JPH0811079B2

JPH0811079B2 - 増幅ハイブリダイゼ−ション検定法

Info

Publication number: JPH0811079B2
Application number: JP62500382A
Authority: JP
Inventors: ジェイシュナイダー，ロバート; イーシェンク，トーマス
Original assignee: プリンストンユニヴア−シテイ
Priority date: 1985-12-13
Filing date: 1986-12-12
Publication date: 1996-02-07
Anticipated expiration: 2011-02-07
Also published as: AU599628B2; CA1291696C; EP0248896A4; FI873495A0; DE3689954T2; AU6837287A; DE3689954D1; US5424188A; FI873495A7; ATE108208T1; NO873259D0; DK420387A; EP0248896B1; NO873259L; WO1987003622A1; EP0248896A1; JPS63501984A; FI873495L; US4882269A; DK420387D0

Description

【発明の詳細な説明】本出願は、ここに全体に渡り参考文献として組み込ま
れている1985年12月13日出願の同時係属出願第808,695
号の一部継続出願である。

1.序本発明は、検定法において使用されるリポーターグル
ープにより生ずる信号（シグナル）を著しく増幅する検
出システムを用いるハイブリダイゼーション検定法に関
する。興味ある標的配列にハイブリットを形成する第１
プローブについて記載する。増幅信号は、第２信号発生
プローブ族を第１プローブ上の多数部位に結合させるこ
とにより得られる。

ここに記載のハイブリダイゼーションおよび検出法
は、キットとして使用でき、かつ研究所および臨床実験
室または食物、農業および家畜病治療の科学における核
酸配列の検出用に十分自動化できる。それはヒトおよび
家畜病治療医薬における病原性微生物（細菌、ウイル
ス、菌状腫、酵母、原性動物）の検出および癌性細胞と
染色体における遺伝的欠陥検出用の強力な診断用装置で
ある。

2.発明の背景技術核酸ハイブリダイゼーション検定法は、病原性微生
物、癌性細胞および染色体上の遺伝的欠陥により生ずる
医学的および家畜病の病気診断において強力な手段とな
り得る方法である。しかしながら、多くの問題が、診断
上の適用を非現実的とする現在の技術とともに存在す
る。この検定法は、極めて鋭敏であり、再現性があり、
技術的触診がほとんど必要なく、それゆえキットおよび
自動化に好適であるものでなければならない。

2.1ハイブリダイゼーション検定法特異核酸配列（DNAまたはRNA）検出用の最も一般的な
方法は、放射性プローブおよびオートラジオグラフィー
のハイブリダイゼーション法により達成される。伝統的
に、放射性プローブは、ニックトランスレーション［リ
グバイ等、1977年ジャーナルオブモレキュラーバ
イオロジー 113巻、237〜251頁（Rigby et al.,1977,
J.Mol.Biol.113,237-251）］そして最近にはSP6トラン
スクリプション（転写）［メルトン等、1984年、ニュク
レイックアシッズリサーチ 12巻、1735〜7056頁
（Melton et al.,1984,Nucl.Acids Reg.12,1735-705
6）］により作製されてきた。これらの方法では、低濃
度のDNAまたはRNA配列の検出を可能にする高特異活性放
射性プローブ類が生ずる。しかしながら、これらの方法
にはいくつかの不利益がある。第一に、プローブ類の生
産には半減期の短い放射性同位体を使用して新鮮なプロ
ーブ類を連続生産することが必要である。第二に、標識
化工程には、高価であり、かつ極めて慎重に検定しなけ
ればならない反応条件を必要とする酵素の使用を要す
る。第三に、放射性同位体は、私達に対して生物学的に
毒性である。事実、それらの使用には正式な免許が必要
であり、それらの処理は、増々高価で困難かつ危険にな
っている。

放射性プローブ類の生産に前述の工程を使用してプロ
ーブ内に合成されるビオチン化ヌクレオチド類似体を使
用する非放射性ハイブリダイゼーションプローブが開
発された［ランガー等、1981年；プロシーディングス
オブザナショナルアカデミーオブサイエンシ
スオブジユナイテッドステーツオブアメリ
カ 78巻、6633〜6637頁（Langer et al.,1981;Proc.N
atl.Acad.S ci.USA 78,6633-6637）］。標的配列へのプ
ローブ類のハイブリダイゼーションは、ビオチンとアビ
ジン−接合酵素類、蛍光性化合物または免疫検出システ
ムでリンクした酵素との相互作用により検出される。放
射能を使用することはないけれども、いくつかの問題が
ビオチン−アビジン技術と結びついている。問題の一つ
は感度である。主としてビオチンプローブ類は放射能プ
ローブ類と同程度の感度ではない。遭遇した他の問題
は、ヌクレオチド類の変化が標的へのプローブのハイブ
リダイゼーションを干渉することである。

各種の信号発生系を使用するハイブリダイゼーション
検定法が開発された。例えば、検定法をより免疫遺伝的
にする核酸の化学修飾を利用する非放射性ハイブリダイ
ゼーション検定法システムが開発された［ハルツベルク
（Herzberg）EP O 128 018 A2］。信号は、変性核酸を
認識する抗体を含むリポーターグループにより発生させ
られる。標的遺伝子に相補助的な核酸配列を有する線状
ファージM13ssDNAに架橋した放射性標識化またはビオチ
ン化エシェリキア・コリ（Escherichia coli）一本鎖D
NA結合蛋白質（SSB）がハイブリダイゼーション検定法
システムにおいてプローブとして最近使用された［サイ
ナベン等、1985年、ニュクレイックアシッズ、リサー
チ 13巻 2789-2802頁（Synaven et al.,1985,Nucl.Ac
ids Res.13,2789-2802）］。他のハイブリダイゼーショ
ンシステムにおいて、プローブのアデニンとシトシン
核酸塩基は化学修飾によりリポーターグループに結合さ
せられる（ランデス（Landes）,EPO 138 357A2と米国特
許第4,626,501号］。

ここまでの記載のようにハイブリダイゼーション検定
法では、標識プローブ類の各々が異なる標的配列にハイ
ブリダイズする該プローブ類を調製することが必要であ
る。調製すべてき標識、プローブ類数を減少するため
に、標的核酸と一般的な信号発生ポリヌクレオチド間に
“架橋”ポリヌクレオチドを利用するハイブリダイゼー
ション法が開発された。架橋ポリヌクレオチドは、標的
遺伝子に相補的な核酸配列を含む一本鎖線状バクテリオ
ファージからなる。一般的な信号発生ポリヌクレオチド
は、架橋ポリヌクレオチドに相補的な一本鎖ファージDN
Aのセグメント（一部）である［パーゴリッチィ等（Per
golizzi et al.,）EP O 128 332 A1;チスウエル（Chisw
ell）,EPO 153 873 A2］。

ハイブリダイゼーション法に関連する他の問題は、ハ
イブリダイゼーション反応において非ハイブリダイズプ
ローブ類があると擬似性結果を導くために、ハイブリダ
イゼーション反応から標的配列にハイブリダイズしない
標識プローブ類の除去を伴うことである。非ハイブリダ
イズプローブ類の分離要求を回避するクレームのハイブ
リダイゼーション検定法が記述された［アルバレラ等
（Albarella et al）EPO 144 914 A2］。この系は、結
合した時に信号を発する二種成分のコーハイブリダイゼ
ーション（cohybridization）を必要とする。固体支持
体への核酸の共有付着のため、光化学反応性挿入剤を利
用する他のハイブリダイゼーション検定法が記述された
［ダッタグプタとクローサーズ（Dattagupta and Croth
ers）EPO 130 523 A2］。固定化標的核酸はハイブリダ
イゼーションが可能である。他の固定化ハイブリダイゼ
ーション検定システムは、最初にハイブリダイズし、そ
してプローブと標的配列間に共有結合することを伴う。
［ヤブサキ等（Yabusaki et al.）WO 85/02628］。２つ
の際立った一本鎖ヌクレオチドプローブ類を必要とする
固定化サンドイッチハイブリダイゼーション技術も同様
に報告された［ダン等1977年セル12巻 23-36頁（Dunn
et al.,1977,Cell 12;23-36;ランキ（Ranki）等米国特
許第4,563,419号）］。

2.2核酸への修飾核酸の修飾が多くの理由で行なわれた。これらは、ポ
リヌクレオチド類の組成および／または構造の研究に加
えて核酸分子へ試薬と基質をカップリングする方法の開
発と同様に本発明にとって秘密の動機づけを含む。下記
変性は二つのカテゴリーにグループ分けされる：（１）核酸を有する蛋白質の会合および（２）核酸の化学修飾。

2.2.1核酸に結合する蛋白質核酸（RNAおよびDNA）への結合可能な蛋白質は次のも
のを含む。（ａ）ssDNA結合蛋白質（例えば、エシェリ
キア・コリSSB,バクテリオファージT4遺伝子32蛋白質、
fdファージSSB）（ｂ）dsDNA結合蛋白質（例えば、ヒス
トン、ポリメラーゼ）、（ｃ）ssDNA結合蛋白質（例え
ば、mRNP蛋白質）、（ｄ）dsRNA結合蛋白質（例えば、
真核的翻訳開始因子）。

エシェリキア・コリSSBは、特に各種の理由から興味
がある。SSBは、リン酸塩バックボーンとの相互作用に
より明らかに、塩基組成物と独立のssDNAと結合する
［リュエッシェンとヴェットミュラ、1975年バイオケミ
ストリー14巻5529〜5534頁（Ruyechen and Wetmur,197
5,Biochem.14;5529-5534）］。SSB遺伝子は、クローン
化し［サンカーとラップ1979年ビービーアールシー90巻
123〜129頁（Sancar and Rupp,1979,BBRC 90,123-12
9）］、蛋白質の大量精製を可能とする。SSBは、互いに
ssDNAと結合し、そして蛋白質の連続鎖を形成する。蛋
白質は、特に安定であり、そして変性に耐える能力に基
づいて大量に精製する計画が展開された［シュナイダー
とヴエトミュラ、1982年バイオケミストリー21巻 608
〜615頁（Schneider and Wetmur,1982,Biochemistry 2
1,608〜615）］。SSBに複合したssDNA分子がヌクリアー
ゼによる減成に免疫的であることも同様に示された。

2.2.2核酸の化学修飾多くの方法は、核酸を有する蛋白質分子の共有会合に
対して記載されており、そして十分に知られている。こ
れらは、グルタルアルデヒド、フォルムアルデヒド、グ
リオキサール、カルボジイミド、紫外線による架橋およ
び酸化／還元系（これらに限定されない）を含む。

核酸へのサッカリドの付着は、多くの研究グループに
より記述されている。その技術には、核酸及びサッカリ
ドの化学活性化が必要である。同様に、核酸分子はジア
ゾカップリング反応によりセルロース紙への共有結合用
に修飾された［アルビン等、1979年、メソーズイン
エンザイモロジー、68巻、220〜242頁（Alwine et a
l.,1979,Methods Enz.68,220〜242）］。同様に、この
技術は糖とビオチン部を核酸に付着するためにも使用さ
れた。

アルキル化剤は、核酸分子を誘導するために使用され
た。一例としてクロロアセトアルデヒドがある。クロロ
アセトアルデヒドとアデニンおよびシトシンのヌクレオ
シド類との反応は1971年以来公知である［コチェトコー
ブ等1971年テトラヘドロンレターズ 1993〜1996頁
（Kochetkou et al.,1971,Tetrahedron Lett.,1993-199
6）］。クロロアセトアルデヒドは、ほぼ定量的に若干
酸性条件（pH3.5〜4.5）でアデニンとシトシンと反応し
て高蛍光1,N⁶−エテノアデノシン（エテノーＡ）誘導体
と蛍光の少ない3,N⁴−エテノシチジン（エテノーＣ）誘
導体を生じる［バリオ等、1972年ビービーアールシー46
巻、597〜604頁（Barrio et al.,1972,BBRC 46,597-60
4）］。ウリジン、チミジン、グアノシンまたはイノシ
ンとは反応しない。一本鎖ポリリボヌクレオチドおよび
ポリデオキシリボヌクレオチドを有するエタノ誘導体の
形成は、いかなる検出可能な鎖切断を生じない。蛍光励
起は、エテノーＡで410nmそしてエテノーＣで347nmにお
いて対応する蛍光放出最高で、300nmにおいて最高に達
成される。クロロアセトアルデヒドは、RNA分子中の入
手しやすい（すなわち、非塩基対）ヌクレオチドの修飾
に使用された［バリオ等、1972年ビービーアールシー46
巻、597〜604頁（Barrio et al.,1972,BBRC 46,597-60
4）］。標識核酸用の他のアルキル化法は、標識試薬の
アルキル化部分を部分的二本鎖核酸に挿入することを含
む［シェルドン（Sheldon）米国特許第4,617,261
号）］。

3.発明の要約本発明は、興味のある標的配列へのハイブリダイゼー
ションにおいて著しく増幅された信号を生ずるハイブリ
ダイゼーション検定法に関する。従って、第１プロー
ブ、すなわち興味ある標的DNAにハイブリッド形成する
小セグメントが与えられる。第１プローブの異なるセグ
メントにハイブリッド形成する信号発生第２プローブ族
は、ハイブリダイゼーションという事件により生じた信
号を著しく増幅する。検定成分の立体配置に基づいて、
ハイブリダイゼーションは移動種間または固定および移
動種との結合間で生ずる。本発明は、ハイブリダイゼー
ション検定法、プローブ、信号発生および使用方法に関
する。

ハイブリダイゼーション検定法において、一次ハイブ
リダイゼーション事件の検出は、一般に第２事件より増
幅されなかった。これらのシステムにおいて、増幅強度
は、リポーターグループの一次プローブへの結合により
決定され、そして標的比への信号が厳しく制限される。
本発明は、第１プローブに関する多くの第２プローブハ
イブリダイゼーション事件リポーターグループを第２プ
ローブに付着または第２プローブを修飾してリポーター
グループを形成し、そしてこれらの信号を検出すること
により標的比への信号を著しく増幅する検定法について
開示する。

3.1定義複数または単一で使用される次の用語は、次の記載の
意味を有する：「第１プローブ」は、興味のある標的配列に相補性で
あり、標的配列に結合せず、かつ他の物質に結合可能な
「尾」に付着したポリヌクレオチド配列からなる。第１
プローブの「尾」は、一本鎖および二本鎖ポリヌクレオ
チド、およびセルロース、ナイロン、レーヨン等の天然
または合成ポリマーを含むが、これらに限定されること
のない多くのポリマーのいずれかからなる。一次プロー
ブは、線状または環状分子からなってもよい。

「第２プローブ」は、信号発生プローブの各々が「信
号発生成分」に付着した第１プローブの尾に結合可能な
セグメントを含む信号発生プローブ族からなる。第２プ
ローブの組成は、第１プローブの尾の組成に依存する。
例えば、第１プローブの尾が一本鎖ポリヌクレオチドで
あると、第２プローブは、ポリヌクレオチドの各々が第
１プローブの尾のセグメントにハイブリダイズする一本
鎖蛋白質を含むポリヌクレオチド族からなることができ
る。他の組成物がここで定義される。第２プローブの信
号発生成分は、リポーターグループの付着または第２プ
ローブの修飾により第２プローブを与えるのでプローブ
自身が検出可能な信号を発生する。第２プローブは、線
状または環状分子からなるであろう。

「リポーターグループ」は、検出可能な信号をそれ自
体で発生し、または他の化合物との相互作用の後に検出
可能な信号を発生する他種類の化合物のいずれかと定義
される。これらは、それ自体で検出可能な信号を発生し
得る第２プローブを含む。

「第１プローブカセット」は、（ａ）いずれの標的ヌ
クレオチド配列をも挿入し得る多クローン部位および
（ｂ）第２プローブ族がハイブリダイズし得る付加的ヌ
クレオチド配列を含むヌクレオチドベクターからなる。
事実、ポリヌクレオチド第１プローブは、第１プローブ
カセットを使用して標的配列を多クローン部位に挿入ク
ローン化し、そして生ずる組換えヌクレオチドベクター
の一本鎖形態を精製することにより構成されるであろ
う。

図面の簡単な説明図面は目盛どおりに画かれていない。

第１図は、標的核酸配列検出用の本発明のハイブリダ
イゼーション検定法の機構を説明する図である。「Ｔ」
は標的核酸配列を示す。「Ｒ」は、直接または間接的に
第２プローブに付着した多種類のリポーターグループの
いずれかを示す。第１および第２ハイブリダイゼーショ
ンプローブが示される。パネルＡは、第１および第２プ
ローブの両者が直鎖分子である際に形成されるハイブリ
ダイゼーション複合体を示す；これは「クリスマスツリ
ー」構造を形成する。パネルＢは、第１プローブが線状
であり、第２プローブが環状である検定法から生じるハ
イブリダイゼーション複合体の一変形を示す。パネルＣ
は、第１および第２プローブが環状である際に形成され
るハイブリダイゼーション複合体を示す。パネルＤは、
第１プローブが環状であり第２プローブが線状である際
に形成されるハイブリダイゼーション複合体を示す。

第２図は、後述の7.2節で詳細に説明する２つの第１
プローブカセットpTN5-9とmpTN5-9の構成を示す図であ
る。これらカセットのパッケージ（＋）一本鎖は、第３
図において示される第２プローブに含まれるセンス（有
意味な）Tn5（＋）配列に相補的であるアンチセンス
（非転写）Tn5（−）配列を含む。

第３図は、第２図におけるカセットから調製された第
１プローブと組み合せて使用し得る第２プローブ族に含
まれるTn5（＋）配列の５セグメントを示す図である。V
F1,VF2そしてVF4として示される領域は、それぞれPEMBL
8＋にクローン化し、そして５領域の全てはM13mp10にク
ローン化した（後述の7.3節を参照のこと）。

第４図は、SV40標的DNA検出にSV40DNAとTn5（−）配
列を含む第１プローブとTn5（＋）配列を含む第２プロ
ーブ族を組み合せる使用方法を示す図である。パネルＡ
は、第１および第２プローブの線状化を表わす図であ
る。パネルＢは、パネルＡの線状プローブを使用する際
に形成されるハイブリダイゼーション複合体を表わす図
である。

第５図は、ドットブロット型（dotblot format）にお
いて本発明の方法を使用して標的SV40DNAの検出を増幅
することを示す。パネルＡにおいて、異なる量の標的SV
40DNAは、対照として標識³²Ｐ−第１プローブを使用し
て検出された。パネルＢにおいて異なる量の標的SV40DN
Aは、非標識第１プローブと本発明の方法に一致する標
識³²Ｐ−第２プローブ族を用いて検出された。

第６図は、ドットブロット型において非放射性リポー
ターグループで標識化した第２プローブ族と組み合せた
第１プローブを使用して生じる増幅信号を示すものであ
る。レーン２と３において、光ビチオン第２プローブ
は、減少量の１次プローブカセットにハイブリダイズさ
れ、ハイブリダイゼーションはアビジン−リンク化アル
カリ金属フォスファーターゼ比色反応を用いて検出され
た。レーン１は、減量量の対照ビチオンM13ssDNAを含
む。

5.発明の記述ハイブリダイゼーション検定法は、特異核酸配列の検
出および定量、特に、対応する遺伝子（DNA）と遺伝子
生産物（RNA）について記載される。検定法システム
は、１次ハイブリダイゼーションプローブ、すなわち標
的遺伝子に相補的な一本鎖核酸配列を含む蛋白質からな
り、それ故にハイブリダイズする;1次プローブの残部は
標的配列にハイブリダイズできず、尾と称せられる。第
２ハイブリダイゼーションプローブ族が与えられ、その
各々が第１プローブ尾部に結合し得るセグメントに付着
した信号発生成分を伴う。第２ハイブリダイゼーション
プローブは、そのような方法で調製されるので多数のも
のは１次プローブの各々と相互作用し、それ故に、多く
の第２プローブは標的配列を認識する第１プローブの各
々に結合する。このことは初期認識事件の大きな増幅を
生じる。

第１および第２プローブは、いかなる組合せにおいて
も使用し得る線状または環状（部分）であってもよい
（第１図参照）。例えば、第１と第２プローブの両方が
線状分子であると、形成されるハイブリダイゼーション
複合体は、第1A図に示されるような「クリスマスツリ
ー」構造を有するだろう。環状第１と第２プローブの使
用から生ずるハイブリダイゼーション複合体は第1c図に
示される。線状と環状プローブの混合から生ずるハイブ
リダイゼーション複合体は、第1Bと第1D図に示される。

検出信号の発生は、多くの方法で達成し得る。

ある一方法において、検出可能な信号を発する多くの
リポーターグループが使用前に第２プローブに直接付着
させられる。信号発生リポーターグループを第１プロー
ブと結合する第２プローブの領域に組み込まないので、
第２プローブのその後の第１プローブへの付着は干渉が
ない。第２の方法において、中間基質が第２プローブに
付着させられる。例えば、その基質は、抗体分子が結合
でき、各々が多種類リポーターグループのいずれかを含
む免疫遺伝性蛋白質でよい。また、基質はカップリング
システムを通じてリポーターグループに結合し得るであ
ろう。第三の方法は、第２プローブ修飾機能を組込む方
法であるので、プローブ自体がリポーターグループにな
る；換言すると、第２グループ自体が検出可能な信号を
発生する。

本発明のハイブリダイゼーション検定法は、多くの方
法で行なってもよいが、各々の方法は同時又は一連のス
テップで行なわれる次のステップを含む；（ａ）標的配列をハイブリダイゼーションを生じさせる
条件下で第１プローブと接触させること、（ｂ）第２プローブ族を第２プローブが第１プローブの
尾と結合し得る条件下で前記ステップ（ａ）において形
成されたハイブリダイゼーション生産物と接触させるこ
と、そして（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体において結合した
第２プローブが発生する信号を検出すること。

事実、標的核酸配列が最初に各種固体支技体に固定化
されるであろう、又は液体系が使用し得る。該システム
はそれ独自の特性を有しており、そして注意して発生信
号を選択すべきである。各システムは自動化しやすい。

本発明のプローブおよび方法は、研究所および臨床実
験室又は植物、農業および家畜病治療の科学分野におい
てポリヌクレオチド類検出に使用し得る。それはヒトお
よび家畜病治療医薬における病原性微生物（細菌、ウィ
ルス、菌状腫、酵母、原性動物）の検出および癌細胞と
染色体における遺伝的欠如の検出用の強力な診断用装置
である。

本発明は、ハイブリダイゼーション検定法、核酸ハイ
ブリダイゼーションに基づく増幅システムの製作とリポ
ーターグループをハイブリダイゼーション分子に付着す
る方法に関する。大きな増幅が標的核酸配列の検出のた
めに生ずることが評価される。

明確にする目的で本発明の既述は、次のカテゴリーに
分けられた、すなわち（ａ）第１と第２プローブの記
述、（ｂ）リポーターグループの記述、そして（ｃ）本
発明のハイブリダイゼーションシステムの使用および自
動化。

5.1.第１プローブ前述のように、第１プローブは、標的配列に相補的で
あり、さらに標的配列に結合しない重合性の尾に付着さ
せられる一本鎖ポリヌクレオチド配列からなる。そのプ
ローブは標的配列と安定なハイブリダイゼーションを形
成すべきである。少なくとも約10〜12の連続塩基対相互
作用が安定なハイブリダイゼーションを定義すると一般
に理解される。

標的配列へ相補的である第１プローブのその部分は、
DNAまたはRNAのいずれかからなり、そして標的配列への
ハイブリダイゼーションを許容するため使用前は一本鎖
であるべきである。それは通常、しかし必ずしもそうで
はないが、標的配列をプラスミドまたは配列の多くの複
製を生産するために使用し得るウィルスのような組換え
ベクターにクローン化することにより産生される。又
は、第１プローブは化学的方法により合成してもよい。
これらの工程は、当業者には既知である。

標的配列が必要とする補体は、核酸であるべきであ
る。第１プローブの残部、即ち、尾はヌクレオチド配列
にカップリングでき、そしてリポーターグループが結合
しまたは第２プローブが反応し得る天然または合成のポ
リマーのいずれかからなる。例えば、ナイロン、プラス
チック、セルロース繊維、レーヨン、綿繊維、ポリサッ
カリド類、ニトロセルロース等のポリマーが挙げられる
がこれに限定されない。この場合、第２プローブは、同
一又は異なるポリマーからなり、そのポリマーの部分が
第１プローブの尾部に結合する。

第１プローブが実質的に一本鎖ポリヌクレオチドから
なり、そして第２プローブが第１プローブの尾の異なる
セグメントにハイブリダイズする一本鎖領域を含む種々
のポリヌクレオチド族からなる場合に、特に有効な実施
態様が得られる。尾を含む両第１プローブがポリヌクレ
オチドからなる時に、プローブ全体は組換えDNA技術に
より相対的に簡単に産生し得る。従って、第１プローブ
はプラスミドまたはウィルスDNAのような組換えベクタ
ーを使用してクローン化してもよい。事実、第１プロー
ブは標的配列を含む組換えベクター分子の全長からなる
であろう。

クローニングと一本鎖第１プローブの生産に特に利益
を与えるベクターシステムは、M13とf1のような線状バ
クテリオファージから誘導されたベクターからなる。こ
れらのファージベクターは、相補性配向において簡単に
精製された一本鎖DNA分子を大量に産生し得る。事実、
反対のファージDNA配向は、f1ファージシステムにおい
て別々にパッケージ化されており、第１プローブとして
使用する＋または−の鎖のいずれかの精製と単離を可能
とする。第１プローブは、これらのファージベクターを
用いて標的遺伝子配列をベクターのクローニング部位に
挿入することにより構成してもよい。第２プローブは、
第１プローブの「尾」部分、即ちクローニング部位外の
第１プローブベクター領域にハイブリダイズする配列を
含む類似ベクターを用いて調製し得る。一方、標的配列
に加えて、他の外来DNA配列は、第２プローブがハイブ
リダイズし得るように独特な配列を組込むために第１プ
ローブベクターのプローブの尾部にクローン化してもよ
い。

一本鎖ヌクレオチドプローブとして簡単に単離し得る
組換え分子は、環状プローブとして使用でき、または多
くの方法により線状分子に添加し得る。特に、ベクター
に独特な制限酵素認識部位をエンコード（encode）する
オリゴヌクレオチドは、環状一本鎖ベクターにハイブリ
ダイズさせてもよい。制限酵素によるその後の消化は、
プローブ分子の線状化を生じさせる。一方、線状化は低
速度で一本鎖DNA類を認識配列で切断し得るある制限酵
素を用いて達成し得る（例えばHind III）、また、環状
プローブは、例えば紫外線で鎖を切断し、または100℃
で数分間インキュベートすることにより非特異的に線状
化し得る。

第１プローブの供給ベクターシステムを使用して得ら
れる別の利益は、第１プローブカセットを構成し得るこ
とである。カセットは、（ａ）標的DNAの挿入とクロー
ニングを可能とする多クローニング部位および（ｂ）相
補的であり、そして第２プローブ、即ち第１プローブの
「尾」部分の結合が可能であるベクターの第２部分を有
するベクターからなる。これらのカセットは、第２プロ
ーブ同族と一緒に使用し得る所定の標的配列のいずれを
も含む第１プローブを調製し得る。第２プローブ族は、
強力な新規次元をハイブリダイゼーション技術に、即ち
配列と源にかかわらず、標的遺伝子のいずれをも検出す
る同一セットの第２プローブを使用する能力を加える。
標的遺伝子DNAのいずれの第１プローブカセットへの挿
入は、第１プローブの生産に続いて、不変第２プローブ
認識配列を保持する。結局、ユーザーは、標的配列を含
む単一の第１プローブの構成のみを必要とする。この第
１プローブは、増幅信号を得るために読み取りシステム
を含む第２プローブの同族と組合せて使用してもよい。

他の実施態様において、RNA合成反応は第１と第２プ
ローブを生じさせるために使用してもよい。例えば、第
１または第２プローブに対応する配列は、SP6またはT7
ファージプロモーターにクローン化してもよい。RNA転
写（transcripts）を生じさせ、例えば、放射性グルー
プまたは前記の検出可能な信号を発生可能な修飾ヌクレ
オチドのようなリポーターグループを組込んでもよい。

5.2.第２プローブ前記のように、第２プローブは、信号発生プローブ族
からなり、その各々が信号発生成分と第１プローブ尾部
に結合し得るセグメントからなる。第２プローブ組成
は、第１プローブの尾の組成に依存する。例えば、第１
プローブの尾が天然または合成ポリマーのような非核酸
ポリマーからなると、第２プローブは同一又は異なるポ
リマーからなり、その部分が第１プローブの尾に結合す
るだろう。

第１プローブの尾が実質的に一本鎖であるポリヌクレ
オチドからなると、第２プローブは、ポリヌクレオチド
の各々が第１プローブの尾の異なるセグメントにハイブ
リダイズする一本鎖部分を含むポリヌクレオチド族から
なりえる；第２プローブ族の信号発生成分は、修飾され
た一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドから構成されて
もよいので、そのヌクレオチド自体で信号を発しまたは
付着リポーターグループが信号を発する。

ポリヌクレオチドからなる第２プローブは、組換えDN
A技術または化学合成法を用いて生産されるであろう。
組換えDNA技術によるポルヌクレオチド第２プローブを
生産する便利な方法は、例えば第１プローブのクローニ
ング用に議論したと同じ方法を使用してプローブヌクレ
オチド配列をクローニングすることをともなう。しか
し、第２プローブは標的配列が欠けるであろう。第２プ
ローブ調製のために少なくとも二つの一般的な解決法が
採用されるであろう、（ａ）第１プローブの尾にハイブ
リダイズしない一本鎖クローニングベクターは、第１プ
ローブ尾部に相補的である特異配列の挿入により修飾し
得る、または（ｂ）第１プローブの尾に相補的である一
本鎖クローニングベクターは、ほとんどの特異部分がも
はや塩基対を形成しないように修飾される。

本発明のある実施態様において、ポリヌクレオチド第
２プローブは、第１プローブにハイブリダイズしそうに
ないクローニングベヒクル（媒体）を選択することによ
り、組換えDNA技術を使用して簡単に構成し得る。例え
ば、かかるベヒクルは、ヌクレオチド配列において第１
プローブと異なるベクターまたは第１プローブのベクタ
ーに同一であり、それゆえに非相補的な配列を有するベ
クターを含むだろう。第１プローブの尾の一部または部
分に相補的であるヌクレオチド配列は、適当なクローニ
ング部位に挿入され、そしてそれらのベクターにクロー
ン化し得るので組換え分子が構成され、該分子のセグメ
ントだけが第１プローブの尾にハイブリダイズし得る。
挿入配列は、第１プローブの尾において自然に発生する
配列または第１プローブの尾にクローン化した外来配列
の補体であろう。生じた第２プローブ（例えば、組換え
ssDNAベクター）は、挿入した相補的ヌクレオチド配列
のため第１プローブの尾の特異部分にハイブリダイズで
きるであろう。しかしながらクローニングベヒクル残部
は、第１プローブの尾にハイブリダイズしないので、リ
ポーターグループの修飾または付着により第２プローブ
の信号発生成分として利用できるであろう。信号発生成
分は、やや飽和状態における非特異的標識化または保護
／保護除去反応により分子に与えられる、このことは、
第１プローブの尾にハイブリダイズする領域を保護し、
リポーターグループが分子上に必要とされまたは付与さ
れるために分子の非保護領域を変性し、そして第２プロ
ーブ保護を除去することを伴なう。従って、信号発生第
２プローブ族、即ち第１プローブの尾の異なる部分に相
補的であるクローン化配列を含むそれぞれが構成される
であろう。クローニングと一本鎖第２プローブの生産に
特に利益を提供するベクターシステムは、M13とf1のよ
うな線状バクテリオファージから誘導されたベクターか
らなる。発生する環状一本鎖プローブは、必要により第
１プローブ用に記載したように線状にしてもよい。

本発明の実施態様は、後述の実施例において更に十分
に記載されそして示されており、その中でpEMBL＋また
はM13第１プローブはSV40標的DNA配列と外来配列、即ち
Tn5を含むように構成させられた。このTn5配列の異なる
部分を含む５つの第２プローブは、M13において相補的
配向でクローン化された。これら第１プローブの第２プ
ローブ族へのハイブリダイゼーションは複合体を形成
し、そこにおいて５つの第２プローブは第１プローブの
尾の異なる領域にハイブリダイズし、順次試験SV40DNA
配列にハイブリダイズした。複合体は、リポーターグル
ープを５つの第２プローブ族に組み込むことにより検出
された。このシステムは、第１プローブとSV40試験標的
DNA配列間の初期ハイブリダイゼーション事件の増幅に
約立った。第２プローブは、相補的Tn5DNAエレメントが
ない場合に第１プローブにハイブリダイズする能力がな
かった。

本発明の他の実施態様において、第１プローブの尾に
相補的である一本鎖クローニングベクターは修飾される
のでほとんど特異部分はもはや塩基対を形成し得ない。
線状バクテリオファージベクターは、ある配向で一本鎖
第１プローブの生産に使用でき、そしてこれらの同一ベ
クターは、反対配向で一本鎖第２プローブ族を生産する
ためにも使用し得る。このように、バクテリオファージ
は、標的配列に相補的な配列を含む「＋」（センス配
向）において第１プローブを生産するために使用でき、
そして第２プローブ族は第１プローブに相補的である
「−」（アンチセンス）配向において使用でき、そして
逆も同様である。一本鎖第２プローブが生産されると、
そのプローブは修飾されるので各第２プローブの異なる
セグメントのみが第１プローブの尾の異なる部分にハイ
ブリダイズでき、このように分子族を生成する。このこ
とは、（ａ）各第２プローブ上の異なる位置の少領域を
保護すること、（ｂ）各分子の非保護領域がリポーター
グループを必要とし、またそれ自体がリポーターグルー
プに変化させられ、そしてガイブリダイズしないように
するために分子を変性させること；および（ｃ）第２グ
ループの保護を除去することにより達成されるだろう。
生産物は第２プローブ族であり、その各々が第１プロー
ブの尾の異なる部分に結合し得るセグメントを含み、一
方分子残部、即ち第１プローブの尾に結合しない残部は
検出可能な信号を発する。

第２プローブは、短い一本鎖の相補的ポリヌクレオチ
ドのハイブリダイゼーションにより簡単に保護される。
信号発生成分を与えるために非保護領域の変性後、分子
の保護は短保護ポリヌクレオチドの変性と分離により最
も簡単に除去される。第２プローブが環状分子である
と、変性または線状ポリヌクレオチドのみを消化するエ
キソヌクレアーゼを使用するヌクレアーゼ消化により保
護が除去され得る。

下記、特別な実施態様において、線状バクテリオファ
ージf1プラスミドを使用して第１及び第２プローブを生
産する方法が記述されている。この実施態様において、
第１プローブは標的遺伝子配列をも含むpsP64f＋配向ss
DNAと定義されている。標的遺伝子配列は、標準クロー
ニング技術によりプラスミドのポリリンカー領域に挿入
され、そしてプラスミドはエシェリキア・コリ（E．col
i）菌株JMl0lまたはNM522において繁殖させられる。標
的配列を含む大量のssDNA分子は、公知の方法を使用し
て生産し得る［デンテ等、1983年ニュレクイックアシ
ッズリサーチ11巻1645〜1655頁（Dente et al.,1983N
uc.Acids.Res.11:1645-1655）］。標的配列を含有する
得られた第１プローブ（例えば、SV40 DNA配列、相同性
ヘルペスウイルスまたはヒトDNAセグメント等の興味あ
る遺伝子）は、（＋）（即ちセンス）鎖配向において生
産される。

ssDNA第２プローブは、psP64（−）を使用して（＋）
配向用に記述したと同一方法を用いて生産される。しか
し、標的遺伝子はベクター中に挿入されていない。第２
プローブ族を生じさせるために、psP64f（−）ssDNAは
少なくとも５サンプルに分けられる。各サンプルに、異
なる領域に対応する短ssDNAフラグメント（約20〜500塩
基）をハイブリダイズし、5ssDNA環状物を爆発的に生産
し、それぞれを異なる領域において保護する。加えられ
る短ssDNA分子は、鎖分離ゲルからのssDNA分子の精製に
続くプラスミドの制限酵素消化またはオリゴヌクレオチ
ドの合成のいずれかにより予め生産された。非保護一本
鎖DNA領域は、各種の技術により修飾可能であり、それ
らの全ては第２プローブ鎖を基質としてリポーターグル
ープを結合するために利用される。これらは、第5.3節
に充分に記載されている。信号発生成分を形成するため
に非保護領域の修飾後、必要により第２プローブは線状
化され、そして保護領域は二方法のいずれかで保護が除
去される。

（ａ）変性およびニッキング:100℃で変性し、サークル
あたり１ヒット（hit）を生産するために必要な滴定量
のDNaseIで環状物をニックする。大きさの相違に基いて
（例えば、カラムクロマトグラフィー）大きな第２プロ
ーブから小さなDNAフラグメントを分離する。又は、制
限酵素は、変性と分離に続き二重らせん端で一部位でも
って切断するために使用し得る。

（ｂ）保護領域の酵素消化：ラムダファージエキソヌ
クレアーゼかエシェリキア・コリエキソヌクレアーゼ
IIIのいずれかは、標準反応条件で線状DNAフラグメント
消化に使用できる。ssDNA環状物は、前記のようにDNase
Iを使用して線状化されうる。

第２プローブ調製のために選ばれた方法に関係なく、
構成された第２プローブ族は、新規および異なる標的を
検出するために使用したとしても再設計する必要はな
い。新規配列を含有する第１プローブの場合にのみ構成
することが必要である。このことは、新規標的配列を第
１プローブカセットに挿入して第１プローブをクローン
化することにより簡単に達成されうる。第２プローブの
同族は、新しい第１プローブと組み合せて使用し得る。

さらに、第２プローブは、第１プローブにハイブリダ
イズするためにはその領域において一本鎖であるべきで
ある。特に有益な実施態様において、DNA合成反応は検
出可能な第１および第２プローブを発生させるために使
用される。第１プローブ認識配列を欠く第２プローブDN
A類のニットトランスレーションは、第２プローブ全族
にハイブリダイズ可能な標識セグメントを生じさせるた
めに使用される。これらのセグメントは、放射性ヌクレ
オチドまたはリポーターグループとして役立つ（BuDRに
対する抗体により同定されるBuDR修飾ヌクレオチドのよ
うな）修飾ヌクレオチドを組込んで検出可能な信号を提
供できる。一方、短い“プライマー”セグメントを使用
する第２鎖合成反応は、修飾または放射性標識ヌクレオ
チドを第１プローブの尾にハイブリダイズする能力を妨
げない第２プロブの部分に相補的な第２鎖に組み込むた
めに使用される。

さらに他の実施態様において、第2RNAプローブは、第
１プローブについて以前に述べた方法を使用して調製さ
れうる。

5.3.リポーターグループ本発明の種々の実施態様が後述されており、リポータ
ーグループは、標的核酸配列の検出および定量の目的で
第２プローブ上に生成させられる。リポーターグループ
の特性とリポーターグループを生成するためのそれぞれ
の修飾がある程度まで第２プローブ組成により決定され
る。

5.3.1.第２プローブのリポーターグループへの転化化学的に修飾された第２核酸プローブ自身がリポータ
ーグループとして機能する。例えば、修飾は、放射性同
位体、ビチオン（アビジン−カップルリポーター分子
とともに使用される）そして糖（レクチンカップル
リポーターと伴に使用される）のヌクレオチドの組込み
を含む。特に注目すべき修飾は、第2ssDNAまたはssRNA
プローブの蛍光核酸誘導体への転化である。このこと
は、若干酸性条件において保護第２プローブのクロロア
セトアルデヒド処理により達成され、非塩基対アデニン
（と小さい方のシトキン残基）を蛍光エテノー誘導体に
転化する。

代表的な反応条件は、保護第２プローブを100〜500μ
g/mlの割合で2Mクロロアセトアルデヒド、20mM酢酸カリ
ウムのpH4.5の中で、37℃において10〜24時間インキュ
ベートすることである。未反応クロロアセトアルデヒド
は、透析またはカラムクロマトグラフィーにより一般に
除去される。反応プローブはエタノール沈降により濃縮
されるだろう。通常70％〜100％の非対（即ち、非塩基
対）アデニン残基（Ａ−残基）は修飾されて蛍光エテノ
誘導体となる。薬剤がssDNAのみを修飾するため、第１
プローブにハイブリダイズするように選択された第２プ
ローブ領域は、あとで除去される補体配列でのハイブリ
ダイゼーションにより保護されるだろう。ssDNA修飾
は、非保護領域のハイブリダイゼーションを完全に除去
する付加的な利益を有する。蛍光信号の増幅は、遊離ヌ
クレオチドを解放するヌクレアーゼを有する検定法の産
物とて生ずるハイブリダイゼーションの消化により付加
され、蛍光強度の増加か大きい付随物を生ずる。

5.3.2.リポーターグループの第２プローブへの付着各種のリポーターグループは、種々の手段により第２
プローブに付着させられる。これらのグループは直接あ
るいは間接的にプローブに付着させられる。使用できる
リポーターグループは次のものを挙げることができる
が、これらに限定されることはない。

（ａ）検出可能な作用を行なう各種の酵素（例えば、ア
ルカリ性フォスファターゼ、セイヨウワサビペルオキ
シダーゼ）、（ｂ）電子顕微鏡または導電率のような電
気特性により検出可能な電子の密な、または電気的グル
ープ（例えば、フェリチンまたはコロイダルゴール
ド）、（ｃ）発色団（例えば、蛍光化合物、色素）、
（ｄ）放射性分子（例えば、³²P,¹²⁵Ｉ）そして（ｅ）
化学的反応性分子（例えば、色変化を受けまたはする化
合物）。

リポーターグループをプローブに直接付着する方法
は、プローブとリポーターグループの組成特性に依存し
て変わるだろう。共有結合または非共有リンケージのい
ずれかが使用できる。第２プローブがヌクレオチドから
なると、種々の反応性部位は、リポーター分子の付着用
部位として使用できるアミノ基、フォスフォ基、ヒドロ
キシ基等（これに限定されない）を含むプローブ分子上
に発生する。

リポーターグループは、多くの方法で第２プローブ信
号発生成分に間接的に付着させられる。このことは、リ
ポーターグループの他の薬剤を介する第２プローブの付
着を伴う。次のことを含むがそれに限定されることのな
い多くの方法が可能である。すなわち、（ａ）薬剤は、
第２プローブとリポーターグループ間のリンク（鎖）と
して役立つ二官能リンカーでありえる、（ｂ）薬剤は、
リポーターグループ用の基質であり得る（例えば、リポ
ーターグループが酵素であると第２グループに付着する
薬剤は酵素用基質であるべきだ）、（ｃ）薬剤は、リポ
ーターグループで標識化された抗体分子に特異的抗原で
あり得る、そして（ｄ）薬剤は、アビジン−リンクリ
ポーター分子が接合でき、またはその逆であるビチオン
のような化学基でありえる。かかる薬剤は、アガロース
ビーズ、ラテックス粒子、デキストランビーズ、細孔
制御ガラスとシリカ、ニトロセルロース、セルロース繊
維と紙、レーヨン、サッカリド部分、サイロンと他の合
成ポリマー、そして結晶（例えばピエゾクリスタル）で
あるが、これらに限定されない。これらの全てに対して
リポーターグループはカップルできる。これらの基質自
体は、例えば検出可能なデリビティゼーション（derivi
tization）反応により検出用に使用できる。

第２プローブがヌクレオチドからなる特定実施態様に
おいて、リポーター分子を付着するために使用される多
くの蛋白質が有効である。事実、特定種類のヌクレオチ
ドに対する蛋白質の自然アフィニティーを利用できる：
例えば、エシェリキア・コリSSB、fdファージSSBおよび
バクテリオファージT4遺伝子32は、各々特異的にssDNA
分子に結合する：ヒストンと多くのポリメラーゼは、特
異的にdsDNA分子に結合する、真核生物mRNP粒子は特異
的にssRNA分子に結合する、そして、ある真核生物の翻
訳開始因子は、dsDNA分子に特異的に結合する。また、
これらまたは他蛋白質は、プローブ用の自然アフィニテ
ィにもかかわらず第２プローブに共有結合できる。

光活性化アルキレーションを含む光接合と称される特
別に有効な反応は、蛋白質と他の分子を酵素リンク化ア
ビジン比色反応を使用して検出される第２プローブに接
合するために使用される。事実、光ビオチニレーション
は、後述の実施例において、ビチオンを酵素リンク化ア
ビジン比色反応を用いて検出される第２プローブに共有
化合的に付着させるために使用された。同様に、蛍光リ
ポーターグループは、ホトビオチニレーションと類似反
応により核酸に同様に接合されるだろう。フルオロセイ
ン化プローブは、その後紫外線励起に基づいて生ずる蛍
光を直接記録することにより検出されるだろう。また、
フルオロセイン基に対する抗体分子は、アルカリ性フォ
スファターゼのようなリポーターグループに及ぼしても
よい。

他の実施態様において、エシェリキア・コリSSBは、
記載に従って精製され［シュナイダーとヴェトミユア、
1982年バイオケミストリー21巻608〜615頁（Schneider
and Wetmur,1982 Biochem,21,608-615）］、そして保
護第２プローブに加えられ非保護（一本鎖）領域の100
％飽和を達成する。また、SSBは、ほぼ飽和レベル（例
えば、50〜70％）において非保護第２プローブに加えら
れるだろう。完全飽和の代表結合条件は、150mM NaCl,1
0mM Tris HCl,pH8,1mM EDTAにおける20-200μg/ml第２
プローブ、8:1（w/w）SSB/第２プローブ、室温で30分か
らなる。SSBは、次の様に自分自身とssDNAに架橋する：
蛋白質−蛋白質架橋はグルタルアルデヒド中で溶液0.1
％を１時間徐々に攪拌して得ることで行なわれる。グル
タルアルデヒドは透析により除去される。蛋白質−ssDN
A架橋は、標準的手法に従って混合物を短波長UV線照射
により行なわれる。例えば、信号は、各種のリポーター
グループに接合した抗SSB抗体の添加またはこれらのリ
ポーターグループのSSB自身への直接組込みにより発生
するだろう。

他の注目すべき信号発生システムは、酵素ベータガラ
クトシダーゼの複数コピー（複製）を第２プローブに結
合することである。例えば、酵素は直接プローブにカッ
プルし、または基質を結合したプローブに対する抗体に
カップルする。ハイブリダイゼーションは、ベータガラ
クトシダーゼにより開裂されて蛍光誘導体、フルオロセ
インを生ずる非蛍光基質フルオロセインジ（ベータ−
Ｄ−ガラクトピラノシド）のその後の添加により定量さ
れる［ロットマン,1961年プロシーディングスオブ
ザナショナルアカデミーオブサイエンシスオ
ブジユナイテッドステーツオブアメリカ47巻
1981-1991頁（Rotman,1961,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,4
7,1981-1991）］。

5.4.ハイブリダイゼーション検定法本発明のハイブリダイゼーション検定法は、多くの方
法で達成されるが、各方法は下記の方法を同時、順次ま
たは逆に行なう次ステップを含む。

（ａ）ハイブリダイゼーションを相補的配列間に生じさ
せる条件で標的配列を第１プローブと接触させること、（ｂ）第２プローブを第１プローブの尾に結合可能な条
件で第２プローブ族を前記ステップ（ａ）で形成したハ
イブリダイゼーション反応生成物と接触させること、そ
して（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体において結合した
第２プローブから、生じた信号を検出すること。ハイブ
リダイゼーションは次の物理複合体を形成する、第１プ
ローブは標的核酸と結合させられ、そして第２プローブ
の多くのコピーが第１プローブに結合させられる（第１
図参照のこと）。

そして検定法は、標的配列を種々の固体支持体、即ち
ニトロセルロース、アガロースビーズ、修飾セルロース
繊維、ポリプロピレンまたはセファクリル（sephacry
l）等があるがこれらに限定されない、を固定化するこ
とで導かれるであろう。標的配列は、非共有相互作用を
介して固体支持体で固定化できた。また、標的配列は、
当業者に知られている方法を使用して固体支持体に共有
付着できるため、標的配列は固定化されるがハイブリダ
イゼーションの能力が残されている［アルバレラ等、EP
O 144914 A2;ダッタグプタとクローサーズ EPO 130523
A2;ヤブサル等 WO85/02628（Albarella et al.,EPO 144
914 A2;Dattagupta and Crothers EPO 130523 A2;Yabu
salu et al.,WO85/02628）］。更に、増幅サンドイッチ
ハイブリダイゼーション法は完成され、その中で標的
DNAは第１プローブの結合を干渉しない固定配列にアニ
ールされ、そして固定配列は本発明の第１プローブと第
２プローブ族に接触する。

これらの方法の結果、ハイブリダイゼーション複合体
が固定化され、そしてリポーターグループにより発生さ
せられた信号は固体支持体上で検出される。または、固
体化ハイブリダイゼーション複合体形成、未反応成分分
離または系からの除去後、検定システム液相において信
号放出および発生のためハイブリダイゼーション複合体
が分裂させられる。各立体配置において信号が読み取ら
れ、定量化されるだろう。

さらに本発明のさらに他の実施態様において、ハイブ
リダイゼーション反応は、液中の移動成分を使用して達
成される。溶液中で形成するハイブリダイゼーション複
合体は、その後「アンカー配列」、即ち固定化され、ま
たは簡単に固定化され、そして第１プローブの結合を干
渉しない標的配列部分にハイブリダイズする配列を用い
て固定化される。例えば、溶液中で形成されたハイブリ
ダイゼーション複合体は、ビチオン化アンカー配列とア
ビジン被覆固体支持体を使用して固定化される。この実
施態様に従って、ハイブリダイゼーション反応は溶液中
で完成させられ、そしてハイブリダイゼーション複合体
は、アビジン被覆微少力価ウエルにおいて固定化され
る。類似分離技術は、従来のハイブリダイゼーション法
を使用して極めて最近示され［シバネン等1986年ニュク
レイックアシッズリサーチ 14（12） 5037-5048頁
（Syvanen et al.,1986,Nucleic Acids Research 14（1
2）:5037-5048］参照のこと］、そして、熟練技術工に
より本発明の実施において採用される。

5.5.ハイブリダイゼーション検定法の自動化本発明は充分に自動化され得る。利用された検出シス
テム形は、リポーターグループにより発せられた信号に
依存する。検出システムは、蛍光、色の変化そして電気
伝導度の自動観察を含むがこれらに限定されることはな
い。

検出は各種システムを使用して達成され、その各々は
急速プロセシング異種方法に対しそれぞれ利益を有す
る。例えば、本発明の固定化ハイブリダイゼーション複
合体から発生した信号は、固体支持体から直接検出され
る。また、ハイブリダイゼーション複合体は、信号が溶
液中で検出される場合に固体支持から放出される。加え
て全ハイブリダイゼーション法は、溶液中で自由に行な
われる。即ち液体ハイブリダイゼーションである。若し
反応生成物が、例えば微小力価ウエル中でその後固定化
されると、発生した信号は簡単に読み取られ、定量され
る。

かかるシステムの一実施例において標的核酸は、キャ
ピラリーチューブ内の固体支持体に固定される。ハイブ
リダイゼーション反応は、キャピラリーチューブ内にお
いてプローブが機械的に運搬される自動プロセスにより
行なわれる。蛍光そして色の変化などの信号は、高強度
光源と観察用繊維光学を使用して検出される。電気伝導
度は、溶液中の抵抗または例えばピエゾ（電気）結晶中
の電子流を測定して決定される。

6.実施例：増幅ハイブリダイゼーション検定法に使用す
る第１と第２プローブの構成実施例において使用される第１プローブカセットと第
２プローブ族の構成は以下に記述される。第１プローブ
カセットは、（ａ）いかなる所定標的DNA配列も挿入可
能な多クローニング部位および（ｂ）Tn5DNA配列を含
む。カセットのパッケージ（＋）一本鎖は、Tn5（＋）D
NA含有第２プローブ族がハイブリダイズできるアンチセ
ンスTn5（−）DNAを含む。

6.1.原料と方法 Tn5DNAは、プラスミドpEG81、PvuII部位近傍に全長Tn
5を含むPBR322プラスミドから得られた［ラプスキー
等.,1984年ジーン,30巻 99〜106頁（Lupski et al.,
1984,Gene 30:99〜106）］。バクテリオファージ f1
ベクター pEMBL8＋［デンテ等.,1983年ニュクレイック
アシッズリサーチ 11巻 1645〜1655頁（Dente et
al.,1983,Nucl.Acids Res.11:1645-1655）］およびバ
クテリオファージ M13 ベクターmp10は、エシェリキ
ア・コリTG-1,DH-1（recA−）変異型において繁殖させ
られた。pEMBL8＋プラスミドは、Ir1バクテリオファー
ジを使用して一本鎖DNA（ssDNA）形に動員された［デン
テ等.,1983年ニュックレイックアシッズリサーチ
11巻1645-1655（Dente et al.,1983,Nucl.Acids Res.
11:1645-1655）］。プラスミドDNAsは、透明溶解産物法
により生成され、CsCl勾配上で精製された［ハムフレイ
ズ1975年ビービーエー383巻:457-463頁（Humphreys et
al.,1975,BBA 383:457-463）］。バクテリオファージ
ssDNAは、前記1983年のデンテ等の既述のようにPEG/NaC
l沈降とフェノール：クロロホルム抽出により精製され
た。均一な標識ファージベクターssDNAsは、ゲイナー等
［1982年ジャーナルオブヴァイラロジー 44巻
276-285頁（Gaynor et al.,1982,J.Vir,44,276-285）］
により15ml培地当り1mCi³²ＰO₄で調製された。DNAsは１
〜３×10⁵cpm/ugであった。

DNA制限フラグメントは分析され、標準的方法を使用
してアガロースゲルから抽出された［マニアチス等1982
年モノキュラークローニング、アラボラトリーマニ
ュアル、コールドスプリングハーバー,150-164頁
（Maniatis,et al.,1982,Molecuar Cloning,A Laborato
ry Manual,Cold Spring Harbor,pp 150-164）］。DNA連
結反応、形質転換および形質転換細胞の分析法は、1982
年のマニアチス等の前記第286-291,250-252そして368-3
69頁に既述されていた。制限エンドヌクレアーゼと他の
DNA修飾酵素は、ポーリンガーマンハイム（Boehringe
r Mannheim）からのもので供給者の指示に従って使用し
た。バクテリアを、LBまたはM9培地で成長させた［マニ
アチス等1982年同上60-73頁］。

6.2.第１プローブカセットの構成第１プローブカセットの初期のプロトタイプを、バク
テリオファージ f1 pEMBL8＋ベクター中で構成した
［デンテ等.,1983年ニュクレイックアシッズリサ
ーチ 11巻 1645-1655（Dente et al.,1983,Nucl.Acid
s Res.11,1645-1655）］。Tn5DNAフラグメントをベクタ
ーに挿入して第２プローブDNAs用のハイブリダイゼーシ
ョン標的を生産した（下記参照のこと）。Tn5は、関連f
dバクテリオファージ中で安定して運搬されることが示
されたので選ばれた［アウエルスワイド等1981年，シー
エスエッチキュービー45巻:107-113頁（Auerswald et a
l.,981,CSHQB,45,107-113）］。

第１プローブカセットは、Tn5 2.8Kbp Bg1IIDNAフラ
グメントをBamHI部位でpEMBL8＋に挿入して構成した
（第２図参照のこと）。Tn5フラグメントは、カナマイ
シンとストレプトマイシン薬品耐性遺伝子用のコード領
域を含む。正の形質転換細胞は、その後選ばれ、そして
第２図に示される配向においてフラグメントを有するこ
れらは、pTn5-9を同定するためにさらに制限フラグメン
ト分析でスクリーンされた。この配向は、Tn5カナマイ
シン遺伝子をpEMBL8＋lacＺ遺伝子の次に位置させる。
（＋）センスssDNA環の生産は、Tn5（＋）配列含有第２
プローブ族が結合する2.8Kbp Tn5（−）DNAフラグメン
トを含んでいた。通常，（＋）は、mRNAコード鎖に等し
いセンスであると定義される。第１プローブカセットpT
n5-9は、第２図に示されるようにTn5DNAと側面を接する
EcoRI、SmaＩ、SalＩそしてHindIII用のポリリンカー部
位をさらに有する。これらの多クローニング部位は、い
ずれの標的DNA配列を第１プローブカセットに挿入する
ためにも使用できる。

pTN5-9のM13変異型は、mpTn5-9構成のためにEcoRI/Hi
ndIIITn5フラグメントをM13mp10にサブクローニングす
ることにより構成した（第２図参照のこと）。この構成
の結果、Tn5DNAは、M13mp10のポリリンカーと置換す
る。

6.3.第２プローブの構成５つの第２プローブは、いくつかはpEMBL8＋，そして
全てをM13mp10ベクター中で構成された。各パッケージ
化組換えssDNAは、Tn5（＋）2.8Kbpフラグメントの異な
るセグメントを含み、ssDNA第１プローブカセットに含
まれた全長Tn5（−）配列に対して反対配向（アンチセ
ンス）で挿入した。Tn5（＋）特異DNAは、234〜871bps
範囲の第２プローブに挿入する（第３図）。各第２プロ
ーブの構成を下記に示す：第２プローブpVF1とmpVF1:27
0bpTn5Bg1II/PvuIIフラグメント（Bg1IITn5フラグメン
トのヌクレオチド１〜270）は、pVF1を構成するためにB
amHI/HindIIにおいてpEMBL8＋に挿入された。M13変異
型、即ちmpVF1は、フラグメント含有EcoRI/HindIIITn5
をpVF1からM13mp10にサブクローニングすることにより
構成した。

第２プローブpVF2とmpVF2:246bpTn5XhoIIフラグメン
ト（Bg1IITn5フラグメントのヌクレオチド336〜582）
は、BamHI部位においてpEMBL8＋に挿入された。「アン
チセンス」方向にフラグメントを有するポジティブ
（正）な形質転換細胞は、pVF2を生産するために正常な
配向用の他の制限酵素分析により選ばれた。M13変異
型、即ちmpVF2は、Tn5フラグメントをM13mp10にサブク
ローニングすることで構成した。

第２プローブmpVF3:238bpTn5HindIIフラグメント（Bg
lIITn5フラグメントのヌクレオチド1170〜1408）は、Hi
ndII部位においてM13mp10に挿入された。ポジティブ
（正）は形質転換細胞は、その上制限酵素消化により
“アンチセンス”配向用にスクリーンされ、mpVF3は同
定された。

第２プローブpVF4とmpVF4:234bpTn5BamHI/BalＩフラ
グメント（BglIITn5フラグメントのヌクレオチド1542〜
1776）は、pVF4を構成するためにBamHI/HindIIにおいて
pEMBL8＋に挿入された。M13変異型、即ちmpVF4は、EcoR
I/HindIIIフラグメントをM13mp10にサブクローニングす
ることにより同様に構成した。

第２プローブmpVF5:871bpTn5NruI/Bg1IIフラグメント
（BglIITn5フラグメントのヌクレオチド1914〜2785）
は、mpVF5を構成するためにSamI/BamHI部位においてM13
mp10に挿入された。

7.実施例：増幅放射性標識ハイブリダイゼーション検定
法に使用する標的DNAの検出 SV40標的DNA配列を検出するために第６節で構成され
た第１プローブカセットと第２プローブの使用法は、下
記小部に示される。この終りまでに、SV40標的DNAは、S
V40標的配列に特異な第１プローブを構成するために第
１プローブカセットの多クローニング部位にクローンし
た。ハイブリダイゼーションは、第２プローブに組み込
んだ放射性リポーターグループを介して検出した。下記
小部に開示したデータは、発生した増幅信号が本発明の
検定法を使用して少量の標的SV40DNA配列の検定の余地
を認めることを示す。

7.1原料と方法 7.1.1標的配列の第１プローブカセットへの挿入 SV40配列は、試験標的DNAとして使用された。SV40標
的含有第１プローブを構成するために、SV40初期領域Ｔ
−抗原遺伝子からの525bpHindIIIDNAフラグメント（SV4
0マップのヌクレオチド3476〜4002）は、第１プロー
ブ、pTn5-94またはmpTn5-94をそれぞれ構成するためにp
TN5-9のHiNdIII部位またはmpTN5-9カセット挿入された
（第4A図参照のこと）。SV40DNAとTn5（−）DNA挿入を
含む一本鎖第１プローブは、第6.1節の記載のように精
製した。

7.1.2第２プローブの放射性標識化第6.3節で構成した第２プローブは、インビボで³²ＰO
₄（50-1000Ci/mM,ニューイングランドニュクリアー，
マサチューセッツ州）を用いて標識化し、そしてTn5
（＋）挿入を含む一本鎖第２プローブは、第6.1節記載
のように精製した。

7.1.3ハイブリダイゼーションの手順ニトロセルロースフィルター［シュライヒャーア
ンドシュエル（Schleicher and Schuell）］を10×
SSCに予め浸し、シュライヒャーアンドシュエル最
小倍ドットブロット装置に取付けた。一本鎖DNAサンプ
ルは、10×SSCと50ng支持体サケ精子ssDNA含有25μｌ容
積に適用し、そして10×SSCで充分に洗浄した。フィル
ターは、真空下、80℃で１〜２時間ベーク（bake）し
た。ブロット調製は、本質的にトーマス（Thomas）によ
る記載のようであった。［1980年プロシーディングス
オブザナショナルアカデミーオブサイエンス
オブジユナイテッドステーツオブアメリカ
77巻5201-5205（1980,Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.,7
7:5201-5205）］．。ブロットは、50mMトリスHCl,pH7.
5,0.5％SDS,1mM EDTA,3×SSC,I×デンハルト（Denhard
t′ｓ）溶液、1mg/mlサケ精子ssDNA（そして指示された
ように50％ホルムアミドで）において、43℃（ホルムア
ミド）または68℃（水性）で４時間〜一夜の間、プレハ
イブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、前記の
ように一夜100μg/mlサケ精子DNAで行なった。注意すべ
きことを除き、フィルターを次のように洗浄した:25℃
において２×SSC,0.5％SDS（ナトリウムドデシルサルフ
ェート）中において２×５分間;0.1×SSC、0.5％SDSに
おいて68℃で60分間;0.1×SSC、0.5％SDSにおいて68℃
で20分間、放射性スポットは、コダックXAR-5フィルム
と増度スクリーンを用いて−70℃でオートラジオグラフ
ィーを使用して検出した。

7.2.標的DNAの検出第２プローブDNA類が標的DNA配列にハイブリダイズし
た第１プローブを充分に検出できることを示すデモンス
トレーションは、線状プローブを利用するドット−ブロ
ット実験において行なわれた。この終りに至るまでに、
プローブDNAsの全ては（標識と未標識）線状化された
（第４図参照のこと）。一本鎖第１プローブを線状化す
るために、ファージベクターポリリンカーPstＩ部
位に相補的である（即ち、５′GACCTGCAGCCA-3′に相補
的）一本鎖オリゴヌクレオチド12残基長は、応用バイオ
システムシンセサイザーを使用して合成した。合成ヌ
クレオチドは、その後制限酵素PstＩで消化される二本
鎖PstＩ認識部位を生産するために、10:1のモル比で環
状第１プローブにアニールした。この部位は、第１プロ
ーブのTn5（−）とSV40 DNAエレメントを線状分子の両
端に分離するために選ばれた。５つの放射標識第２プロ
ーブを線状化するために、類似計画は、EcoRI部位に相
補的なオリゴヌクレオチドを用いて行なわれた（第4A図
参照のこと）。

SV40標的DNAを、HindIIIで消化、変性し、ニトロセル
ロースフィルターに適用した。100ng〜100pgは、50ngの
サケ精子ssDNA支持体の存在下で適用した。プレハイブ
リダイゼーション後、１つのブロットは、約200ng/ml標
識第１プローブでハイブリダイズされた（約1.2×10⁵cp
m）。第5A図参照のこと。他のブロットは、最初に約100
ng/ml非標識第１プローブでハイブリダイズされ、200ng
/ml標識プローブ（約1.5×10⁶cpm）で続けられた。第4B
と5B図を参照のこと。標識第１プローブ量は、５つの結
合した第２プローブの1/10、むしろ1/15であった。それ
にもかかわらず、第５図は、本発明の増幅システムを明
白に示す。これらの結果は、標識第２プローブ族を用い
るハイブリダイゼーションが標識化第１プローブ単独よ
りも約５〜25倍より感度が高いことを示す（第5A図と5B
図において1.0ngと0.1ngSV40 DNAスポットを比較せ
よ）。これらの結果は、非標識第１プローブが標的SV40
DNA配列にハイブリダイズし、そして次々と５つの標識
第２プローブまで結合したことを示す（線図的に複合し
たハイブリダイゼーションを示す第4B図を参照のこ
と）。

8.実施例：ハイブリダイゼーション複合体の超微細分析第１プローブカセットと第2DNAプローブ間に形成され
たハイブリダイゼーション複合体は、電子顕微鏡で観ら
れた。

DNAプローブの全ては、第６節で調製された精製ssDNA
からなる。第２プローブは、１分子当り約１つのニック
を生ずる100℃における５分間インキュベーションで線
状化した。第１プローブは、真正ハイブリダイゼーショ
ン複合体の同定を助けるために一本鎖環状体として保持
された。５つの第２プローブの３つだけは、複合体の顕
在化を促進するためにハイブリダイゼーション検定法に
おいて使用された。約20ngの環状第１プローブと20ngの
各第２プローブは、電子顕微鏡観察のためアリコートが
除去される前に、50％フォルムアミドと、５×SSC中に
おいて43℃で４時間ハイブリダイズした。

ハイブリダイゼーション後、DNAサンプルをデービス
等（Davis et al）の方法に従ってハイポフェース（hyp
ophase）上に散布し［1971年メソーズエンザイモロジ
ー 21巻 413-428頁（1971,Methods Enz.21:413-42
8）］、パーロディアン（parlodian）被覆銅グリッド
（３％）上に拾い上げ、ペントン（Penton）真空電子ビ
ームガンを用いて約８度の角度でタングステン白金回転
シャドウ法にかけた。DNA類は、ツァイス（Zeiss）電子
顕微鏡で観察され、写真でとった。陰画における初期倍
率は6300〜40,000であった。

観察されたハイブリダイゼーション複合体において、
３つの線状第２プローブは、ハイブリダイゼーション複
合体中の１つの環状第１プローブに結合していることが
明白であった。複合体を注意深く観察すると、３つの第
２プローブは環の約1/3〜1/2を囲む第１プローブ領域に
ハイブリダイズしたことが示された。このことは、ハイ
ブリダイゼーションが第１プローブTn5（−）DNAエレメ
ント（DNA環の約40％を表わす）と第２プローブにおけ
る相補的Tn5（＋）エレメント間に特に生ずるかどうか
のみを期待すべきだ。

9.実施例：非放射性標識を使用するハイブリダイゼーシ
ョン複合体の実証下記小部におけるデータは、非放射性リポーターグル
ープを使用するハイブリダイゼーション複合体の検出を
示す。第２プローブが非放射性リポーターグループを使
用して第１プローブを充分に検出できることを示すため
に、充分に研究されたアビジン−ビオチン系を使用した
［ランガー等.,1981年ピーエヌエーエス78巻6633-6637
（Langer et al.,1981,PNAS 78:6633-6637）］。この系
は、アビジンとビオチン間の極めて高い結合定数を利用
し［グリーン,1975年、アドバンシスインプロティ
ンケミストリー29巻 85-133頁（Green,1975,Adv.Pro
t.Chem.29:85-133）］、アビジン結合リポーターグルー
プが使用される際に微少量のビチオンを検出する。この
終りに至るまでに、第２プローブは下記のようにビオチ
ン化され、ドットブロットフォーマットで第１プロ
ーブカセットと伴に使用された。ビオチン化第２プロー
ブの第１プローブカセットへのハイブリダイゼーション
は、ドットブロットフォーマットにおいてアビジン
結合酵素比色法を用いて検出した。

9.1.原料と方法：ホトビオチニレーションと色の展開フォトビチオンアセテートの一本鎖プローブDNA類へ
のフォトクロスリンク（光架橋）は、供給者の指示に従
って［ブレサリミテッドオーストラリア；とフォー
スター等.,1985年ニュクレイックアシッズリサー
チ 13巻:745〜761頁（Bresa Ltd.Australia;and Forst
er et al.,1985,Nucl.Acids Res.13:745-761）］、450
ワットの水銀放電ランプ（フィリップスMLR500W）を使
用して種々の時間行なった。一本鎖第2DNAプローブは、
フォトビチオンアセテート、即ち、可視光線の照射後
ssDNA誘導体を合成する光活性化ビチオン類似体と反応
させた［フォースター等,1985年ニュクレイックアシ
ッズリサーチ 13巻:745〜761頁（Forster et al.,19
85,Nucl.Acids Res.13:745-761）］。フォトビチオンが
DNAにおいて約１％のヌクレオチドのみ標識化するため
に使用される（より高いレベルは、沈降とハイブリダイ
ゼーションの減少を導く）ために、修飾の程度は、反応
時間を変更することで決定した。５〜15分照射が最適架
橋密度を生ずることが見い出された。これらの反応条件
がこの研究において使用された。

色の展開は、アビジン−アルカリ性フォスファターゼ
を用いて行なった［ブレサリミテッド、オーストラリ
ア（Bresa Ltd.Australia）］。フィルターを遮断し、
色の展開は製造会社の指示に従って行なった。色の展開
後、フィルターを固定し、10mMトリスHClpH8、1mMEDTA
中に貯蔵した。

9.2.ハイブリダイゼーション複合体の検出プローブ複合体ハイブリダイゼーションを示すため
に、減少量の一本鎖第１プローブカセット（第６節で構
成されたもの）をニトロセルロースフィルターに適用し
た。第１プローブカセットは、EcoRIで最初に消化され
る非修飾第１プローブカセットdsDNAプラスミド（pTn5-
9）から調製され、ファージベクターSSDNAが働いたほう
がよいけれども使用前に変性された。10倍連続希釈溶液
は、50ng〜5pgの範囲で使用された。約15ngの各環状ビ
オチン第２プローブ（即ち、pVF1,pVF2,mpVF3、pVF4とm
pVF5）は、水性条件（68℃，一夜）で第１プローブカセ
ットにハイブリダイズさせた。ブロットは、高温洗浄が
37℃に低下することを除いて前記のように洗浄した。第
２プローブの第１プローブカセットへのハイブリダイゼ
ーションは、アビジン−リンク化アルカリ性フォファタ
ーゼと比色法（ニトロブルーテトラゾリウム）を使用し
て検出した。色の展開は、４時間のインキュベーション
後終了した。

この実験結果は、第６図に示される。レーン１は、減
少量の対照、即ち基準として約立つビオチンM13ssDNAを
含む。M13DNAは約１〜２％のレベルへ修飾される。検定
法において使用される第２プローブDNA類は、５分（レ
ーン２）または15分（レーン３）のいずれか用に光ビチ
オン化された。

ほんの４時間の光の展開後、ハイブリダイゼーション
複合体は、500から50pg範囲にまで明らかに検出され
た。事実、ハイブリダイゼーション複合体は、明確では
ないが5pg範囲においてさえも観察できる。しかしなが
ら、これらの実験は、システムの最高感度を決定するた
めに設計されたものではないことを指摘することが重要
である。より高い感度は、修飾第２プローブを展開時間
同様に増すことにより明らかに達成される。極微少量の
修飾第２プローブDNAsが使用され、そして色の展開は、
たった４時間後に終結した。しかし、これらの結果は、
極微少量の第１プローブDNAが非放射読み取りシステム
を使用して修飾第２プローブにより簡単に検出されるこ
とを示す。M13DNA基準との比較により、これらの結果
は、約５％の注入第２プローブDNAsが実際に第１プロー
ブに結合することも示す。このことは、固相法ハイブリ
ダイゼーションに対して期待した効果範囲であることが
明白である。

9.3.信号増幅本発明の方法を用いて達成された増幅をさらに示すた
めに、ドットブロットハイブリダイゼーション実験
は、第１プローブカセットが1,2,3,4または５つ全ての
ビチオン第２プローブを使用して検出することで行なっ
た。この実験において、100ngスポットの一本鎖第１プ
ローブカセットpTn5-9は、前記のようにニトロセルロー
スフィルターに適用した。個々のフィルターは、その後
１〜５個のビチオン第２プローブ（各々50ng）でハイブ
リダイズした。フィルターを洗浄し、前記のように色の
展開を行なった。発色反応は、４時間で終了した。フィ
ルターは、得られた増幅度を評価するためにデンシトメ
ーターで走査した。結果を後記第１表に示す。吸収プロ
ットは、第１表において各実験の相対ピーク面積を与え
るために自動的に積分した。

第１表の結果は、発生した信号増幅度が検出システム
において使用された第２プローブ数に直接関係すること
を示す。

本発明は、これらの実施態様が本発明の各種態様を示
すことを目的としており、そして機能的に同一の実施態
様が本発明の範囲内であるために、開示された実施例に
よりその範囲が限定されるべきではない。事実、ここに
示されかつ記載されたものに加えて本発明の各種変更
は、当業者にとって前記の記述および添付図面から明ら
かになるであろう。かかる変更は、添付請求の範囲内に
入るであろう。

またKbpとbpに関する全ては約であることに注意すべ
きである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 (56)参考文献特開昭60−93355（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−237361（ＪＰ，Ａ) 西独国特許出願公開3420925（ＤＥ，Ａ１)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）標的ヌクレオチドをハイブリダイゼ
ーションを許容する条件下に、（ｉ）標的ヌクレオチド
配列に相補的であるポリヌクレオチド配列と標的配列に
結合不可能な結合部位を有するポリマー尾部とからなる
第１プローブおよび（ii）信号発生プローブ群よりな
り、その各メンバーが信号発生成分と第１プローブの尾
部の一部に結合可能なポリマーとからなる複数の第２プ
ローブと接触させ；そして（ｂ）階段（ａ）で生成した反応生成物により発生した
信号を検出する；ことよりなる標的ヌクレオチド配列の検出方法。
【請求項２】第１プローブの尾部が合成ポリマーからな
る請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】第１プローブの尾部が天然ポリマーからな
る請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項４】第１プローブの尾部が一本鎖ヌクレオチド
ポリマーからなる請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項５】ヌクレオチドポリマーがデオキシリボ核酸
からなる請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項６】ヌクレオチドポリマーがリボ核酸からなる
請求の範囲第４項に記載の方法。
【請求項７】第２プローブが合成ポリマーからなる請求
の範囲第１項に記載の方法。
【請求項８】第２プローブが天然ポリマーからなる請求
の範囲第１項に記載の方法。
【請求項９】第２プローブがヌクレオチドポリマーから
なる請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１０】第２プローブがデオキシリボ核酸からな
る請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１１】第２プローブがリボ核酸からなる請求の
範囲第９項に記載の方法。
【請求項１２】第２プローブの信号発生成分が発色団か
らなる請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１３】第２プローブの信号発生成分が放射性化
合物からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１４】第２プローブの信号発生成分が検出可能
な生成物を形成する酵素−基質系からなる請求の範囲第
１項に記載の方法。
【請求項１５】酵素がβ−ガラクトシダーゼからなる請
求の範囲第14項に記載の方法。
【請求項１６】酵素がアルカリ性フォスファターゼから
なる請求の範囲第14項に記載の方法。
【請求項１７】第２プローブの信号発生成分が蛍光化合
物からなる請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項１８】蛍光化合物が一本鎖核酸分子のエテノ
（etheno）誘導体からなる請求の範囲第17項に記載の方
法。
【請求項１９】信号発生成分が薬剤を介して第２プロー
ブに間接的に付着したリポーターグループからなる請求
の範囲第１項に記載の方法。
【請求項２０】リポーターグループがアビジンに付着
し、第２プローブがビオチン化されている請求の範囲第
19項に記載の方法。
【請求項２１】第２プローブが一本鎖核酸分子からな
り、かつ薬剤が一本鎖結合蛋白質からなる請求の範囲第
19項に記載の方法。
【請求項２２】（ａ）標的ヌクレオチド配列に相補的な
ポリヌクレオチド配列と標的配列に結合不可能な結合部
位を有するポリマー尾部とからなる第１プローブ；および（ｂ）信号発生プローブ群よりなり、その各メンバーが
信号発生成分と第１プローブの尾部の一部に結合可能な
ポリマーとからなる複数の第２プローブ；よりなる標的ヌクレオチド配列の検出用のハイブリダイ
ゼーション検定キット。
【請求項２３】第１プローブの尾部が合成ポリマーから
なる請求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項２４】第１プローブの尾部が天然ポリマーから
なる請求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項２５】第１プローブの尾部が一本鎖ヌクレオチ
ドポリマーからなる請求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項２６】ヌクレオチドポリマーがデオキシリボ核
酸からなる請求の範囲第25項に記載のキット。
【請求項２７】ヌクレオチドポリマーがリボ核酸からな
る請求の範囲第25項に記載のキット。
【請求項２８】第２プローブが合成ポリマーからなる請
求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項２９】第２プローブが天然ポリマーからなる請
求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項３０】第２プローブがヌクレオチドポリマーか
らなる請求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項３１】第２プローブがデオキシリボ核酸からな
る請求の範囲第30項に記載のキット。
【請求項３２】第２プローブがリボ核酸からなる請求の
範囲第30項に記載のキット。
【請求項３３】第２プローブの信号発生成分が発色団か
らなる請求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項３４】第２プローブの信号発生成分が放射性化
合物からなる請求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項３５】第２プローブの信号発生成分が検出可能
な生成物を生ずる酵素−基質系である請求の範囲第22項
に記載のキット。
【請求項３６】酵素がβ−ガラクトシダーゼからなる請
求の範囲第35項に記載のキット。
【請求項３７】酵素がアルカリ性フォスファターゼから
なる請求の範囲第35項に記載のキット。
【請求項３８】第２プローブの信号発生化合物が蛍光化
合物からなる請求の範囲第22項に記載のキット。
【請求項３９】蛍光化合物が一本鎖核酸分子のエテノ誘
導体からなる請求の範囲第38項に記載のキット。
【請求項４０】信号発生成分が薬剤を介して第２プロー
ブに間接的に付着したリポーターグループからなる請求
の範囲第22項に記載のキット。
【請求項４１】リポーターグループがアビジンに付着
し、かつ第２プローブがビオチン化されている請求の範
囲第40項に記載のキット。
【請求項４２】第２プローブが一本鎖核酸分子からな
り、かつ薬剤が一本鎖結合蛋白質からなる請求の範囲第
40項に記載のキット。
【請求項４３】（ａ）（ｉ）標的ヌクレオチド配列を挿
入しかつクローン化できる多数のクローニング部位およ
び（ii）その相補体にハイブリダイズ可能な第２ヌクレ
オチド配列を有するクローニングベクターからなる第１
プローブカセット；および（ｂ）信号発生プローブ群からなり、その各メンバーが
信号発生成分と第１プローブカセットクローニングベク
ターの第２ヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能なヌ
クレオチド配列からなる複数の第２プローブ；からなる標的ヌクレオチド配列検出用のハイブリダイゼ
ーション検定キット。
【請求項４４】第２プローブの信号発生成分が発色団か
らなる請求の範囲第43項に記載のキット。
【請求項４５】第２プローブの信号発生成分が放射性化
合物からなる請求の範囲第43項に記載のキット。
【請求項４６】第２プローブの信号発生成分が検出可能
な生成物を形成する酵素−基質系からなる請求の範囲第
43項に記載のキット。
【請求項４７】酵素がβ−ガラクトシダーゼからなる請
求の範囲第46項に記載のキット。
【請求項４８】酵素がアルカリ性フォスファターゼから
なる請求の範囲第46項に記載のキット。
【請求項４９】第２プローブの信号発生化合物が蛍光化
合物からなる請求の範囲第43項に記載のキット。
【請求項５０】蛍光化合物が一本鎖核酸分子のエテノ誘
導体からなる請求の範囲第49項に記載のキット。
【請求項５１】信号発生成分が薬剤を介して第２プロー
ブに間接的に付着したリポーターグループからなる請求
の範囲第43項に記載のキット。
【請求項５２】リポーターグループがアビジンに付着
し、かつ第２プローブがビオチン化されている請求の範
囲第51項に記載のキット。
【請求項５３】第２プローブが一本鎖核酸分子からな
り、かつ薬剤が一本鎖結合蛋白質からなる請求の範囲第
52項に記載のキット。
【請求項５４】信号発生プローブ群からなり、その各メ
ンバーが信号発生成分と第１プローブの尾部の一部に結
合可能なポリマーとからなる複数の第２プローブを含
む、標的ヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド
配列と標的配列に結合不可能な結合部位を有するポリマ
ー尾部とを有する第１プローブにハイブリダイズした標
的ヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼー
ション検定キット。
【請求項５５】第２プローブが合成ポリマーからなる請
求の範囲第54項に記載のキット。
【請求項５６】第２プローブが天然ポリマーからなる請
求の範囲第54項に記載のキット。
【請求項５７】第２プローブがヌクレオチドポリマーか
らなる請求の範囲第54項に記載のキット。
【請求項５８】第２プローブがデオキシリボ核酸からな
る請求の範囲第57項に記載のキット。
【請求項５９】第２プローブがリボ核酸からなる請求の
範囲第57項に記載のキット。
【請求項６０】第２プローブの信号発生成分が発色団か
らなる請求の範囲第54項に記載のキット。
【請求項６１】第２プローブの信号発生成分が放射性化
合物からなる請求の範囲第54項に記載のキット。
【請求項６２】第２プローブの信号発生成分が検出可能
な生成物を形成する酵素−基質系からなる請求の範囲第
54項に記載のキット。
【請求項６３】酵素がβ−ガラクトシダーゼからなる請
求の範囲第62項に記載のキット。
【請求項６４】酵素がアルカリ性フォスファターゼから
なる請求の範囲第62項に記載のキット。
【請求項６５】第２プローブの信号発生化合物が蛍光化
合物からなる請求の範囲第54項に記載のキット。
【請求項６６】蛍光化合物が一本鎖核酸分子のエテノ誘
導体からなる請求の範囲第65項に記載のキット。
【請求項６７】信号発生成分が薬剤を介して第２プロー
ブに間接的に付着したリポーターグループからなる請求
の範囲第54項に記載のキット。
【請求項６８】リポーターグループがアビジンに付着
し、かつ第２プローブがビオチン化されている請求の範
囲第67項に記載のキット。
【請求項６９】第２プローブが一本鎖核酸分子からな
り、かつ薬剤が一本鎖結合蛋白質からなる請求の範囲第
67項に記載のキット。