JPH057995B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH057995B2 JPH057995B2 JP59134536A JP13453684A JPH057995B2 JP H057995 B2 JPH057995 B2 JP H057995B2 JP 59134536 A JP59134536 A JP 59134536A JP 13453684 A JP13453684 A JP 13453684A JP H057995 B2 JPH057995 B2 JP H057995B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- growth hormone
- added
- tris
- cdna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は魚類の成長ホルモンポリペプチドをコ
ードするDNA、該DNAを組み込んだ組換え体
DNA、該組換え体DNAを含む微生物および該微
生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチドの
製造法に関する。魚類の成長ホルモンは魚類の養
殖産業分野において広い用途が期待される。 従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産
されるが、それらの活性ならびに構造は公知であ
る。たとえば、ヒト成長ホルモンについては、
U.J.LewisらによつてJ.Am.Chem.Soc.，80，
4429（1958）に、A.S.HartreeによつてBiochem.
J.，100，754（1966）に、C.H.LiらによつてArch.
Biochem.Biophys.Acta（Suppl.），１，327（1962）
に報告されている。 魚類の成長ホルモンについても、これまでに単
離されたという報告は多く見られるが、その生理
活性と蛋白化学的な性質で信頼性のあるものは数
が少ない。信頼性のある報告の例には次のような
ものがある。 テイラピアよりの単離例S.W.Farmerら、Gen.
Comp.Endocrin.，30，91（1976）． チヨウザメよりの単離例S.W.Farmerら、 Endocrinology，108，377（1981）． コイよりの単離例A.F.Cookら、Gen.Comp. Endorcrin.，50，335（1983）． 一方哺乳動物の成長ホルモン遺伝子については
ラツト成長ホルモン遺伝子〔P.H.Seeburgら： Nature270 486（1977）〕、ウシおよびブタの成
長ホルモン遺伝子〔P.H.Seeburgら：DNA，２，
37（1983）〕、ヒト成長ホルモン遺伝子〔J.A.
Martialら：Sciece，205，602（1979）〕などがす
でに知られているが、魚類の成長ホルモン遺伝子
についてはいまだに報告がない。 本発明者らは先にサケ脳下垂体から成長ホルモ
ンを抽出、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列
（31個）の決定を行つた。また、この物質が硬骨
魚類において成長促進効果を有することも確認し
ている〔特願昭59−68670〕。 発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有
するので、養魚用餌料の組成物として有用である
が、魚類の脳下垂体からの採取は供給量が限られ
ている。従つて魚類の成長ホルモンを安価に大量
に供給する方法の開発が望まれている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えDNA技法により魚類の
成長ホルモンを製造する方法について研究を行つ
た。その結果、魚類の成長ホルモン製造に使用す
ることができる、魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドに相補的なDNAの採取ならびにこれを含む組
換え体DNAおよび微生物の製造に成功した。即
ちサケ脳下垂体からメツセンジヤーRNA
（mRNA）を抽出し、これと相補的なDNA
（cDNA）を合成し、次いでサケの成長ホルモン
のＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するDNAプ
ローブを合成し、このDNAとハイブリダイズす
るcDNAを選択することにより、サケ成長ホルモ
ン遺伝子をクローン化することに成功した。さら
にこのcDNAの全塩基配列を決定し、本発明を完
成するに至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、
とくに第１表に示されたペプチド配列を有するポ
リペプチドを提供する。該ポリペプチドは、組換
えDNA技法を用いて下記のごとく製造すること
ができる。 即ち、魚類成長ホルモンのmRNAを鋳型とし
て用いて該mRNAに相補性を示すDNA（cDNA）
を調製し、該cDNAを組み込んだ組換え体プラス
ミドを調製する。さらに、該組換え体プラスミド
を宿主微生物に挿入する。該DNAおよび組換え
体プラスミドは、とくにエツシエリヒア・コリの
ような細菌中でサケ成長ホルモン遺伝子の増幅に
使用することができる。該組換え体プラスミドを
有する微生物はサケ成長ホルモンを安価に大量に
製造するために有用である。 従つて、本発明は、魚類の成長ホルモンポリペ
プチドをコードするDNA、該DNAを組み込んだ
組換え体DNAならびに該組換え体DNAを含む微
生物を提供する。 本発明のDNAと組換え体プラスミドは下記の
一般的手法で調製される。 シロザケ脳下垂体より全RNAを調製し、これ
をオリゴdTセルロース（oligo dT cellulose）
カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリ
Ａ）を有するRNA（ポリA+RNA）を分離する。
このポリA+RNAを鋳型とし、逆転写酵素により
二重鎖DNAを合成する。組換え体は試験管内
DNA組換え技法を用い、大腸菌のプラスミド
DNAのようなベクターDNAに該合成DNAを挿
入して得られる。シロザケ成長ホルモンmRNA
に相補性を示すDNAを有する組換え体プラスミ
ドを選択する。 次に本発明のDNAおよび組換え体プラスミド
の製法について具体的に説明する。 捕獲されたシロザケより脳下垂体を摘出し、即
座に液体窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体
にグアニジウム・イソチオシアネート
（guanidium isothiocyanate）を加え破砕し、可
溶化する。次いでCsCl溶液層に重層し、超遠心
後、沈殿物とし全細胞質RNAを得る。またグア
ニジウム・イソチオシアネート可溶化物にLiClを
加えてRNAのみを沈殿させ回収することもでき
る。 抽出したRNAをNaClまたはKClの高塩濃度
（たとえば0.5M）溶液に溶解し、オリゴ（dT）
セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有す
るmRNAをカラムに吸着させる。水、10mMト
リス−HCl緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて
溶出し、ポリ（Ａ）を有するmRNAを単離する。 以下、Okayama−Bergの方法〔Okayama
＆ Berg；Mol.Cell.Biol.２，161（1982）〕に従
い、cDNAの合成および、そのベクターへの組み
込みを行う。 まずベクタープライマーを合成する。ベクター
としてはたとえばpCDV1を適当な溶液、たとえ
ばトリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5，
10mM），MgCl2（たとえば6mM），NaCl（たとえ
ば10mM）を含む溶液中でKpnIで処理し、
pCDV1のKpnI部位を切断する。このDNAをト
リス−HCl緩衝液（たとえばPH6.8，30mM），カ
コジル酸ナトリウム（たとえば140mM），CoCl2
（たとえば1mM），ジチオスレイトール（たとえ
ば0.1mM）およびdTTP（たとえば0.25mM）中、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼとともに一定温度（たとえば37℃）で一定
時間（たとえば20分間）インキユベートし、ベク
ターDNAの両３′末端に60個前後のチミジル残基
を付加する。さらにこのDNAをトリス−HCl緩
衝液（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl2（たとえ
ば6mM），NaCl（たとえば100mM）を含む溶液
中EcoRIで切断後、低融点アガロースゲル電気泳
動〔Lars Wieslander：Analytical
Biochemistry，98，305（1979）〕にて分画し、約
3.1キロベースの断片を回収する。次いで該DNA
をNaClまたはKClの高塩濃度（たとえば0.5M）
溶液に溶解し、ポリ（dA）セルロースカラムに
通塔してポリ（Ｔ）を有するベクタープライマー
分子のみをカラムに吸着させる。水、10mMトリ
ス−HCl緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶
出し、ポリ（Ｔ）の付加したベクタープライマー
分子のみを単離する。 次にリンカーDNAを合成する。たとえば
pL1DNAを適当な溶液、たとえばトリス−HCl
緩衝液（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl2（たと
えば6mM），NaCl（たとえば50mM）を含む溶液
中でPstIで処理し、pL1のPstI部位を切断する。
このDNAを、dTTPの代わりにdGTPを加える
以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処
理し、15個前後のオリゴdG鎖を付加する。該
DNAを適当な溶液たとえばトリス−HCl緩衝液
（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl2（たとえば
6mM），NaCl（たとえば60mM）を含む溶液中
Hindにて切断する。アガロースゲル電気泳動
にて約0.5キロベースのDNA断片を分画し、
DEAEペーパーにて回収する。このようにしてリ
ンカーDNAを得る。 以上のようにして得たポリ（Ａ）+RNA、ベク
タープライマー、リンカーDNAを用い、cDNA
合成を行う。ポリ（Ａ）+RNA、ベクタープライ
マーDNAをトリス−HCl緩衝液（たとえばPH
8.3、50mM），MgCl2（たとえば8mM）、KCl（た
とえば30mM）、ジチオスレイトール（たとえば
0.3mM）、dATP，dTTP，dCTP，dGTP（たと
えば各々2mM）を含む溶液中、逆転写酵素を一
定温度（たとえば37℃）、一定時間（たとえば40
分間）反応させる。こうして得たRNA−DNA二
重鎖の３′末端に、dTTPがdCTPに変わる以外
はベクタープライマーにdT鎖を付加した条件と
同様の操作でオリゴdC鎖を15個前後付加する。
このDNAをトリス−HCl緩衝液（たとえばPH
7.5、10mM）、MgCl2（たとえば6mM）、NaCl（た
とえば60mM）を含む溶液中Hindで切断する。
このDNAに、先に調製したリンカーDNAを混合
し、トリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5、
20mM）、MgCl2（たとえば4mM）、（NH4）2SO4
（たとえば10mM）、KCl（たとえば0.1M）、β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（β−
NAD）（たとえば0.1mM）を含む溶液中、大腸
菌DNAリガーゼとともに一定時間（たとえば16
時間）、一定温度（たとえば12℃）でインキユベ
ートする。こうしてcDNAとリンカーDNAとの
環状化が行われる。この反応液にdATP，
dTTP，dGTP，dCTPを各々、終濃度40μMとな
るよう加え、大腸菌DNAリガーゼ、大腸菌DNA
ポリメラーゼ、大腸菌リボヌクレアーゼＨを加
え、RNA部分をDNAに変換することにより、完
全な二重鎖cDNAを含む組換えプラスミドを得
る。 こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、
たとえば大腸菌c600SF8株を、たとえばScottら
の方法〔重定勝哉：細胞工学２、616（1983）〕に
より形質転換する。上記で得た組換え体プラスミ
ド上にはアンピシリン耐性遺伝子が存在するた
め、形質転換した大腸菌はアンピシリン耐性を示
す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性
（Apr）菌株から魚類の成長ホルモンmRNAに相
補性を示す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミド
DNAを保有する菌株を選択するのに一般的に用
いられる。すなわち、上記で得られた形質転換株
をニトロセルロースフイルター上に固定し、既知
のシロザケ成長ホルモンのアミノ酸配列より予想
されるDNA配列を有する合成DNAプローブと会
合させ、強く会合するものを選択する
〔Grunstein−Hognessの方法、Proc.Natl.Acap.
Sci.，USA.，72，3961（1975）〕。プローブDNA
は通常のトリエステル法（J.Am.Chem.Soc.，
97，7327（1975）〕で合成される。合成DNAプロ
ーブによる選択はSouthernらの方法〔J.Mol.
Biol.98，503（1975）〕によつてさらに確実にで
き、この方法でシロザケ成長ホルモンmRNAに
相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミド
DNAを同定できる。 本発明の新規組換え体プラスミドは大腸菌のよ
うな微生物、あるいは真核細胞による魚類成長ホ
ルモンポリペプチドの大量生産に用いられる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例１ シロザケ脳下垂体よりのポリA+RNA
の調製： シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネ
ート−セシウムクロライド法〔Maniatisら編、
Molecular Cloning.p196，Cold Spring Harbor
刊；重定勝哉、細胞工学、２，616（1983）〕に従
いポリＡを有するRNAを下記のごとく調製した。 シロザケの凍結脳下垂体2g（約30個体分）を
4Mグアニジウムチオシアネート、0.5％ザルコシ
ン、5mMクエン酸ナトリウム（PH７）および
0.1Mβ−メルカプトエタノールからなる溶液10ml
中でテフロンホモゲナイザー（5rpm）にて破砕
し可溶化した。このホモジネートを18G注射針に
数回通してDNAを分断した。5.7MCsCl、0.1M
EDTA（PH８）の溶液各1.2mlを超遠心管中に分注
しておき、前記ホモジネートを重層した。
Hitachi RPS40ローターにて35000rpm、15時間
遠心後、RNAを沈殿として回収した。RNAの沈
殿を1mM EDTAを含むトリス−HCl（PH8.0）溶
液10mlに溶解し、フエノール−クロロホルムで抽
出後、エタノール沈殿により回収した。得られた
RNA約１mgを10mMトリス−HCl（PH8.0）および
1mM EDTAからなる溶液１mlに溶かした。65
℃、５分間インキユベートし、0.1mlの5MNaCl
を加えた。混合物をオリゴdTセルロース・カラ
ム（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）クロマトグラ
フイーにかけた。吸着したポリＡを有する
mRNAを10mMトリス−HCl（PH8.0および1mM
EDTAからなる溶液で溶出しポリＡを有する
mRNA約10μgを得た。 実施例２ cDNA合成と該DNAのベクターへの
挿入： Okayama−Bergの方法〔Mol.Cell.Biol.，２，
161（1982）〕に従い、cDNAの合成とそれを組み
込んだ組換え体プラスミドの造成を行つた。その
工程の概略を第１図に示す。 pCDV1〔Okayama ＆ Berg：J.Mol.Cell.
Biol.，３，280（1983）〕400μgを10mMトリス−
HCl（PH7.5）、6mM MgCl2および10mM NaClか
らなる溶液300μlに加え、さらに500単位のKpn
（宝酒造社製）を加えて、37℃、６時間反応させ、
プラスミド中のKpn部位で切断した。フエノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により
DNAを回収した。Kpn切断した該DNA約
200μgを40mMカコジル酸ナトリウム、30mMト
リス−HCl（PH6.8），1mM CaCl2および0.1mMジ
チオスレイトール（以下DTTと略記する）から
なる緩衝液（以下TdT緩衝液と略記する）に
dTTPを0.25mMとなるよう加えた溶液200μlに加
え、さらに81単位のターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼ（以下TdTと略記す
る）（Ｐ−Ｌ Bioche−micals社製）を加えて、
37℃11分間反応させた。ここで、pCDV1のKpn
切断部位の３′末端にポリdT鎖が約67個付加さ
れた。該溶液からフエノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿により、ポリdT鎖の付加し
たpCDV1DNA約100μgを回収した。該DNAを
10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl2，
100mM NaClからなる緩衝液150μlに加え、さら
に360単位のEcoR（宝酒造社製）を加え、37℃
２時間反応させた。該反応物を低融点アガロース
ゲル電気泳動後、約3.1KbのDNA断片を回収し、
約60μgのポリdT鎖付加pCDV1を得た。該DNA
を10mMトリス−HCl（PH8.0）および1mM
EDTAからなる溶液500μlに溶解し、65℃５分間
インキユベート後、氷冷して50μlの5M NaClを
加えた。混合物をオリゴdAセルロースカラム
（コラボラテイブリサーチ社製）クロマトグラフ
イーにかけた。ポリdT鎖長が充分なものはカラ
ムに吸着し、これを10mMトリス−HC（PH
8.0）および1mMEDTAからなる溶液で溶出し、
ポリdT鎖の付加したpCDV1（以下ベクタープラ
イマーと略記する）27μgを得た。 次にリンカーDNAの調製を行なう。 pL1〔Okayama ＆ Berg：Mol.Cell.Biol.３，
280（1983）〕約14μgを10mMトリス−HCl（PH
7.5）、6mM MgCl2および50mM NaClからなる
緩衝液200μlに加え、さらに50単位のPst（宝酒
造社製）を加え、37℃４時間反応させ、
pL1DNA中のPst部位で切断させた。該反応物
をフエノール−クロロホルム抽出後、エタノール
沈殿を行い、Pstで切断したpL1DNA約13μgを
回収した。該DNA約13μgをTdT緩衝液に終濃度
0.25mMのdGTPを含む溶液50μlに加え、さらに
TdT（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）54単位を加え
て37℃13分間インキユベートし、pL1のPst切
断部位３′末端にdG鎖を約14個付加した。フエノ
ール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にて
DNAを回収した。該DNAを100μlの10mMトリ
ス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl2および60mM
NaClからなる緩衝液100μlに加え、さらに80単位
のHind（宝酒造社製）を加えて37℃３時間イ
ンキユベートし、pL1DNAのHind部位で切断
した。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分
画し、約0.5KbのDNA断片をDEAEペーパー法
〔Dretzenら、Ana1.Biochem.，112，295（1981）〕
にて回収し、オリゴdG鎖付きのリンカーDNA
（以下単にリンカーDNAと略記する）を得た。 上記で調製したポリ（Ａ）RNA約2μg，ベク
タープライマー約1.4μgを50mMトリス−HCl（PH
8.3）、8mM MgCl2，30mM KCl，0.3mM
DTT，2mM dNTP（dATP，dTTP，dGTPお
よびdCTP）および10単位のリボヌクレアーゼイ
ンヒビター（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）から
なる溶液22.3μlに溶解し、10単位の逆転写酵素
（生化学工業社製）を加え、37℃40分間インキユ
ベートし、mRNAに相補的なDNAを合成させ
た。該反応物をフエノール−クロロホルム抽出、
エタノール沈殿を行ない、RNA−DNA二重鎖の
付加したベクタープライマーDNAを回収した。
該DNAを66μMdCTPおよび0.2μgポリＡを含む
TdT緩衝液20μlに溶かし、14単位のTdT（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）を加えて37℃８分間イン
キユベートし、cDNA３′末端に12個のdC鎖を付
加した。該反応物をフエノール−クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿によりdC鎖の付加した
cDNA−ベクタープライマーDNAを回収した。
該DNAをトリス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl2お
よび60mM NaClからなる液400μlに溶かし、20
単位のHind（宝酒造社製）を加え、37℃２時
間インキユベートし、Hind部位で切断した。
該反応物をフエノール−クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿して0.5pmoleのdC鎖付加cDNA−ベ
クタープライマーDNAを得た。該
DNA0.08pmoleおよび前記のリンカー
DNA0.16pmoleを40μlのトリス−HCl（PH7.5）、
0.1M NaClおよび1mM EDTAからなる溶液
40μlに加え、65℃、42℃、０℃でそれぞれ10分、
25分、30分間インキユベートした。20mMトリス
−HCl（PH7.5）、4mM MgCl2，10mM
（NH4）2SO4，0.1M KClおよび0.1mMβ−NAD
の組成で、全量400μlとなるよう反応液を調製し
た。該反応液に10単位の大腸菌DNAリガーゼ
（New England Biolabs社製）を加え、11℃一
液インキユベートした。該反応液を各40μMの
dNTP、0.15mMβ−NADとなるよう成分を追加
調製し、５単位の大腸菌DNAリガーゼ、７単位
の大腸菌DNAポリメラーゼ（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）および２単位の大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）を
加え、12℃、25℃で順次１時間ずつインキユベー
トした。上記反応で、cDNAを含む組換えDNA
の環状化と、RNA−DNA二重鎖のRNA部分が
DNAに置換され、完全な二重鎖DNAの組換えプ
ラスミドが生成した。 実施例３ シロザケ成長ホルモンcDNAを含む組
換えDNAの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大
腸菌c600SF8株〔Cameron：Proc.Natl.Acad.
Sci.USA，72，3416（1975）〕をScottらの方法
〔重定勝哉：細胞工学、２，616（1983）〕に従い形
質転換した。得られた約１万個のコロニーのうち
4800個をニトロセルロース上に固定した。シロザ
ケ成長ホルモンのＮ末端から23番目−28番目のア
ミノ酸配列に対応する合成DNA、すなわち （３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴまた
はＣ、12番目はＣまたはＴ、15番目はＣまたはＴ
であり、組み合わせて16通りの合成DNAの混合
物となる）を32Pで標識したプローブに40℃で強
く会合した８菌株を選んだ〔Grunstein−
Hognessの方法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，
3961（1975）〕。得られた８菌株についてSouthern
の方法〔J.Mol.Biol.，98，503（1975）〕により、
上記プローブおよびＣ末端付近のアミノ酸配列に
対応する合成DNAプローブ （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまた
はＧ、９番目はＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか、12番
目はＧまたはＡであり、組み合わせて32通りの合
成DNAの混合物となる）とも会合が確認された。
これらのプラスミドはpSGH1，３，６，８，９，
10，14，17と命名したが、いずれも、シロザケ成
長ホルモンのアミノ酸配列から予想されるDNA
配列を有することから成長ホルモンcDNAを含ん
でいるものと考えられた。 実施例４ 該プラスミドpSGH1の塩基配列： 上記で得られたプラスミド８種につき、種々の
制限酵素で消化し、cDNA部分の切断地図を決定
した。制限酵素部位の存在位置から、得られたプ
ラスミドは３群に分類でき、pSGH1，６，９，
10，17の群、pSGH3の群、pSGH8，14の群と分
けられた。それぞれの群の制限酵素地図を第２図
に示す。 次に実施例３で行つた合成DNAプローブと最
も強い会合を示し、かつほぼ完全長のcDNAを含
むと考えられるpSGH1を含む群のプラスミド、
特にpSGH1について、その翻訳領域の全ヌクレ
オチド配列をM13フアージを用いたSanger法
〔Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci，USA，74，
5463（1977）：Amersham社 M13 cloning and
sequencing handbook〕に従つて決定した。配
列を第１表に示す。第１表中、塩基数１−66がシ
グナルペプチドを、67−630がシロザケ成長ホル
モンの成熟ペプチドをコードする。pSGH1に含
まれるcDNA配列から予想されるアミノ酸配列
は、シロザケ成長ホルモンペプチドから決定され
ているＮ末端付近およびＣ末端付近のアミノ酸配
列と完全に一致し、該cDNAはシロザケ成長ホル
モンをコードしていることが確認された。
pSGH1、pSGH3、pSGH8を含む大腸菌（それぞ
れESGH1、ESGH3、ESGH8）は昭和59年６月
23日付で、FERM BP−551，552および553とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。 【表】 発明の効果 本発明によれば、魚類の成長ホルモンポリペプ
チドをコードするDNAを組み込んだ組換え体
DNA、該組換え体DNAを含む微生物が得られ、
これらは魚類の成長ホルモンポリペプチドの大量
生産に利用することができる。
ードするDNA、該DNAを組み込んだ組換え体
DNA、該組換え体DNAを含む微生物および該微
生物を用いる魚類の成長ホルモンポリペプチドの
製造法に関する。魚類の成長ホルモンは魚類の養
殖産業分野において広い用途が期待される。 従来の技術 哺乳類の成長ホルモンは脳下垂体において生産
されるが、それらの活性ならびに構造は公知であ
る。たとえば、ヒト成長ホルモンについては、
U.J.LewisらによつてJ.Am.Chem.Soc.，80，
4429（1958）に、A.S.HartreeによつてBiochem.
J.，100，754（1966）に、C.H.LiらによつてArch.
Biochem.Biophys.Acta（Suppl.），１，327（1962）
に報告されている。 魚類の成長ホルモンについても、これまでに単
離されたという報告は多く見られるが、その生理
活性と蛋白化学的な性質で信頼性のあるものは数
が少ない。信頼性のある報告の例には次のような
ものがある。 テイラピアよりの単離例S.W.Farmerら、Gen.
Comp.Endocrin.，30，91（1976）． チヨウザメよりの単離例S.W.Farmerら、 Endocrinology，108，377（1981）． コイよりの単離例A.F.Cookら、Gen.Comp. Endorcrin.，50，335（1983）． 一方哺乳動物の成長ホルモン遺伝子については
ラツト成長ホルモン遺伝子〔P.H.Seeburgら： Nature270 486（1977）〕、ウシおよびブタの成
長ホルモン遺伝子〔P.H.Seeburgら：DNA，２，
37（1983）〕、ヒト成長ホルモン遺伝子〔J.A.
Martialら：Sciece，205，602（1979）〕などがす
でに知られているが、魚類の成長ホルモン遺伝子
についてはいまだに報告がない。 本発明者らは先にサケ脳下垂体から成長ホルモ
ンを抽出、精製し、Ｎ末端からのアミノ酸配列
（31個）の決定を行つた。また、この物質が硬骨
魚類において成長促進効果を有することも確認し
ている〔特願昭59−68670〕。 発明が解決しようとする問題点 魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有
するので、養魚用餌料の組成物として有用である
が、魚類の脳下垂体からの採取は供給量が限られ
ている。従つて魚類の成長ホルモンを安価に大量
に供給する方法の開発が望まれている。 問題点を解決するための手段 本発明者らは、組換えDNA技法により魚類の
成長ホルモンを製造する方法について研究を行つ
た。その結果、魚類の成長ホルモン製造に使用す
ることができる、魚類の成長ホルモンポリペプチ
ドに相補的なDNAの採取ならびにこれを含む組
換え体DNAおよび微生物の製造に成功した。即
ちサケ脳下垂体からメツセンジヤーRNA
（mRNA）を抽出し、これと相補的なDNA
（cDNA）を合成し、次いでサケの成長ホルモン
のＮ末端付近のアミノ酸配列に対応するDNAプ
ローブを合成し、このDNAとハイブリダイズす
るcDNAを選択することにより、サケ成長ホルモ
ン遺伝子をクローン化することに成功した。さら
にこのcDNAの全塩基配列を決定し、本発明を完
成するに至つた。 以下本発明を詳細に説明する。 本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、
とくに第１表に示されたペプチド配列を有するポ
リペプチドを提供する。該ポリペプチドは、組換
えDNA技法を用いて下記のごとく製造すること
ができる。 即ち、魚類成長ホルモンのmRNAを鋳型とし
て用いて該mRNAに相補性を示すDNA（cDNA）
を調製し、該cDNAを組み込んだ組換え体プラス
ミドを調製する。さらに、該組換え体プラスミド
を宿主微生物に挿入する。該DNAおよび組換え
体プラスミドは、とくにエツシエリヒア・コリの
ような細菌中でサケ成長ホルモン遺伝子の増幅に
使用することができる。該組換え体プラスミドを
有する微生物はサケ成長ホルモンを安価に大量に
製造するために有用である。 従つて、本発明は、魚類の成長ホルモンポリペ
プチドをコードするDNA、該DNAを組み込んだ
組換え体DNAならびに該組換え体DNAを含む微
生物を提供する。 本発明のDNAと組換え体プラスミドは下記の
一般的手法で調製される。 シロザケ脳下垂体より全RNAを調製し、これ
をオリゴdTセルロース（oligo dT cellulose）
カラムを通すことによりポリアデニル酸（ポリ
Ａ）を有するRNA（ポリA+RNA）を分離する。
このポリA+RNAを鋳型とし、逆転写酵素により
二重鎖DNAを合成する。組換え体は試験管内
DNA組換え技法を用い、大腸菌のプラスミド
DNAのようなベクターDNAに該合成DNAを挿
入して得られる。シロザケ成長ホルモンmRNA
に相補性を示すDNAを有する組換え体プラスミ
ドを選択する。 次に本発明のDNAおよび組換え体プラスミド
の製法について具体的に説明する。 捕獲されたシロザケより脳下垂体を摘出し、即
座に液体窒素中にて凍結する。この凍結脳下垂体
にグアニジウム・イソチオシアネート
（guanidium isothiocyanate）を加え破砕し、可
溶化する。次いでCsCl溶液層に重層し、超遠心
後、沈殿物とし全細胞質RNAを得る。またグア
ニジウム・イソチオシアネート可溶化物にLiClを
加えてRNAのみを沈殿させ回収することもでき
る。 抽出したRNAをNaClまたはKClの高塩濃度
（たとえば0.5M）溶液に溶解し、オリゴ（dT）
セルロースのカラムに通塔してポリ（Ａ）を有す
るmRNAをカラムに吸着させる。水、10mMト
リス−HCl緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて
溶出し、ポリ（Ａ）を有するmRNAを単離する。 以下、Okayama−Bergの方法〔Okayama
＆ Berg；Mol.Cell.Biol.２，161（1982）〕に従
い、cDNAの合成および、そのベクターへの組み
込みを行う。 まずベクタープライマーを合成する。ベクター
としてはたとえばpCDV1を適当な溶液、たとえ
ばトリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5，
10mM），MgCl2（たとえば6mM），NaCl（たとえ
ば10mM）を含む溶液中でKpnIで処理し、
pCDV1のKpnI部位を切断する。このDNAをト
リス−HCl緩衝液（たとえばPH6.8，30mM），カ
コジル酸ナトリウム（たとえば140mM），CoCl2
（たとえば1mM），ジチオスレイトール（たとえ
ば0.1mM）およびdTTP（たとえば0.25mM）中、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエ
ラーゼとともに一定温度（たとえば37℃）で一定
時間（たとえば20分間）インキユベートし、ベク
ターDNAの両３′末端に60個前後のチミジル残基
を付加する。さらにこのDNAをトリス−HCl緩
衝液（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl2（たとえ
ば6mM），NaCl（たとえば100mM）を含む溶液
中EcoRIで切断後、低融点アガロースゲル電気泳
動〔Lars Wieslander：Analytical
Biochemistry，98，305（1979）〕にて分画し、約
3.1キロベースの断片を回収する。次いで該DNA
をNaClまたはKClの高塩濃度（たとえば0.5M）
溶液に溶解し、ポリ（dA）セルロースカラムに
通塔してポリ（Ｔ）を有するベクタープライマー
分子のみをカラムに吸着させる。水、10mMトリ
ス−HCl緩衝液のような低塩濃度溶液を用いて溶
出し、ポリ（Ｔ）の付加したベクタープライマー
分子のみを単離する。 次にリンカーDNAを合成する。たとえば
pL1DNAを適当な溶液、たとえばトリス−HCl
緩衝液（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl2（たと
えば6mM），NaCl（たとえば50mM）を含む溶液
中でPstIで処理し、pL1のPstI部位を切断する。
このDNAを、dTTPの代わりにdGTPを加える
以外はベクタープライマー合成の場合と同様に処
理し、15個前後のオリゴdG鎖を付加する。該
DNAを適当な溶液たとえばトリス−HCl緩衝液
（たとえばPH7.5，10mM）、MgCl2（たとえば
6mM），NaCl（たとえば60mM）を含む溶液中
Hindにて切断する。アガロースゲル電気泳動
にて約0.5キロベースのDNA断片を分画し、
DEAEペーパーにて回収する。このようにしてリ
ンカーDNAを得る。 以上のようにして得たポリ（Ａ）+RNA、ベク
タープライマー、リンカーDNAを用い、cDNA
合成を行う。ポリ（Ａ）+RNA、ベクタープライ
マーDNAをトリス−HCl緩衝液（たとえばPH
8.3、50mM），MgCl2（たとえば8mM）、KCl（た
とえば30mM）、ジチオスレイトール（たとえば
0.3mM）、dATP，dTTP，dCTP，dGTP（たと
えば各々2mM）を含む溶液中、逆転写酵素を一
定温度（たとえば37℃）、一定時間（たとえば40
分間）反応させる。こうして得たRNA−DNA二
重鎖の３′末端に、dTTPがdCTPに変わる以外
はベクタープライマーにdT鎖を付加した条件と
同様の操作でオリゴdC鎖を15個前後付加する。
このDNAをトリス−HCl緩衝液（たとえばPH
7.5、10mM）、MgCl2（たとえば6mM）、NaCl（た
とえば60mM）を含む溶液中Hindで切断する。
このDNAに、先に調製したリンカーDNAを混合
し、トリス−HCl緩衝液（たとえばPH7.5、
20mM）、MgCl2（たとえば4mM）、（NH4）2SO4
（たとえば10mM）、KCl（たとえば0.1M）、β−ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド（β−
NAD）（たとえば0.1mM）を含む溶液中、大腸
菌DNAリガーゼとともに一定時間（たとえば16
時間）、一定温度（たとえば12℃）でインキユベ
ートする。こうしてcDNAとリンカーDNAとの
環状化が行われる。この反応液にdATP，
dTTP，dGTP，dCTPを各々、終濃度40μMとな
るよう加え、大腸菌DNAリガーゼ、大腸菌DNA
ポリメラーゼ、大腸菌リボヌクレアーゼＨを加
え、RNA部分をDNAに変換することにより、完
全な二重鎖cDNAを含む組換えプラスミドを得
る。 こうして得た組換えプラスミドを用い大腸菌、
たとえば大腸菌c600SF8株を、たとえばScottら
の方法〔重定勝哉：細胞工学２、616（1983）〕に
より形質転換する。上記で得た組換え体プラスミ
ド上にはアンピシリン耐性遺伝子が存在するた
め、形質転換した大腸菌はアンピシリン耐性を示
す。以下の手法はこれらアンピシリン耐性
（Apr）菌株から魚類の成長ホルモンmRNAに相
補性を示す遺伝子を持つ新規組換え体プラスミド
DNAを保有する菌株を選択するのに一般的に用
いられる。すなわち、上記で得られた形質転換株
をニトロセルロースフイルター上に固定し、既知
のシロザケ成長ホルモンのアミノ酸配列より予想
されるDNA配列を有する合成DNAプローブと会
合させ、強く会合するものを選択する
〔Grunstein−Hognessの方法、Proc.Natl.Acap.
Sci.，USA.，72，3961（1975）〕。プローブDNA
は通常のトリエステル法（J.Am.Chem.Soc.，
97，7327（1975）〕で合成される。合成DNAプロ
ーブによる選択はSouthernらの方法〔J.Mol.
Biol.98，503（1975）〕によつてさらに確実にで
き、この方法でシロザケ成長ホルモンmRNAに
相補性を示す遺伝子を有する組換え体プラスミド
DNAを同定できる。 本発明の新規組換え体プラスミドは大腸菌のよ
うな微生物、あるいは真核細胞による魚類成長ホ
ルモンポリペプチドの大量生産に用いられる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例１ シロザケ脳下垂体よりのポリA+RNA
の調製： シロザケ脳下垂体よりグアニジウムチオシアネ
ート−セシウムクロライド法〔Maniatisら編、
Molecular Cloning.p196，Cold Spring Harbor
刊；重定勝哉、細胞工学、２，616（1983）〕に従
いポリＡを有するRNAを下記のごとく調製した。 シロザケの凍結脳下垂体2g（約30個体分）を
4Mグアニジウムチオシアネート、0.5％ザルコシ
ン、5mMクエン酸ナトリウム（PH７）および
0.1Mβ−メルカプトエタノールからなる溶液10ml
中でテフロンホモゲナイザー（5rpm）にて破砕
し可溶化した。このホモジネートを18G注射針に
数回通してDNAを分断した。5.7MCsCl、0.1M
EDTA（PH８）の溶液各1.2mlを超遠心管中に分注
しておき、前記ホモジネートを重層した。
Hitachi RPS40ローターにて35000rpm、15時間
遠心後、RNAを沈殿として回収した。RNAの沈
殿を1mM EDTAを含むトリス−HCl（PH8.0）溶
液10mlに溶解し、フエノール−クロロホルムで抽
出後、エタノール沈殿により回収した。得られた
RNA約１mgを10mMトリス−HCl（PH8.0）および
1mM EDTAからなる溶液１mlに溶かした。65
℃、５分間インキユベートし、0.1mlの5MNaCl
を加えた。混合物をオリゴdTセルロース・カラ
ム（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）クロマトグラ
フイーにかけた。吸着したポリＡを有する
mRNAを10mMトリス−HCl（PH8.0および1mM
EDTAからなる溶液で溶出しポリＡを有する
mRNA約10μgを得た。 実施例２ cDNA合成と該DNAのベクターへの
挿入： Okayama−Bergの方法〔Mol.Cell.Biol.，２，
161（1982）〕に従い、cDNAの合成とそれを組み
込んだ組換え体プラスミドの造成を行つた。その
工程の概略を第１図に示す。 pCDV1〔Okayama ＆ Berg：J.Mol.Cell.
Biol.，３，280（1983）〕400μgを10mMトリス−
HCl（PH7.5）、6mM MgCl2および10mM NaClか
らなる溶液300μlに加え、さらに500単位のKpn
（宝酒造社製）を加えて、37℃、６時間反応させ、
プラスミド中のKpn部位で切断した。フエノー
ル−クロロホルム抽出後、エタノール沈殿により
DNAを回収した。Kpn切断した該DNA約
200μgを40mMカコジル酸ナトリウム、30mMト
リス−HCl（PH6.8），1mM CaCl2および0.1mMジ
チオスレイトール（以下DTTと略記する）から
なる緩衝液（以下TdT緩衝液と略記する）に
dTTPを0.25mMとなるよう加えた溶液200μlに加
え、さらに81単位のターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼ（以下TdTと略記す
る）（Ｐ−Ｌ Bioche−micals社製）を加えて、
37℃11分間反応させた。ここで、pCDV1のKpn
切断部位の３′末端にポリdT鎖が約67個付加さ
れた。該溶液からフエノール−クロロホルム抽
出、エタノール沈殿により、ポリdT鎖の付加し
たpCDV1DNA約100μgを回収した。該DNAを
10mMトリス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl2，
100mM NaClからなる緩衝液150μlに加え、さら
に360単位のEcoR（宝酒造社製）を加え、37℃
２時間反応させた。該反応物を低融点アガロース
ゲル電気泳動後、約3.1KbのDNA断片を回収し、
約60μgのポリdT鎖付加pCDV1を得た。該DNA
を10mMトリス−HCl（PH8.0）および1mM
EDTAからなる溶液500μlに溶解し、65℃５分間
インキユベート後、氷冷して50μlの5M NaClを
加えた。混合物をオリゴdAセルロースカラム
（コラボラテイブリサーチ社製）クロマトグラフ
イーにかけた。ポリdT鎖長が充分なものはカラ
ムに吸着し、これを10mMトリス−HC（PH
8.0）および1mMEDTAからなる溶液で溶出し、
ポリdT鎖の付加したpCDV1（以下ベクタープラ
イマーと略記する）27μgを得た。 次にリンカーDNAの調製を行なう。 pL1〔Okayama ＆ Berg：Mol.Cell.Biol.３，
280（1983）〕約14μgを10mMトリス−HCl（PH
7.5）、6mM MgCl2および50mM NaClからなる
緩衝液200μlに加え、さらに50単位のPst（宝酒
造社製）を加え、37℃４時間反応させ、
pL1DNA中のPst部位で切断させた。該反応物
をフエノール−クロロホルム抽出後、エタノール
沈殿を行い、Pstで切断したpL1DNA約13μgを
回収した。該DNA約13μgをTdT緩衝液に終濃度
0.25mMのdGTPを含む溶液50μlに加え、さらに
TdT（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）54単位を加え
て37℃13分間インキユベートし、pL1のPst切
断部位３′末端にdG鎖を約14個付加した。フエノ
ール−クロロホルム抽出後エタノール沈殿にて
DNAを回収した。該DNAを100μlの10mMトリ
ス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl2および60mM
NaClからなる緩衝液100μlに加え、さらに80単位
のHind（宝酒造社製）を加えて37℃３時間イ
ンキユベートし、pL1DNAのHind部位で切断
した。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分
画し、約0.5KbのDNA断片をDEAEペーパー法
〔Dretzenら、Ana1.Biochem.，112，295（1981）〕
にて回収し、オリゴdG鎖付きのリンカーDNA
（以下単にリンカーDNAと略記する）を得た。 上記で調製したポリ（Ａ）RNA約2μg，ベク
タープライマー約1.4μgを50mMトリス−HCl（PH
8.3）、8mM MgCl2，30mM KCl，0.3mM
DTT，2mM dNTP（dATP，dTTP，dGTPお
よびdCTP）および10単位のリボヌクレアーゼイ
ンヒビター（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）から
なる溶液22.3μlに溶解し、10単位の逆転写酵素
（生化学工業社製）を加え、37℃40分間インキユ
ベートし、mRNAに相補的なDNAを合成させ
た。該反応物をフエノール−クロロホルム抽出、
エタノール沈殿を行ない、RNA−DNA二重鎖の
付加したベクタープライマーDNAを回収した。
該DNAを66μMdCTPおよび0.2μgポリＡを含む
TdT緩衝液20μlに溶かし、14単位のTdT（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）を加えて37℃８分間イン
キユベートし、cDNA３′末端に12個のdC鎖を付
加した。該反応物をフエノール−クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿によりdC鎖の付加した
cDNA−ベクタープライマーDNAを回収した。
該DNAをトリス−HCl（PH7.5）、6mM MgCl2お
よび60mM NaClからなる液400μlに溶かし、20
単位のHind（宝酒造社製）を加え、37℃２時
間インキユベートし、Hind部位で切断した。
該反応物をフエノール−クロロホルム抽出、エタ
ノール沈殿して0.5pmoleのdC鎖付加cDNA−ベ
クタープライマーDNAを得た。該
DNA0.08pmoleおよび前記のリンカー
DNA0.16pmoleを40μlのトリス−HCl（PH7.5）、
0.1M NaClおよび1mM EDTAからなる溶液
40μlに加え、65℃、42℃、０℃でそれぞれ10分、
25分、30分間インキユベートした。20mMトリス
−HCl（PH7.5）、4mM MgCl2，10mM
（NH4）2SO4，0.1M KClおよび0.1mMβ−NAD
の組成で、全量400μlとなるよう反応液を調製し
た。該反応液に10単位の大腸菌DNAリガーゼ
（New England Biolabs社製）を加え、11℃一
液インキユベートした。該反応液を各40μMの
dNTP、0.15mMβ−NADとなるよう成分を追加
調製し、５単位の大腸菌DNAリガーゼ、７単位
の大腸菌DNAポリメラーゼ（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製）および２単位の大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨ（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製）を
加え、12℃、25℃で順次１時間ずつインキユベー
トした。上記反応で、cDNAを含む組換えDNA
の環状化と、RNA−DNA二重鎖のRNA部分が
DNAに置換され、完全な二重鎖DNAの組換えプ
ラスミドが生成した。 実施例３ シロザケ成長ホルモンcDNAを含む組
換えDNAの選択： 実施例２で得た組換え体プラスミドを用い、大
腸菌c600SF8株〔Cameron：Proc.Natl.Acad.
Sci.USA，72，3416（1975）〕をScottらの方法
〔重定勝哉：細胞工学、２，616（1983）〕に従い形
質転換した。得られた約１万個のコロニーのうち
4800個をニトロセルロース上に固定した。シロザ
ケ成長ホルモンのＮ末端から23番目−28番目のア
ミノ酸配列に対応する合成DNA、すなわち （３番目の塩基はＡまたはＧ、９番目はＴまた
はＣ、12番目はＣまたはＴ、15番目はＣまたはＴ
であり、組み合わせて16通りの合成DNAの混合
物となる）を32Pで標識したプローブに40℃で強
く会合した８菌株を選んだ〔Grunstein−
Hognessの方法、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，72，
3961（1975）〕。得られた８菌株についてSouthern
の方法〔J.Mol.Biol.，98，503（1975）〕により、
上記プローブおよびＣ末端付近のアミノ酸配列に
対応する合成DNAプローブ （３番目の塩基はＣまたはＴ、６番目はＡまた
はＧ、９番目はＡ，Ｔ，Ｇ，Ｃのいずれか、12番
目はＧまたはＡであり、組み合わせて32通りの合
成DNAの混合物となる）とも会合が確認された。
これらのプラスミドはpSGH1，３，６，８，９，
10，14，17と命名したが、いずれも、シロザケ成
長ホルモンのアミノ酸配列から予想されるDNA
配列を有することから成長ホルモンcDNAを含ん
でいるものと考えられた。 実施例４ 該プラスミドpSGH1の塩基配列： 上記で得られたプラスミド８種につき、種々の
制限酵素で消化し、cDNA部分の切断地図を決定
した。制限酵素部位の存在位置から、得られたプ
ラスミドは３群に分類でき、pSGH1，６，９，
10，17の群、pSGH3の群、pSGH8，14の群と分
けられた。それぞれの群の制限酵素地図を第２図
に示す。 次に実施例３で行つた合成DNAプローブと最
も強い会合を示し、かつほぼ完全長のcDNAを含
むと考えられるpSGH1を含む群のプラスミド、
特にpSGH1について、その翻訳領域の全ヌクレ
オチド配列をM13フアージを用いたSanger法
〔Sangerら、Proc.Natl.Acad.Sci，USA，74，
5463（1977）：Amersham社 M13 cloning and
sequencing handbook〕に従つて決定した。配
列を第１表に示す。第１表中、塩基数１−66がシ
グナルペプチドを、67−630がシロザケ成長ホル
モンの成熟ペプチドをコードする。pSGH1に含
まれるcDNA配列から予想されるアミノ酸配列
は、シロザケ成長ホルモンペプチドから決定され
ているＮ末端付近およびＣ末端付近のアミノ酸配
列と完全に一致し、該cDNAはシロザケ成長ホル
モンをコードしていることが確認された。
pSGH1、pSGH3、pSGH8を含む大腸菌（それぞ
れESGH1、ESGH3、ESGH8）は昭和59年６月
23日付で、FERM BP−551，552および553とし
て工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて
いる。 【表】 発明の効果 本発明によれば、魚類の成長ホルモンポリペプ
チドをコードするDNAを組み込んだ組換え体
DNA、該組換え体DNAを含む微生物が得られ、
これらは魚類の成長ホルモンポリペプチドの大量
生産に利用することができる。
第１図はOkayama−Berg法によるcDNA合成
と、該DNAを含む組換え体プラスミドの造成過
程の概略を示す。第２図はpSGH1、pSGH3、
pSGH8に含まれるcDNAの制限酵素地図を示す。
と、該DNAを含む組換え体プラスミドの造成過
程の概略を示す。第２図はpSGH1、pSGH3、
pSGH8に含まれるcDNAの制限酵素地図を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記のペプチド配列を含む魚類の成長ホルモ
ンポリペプチドをコードするDNA。 【表】 【表】 ２ 下記のペプチド配列を含む魚類の成長ホルモ
ンポリペプチドをコードするDNAを組み込んだ
組換え体DNA。 【表】 【表】 ３ プラスミドpSGH1，pSGH3またはpSGH8と
名づけた特許請求の範囲第２項の組換え体DNA。 ４ 下記のペプチド配列を含む魚類の成長ホルモ
ンポリペプチドをコードするDNAを組み込んだ
組換え体DNAを含む細菌。 【表】 ５ 該細菌がエツシエリヒア・コリに属する特許
請求の範囲第４項の細菌。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59134536A JPS6115699A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
| CA000485108A CA1272144A (en) | 1984-06-29 | 1985-06-25 | Fish growth hormone polypeptide |
| AU44195/85A AU575961B2 (en) | 1984-06-29 | 1985-06-26 | Salmon fish growth hormone by genetic engeneering |
| NO852568A NO174717C (no) | 1984-06-29 | 1985-06-26 | Fremgangsmåte for fremstilling av et fiskeveksthormon-polypeptid fra Oncorhynchus keta samt ekspresjonsvektorer til bruk ved fremgangsmåten |
| EP85107987A EP0166444B1 (en) | 1984-06-29 | 1985-06-27 | Fish growth hormone polypeptide |
| SU853913602A RU1825376C (ru) | 1984-06-29 | 1985-06-28 | Способ получени ДНК, кодирующей гормон роста лосос , способ конст-ни промежуточной рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей ДНК-фрагмент, кодирующий гормон роста лосос , дл получени плазмид pS GH1, pS GH3, pS GH9, pS GH10, pS GH14 и pS GH17, способ получени реком-ной плазмидной ДНК pS GH1B2, кодирующей гормон роста лосос , способ получени реком-ной плазмидной ДНК pSGH II С2, кодирующей гормон роста лосос , способ получени реком-ного гормона роста лосос |
| US06/750,587 US4689402A (en) | 1984-06-29 | 1985-07-01 | Fish growth hormone polypeptide |
| US07/017,630 US4849359A (en) | 1984-06-29 | 1987-04-14 | Fish growth hormone polypeptide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59134536A JPS6115699A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6115699A JPS6115699A (ja) | 1986-01-23 |
| JPH057995B2 true JPH057995B2 (ja) | 1993-01-29 |
Family
ID=15130608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59134536A Granted JPS6115699A (ja) | 1984-06-29 | 1984-06-29 | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6115699A (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6193196A (ja) * | 1984-10-12 | 1986-05-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモン遺伝子 |
| JPS6193197A (ja) * | 1984-10-12 | 1986-05-12 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | 魚類の成長ホルモンポリペプチド |
| JPH0568572A (ja) * | 1991-09-11 | 1993-03-23 | Agency Of Ind Science & Technol | サケ成長ホルモンを生産するラン藻シネココツカス |
-
1984
- 1984-06-29 JP JP59134536A patent/JPS6115699A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6115699A (ja) | 1986-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0083777B1 (en) | Physiologically active peptide with between 147 and 162 amino acid residues | |
| EP0112149B1 (en) | Molecular cloning and characterization of a further gene sequence coding for human relaxin | |
| JP2533470B2 (ja) | 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法 | |
| EP0051873A2 (en) | Hybrid human leukocyte interferons, process for their microbial production, intermediates therefor and compositions containing them | |
| JP2521657B2 (ja) | 組換ｄｎａ分子及びこれを含有する形質転換宿主細胞 | |
| HU197350B (en) | Process for the molecular cloning and characterization of gene encoding human relaxin and for the production of human h1 relaxin | |
| CA1272144A (en) | Fish growth hormone polypeptide | |
| JP2637393B2 (ja) | プロインシュリンおよびプレプロインシュリン産生暗号を有するヒト遺伝子 | |
| EP0259891B1 (en) | [Leu 13] motilin, DNAs coding for same and methods for producing same | |
| JPH057995B2 (ja) | ||
| HU197939B (en) | Process for producing deoxyribonucleic acid, or its precursor, determining human growth hormone releasing factor | |
| EP0169505A2 (en) | Process for preparing oligopeptide | |
| JP2548204B2 (ja) | 新生理活性ポリペプチド | |
| JPH051799B2 (ja) | ||
| JPH051800B2 (ja) | ||
| JPS59140884A (ja) | コルチコトロピン放出因子をコ−ドするクロ−ン化ｄｎａフラグメント | |
| JPS63304997A (ja) | 魚類の生殖腺刺激ホルモン遺伝子 | |
| JPS6222800A (ja) | 魚類の成長ホルモン遺伝子および該遺伝子のコ−ドするポリペプチド | |
| JPS638399A (ja) | 生理活性ポリペプチド | |
| JPS61291598A (ja) | 魚類カルシトニン誘導体及びその製造方法 | |
| HUT51328A (en) | Process for producing proteins | |
| JPH0579310B2 (ja) | ||
| JPH0683670B2 (ja) | デオキシリボ核酸 | |
| JPH0695938B2 (ja) | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド | |
| JPH05268969A (ja) | 魚類の新規成長ホルモンポリペプチド |