JPH0516836B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、カゼインのトリプシン分解液を高温
加圧加熱処理することにより、トリプシンを完全
失活させ、生じた沈澱物を分離除去して上清を採
取することを特徴とするアンジオテンシン転換酵
素阻害ペプチドの取得方法に関する。

〔従来の技術〕

高血圧症の発症にレニン−アンジオテンシン系
が深いかかわりを持つていることはよく知られて
いる。このレニン−アンジオテンシン系は血圧調
節に与るアンジオテンシン転換酵素
（Angiotensin Converting Enzyme、以下ACE
と略記する）が存在し、該酵素は、アンジオテン
シンを強い血管壁平滑筋収縮作用を有するアン
ジオテンシンに転換せしめることを通じて血圧
上昇に関与している。従つて、この酵素活性を抑
制することによつて血圧上昇を防ぐこと（降圧）
が可能である。

アンジオテンシン転換酵素の活性阻害物質とし
て、既に種々の物質が見い出されており、例えば
合成物についてはＤ−２−メチル−３−メルカプ
トプロパノイル−Ｌ−プロリン（一般名カプトプ
リル）がその高い阻害活性からして、現に経口降
圧剤として実用に供されている。また、天然物あ
るいは天然物由来の阻害物質としては、蛇毒ペプ
チドおよびその類縁体、あるいは牛由来カゼイン
をトリプシン分解して得られるペプチド等が知ら
れている。

それらのうち、天然物あるいは天然物由来の阻
害物質は、合成物が毒性や副作用の点でなお問題
を残しているのに対し、より安全性にすぐれた降
圧剤となることが期待でき、なかでもカゼイン由
来の阻害ペプチドは、安全性、有効性に加えて、
コスト面でも有利と見込まれるところからその降
圧剤としての実用化が検討されている。（特開昭
58−109425）。

カゼイン由来のACE阻害ペプチドとしては、
例えば以下に示す如きアミノ酸配列からなる
CEI₁₂、CEI〓₇およびCEI₆がある。

CEI₁₂：Phe−Phe−VaI−Ala−Pro−Phe−Pro
−Glu−Val−Phe−Gly−Lys CEI〓₇：Ala−Val−Pro−Tyr−Pro−Gln−Arg CEI₆：Thr−Thr−Met−Pro−Leu−Trp これら天然物由来のACE阻害物質は、安全性
に加えて、製造面に於いても比較的容易かつ低コ
ストでの量産化が可能と見込まれているが、精製
法の複雑さから、いまだ実用化に至つていない。

〔発明が解決しようとする課題〕

カゼインのトリプシン分解液からの未反応カゼ
イン除去方法としては、従来公知の加熱変性沈
澱、等電点沈澱、有機溶媒沈澱、酸変性沈澱等い
ずれの手法も可能であつたが、分解のために添加
したトリプシン活性はいずれの手法でも残存し、
トリプシンを完全に除くことは困難であつた。ま
た、等電点沈澱等酸を添加する工程を行なつた場
合には、その後の脱塩操作が必要となり、工業的
には煩雑であつた。そこで、トリプシンの酵素活
性を完全に失活させ、かつ脱塩操作が必要となら
ない、工業的に簡便な目的ペプチド取得方法が望
まれた。加えて、カゼイン分解後の殺菌工程も課
題であつた。

即ち、本発明は前記のカゼイン由来の阻害ペプ
チドに注目し、これを簡便・迅速かつ大量に、ト
リプシンを完全失活させ、殺菌性も高く取得する
方法を目的としている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、カゼインをトリプシンにより分解
し、その分解液を高温加圧加熱処理するとによ
り、トリプシンを完全失活させ、生じた沈澱物を
分離除去し、上清を採取することを特徴とするア
ンジオテンシン転換酵素阻害ペプチドの取得方法
である。

以下に本発明の方法につき説明する。

本製造に使用する原料であるカゼインは各種酸
カゼイン、カゼインナトリウム、カゼインカルシ
ウム等のカゼインが最も良いが、牛乳、スキムミ
ルク等の未精製のものでも原料として用いること
ができる。本発明に使用する酵素はトリプシンで
なければならず、トリプシンが含有成分の一部と
なつているパンクレアチン等の酵素では、CEI₁₂
等のペプチドの取得効果が激減するため不適当で
ある。

カゼインをトリプシンにより分解する方法は公
知のいずれの方法でもよく、牛由来カゼインをPH
5.0〜10.0の条件下基質あたり0.1〜５重量部のト
リプシンを添加し、15〜60℃好ましくは20〜50℃
で30分〜18時間反応させることにより、カゼイン
分解液を得ることができる。

次に、この分解液を、ジヤーフアーメンター等
の密閉下で105℃以上に加熱することによつて、
トリプシンを完全に失活させ、変性させた未反応
カゼインと共に沈澱させる。

加熱時間は温度によつて異なるが、例えば蒸気
加熱で105℃の場合15分以上、110℃の場合10分以
上、120℃の場合５分以上、130℃の場合３分以上
が適当である。

その際、密閉系内は加圧状態となつており、そ
の圧力は、系内の内容物によつて異なり一概には
規定できないが、105℃の場合で約1.2atm、130
℃の場合で約2.7atmである。この沈澱物を過
または遠心分離等の方法で分離除去する。この殺
菌された上清を噴霧乾燥または凍結乾燥等の手法
を用いて乾燥させ、白色粉末のACE阻害ペプチ
ドを得た。

本発明方法により得られたACE阻害ペプチド
は、前記のCEI₁₂、CEI〓₇およびCEI₆を主体とす
る粗ペプチドである。このものについて検討を行
なつたところ、予想外にも経口投与により、予防
的な血圧調節には有効性が期待できる降圧作用を
示し、その低毒性、高い安全性と相俟つて、ここ
に高血圧予防、高血圧傾向緩和のための健康食品
等として有用な経口摂食物の提供が可能となるこ
とを見い出した。

以上の如きカゼイン由来のACE阻害ペプチド
類は、通常粉末の形で単離・取得したうえ、これ
をそのまま、もしくはより好適には適当な無毒性
の経口投与（摂取）用担体と共に適宜の形状、形
態からなる組成物として経口摂食用に供する。

組成物の例としては、ACE阻害ペプチドを、
薬学的に許容される担体（賦形剤、滑沢剤、結合
剤、着色剤、矯知剤、賦香剤等）と共に、経口投
与用の製薬製剤の形態、例えば錠剤（糖衣錠、発
泡錠、フイルムコート錠、咀嚼錠等）、カプセル
剤、トローチ剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤等とし
たものが挙げられる。

また、固形あるいは液状の食品ないしは嗜好
品、例えば菓子類、粉末茶、アルコール飲料、ス
ポーツ飲料等の形態としてもよい。

これら経口摂食物の製造方法としては、製剤あ
るいは食品製造に於ける通常の方法を使用するこ
とができる。

用量は、一般に成人男子１日当り５mg〜10ｇ／
Kg体重であり、かかる範囲から摂食目的に応じて
適宜の量が選択される。

〔実施例〕

以下、実施例によつて本発明を更に詳細に説明
する。

なお、取得したACE阻害ペプチドの活性
（ID₅₀）は、以下の方法によつて測定したもので
ある。

（ACE阻害ペプチドのACE阻害活性の測定） (i) ACE液の調製 ５ｇのラビツトラングアセトンパウダー（シ
グマ社製）を50mlの0.1Mホウ酸緩衝液（PH
8.3）に溶解し、40000×ｇ、40分の条件下で遠
心処理し、その上清液をさらに蒸気緩衝液で10
倍に稀釈し、ACE液を得た。

(ii) 活性の測定 試料を試験管に0.03ml入れ、これに基質とし
て、250μのヒプリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ
−ロイシン（シグマ社製、最終濃度５ｍＭ、
NaCl300ｍＭを含む。）を添加し、37℃で10分
間保温後、上記酵素液を0.1ml添加し、37℃で
30分間反応させた。その後、1N塩酸0.25mlを
添加して反応を停止させた後、1.5mlの酢酸エ
チルを加え、15秒間激しく攪拌した。その後、
3500rpmで15分間遠心して、酢酸エチル層１ml
を採取した。その酢酸エチル層を120℃で30分
間加熱し、溶媒を除去した。溶媒除去後、蒸溜
水１mlを添加し、抽出されたヒプリル酸の吸収
（228nmの吸光度）を測定し、これを酵素活性
とした。

阻害率は次式より算出した。

阻害率＝（Ａ−Ｂ）／Ａ×100％ Ａ：阻害剤を含まない場合の228nmの吸光度 Ｂ：阻害剤添加の場合の228nmの吸光度 そして、阻害率50％の時の酵素反応液中の阻害
剤の濃度をID₅₀とする。

実施例 １ 50ジヤーフアメンター（ミツワ社製）に牛由
来カゼイン（BESNIER社製、食品用酸カゼイ
ン）2.0Kgを20の水に懸濁し、10N KOHによ
つてPHを7.5に調製する。37℃に保温し、トリプ
シン（ノボインダストリー社製、PTN3.0S
EC3.4.21.4豚膵臓由来）５ｇを加え、攪拌しなが
ら４時間消化を行つた。これをジヤーフアメンタ
ー内で高温加圧加熱処理（121℃、10分）し、生
じた沈澱を10000rpm、４℃で連続遠心分離して
除き、上清を得た。この得られた上清の残存トリ
プシン活性を後に示す方法により測定すると、残
存率は０％であつた。この上清を乾燥し、ペプチ
ド含有物1.4Kgを得た。

残存トリプシン活性は、以下の方法によつて測
定・算定したものである。

（残存トリプシン活性測定法） 合成基質ベンゾイル−アルギニン−４−ニトロ
アニリド（N〓−benzoyl−Ｌ−arginine−４−
nitroanilide：Bz−Arg−4NAと略記）の酵素加
水分解による遊離４−ニトロアニリドの発色量を
測定することにより、トリプシン活性の残存率を
算出した。

(i) 基質 Bz−Arg−4NAを５ｍＭ塩化カルシウムを
含む0.15Mトリス塩酸緩衝液（PH7.8）に溶解
し、0.8ｍＭ濃度溶液とした。

(ii) トリプシン活性測定 37℃に加温した(i)の基質0.9mlに試料（加熱
処理等の処理を行なつた後の消化液上清）0.1
ml（必要に応じ希釈）を加え、37℃で１時間反
応させた。これに50％酢酸を0.2ml加え、反応
を停止させた。これを遠心し、上清の遊離４−
ニトロアニリドの吸収（405nmの吸光度）を測
定した。

さらに、上記試料を、『処理工程前の消化液と
したもの』および『水としたもの』についても同
様の測定を行ない、残存トリプシン活性を次式に
より算出した。

残存率＝（Ｘ−Ｂ）／（X₀−Ｂ）×100％ Ｘ：加熱処理等の処理を行なつた後の消化液上
清を試料とした時の吸光度 X₀：処理工程前の消化液を試料とした時の吸
光度 Ｂ：水を試料とした時の吸光度 実施例 ２〜３ 高温加圧加熱処理条件を、『110℃、10分（例
２）』および『105℃、15分（例３）』として実施
例−１記載の方法によりカゼイン分解ペプチドを
含む上清を得た。この上清を、上記方法によつて
残存トリプシン活性を測定したところ、いずれも
残存率０％であつた。

比較例 １ 高温加圧加熱処理にかえて、沸騰湯浴による加
熱処理（『100℃、10分』）として実施例１記載の
方法によりカゼイン分解ペプチドを含む上清を得
た。この上清を、上記方法によつて残存トリプシ
ン活性を測定したところ、残存率10.2％であつ
た。

以上により、高温加圧加熱処理にて、残存トリ
プシンが完全失活していることがわかる。

実施例１〜３で得られたペプチドはACE阻害
作用を含有し、ID₅₀＝0.23mg／mlであり、かつ
ACE阻害作用を有するペプチドのうちCEI₁₂は液
体クロマトグラフイーにより測定したところ、ペ
プチドのみの重量当り1.3％含有していた。

次に、実施例１で得たペプチドの降圧作用につ
いて試験した。

試験例 １ 実施例１で得たペプチドをラツトに単回経口投
与した時の降圧作用 (1) 試験方法 10週令の自然発症高圧ラツト（日本チヤール
ズ・リバー社）を、温度23±２℃、湿度50±10
％の動物質に収容し、水および飼料（オリエン
タル酵母社製、MF）を自由に摂食させた。ラ
ツトを一週間予備飼育したのち、収縮期血圧が
約180mmHg以上で健康なものを試験に用いた。
即ち、実施例１で得られたペプチドをラツト体
重当り3.0ｇ経口投当し、経時的に血圧、心拍
数を測定して降圧作用を検討した。測定時期
は、投与前および投与後0.5、１、２、３、４、
６、８、24時間の計８回測定した。

測定は、非観血的無加温式尾動脈血圧・心拍
数測定装置（理研開発社製）を用い、一匹につ
き３回測定した。

結果は、一群７匹の平均値で示した。

(2) 試験結果 第１図に血圧測定結果を示す。

第１図から明らかな通り、本発明方法により
取得したACE阻害ペプチドは経口投与におい
て顕著な降圧作用を有することがわかる。一
方、心拍数には全く影響を与えず、一定であつ
た。

以下、本発明方法によつて得られたペプチド
の応用令として経口摂食物を示す。

応用例 １ ヨーグルト 含有物 重量％ 牛 乳 67.0％ 全 乳 4.0％ 脱脂粉乳 5.0％ グラニユー糖 7.0％ 水 12.0％ 実施例１のペプチド 5.0％ 通常の製造法について作成した。（10.0ｇ／
cup） 〔発明の効果〕 本発明は、以上説明したように構成されている
ので、以下に記載されるような効果を奏する。

本発明のペプチドの取得方法により、簡便・
迅速・大量に、酵素活性の残存なく、夾雑す
る塩も少なく、殺菌された状態で、ACE阻害
ペプチドを得ることができる。

また、本発明により得られたACE阻害ペプチ
ドは、先に試験例で示した通り、経口投与によつ
て、好ましい血圧降下作用を発揮する。従つて、
本方法により、天然物由来で安全性が高く、しか
も有効なる降圧作用を有する経口剤を実用化する
事が可能となつた意義は大きい。

また、本取得方法は、その後精製分離により
CEI₁₂、CEI〓₇およびCEI₆のペプチドを得ること
ができるため、単一ペプチド取得のための第１次
精製法としても有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、自然発症高血圧ラツトに本発明方法
によつて得られたペプチドを単回経口投与した試
験群の経時変化を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ カゼインのトリプシン分解液を加熱し、生じ
   た沈澱を除去してアンジオテンシン転換酵素阻害
   ペプチドを得るに際し、該分解液を密閉下で105
   ℃以上に加熱することを特徴とする、アンジオテ
   ンシン転換酵素阻害ペプチドの取得方法。