JPH0552199B2 - - Google Patents
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- JPH0552199B2 JPH0552199B2 JP59123758A JP12375884A JPH0552199B2 JP H0552199 B2 JPH0552199 B2 JP H0552199B2 JP 59123758 A JP59123758 A JP 59123758A JP 12375884 A JP12375884 A JP 12375884A JP H0552199 B2 JPH0552199 B2 JP H0552199B2
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- enzyme
- polynucleotide
- stranded
- dna
- stranded polynucleotide
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
特定の構造を有するデオキシリボ核酸（DNA）
およびリボ核酸（RNA）の測定は生化学分野に
おいて重要であり、例えば人血清中のDNAを測
定することによつてウイルス感染の検査あるいは
遺伝性疾患の発見などを行なうことができる。本
発明はこのようなDNA及びRNAの特定のものを
簡便かつ正確に測定しうる方法を提供するもので
ある。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 従来、このDNA及びRNAの測定方法として
は、試料を変性処理して得た一本鎖DNA（Ｓ−
DNA）又は一本鎖RNA（Ｓ−RNA）を固相に結
合させ、この固相にラジオアイソトープを標識し
たＳ−DNA又はＳ−RNAを作用させて固相のＳ
−DNA又はＳ−RNAとバイブリツドを形成させ
てから未反応の標識Ｓ−DNA又はＳ−RNAを除
去し、固相の放射線を測定する方法が行なわれて
いた。この方法は測定の際に固定化、洗浄等数多
くの工程を必要とし、特に試料の固定化に長時間
を要するところから操作の労力及び時間の両方に
問題があつた。 本発明者らはこのような問題のない方法を開発
すべく種々検討の結果、予め標識された一本鎖ポ
リヌクレオチドを固相に結合させておき、この固
相に試料を変性処理させて得た一本鎖ポリヌクレ
オチドを作用させてハイブリツドを形成させ、ハ
イブリツドしたポリヌクレオチドを制限酵素で切
断する方法を案出し、その内容を既に特許出願
（特願昭58−199702号）した。しかしながら、こ
の方法もまだ固相の分離が必要であり、特に大量
の検体を一度に処理する臨床分析等にあつてはこ
の分離操作が煩雑であつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明はこのような問題点を解決するものであ
り、測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブ
リツドする一本鎖ポリヌクレオチドに一の酵素及
びこの酵素の作用による生成物質を基質とする他
の一の酵素を結合させ又はしうるようにし、この
二種の酵素による連続反応がこのポリヌクレオチ
ドの切断によつて変化することを利用している。 すなわち、本発明は、測定対象の一本鎖ポリヌ
クレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しう
る一本鎖ポリヌクレオチドに、酵素１と、酵素
１の作用により生成する物質を基質とする酵素２
とが、直接又は間接的に結合しているか、ある
いは酵素１及び酵素２がそれぞれ結合しうる親和
性物質が結合している、標識ポリヌクレオチド
に；測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドを接触さ
せて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；該二本
鎖ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチド制
限酵素を作用させて切断し；上記の場合には、
上記いずれかの段階で該親和性物質に酵素１及び
酵素２をそれぞれ結合させ；その後酵素２の活性
を測定することを特徴とするポリヌクレオチドの
測定方法である。 測定対象は一本鎖ポリヌクレオチド（以下、測
定対象ポリヌクレオチドという。）である。測定
対象ポリヌクレオチドにはDNA及びRNAを含
む。試料中に含まれるポリヌクレオチドが二本鎖
である場合には水酸化ナトリウム溶液の添加など
のアルカリ処理あるいは熱処理などにより一本鎖
にしておく必要がある。試料の種類は問わない
が、例えば人血清、尿、組織抽出物などである。
人血清などのようにポリヌクレオチドが蛋白と結
合しているおそれがある場合には試料をプロテア
ーゼ等を処理して蛋白を分離しておくのがよい。 この測定対象ポリヌクレオチドと接触させる一
本鎖ポリヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオ
チドという。）は、酵素１と、酵素１の作用によ
り生成する物質を基質とする酵素２とが、直接又
は間接的に前記一本鎖ポリヌクレオチドに結合し
ているか、あるいは酵素１及び酵素２がそれぞれ
結合しうる親和性物質が結合している。従つて、
この標識ポリヌクレオチドは測定対象ポリヌクレ
オチドに対するプローブである。一本鎖ポリヌク
レオチドは測定対象ポリヌクレオチドを含む二本
鎖ポリヌクレオチドをアルカリ処理、熱処理など
で変性させて用いればよい。その場合、相補性が
ある相手方の一本鎖ポリヌクレオチドは極力除去
する必要があり、そのため、電気泳動やイオン交
換クロマトグラフイーあるいはアフイニテイーク
ロマトグラフイーなどを利用して精製を行なうの
がよい。また、最近測定対象ポリヌクレオチド、
DNase Ｉ及びDNAポリメラーゼＩの存在下で
各種ヌクレオチドを次々と結合させるニツクトラ
ンスレーシヨン法や大腸菌を用いるcDNA作製法
等の直接一本鎖ポリヌクレオチドを合成する方法
が開発されており、これらの方法によつて合成す
ることも可能である。さらに検出プローブのみを
溶液中でアニーリングさせ、これに二本鎖ポリヌ
クレオチド制限酵素を作用させた後ゲル過して
混入している相補性ポリヌクレオチドを除去して
もよい。 酵素１及び酵素２は、酵素１の作用により生ず
る物質を酵素２が基質とする関係にあればよい。
このような酵素の組合せの例を次に示す。
およびリボ核酸（RNA）の測定は生化学分野に
おいて重要であり、例えば人血清中のDNAを測
定することによつてウイルス感染の検査あるいは
遺伝性疾患の発見などを行なうことができる。本
発明はこのようなDNA及びRNAの特定のものを
簡便かつ正確に測定しうる方法を提供するもので
ある。 （従来の技術及び発明が解決しようとする問題
点） 従来、このDNA及びRNAの測定方法として
は、試料を変性処理して得た一本鎖DNA（Ｓ−
DNA）又は一本鎖RNA（Ｓ−RNA）を固相に結
合させ、この固相にラジオアイソトープを標識し
たＳ−DNA又はＳ−RNAを作用させて固相のＳ
−DNA又はＳ−RNAとバイブリツドを形成させ
てから未反応の標識Ｓ−DNA又はＳ−RNAを除
去し、固相の放射線を測定する方法が行なわれて
いた。この方法は測定の際に固定化、洗浄等数多
くの工程を必要とし、特に試料の固定化に長時間
を要するところから操作の労力及び時間の両方に
問題があつた。 本発明者らはこのような問題のない方法を開発
すべく種々検討の結果、予め標識された一本鎖ポ
リヌクレオチドを固相に結合させておき、この固
相に試料を変性処理させて得た一本鎖ポリヌクレ
オチドを作用させてハイブリツドを形成させ、ハ
イブリツドしたポリヌクレオチドを制限酵素で切
断する方法を案出し、その内容を既に特許出願
（特願昭58−199702号）した。しかしながら、こ
の方法もまだ固相の分離が必要であり、特に大量
の検体を一度に処理する臨床分析等にあつてはこ
の分離操作が煩雑であつた。 （問題点を解決するための手段） 本発明はこのような問題点を解決するものであ
り、測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドとハイブ
リツドする一本鎖ポリヌクレオチドに一の酵素及
びこの酵素の作用による生成物質を基質とする他
の一の酵素を結合させ又はしうるようにし、この
二種の酵素による連続反応がこのポリヌクレオチ
ドの切断によつて変化することを利用している。 すなわち、本発明は、測定対象の一本鎖ポリヌ
クレオチドと二本鎖ポリヌクレオチドを形成しう
る一本鎖ポリヌクレオチドに、酵素１と、酵素
１の作用により生成する物質を基質とする酵素２
とが、直接又は間接的に結合しているか、ある
いは酵素１及び酵素２がそれぞれ結合しうる親和
性物質が結合している、標識ポリヌクレオチド
に；測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドを接触さ
せて二本鎖ポリヌクレオチドを形成させ；該二本
鎖ポリヌクレオチドに二本鎖ポリヌクレオチド制
限酵素を作用させて切断し；上記の場合には、
上記いずれかの段階で該親和性物質に酵素１及び
酵素２をそれぞれ結合させ；その後酵素２の活性
を測定することを特徴とするポリヌクレオチドの
測定方法である。 測定対象は一本鎖ポリヌクレオチド（以下、測
定対象ポリヌクレオチドという。）である。測定
対象ポリヌクレオチドにはDNA及びRNAを含
む。試料中に含まれるポリヌクレオチドが二本鎖
である場合には水酸化ナトリウム溶液の添加など
のアルカリ処理あるいは熱処理などにより一本鎖
にしておく必要がある。試料の種類は問わない
が、例えば人血清、尿、組織抽出物などである。
人血清などのようにポリヌクレオチドが蛋白と結
合しているおそれがある場合には試料をプロテア
ーゼ等を処理して蛋白を分離しておくのがよい。 この測定対象ポリヌクレオチドと接触させる一
本鎖ポリヌクレオチド（以下、標識ポリヌクレオ
チドという。）は、酵素１と、酵素１の作用によ
り生成する物質を基質とする酵素２とが、直接又
は間接的に前記一本鎖ポリヌクレオチドに結合し
ているか、あるいは酵素１及び酵素２がそれぞれ
結合しうる親和性物質が結合している。従つて、
この標識ポリヌクレオチドは測定対象ポリヌクレ
オチドに対するプローブである。一本鎖ポリヌク
レオチドは測定対象ポリヌクレオチドを含む二本
鎖ポリヌクレオチドをアルカリ処理、熱処理など
で変性させて用いればよい。その場合、相補性が
ある相手方の一本鎖ポリヌクレオチドは極力除去
する必要があり、そのため、電気泳動やイオン交
換クロマトグラフイーあるいはアフイニテイーク
ロマトグラフイーなどを利用して精製を行なうの
がよい。また、最近測定対象ポリヌクレオチド、
DNase Ｉ及びDNAポリメラーゼＩの存在下で
各種ヌクレオチドを次々と結合させるニツクトラ
ンスレーシヨン法や大腸菌を用いるcDNA作製法
等の直接一本鎖ポリヌクレオチドを合成する方法
が開発されており、これらの方法によつて合成す
ることも可能である。さらに検出プローブのみを
溶液中でアニーリングさせ、これに二本鎖ポリヌ
クレオチド制限酵素を作用させた後ゲル過して
混入している相補性ポリヌクレオチドを除去して
もよい。 酵素１及び酵素２は、酵素１の作用により生ず
る物質を酵素２が基質とする関係にあればよい。
このような酵素の組合せの例を次に示す。
【表】
フマラーゼ −マレートデヒドロゲナーゼ
これらは一例であり、酵素ハンドブツクあるい
は生化学ハンドブツクに記載されている各種酵素
のなかから適当な組合せを選択して使用すること
ができる。酵素には作用至適PHが中性のほか酸性
あるいはアルカリ性のものがあり、また、耐熱性
を有するものなど種々のものがあるから、測定条
件などに応じ適当なものを選択する。使用される
酵素は通常は２種類であるが、必要に応じ連続反
応する関係にある３種以上の酵素を使用すること
もできる。 酵素１及び酵素２を直接又は間接的に一本鎖ポ
リヌクレオチドに結合させるには、水溶液中で容
易に酵素１及び酵素２を結合しうる親和性物質を
介して行われる。直接結合させる場合、例えば酵
素１及び酵素２のそれぞれに対する抗体に結合さ
せるか、抗体の代りにハプテンを用いてもよい。
間接的に結合しうる親和性物質としては、例えば
一本鎖ポリヌクレオチドに結合したビオチンに、
酵素１及び酵素２がそれぞれ結合したアビジンを
結合させる場合のビオチン−アビジンがこれに相
当する。 あるいは別の実施態様として、酵素１及び酵素
２がそれぞれ結合しうる親和性物質、例えばビオ
チンを一本鎖ポリヌクレオチドに結合させたもの
を標識ポリヌクレオチドとして用い、これを測
定対象のポリヌクレオチドと接触させてバイブリ
ツドする段階、これを制限酵素で切断する段
階、のそれぞれの前又は後に、酵素１及び酵素２
がそれぞれ結合したアビジンを反応させて上記間
接法と同様にビオチン−アビジンを介して酵素１
及び酵素２をポリヌクレオチドに結合させてもよ
い。 酵素１及び酵素２を直接又は間接的に標識ポリ
ヌクレオチドとなる一本鎖ポリヌクレオチドに結
合させる方法は、例えば公知のビオチン・アビジ
ン法に準じて行えばよい。酵素１及び酵素２をポ
リヌクレオチドに結合させる間隙は10〜1000Å程
度が適当であり、このような間隔で結合されるよ
うにこれらの添加量あるいは反応条件などを調節
するのがよい。 このような標識ポリヌクレオチドを測定対象ポ
リヌクレオチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオ
チドを形成させる。接触時間は通常は測定対象ポ
リヌクレオチドが標識ポリヌクレオチドと充分に
反応してバイブリツドを形成しうる程度である
が、例えば0.5〜40時間程度が適当である。温度
は20〜70℃程度、PHは５〜９程度がよい。 二本鎖ポリヌクレオチドを形成させたのちはこ
れに二本鎖ポリヌクレオチド制限酵素（以下、単
に制限酵素という。）を作用させる。この制限酵
素は二本鎖ポリヌクレオチドにのみ特異的に作用
するものがよく、また、認識ポリヌクレオチド鎖
のあまり長くないもののほうが好ましい。制限酵
素は１種のみでなく、２種以上を併用してもよ
い。制限酵素を作用させる時期は通常は測定対象
ポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドとの反
応終了後であるが、測定対象ポリヌクレオチドと
同時あるいはその前に反応系に添加しておいてよ
い場合もある。 制限酵素を作用させたのちはポリヌクレオチド
に結合されている酵素２の活性を測定する。この
反応は公知の活性測定方法により測定すればよ
く、これらの共役酵素や化学物質を利用して比色
定量あるいは蛍光、発光等を定量するなどすれば
よい。 （作用） 標識ポリヌクレオチドは測定対象ポリヌクレオ
チドとハイブリツドを形成する。ハイブリツドを
形成することによつて制限酵素が働いてこの二本
鎖ポリヌクレオチドを切断する。その結果、標識
ポリヌクレオチドに結合されている酵素１と酵素
２との距離が離れて連続反応が起こりにくくな
る。そこで酵素２による反応速度が低下する。 （発明の効果） 本発明の方法は、従来の方法と異なり、測定対
象ポリヌクレオチドを固相に固定するという煩雑
な操作がなく、先願の方法に比しても固液分離及
びそれに付随する洗浄効果が不要な点でさらに簡
便にされている。 （実施例） HBV−DNAプローブの調製 500mlの慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を
9000rpmで15分間遠心し、得られた上清を４℃
100000×ｇで５時間超遠心してＢ型肝炎ウイルス
（HBV）粒子をペリツトとして集めた。このペレ
ツトを0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％２−メ
ルカプトエタノール及び0.1％BSAを含む0.01M
トリス−塩酸緩衝液（PH7.5）10mlに溶かし、こ
のウイルス溶液のうち５mlを保存し、残５mlを
100000×ｇで再度５時間超遠心してペレツトを得
た。 このペレツトを0.5％NP−40を含む10mMトリ
ス−塩酸、0.1M NaClPH7.5溶液200μで処理
し、DNAポリメラーゼを活性化した。この溶液
に1mM dATP、1mM dTTP、
2.5μM32PdGTP、2.5μM32PdCTPを含む0.08M
MgCl2 0.2Mトリス緩衝液（PH7.5）50μを加
えて３時間加温した。この溶液を30％シユークロ
ース溶液の入つた遠心チユーブに重層し、SW65
ローター（ベツクマン社製）を用い50000rpmで
３時間遠心してペレツトを得た。このペレツトを
プロナーゼで処理し、得られた溶液をフエノール
で２回抽出処理した。抽出液を５〜20％シユーク
ロースグラジエントで50000rpmにて３時間遠心
して15S32PDNA分画を集めこれをプールした。
この分画から15S32PDNAをエタノールを用いて
沈澱させ、乾燥して目的のHBV−DNAを得た。 一本鎖HBV−DNAの調製 次に、5mM MgCl2、10mM2−メルカプトエ
タノール、5μM dTTP、5μM dGTP、5μM
dCTP、5μM dATP、10μMアミノヘキシル
dATP及び10μMアミノヘキシルdCTPを含む
50mMトリス−HCl緩衝液（PH7.5）100μにや
はりHBV−DNA1μｇ、DNase I100pｇ及び
DNAポリメラーゼI100pｇを加えて15℃で90分間
インキユベートした。この溶液をやはりフエノー
ルで抽出し、Sephadex Ｇ−50カラムで精製して
修飾型HBV−DNAを得た。この二本鎖HBV−
DNA1mg（１ml）とHBV−DNAを導入した一本
鎖M13−フアジDNA5mg（２ml）にホルムアミド
８mlを加え、５分間この混合液を沸とうさせた。
次に、これに２mlの緩衝液（0.07モル／トリス
−HCl2モル／NaCl、15mM EDTAPH7.5）を
加え、50℃で４時間そしてさらに60℃で１時間加
温した。 この反応液をBio−Gel A50ｍでゲル過し、
ハイブリツドしたDNAと未反応のDNAを分離し
た。ボイド分画の近くに溶出される最初のピーク
を分画し、これにNaClが0.1Mになるように粉末
を加えて溶かした。そして、さらに100％エタノ
ールを溶液１mlに対し２倍の比率（２ml）で加
え、−70℃で２時間放置した。次に、17000×ｇで
10分間遠心し、エタノール沈澱物を50mlの0.1N
NaOH、0.25mM EDTA、0.001％フエノールレ
ツドで溶解した。ただちにこれをBio−Gel A50
でゲル過し、目的の一本鎖HBV−DNAを得
た。 ビオチン化一本鎖HBV−DNAの調製 で調製した一本鎖HBV−DNA100μｇにビオ
チンのサクシンイミドエステル1μｇをPH8.0の炭
酸緩衝液中で37℃で２時間反応させた。これをセ
フアデツクスＧ−25でゲル過し、ボイド分画を
60℃で一夜放置した。この溶液にｄ−DNA制限
酵素溶液（Hae 、Hae 、Hap 、Bgl
、Ava 各1U／ml、10mMトリス−HCl、
7mM MgCl2、7mM2−メルカプトエタノール、
PH7.5）１mlを加え、37℃で１時間反応させた。
この反応物をセフアデツクスＧ−100でゲル過
し、ボイド分画をプールしてこれに除蛋白処理を
行なつた。 SH化アビジンの調製 アビジン２mgを0.1Mリン酸緩衝液PH7.5に溶か
した溶液１mlにSPDP200μｇを含むDMF溶液
100μを加え、室温で30分間反応させた。これ
を1mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液PH7.0で
平衡化したセフアデツクスＧ−25のカラムに入れ
同じ液で展開してゲル過を行なつた。ボイド分
画をプールし、これに２−メルカプトエチルアミ
ン200μｇを加えて37℃で３時間攪拌した。続い
て上記のセフアデツクスＧ−25のカラムを用いて
同様にゲル過し、SH化アビジン２mgを得た。 CHM化ヘキソキナーゼ ヘキサキナーゼ１mgを含む0.1Mリン酸緩衝液
PH7.01mlにシクロヘキシル−４−マレイミドメチ
ルシクロヘキサン−１−カルボン酸サクシンイミ
ドエステル（CHMS）200μｇを含むDMF溶液
100μを加え、室温で１時間放置した。これを
前項と同じセフアデツクスＧ−25のカラムでゲル
過し、ポイド分画をプールした。 アビジン結合ヘキソキナーゼの調製 で調製したSH化アビジン１mgにで調製し
たCHM化ヘキソキナーゼ１mgを加え、37℃で90
分間反応させた。次に、これをACA34カラムで
ゲル過し、アビジンとヘキソキナーゼの１：１
の結合物を分取した。 アビジン結合グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼの調製 と同様の方法で調製したCHM化グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼ１mgを含む溶液１
mlにのSH化アビジン500μｇを含む溶液１mlを
加え、37℃で90分間反応させた。反応物を
ACA34カラムでゲル過し、アビジンとグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの１：１の結
合物を分取した。 DNAの測定 HBウイルス性肝炎患者血清100μに0.5N
NaOH100μを加えて室温で10分間攪拌した。
次に、0.5NHCl100μを加えさらに200μｇ／ml
のプロテイナーゼＫ溶液200μを加えて70℃で
１時間反応させた。これに項で調製したビオチ
ン化一本鎖HBV−DNA200μを加え、37℃で一
夜放置した。ｄ−DNA制限酵素溶液（Bgl 、
Ava 、Hae 、Hae 、Hap 、
Hinc 各1U／ml、10mMトリス−HCl、7mM
MgCl2、70mM NaCl、7mM ２−メルカプトエ
タノール、PH7.5）を1.0ml加えて37℃で１時間反
応させた。反応後、アビジン結合ヘキソキナーゼ
及びアビジン結合グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを各々1.0μｇ含む溶液100μを加え、
さらに基質液（0.1Mグリシルグリシン、20mM
MgCl2グルコース50mg／ml、0.5mM ATP、
0.5mM NADP+、PH8.0）３mlを加え、NADPH
の増加を340nmの吸光度を測定することによりレ
ートアツセイした。 図面は得られた結果を示すものであり、縦軸は
吸光度をそして横軸は血清の希釈度をそれぞれ表
わしている。
これらは一例であり、酵素ハンドブツクあるい
は生化学ハンドブツクに記載されている各種酵素
のなかから適当な組合せを選択して使用すること
ができる。酵素には作用至適PHが中性のほか酸性
あるいはアルカリ性のものがあり、また、耐熱性
を有するものなど種々のものがあるから、測定条
件などに応じ適当なものを選択する。使用される
酵素は通常は２種類であるが、必要に応じ連続反
応する関係にある３種以上の酵素を使用すること
もできる。 酵素１及び酵素２を直接又は間接的に一本鎖ポ
リヌクレオチドに結合させるには、水溶液中で容
易に酵素１及び酵素２を結合しうる親和性物質を
介して行われる。直接結合させる場合、例えば酵
素１及び酵素２のそれぞれに対する抗体に結合さ
せるか、抗体の代りにハプテンを用いてもよい。
間接的に結合しうる親和性物質としては、例えば
一本鎖ポリヌクレオチドに結合したビオチンに、
酵素１及び酵素２がそれぞれ結合したアビジンを
結合させる場合のビオチン−アビジンがこれに相
当する。 あるいは別の実施態様として、酵素１及び酵素
２がそれぞれ結合しうる親和性物質、例えばビオ
チンを一本鎖ポリヌクレオチドに結合させたもの
を標識ポリヌクレオチドとして用い、これを測
定対象のポリヌクレオチドと接触させてバイブリ
ツドする段階、これを制限酵素で切断する段
階、のそれぞれの前又は後に、酵素１及び酵素２
がそれぞれ結合したアビジンを反応させて上記間
接法と同様にビオチン−アビジンを介して酵素１
及び酵素２をポリヌクレオチドに結合させてもよ
い。 酵素１及び酵素２を直接又は間接的に標識ポリ
ヌクレオチドとなる一本鎖ポリヌクレオチドに結
合させる方法は、例えば公知のビオチン・アビジ
ン法に準じて行えばよい。酵素１及び酵素２をポ
リヌクレオチドに結合させる間隙は10〜1000Å程
度が適当であり、このような間隔で結合されるよ
うにこれらの添加量あるいは反応条件などを調節
するのがよい。 このような標識ポリヌクレオチドを測定対象ポ
リヌクレオチドと接触させて二本鎖ポリヌクレオ
チドを形成させる。接触時間は通常は測定対象ポ
リヌクレオチドが標識ポリヌクレオチドと充分に
反応してバイブリツドを形成しうる程度である
が、例えば0.5〜40時間程度が適当である。温度
は20〜70℃程度、PHは５〜９程度がよい。 二本鎖ポリヌクレオチドを形成させたのちはこ
れに二本鎖ポリヌクレオチド制限酵素（以下、単
に制限酵素という。）を作用させる。この制限酵
素は二本鎖ポリヌクレオチドにのみ特異的に作用
するものがよく、また、認識ポリヌクレオチド鎖
のあまり長くないもののほうが好ましい。制限酵
素は１種のみでなく、２種以上を併用してもよ
い。制限酵素を作用させる時期は通常は測定対象
ポリヌクレオチドと標識ポリヌクレオチドとの反
応終了後であるが、測定対象ポリヌクレオチドと
同時あるいはその前に反応系に添加しておいてよ
い場合もある。 制限酵素を作用させたのちはポリヌクレオチド
に結合されている酵素２の活性を測定する。この
反応は公知の活性測定方法により測定すればよ
く、これらの共役酵素や化学物質を利用して比色
定量あるいは蛍光、発光等を定量するなどすれば
よい。 （作用） 標識ポリヌクレオチドは測定対象ポリヌクレオ
チドとハイブリツドを形成する。ハイブリツドを
形成することによつて制限酵素が働いてこの二本
鎖ポリヌクレオチドを切断する。その結果、標識
ポリヌクレオチドに結合されている酵素１と酵素
２との距離が離れて連続反応が起こりにくくな
る。そこで酵素２による反応速度が低下する。 （発明の効果） 本発明の方法は、従来の方法と異なり、測定対
象ポリヌクレオチドを固相に固定するという煩雑
な操作がなく、先願の方法に比しても固液分離及
びそれに付随する洗浄効果が不要な点でさらに簡
便にされている。 （実施例） HBV−DNAプローブの調製 500mlの慢性Ｂ型肝炎患者のプール血清を
9000rpmで15分間遠心し、得られた上清を４℃
100000×ｇで５時間超遠心してＢ型肝炎ウイルス
（HBV）粒子をペリツトとして集めた。このペレ
ツトを0.1M NaCl、1mM EDTA、0.1％２−メ
ルカプトエタノール及び0.1％BSAを含む0.01M
トリス−塩酸緩衝液（PH7.5）10mlに溶かし、こ
のウイルス溶液のうち５mlを保存し、残５mlを
100000×ｇで再度５時間超遠心してペレツトを得
た。 このペレツトを0.5％NP−40を含む10mMトリ
ス−塩酸、0.1M NaClPH7.5溶液200μで処理
し、DNAポリメラーゼを活性化した。この溶液
に1mM dATP、1mM dTTP、
2.5μM32PdGTP、2.5μM32PdCTPを含む0.08M
MgCl2 0.2Mトリス緩衝液（PH7.5）50μを加
えて３時間加温した。この溶液を30％シユークロ
ース溶液の入つた遠心チユーブに重層し、SW65
ローター（ベツクマン社製）を用い50000rpmで
３時間遠心してペレツトを得た。このペレツトを
プロナーゼで処理し、得られた溶液をフエノール
で２回抽出処理した。抽出液を５〜20％シユーク
ロースグラジエントで50000rpmにて３時間遠心
して15S32PDNA分画を集めこれをプールした。
この分画から15S32PDNAをエタノールを用いて
沈澱させ、乾燥して目的のHBV−DNAを得た。 一本鎖HBV−DNAの調製 次に、5mM MgCl2、10mM2−メルカプトエ
タノール、5μM dTTP、5μM dGTP、5μM
dCTP、5μM dATP、10μMアミノヘキシル
dATP及び10μMアミノヘキシルdCTPを含む
50mMトリス−HCl緩衝液（PH7.5）100μにや
はりHBV−DNA1μｇ、DNase I100pｇ及び
DNAポリメラーゼI100pｇを加えて15℃で90分間
インキユベートした。この溶液をやはりフエノー
ルで抽出し、Sephadex Ｇ−50カラムで精製して
修飾型HBV−DNAを得た。この二本鎖HBV−
DNA1mg（１ml）とHBV−DNAを導入した一本
鎖M13−フアジDNA5mg（２ml）にホルムアミド
８mlを加え、５分間この混合液を沸とうさせた。
次に、これに２mlの緩衝液（0.07モル／トリス
−HCl2モル／NaCl、15mM EDTAPH7.5）を
加え、50℃で４時間そしてさらに60℃で１時間加
温した。 この反応液をBio−Gel A50ｍでゲル過し、
ハイブリツドしたDNAと未反応のDNAを分離し
た。ボイド分画の近くに溶出される最初のピーク
を分画し、これにNaClが0.1Mになるように粉末
を加えて溶かした。そして、さらに100％エタノ
ールを溶液１mlに対し２倍の比率（２ml）で加
え、−70℃で２時間放置した。次に、17000×ｇで
10分間遠心し、エタノール沈澱物を50mlの0.1N
NaOH、0.25mM EDTA、0.001％フエノールレ
ツドで溶解した。ただちにこれをBio−Gel A50
でゲル過し、目的の一本鎖HBV−DNAを得
た。 ビオチン化一本鎖HBV−DNAの調製 で調製した一本鎖HBV−DNA100μｇにビオ
チンのサクシンイミドエステル1μｇをPH8.0の炭
酸緩衝液中で37℃で２時間反応させた。これをセ
フアデツクスＧ−25でゲル過し、ボイド分画を
60℃で一夜放置した。この溶液にｄ−DNA制限
酵素溶液（Hae 、Hae 、Hap 、Bgl
、Ava 各1U／ml、10mMトリス−HCl、
7mM MgCl2、7mM2−メルカプトエタノール、
PH7.5）１mlを加え、37℃で１時間反応させた。
この反応物をセフアデツクスＧ−100でゲル過
し、ボイド分画をプールしてこれに除蛋白処理を
行なつた。 SH化アビジンの調製 アビジン２mgを0.1Mリン酸緩衝液PH7.5に溶か
した溶液１mlにSPDP200μｇを含むDMF溶液
100μを加え、室温で30分間反応させた。これ
を1mM EDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液PH7.0で
平衡化したセフアデツクスＧ−25のカラムに入れ
同じ液で展開してゲル過を行なつた。ボイド分
画をプールし、これに２−メルカプトエチルアミ
ン200μｇを加えて37℃で３時間攪拌した。続い
て上記のセフアデツクスＧ−25のカラムを用いて
同様にゲル過し、SH化アビジン２mgを得た。 CHM化ヘキソキナーゼ ヘキサキナーゼ１mgを含む0.1Mリン酸緩衝液
PH7.01mlにシクロヘキシル−４−マレイミドメチ
ルシクロヘキサン−１−カルボン酸サクシンイミ
ドエステル（CHMS）200μｇを含むDMF溶液
100μを加え、室温で１時間放置した。これを
前項と同じセフアデツクスＧ−25のカラムでゲル
過し、ポイド分画をプールした。 アビジン結合ヘキソキナーゼの調製 で調製したSH化アビジン１mgにで調製し
たCHM化ヘキソキナーゼ１mgを加え、37℃で90
分間反応させた。次に、これをACA34カラムで
ゲル過し、アビジンとヘキソキナーゼの１：１
の結合物を分取した。 アビジン結合グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼの調製 と同様の方法で調製したCHM化グルコース
−６−リン酸デヒドロゲナーゼ１mgを含む溶液１
mlにのSH化アビジン500μｇを含む溶液１mlを
加え、37℃で90分間反応させた。反応物を
ACA34カラムでゲル過し、アビジンとグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼの１：１の結
合物を分取した。 DNAの測定 HBウイルス性肝炎患者血清100μに0.5N
NaOH100μを加えて室温で10分間攪拌した。
次に、0.5NHCl100μを加えさらに200μｇ／ml
のプロテイナーゼＫ溶液200μを加えて70℃で
１時間反応させた。これに項で調製したビオチ
ン化一本鎖HBV−DNA200μを加え、37℃で一
夜放置した。ｄ−DNA制限酵素溶液（Bgl 、
Ava 、Hae 、Hae 、Hap 、
Hinc 各1U／ml、10mMトリス−HCl、7mM
MgCl2、70mM NaCl、7mM ２−メルカプトエ
タノール、PH7.5）を1.0ml加えて37℃で１時間反
応させた。反応後、アビジン結合ヘキソキナーゼ
及びアビジン結合グルコース−６−リン酸デヒド
ロゲナーゼを各々1.0μｇ含む溶液100μを加え、
さらに基質液（0.1Mグリシルグリシン、20mM
MgCl2グルコース50mg／ml、0.5mM ATP、
0.5mM NADP+、PH8.0）３mlを加え、NADPH
の増加を340nmの吸光度を測定することによりレ
ートアツセイした。 図面は得られた結果を示すものであり、縦軸は
吸光度をそして横軸は血清の希釈度をそれぞれ表
わしている。
図面は、本発明の方法で測定して得られた、血
清の希釈度と吸光度との関係を示すものである。
清の希釈度と吸光度との関係を示すものである。
Claims (1)
- １ 測定対象の一本鎖ポリヌクレオチドと二本鎖
ポリヌクレオチドを形成しうる一本鎖ポリヌクレ
オチドに、酵素１と、酵素１の作用により生成
する物質を基質とする酵素２とが、直接又は間接
的に結合しているか、あるいは酵素１及び酵素
２がそれぞれ結合しうる親和性物質が結合してい
る、標識ポリヌクレオチドに；測定対象の一本鎖
ポリヌクレオチドを接触させて二本鎖ポリヌクレ
オチドを形成させ；該二本鎖ポリヌクレオチドに
二本鎖ポリヌクレオチド制限酵素を作用させて切
断し；上記の場合には、上記いずれかの段階で
該親和性物質に酵素１及び酵素２をそれぞれ結合
させ；その後酵素２の活性を測定することを特徴
とするポリヌクレオチドの測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59123758A JPS613064A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 酵素を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59123758A JPS613064A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 酵素を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS613064A JPS613064A (ja) | 1986-01-09 |
| JPH0552199B2 true JPH0552199B2 (ja) | 1993-08-04 |
Family
ID=14868563
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59123758A Granted JPS613064A (ja) | 1984-06-18 | 1984-06-18 | 酵素を利用したポリヌクレオチドの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS613064A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07259461A (ja) * | 1994-03-23 | 1995-10-09 | Nomura Kensetsu Kk | 脚 立 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2636970B1 (fr) * | 1988-09-26 | 1991-11-29 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de detection et de dosage d'une sequence specifique d'adn ou d'arn, reactif et necessaire pour sa mise en oeuvre |
-
1984
- 1984-06-18 JP JP59123758A patent/JPS613064A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH07259461A (ja) * | 1994-03-23 | 1995-10-09 | Nomura Kensetsu Kk | 脚 立 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS613064A (ja) | 1986-01-09 |
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