
！の慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を９００Ｏｒｐｍで
１５分間遠心し、得られた上清を４℃１００ＯＯＯＸ
＆で５時間超遠心しテＨＢＶ粒子を４し、トとして集め
た。この被レットをＯ，］ＭＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ 、 ０．１ ％２−メルカグトエタノール及び０１
チＢＳＡを含む０．０，１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５） ］、 Ｏｔｔｒｌに溶かし、このウィルス溶
液のうち５ ｍｌ ｆ保存し、残５ ｒｐｒｌを］ ０
００００ Ｘ ｇで再度５時間超遠心して被レットを得
だ。
！の慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を９００Ｏｒｐｍで
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＆で５時間超遠心しテＨＢＶ粒子を４し、トとして集め
た。この被レットをＯ，］ＭＮａＣ１、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ 、 ０．１ ％２−メルカグトエタノール及び０１
チＢＳＡを含む０．０，１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７，５） ］、 Ｏｔｔｒｌに溶かし、このウィルス溶
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００００ Ｘ ｇで再度５時間超遠心して被レットを得
だ。
この被レットを０５％ＮＰ−４０を含むｌ ＯｍＭ ）
リス−塩酸、０．１ Ｍ ＮａＣ４ｐ８７．５溶液２０
０ μｔで処理し、ＤＮＡｙｆｆｌＪメラーゼを活性化
した。この溶液Ｋ １ ｍＭ ｄＡＴＰ 、 ］、
ｍＭ ｄＴＴＰ 、 ２．５ ａＭ ３２ＰｄＧＴＰ
、２、５ ａＭ ＰｄＣＴＰを含む０．０８ Ｍ Ｍ
ｇＣｌ２０．２ Ｍ ）リス緩衝液（ＰＨ７，５） ｓ
ｏμｔを加、えて３時間加温した。この溶液を３０チ
ンニークロース溶液の入った遠心チューブに重層し、５
Ｗ６５０−ター（べ。
リス−塩酸、０．１ Ｍ ＮａＣ４ｐ８７．５溶液２０
０ μｔで処理し、ＤＮＡｙｆｆｌＪメラーゼを活性化
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ｍＭ ｄＴＴＰ 、 ２．５ ａＭ ３２ＰｄＧＴＰ
、２、５ ａＭ ＰｄＣＴＰを含む０．０８ Ｍ Ｍ
ｇＣｌ２０．２ Ｍ ）リス緩衝液（ＰＨ７，５） ｓ
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Ｗ６５０−ター（べ。
クマ７社製）を用い５００００ｒｐｍで３時間遠心して
４し、トを得た。このぜし、トをグロナーゼで処理し、
得られた溶液をフェノールで２回抽出処理した。抽出液
を５〜２０％／ユークロースグラノエントで５００００
ｒｐｍＫて３時間遠心して１５３ ＰＤＮＡ分画を集
めこれをプールした。この分画から］ ５ Ｓ ”ＰＤ
ＮＡをエタノールを用いて沈澱させ、乾燥して目的のＨ
ＢＶ −ＤＮＡを得た。
４し、トを得た。このぜし、トをグロナーゼで処理し、
得られた溶液をフェノールで２回抽出処理した。抽出液
を５〜２０％／ユークロースグラノエントで５００００
ｒｐｍＫて３時間遠心して１５３ ＰＤＮＡ分画を集
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ＮＡをエタノールを用いて沈澱させ、乾燥して目的のＨ
ＢＶ −ＤＮＡを得た。
（２） 二、クトランスレー／ヨン法による修飾型ＨＢ
Ｖ −ＤＮＡの調製 次に、５ ｍＭＭｇｃｔ２．１０ ｍＭ２−１ルカ７”
ト：ｒ−タ／−ル、５ μＭｄＴＴＰ、 ５ μＭｄ
ＧＴＰ１５ ｔｔＭｄｃＴＰ。
Ｖ −ＤＮＡの調製 次に、５ ｍＭＭｇｃｔ２．１０ ｍＭ２−１ルカ７”
ト：ｒ−タ／−ル、５ μＭｄＴＴＰ、 ５ μＭｄ
ＧＴＰ１５ ｔｔＭｄｃＴＰ。
５ μＭｄＡＴＰ、 １０１１Ｍ７ミノヘキシルｄＡ
ＴＰ及び】０ＭＭアミノヘキソルｄＣＴＰ （５含む５
０ｍＭトリス−ＨＣ４緩衝液（ｐＨ７，５） ｌ ＯＯ
μｔにャｄ ５ ＨＢＶ−ＤＮＡ１ μＬ ＤＮａｓｅ
Ｉ １００ ｐｉｔ及びＤＮＡポリメラーゼ１１００
ｐｇを加えて１５℃で９０分間インキュベートした。
ＴＰ及び】０ＭＭアミノヘキソルｄＣＴＰ （５含む５
０ｍＭトリス−ＨＣ４緩衝液（ｐＨ７，５） ｌ ＯＯ
μｔにャｄ ５ ＨＢＶ−ＤＮＡ１ μＬ ＤＮａｓｅ
Ｉ １００ ｐｉｔ及びＤＮＡポリメラーゼ１１００
ｐｇを加えて１５℃で９０分間インキュベートした。
この溶液をやはりフェノールで抽出し、５ｅｐｈａｄｅ
ｘ Ｇ −５０カラムで精製して修飾型ＨＢＶ −ＤＮ
Ａを得た。
ｘ Ｇ −５０カラムで精製して修飾型ＨＢＶ −ＤＮ
Ａを得た。
この二本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡ １ ｍ９（’ １ ｍｌ
）とＨＢＶ−ＤＮＡを導した一木調Ｍ１３−ファノＤＮ
Ａ ５ ｍｔｉ （２” ） Ｋホルムアミド１３ ａ
ｔ ｆ加え、５分間この混合液を沸とうさせた。次に、
これに２ ｒｔｒｌの緩衝液（０，０７モル／ｌ、トリ
スーＨＣ４２モル／ ｌ ＮａＣ２，ｌ ５ｍＭ
ＥＤＴＡ ｐＨ７，５） ’に加え、５０℃で４時間そ
してさらに６０℃で１時間加温した。
）とＨＢＶ−ＤＮＡを導した一木調Ｍ１３−ファノＤＮ
Ａ ５ ｍｔｉ （２” ） Ｋホルムアミド１３ ａ
ｔ ｆ加え、５分間この混合液を沸とうさせた。次に、
これに２ ｒｔｒｌの緩衝液（０，０７モル／ｌ、トリ
スーＨＣ４２モル／ ｌ ＮａＣ２，ｌ ５ｍＭ
ＥＤＴＡ ｐＨ７，５） ’に加え、５０℃で４時間そ
してさらに６０℃で１時間加温した。
この反応液ｆ Ｂｌｏ−Ｇｅ１ Ａ ５０ ｍでダルｐ
過し、ハイブリ、ドしたＤＮＡと未反応のＤＮＡ ｉ分
離した。
過し、ハイブリ、ドしたＤＮＡと未反応のＤＮＡ ｉ分
離した。
ボイド分画の近くに溶出される最初のピークを分画し、
これにＮａＣ４がＯ，１Ｍになるように粉末を加えて溶
かした。そして、さらに１００％エタノールを溶液１ｍ
εに対し２倍の比率（２＋＋ｌ）で加え、−７０℃で２
時間放置した。次に、］、７０００Ｘ、９で１０分間遠
心し、エタノール沈殿物ｆ ５ Ｑ ｍｌの０． ｌ
Ｎ ＮａＯＨ、０，２５ｍＭ ＥＤＴＡ、、 ０．００
１ ％フェノールレッドで溶解した。ただちにこれをＢ
ｌｏ−Ｃｅ１Ａ５０でグル濾過し、目的の一木調ＨＢＶ
−ＤＮＡを得た。
これにＮａＣ４がＯ，１Ｍになるように粉末を加えて溶
かした。そして、さらに１００％エタノールを溶液１ｍ
εに対し２倍の比率（２＋＋ｌ）で加え、−７０℃で２
時間放置した。次に、］、７０００Ｘ、９で１０分間遠
心し、エタノール沈殿物ｆ ５ Ｑ ｍｌの０． ｌ
Ｎ ＮａＯＨ、０，２５ｍＭ ＥＤＴＡ、、 ０．００
１ ％フェノールレッドで溶解した。ただちにこれをＢ
ｌｏ−Ｃｅ１Ａ５０でグル濾過し、目的の一木調ＨＢＶ
−ＤＮＡを得た。
（３） 発光物質の導入
ローダミンイソチオ／アネート及びフレオレッセインイ
ソチオ／アネート各１．０μ９Ｆｔ含むＤＭＦ溶液１０
０μｔにこのＤＮＡ １・００μｇを含む２ｍεの０．
１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ１０，０を混合し、４℃で１８時間
反応させた。これをセフアゾ、リスＧ−５０でゲル濾過
し、フルオレッセイン及びローダミンを導入シたＨＢＶ
−ＤＮＡ １００ μｇ’を得た。
ソチオ／アネート各１．０μ９Ｆｔ含むＤＭＦ溶液１０
０μｔにこのＤＮＡ １・００μｇを含む２ｍεの０．
１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ１０，０を混合し、４℃で１８時間
反応させた。これをセフアゾ、リスＧ−５０でゲル濾過
し、フルオレッセイン及びローダミンを導入シたＨＢＶ
−ＤＮＡ １００ μｇ’を得た。
（４） ヒト血清ＨＢＶ−ＤＮＡＯ測足ＨＢウィルス
性肝炎患者血清１００μ／！、ＫＯ，５ＮＨａＯＨ１０
０μｔを加えて室温で１０分間攪拌した。
性肝炎患者血清１００μ／！、ＫＯ，５ＮＨａＯＨ１０
０μｔを加えて室温で１０分間攪拌した。
次に、０．５ Ｎ ＨＣｌ １００μｔを加えさらに２
００μｙｄのグロテイナーゼに溶液２００ ／１ｔを加
えて７０℃で１時間反応させた。（３）項で調製した発
光物質結合ＨＢＶ−ＤＮＡ Ｉ Ｏｎｇを含む溶液１０
０μｔを加えて３７℃で一夜放置した。これにｄ −Ｄ
ＮＡ制限酵素溶液（Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ａｖａ ｎ ＋
Ｈａｅ Ｉｆ ＋ Ｈａｅ ｌｉｔ ＋ Ｈａｐ ｎ
＋Ｔ（ｉｎｃ［各Ｉ ＵＡＩ、 １０ ｍＭ ｈリス
−ＨＣｌ、７ｍＭＭｇＣ１２，７０ｍＭＮａｃｔ、 ７
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７，５）を１
．０ ｍｌ加えて３７℃で１時間反応させた。反応物に
’Ｉ−７０ｎｍの光を照射し、６００ ｎｍの螢光強度
を測定した。
００μｙｄのグロテイナーゼに溶液２００ ／１ｔを加
えて７０℃で１時間反応させた。（３）項で調製した発
光物質結合ＨＢＶ−ＤＮＡ Ｉ Ｏｎｇを含む溶液１０
０μｔを加えて３７℃で一夜放置した。これにｄ −Ｄ
ＮＡ制限酵素溶液（Ｂｇｌ ＩＩ 、 Ａｖａ ｎ ＋
Ｈａｅ Ｉｆ ＋ Ｈａｅ ｌｉｔ ＋ Ｈａｐ ｎ
＋Ｔ（ｉｎｃ［各Ｉ ＵＡＩ、 １０ ｍＭ ｈリス
−ＨＣｌ、７ｍＭＭｇＣ１２，７０ｍＭＮａｃｔ、 ７
ｍＭ ２−メルカプトエタノール、ｐＨ７，５）を１
．０ ｍｌ加えて３７℃で１時間反応させた。反応物に
’Ｉ−７０ｎｍの光を照射し、６００ ｎｍの螢光強度
を測定した。
図面は得られた結果を示すものであり、縦軸は相対螢光
強度をそして横軸は血清の希釈度を表わしている。
強度をそして横軸は血清の希釈度を表わしている。
次に本発明法及び従来のラノオアイントーグを用いた方
法で測定した各種ヒト血清のＨＢＶ −ＤＮＡ量を示す
。
法で測定した各種ヒト血清のＨＢＶ −ＤＮＡ量を示す
。
本発明法 従来法
Ａ ］ｏｏｐｙ ’１１０ｐ、？Ｂ
ＮＤ ＮＤＣ２１０１／
２００／／ Ｄ ８９０ ／／ ８６０ ｔｔＥ
６０／／’ ７０〃
ＮＤ ＮＤＣ２１０１／
２００／／ Ｄ ８９０ ／／ ８６０ ｔｔＥ
６０／／’ ７０〃
図面は本発明法で測定した発光物質２の相対螢光強度と
血清希釈率との関係の一例を示すものである。
血清希釈率との関係の一例を示すものである。
Claims (2)
- （１）測定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、発光
物質１又は発光物質１を直接又は間接的に発光させる物
質とこの発光物質１によって励起されて発光する発光物
質２とが結合されかつ該測定対象一本鎖ポリヌクレオチ
ドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポリヌ
クレオチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオチドを形成
させ、該二本鎖ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオ
チド制限酸素を作用させてこの二本鎖ポリヌクレオチド
を切断し、その後発光物質１又は発光物質２の発光を測
定することを特徴とするポリヌクレオチドの測定方法 - （２）発光物質２が螢光物質である特許請求の範囲第１
項記載の測定方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59123757A JPS613063A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59123757A JPS613063A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS613063A true JPS613063A (ja) | 1986-01-09 |
| JPH0515439B2 JPH0515439B2 (ja) | 1993-03-01 |
Family
ID=14868543
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59123757A Granted JPS613063A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 発光物質を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS613063A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996015270A1 (en) * | 1994-11-16 | 1996-05-23 | Perkin-Elmer Corporation | Self-quenching fluorescence probe and method |
| EP0878554A3 (en) * | 1997-05-13 | 2001-11-28 | Becton, Dickinson and Company | Detection of nucleic acids by fluorescence quenching |
| WO2003035864A1 (en) * | 2001-10-26 | 2003-05-01 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of detecting target nucleic acid and nucleic acid probe |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6379888B1 (en) | 1999-09-27 | 2002-04-30 | Becton, Dickinson And Company | Universal probes and methods for detection of nucleic acids |
-
1984
- 1984-06-18 JP JP59123757A patent/JPS613063A/ja active Granted
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996015270A1 (en) * | 1994-11-16 | 1996-05-23 | Perkin-Elmer Corporation | Self-quenching fluorescence probe and method |
| EP0972848A3 (en) * | 1994-11-16 | 2000-10-04 | Perkin-Elmer Corporation | Self-quenching fluorescence probe and method |
| EP0878554A3 (en) * | 1997-05-13 | 2001-11-28 | Becton, Dickinson and Company | Detection of nucleic acids by fluorescence quenching |
| WO2003035864A1 (en) * | 2001-10-26 | 2003-05-01 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method of detecting target nucleic acid and nucleic acid probe |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0515439B2 (ja) | 1993-03-01 |
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