JPS638399A - 生理活性ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生理活性ポリペプチド更に詳しくはリンホトキ
シン活性を有する新規ポリペプチドに関する。

〔従来の技術〕

リンホトキシン（以下ＬＴと略）はリンパ球及びリンパ
球系株化細胞から特異的又は非特異的に放出される細胞
障害活性ｋｍするリンホカインの１種として知られてい
る。ＬＴは棟々の癌細胞に対して障害性があるばかりで
な（、ある種の抗癌剤又はインターフェロンの細ｌＩ′
Ｃ！１［杏効果を増強することから抗腫瘍剤として医薬
への応用が期待されている。〔グレンジャー（Ｇｒａｎ
ｇｅｒ　Ｇ、Ａ、　）ら、第１４回国際化学僚法学会、
京都、１９８５年６月２３〜２８日、アブストラクツ、
第１５貞（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅ
ｓｓ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　。

Ｋｙ：＋ｔｏ、　Ｊａｐａｎ、　Ｊｕｎｅ　２３−２８
　、　Ａｂｓｔｒａｃｔｓｐｌ　５）；ｆｆツナガ（Ｍ
ａｔｓｕｎａｇａ　Ｋ、　）ら、同上アブストラクツ、
第３５２頁〕 ヒト由来細胞によるＬＴ産生については、扁桃細胞また
は末梢血リンパ球をフイトヘムアグルチニン（以下ＰＨ
Ａと略）と共に培養し、その培養上清から取得する方法
〔ビータ−（Ｐｅｔｅｒ　Ｊ、Ｂ、　）ら、ジャーナル
・オブ・イムノロジー（Ｊ。

工ｎｎｍｕｎｏ１．１）１　７７０　（１９７３）　：
ウォーカーら（Ｗａｌｆｅｒ　Ｓ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｌｕ
ｃａｓ　Ｚ、Ｊ、　）、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー（Ｊ　、　■ｍｍｕｎｏｌ、　１０９１２３３（１９
７２））、リンパ球系株化細胞をＰＭＡの存在下に培養
し、その培養上清から取得する方法〔ヤマモト（Ｙａｍ
ａｍｏｔｏ　Ｒ，Ｓ、　）ら；ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・レスポンス・モデイファイアーズ（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）
３　７６（１９８４））、ヒトＴ細胞ハイブリドーマを
ホルボールミリステートアセテート（以下ＰＭＡと略〕
及び／又はコンカナバリンＡ（以下Ｃｏｎ　Ａと略）の
存在下に培養する方法〔浅田ら：セルラー・イムノロジ
ー（Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ−、７７１５０＜１９８
３）））等が知られている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

然し、これらの方法は、生麺量が少なく、又培地に高価
な栄養源（例えば牛胎児血清）を必要とする等ＬＴを高
純度かつ経済的に取得することは非常に困難である。

ＬＴｉ犬量に得るための他の方法として、いわゆる遺伝
子操作の手法を用い、ＬＴに対応する遺伝子全ベクター
に組込み細菌、カビ、酵母又は動物赳胞内で複製、転写
、翻訳せしめてこれら細胞により生産させることが考え
られ、ＬＴに対応する遺伝子の取得が待望されていた。

本発明者らは、先にエメチンーアクチノマイシンＤ法を
用い細胞融合を行いＬＴを産生するヒトＴ細胞ハイブリ
ドーマクローンＡ−Ｃ５−８株を取得した〔浅田ら；セ
ルラー・イムノロジー（ｃｅｌｌ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
　７７　１５０　（１９８３）Ｊ）。

しかし、Ａ−Ｃ５−８株’ｉ＜　Ｃｏｎ　Ａ　％Ｐ）ａ
の存在下ＬＴ最適注生条件（培資時間３０時間以上〕で
培養してもＬＴＶこ対Ｅ’ｔ、するメツセンジャーＲＮ
Ａ　（以下ｍＲＮＡとＮ）ｋ取得できず、従ってＬＴに
対応する遺伝子も取得できなかった。

そこで本発明者らはＬＴに対応するｍＲＮＡの取得条件
全独々検討した結果、Ａ−Ｃ５−８株全ＰＭＡ及び／又
はＣｏｎ　Ａと共に２４時間以内（特に４時間以内）培
養することにより、細胞内に生成したＬＴポリペプチド
に対応するｍＲＮＡ　ｆ取得できることを見出し、更に
このｍＲＮＡよジ遺伝子組換え技術全応用することによ
り、ＬＴポリペブチ更に、本発明者らは鋭意研究全１ね
た結果、（の訪）ヲ組込んだ形質発現ベクターで形質転
換された微生物中でＬＴポリペプチド全生産させること
に成功し、更にこのようにして生産されたヒトＬＴｒｌ
？リペプチド含有生産物から、実質的に不純物ケ含まな
いヒトＬＴポリペプチド全得ることに成功し本発明全完
成した。

遺伝子組換え技術を用いてＬＴ？！−生産する方法に関
し、グレイらの報告（Ｐ、Ｗ、　Ｇｒａｙ　ｅｔ　ａｌ
　；Ｎａｔｕｒｅ　３１２　７２１　（１９８４）　）
がある。

Ｇｒａｙらは、ヒト末梢血リンパ球の非接着細胞をＰＭ
Ａ　、スタフイロコツカル　エンテロトキシンＢ及びサ
イモシンα、と共に４８時間培養後、細胞よりｍＲＮＡ
を取得しｃＤＮＡを作成、制限酵素で切断後合成オリゴ
ヌクレオチドとライデージョン後、大腸菌内でＬＴｉ発
現させている。この報告から推定されるＬＴはアミノ酸
残基数１７１又は１７２、分子量Ｉ　Ｂ、６０　［１を
有する。

本発明において、ｍＲＮＡはヒト細胞ハイブリドーマよ
ジ取得していること、ｍＲＮＡより誘導したｃＤＮＡの
塩基配列が異なることなどの相違がある他、本発明のＬ
ＴポリペブチＶのアミノ酸残基数が１５２であジ分子量
が異なると共にアミノ酸配列でも７番目のアミノ酸が異
なる。

〔問題点を解決するための手段〕　゛ 即ち本発明はＬＴ活性を有する新規なポリペプチドを提
供するものである。

更に評しくは％願昭６０−２８９２４９号明細書で得た
ＬＴポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（第１表）を制
限酵素で切断し、別に翻訳開始部位全４人した形質発現
ベクターを同じ制限酵素で切断したものとを、ライプ−
ジョンしてＬＴポリペプチド生産用の形質発現ベクター
ケ得、この形質発現ベクターを適当な宿主例えば大腸菌
などに導入することにより形質転換体を得て、該形質転
換体全培養して得た培養物から抽出、精製して得た不純
物全実質的に含まないヒ）ＬＴポリペプチドに関する。

以下全白 ヒ）ＬＴポリペプチドは次式（１）のアミノ酸配列を有
する。

以下余白 式（１） ％式％ 上述のポリペプチド及び第１表の塩基配列中の符号は以
下の略号である。

ＡＬＡ　：アラニン、　　　　　ＡＲＣ）　：アルギニ
ン、ＡＳＮ：アスパラギン、　　　ＡＳＰ：アスパライ
ン酸、ＣＹＳニジスティン、　　　　（）ＬＮ：グルタ
ミン、ＧＬＵ：グルタミン酸、　　　ＧＬＹニゲリシン
、ＨＩＳ：ヒスチジン、ＩＬＥ：イソロイシン、ＬＥＵ
：ロイシン、　　　　　ＬＹＳ：リジン、ＭＥＴ　：メ
チオニン、ＰＨＥ　：フェニルアラニン、ＰＲＯニゲロ
リン、　　　　　　ＳＥＲ：セリン、ＴＨＲ：スレオニ
ン、　　　　ＴＲＰ：）リプトファン、ＴＹＲ：チロシ
ン、　　　　　ＶＡＬ：バリン、Ａ　：アデニン、　　
　　　Ｃ：シトシン、Ｇ　ニゲアニン、　　　　　Ｔ　
：チミン、尚、ヒトＬＴ活性を有するポリペプチドのア
ミノ酸配列に関してはヒトリンパ芽球細胞株ＲＰＭ１）
７８８由米の分子量２０．０００と２５．０００のＬＴ
に関しアガワ＃　（Ｂ、Ｂ、　Ａｇｇａｒｗａｌ　）ら
の報告〔デ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６０　
２ろろ４（１９８５，１）があるが、本発明のポリペプ
チドとは上記アミノ酸配列中７番目のアミノ酸残基が異
なる。

さらに大腸菌で発現させる場合ＬＴポリペプチド内に存
在するメチオニン残基金翻訳開始コドンとして用いるた
め余分なメチオニン残基の付加を防ぐことができる。

以下に不発ＥりＪ’に詳ａ　Ｋ説明する。

■ＬＴ高産生産生細胞択　　。

ＬＴ産生細胞としては、正常ヒトリンパ球、ＣＣＲＦ−
ＣＥＭ　、　　ＭＯＬＴ−ＡＦ　％ＪＵＲＫＡＴ等ヒト
Ｔリンパ球糸株化細廊及びそのクローニング株、ＲＰＭ
Ｉ−１７８８等ヒ）　Ｂ　ＩＪンパ球系株化細胞を用い
ることができるが、ＬＴ産生量が尚く細胞の継代が可能
であることから、正常ヒトでリンパ球とヒトＴリンパ原
糸株化細胞とを細胞融合して得たＬＴ産生ヒ）Ｔ細胞ハ
イブリドーマを用いることが好ましい。

ＬＴｉ生ヒ）Ｔ細胞ハイブリドーマは親細胞であるヒ）
　Ｔ　ＩＪンバ球先糸株化細胞りＬＴ産生ｆが筒く、従
って、細胞から抽出、分離されるｍＲＢＴＡのｔも多く
好適に用いられる。

なお、ＬＴの活性測定に用いた分析法は、小林（Ｋｏｂ
ａｙａｓｈｉ　Ｙ、　）らの方法〔ジャーナル・オブ・
イムノロジー（Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ　）　１２２　７
９１（１９７９））’！ｒ用いて行った。すなわち、細
胞培養上清又は細胞抽出物試料のマウスＬ・Ｐ３細胞（
Ｌ細胞の亜株）に対する障害活性全指標として測定した
。ＬＴの１単位／１は、５０％の標的細胞全障害する濃
度で表わした。

ＬＴｉ生ヒトＴ細胞ハイブリドーマは公知の方法（特開
昭５８−７２５２０号公報〕により製造することができ
る。

すなわちヒ）　Ｔ　ＩＪンパ球系腫瘍細胞を蛋白質合成
阻害剤又はこれとＲＮＡ合成阻害剤との併用により処理
し、ヒトＴリンパ球全マイト−ジエン又は抗原で刺激し
、両者を融合促進剤（ポリエチレングリコール等）の存
在下で融合させ、得られた融合細胞（ヒトＴ細胞バイブ
ＩＪ　）Ｆ−マ〕だけを分離して取得することができる
。ヒト’ｒ　、ｍ胞ハイプリドーマ全培養液（例えは基
礎培地ＲＰＭニー１６４０培地に１０％牛脂児血清、５
ｘ１０−５Ｍの２−ヌルカフ０トエタノール、２ｍＭの
グルタミン全添加した培養液（以下、ＲＰＭＩ培地と略
〕中、３７°Ｃ，Ｃｏ２５％−空気９５％の雰囲気下で
培養し、前述のＬＴ産生ヒ）Ｔ細胞ハイブリドーマ全ス
クリーニングする。

■細胞培養 ＬＴｉ生ヒトＴ細胞ハイブリドーマからｍＲＮＡを取得
するたぬには、最低１０’個以上の細胞が必要であジ、
それらは細胞培養によって取得することが一般的である
。すなわち、細胞全栄養培地中１０５〜１０７個／　＋
ｏ’　Ｋ調製したものを、シャーレ、組織培養用フラス
コ回転培養液（スピナーフラスコ）内でＣ０２５％−空
気９５チの雰囲気下、６７°Ｃで培養する。

培養時間は、培地、組成、初期細胞濃度によＶ異なるが
１〜５日間が適当である。培養液を遠心分離し細胞を取
得する。

栄養培地は、糖類、アミノ酸、ビタミン類、ホルモン類
、蛋白質、抗生物りよ、成長因子類及び刺機塩類等から
選ばれた一棟以上を含有する基礎培地、又は基礎培地に
動物血清を添加した培地から適宜選択して用いる。

基礎培地としては、市販されているＲＰＭＩ−１６４０
培地、ＭＥＭ培地、ダルベツコ変法ＭＥＭ培地等も使用
できる。

動物血清としては、牛胎児血清、新生牛血清、馬血清、
ヒト血清等全基礎培地に対し、１〜２０チ添加すること
ができる。

又、細胞をヌードマウス、ハムスター等のヒト以外の温
血動物内で繁殖させて用いることもできる。

０ｍＲＮＡの増幅 ■で取得したＬＴ産生ヒ）Ｔ細胞ノ・イブリドーマを栄
養培地中１０”〜１０フ酎に調整し、史に丹植及び／又
はＣｏｎ　Ａ　ｋ加えて培養することにより、ＬＴに対
応するｍＲＮＡを多Ｊ１°に含むノＩ′（ｆｌ胞を取得
することができる。Ｐ彫・の好適濃度は２０〜２００　
ｎｇ　（ナノグラム）　／　ｔｎｉ％Ｃｏｎ　Ａの好適
一度は５〜５０μｍ１　／　ｍｅの範囲である。

培養時間は２４時間以内特に８時間以内が適当である。

その理由μ、培−ａａａｔ＋胞のリンホトキシン活性に
対応するｍＲＮＡの含量が、時間の経過と共に減少する
からである。特に２４時間を超える場合、ＬＴ産生ヒ）
Ｔ細胞ハイブリドーマ全培養し、培重上清からＬＴを回
収するための最適時間２４〜７２時間では細胞内のＬＴ
に対応するｍＲＮＡかは極めて微は゛でありｍ朋Ａ全回
収することは困難である。

■細胞より全ＲＮＡの抽出 ■で取得した細胞から全ＲＮＡの抽出は塩酸グアニジン
法〔ディージ−（Ｄｅｅｌｅｙ　Ｆ、、Ｇ、　）ら、デ
・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　２５２　８３１０
　（１９７７））等公知の方法で実施できる。

−ｊなわち、■で取得した細胞（１０９個以上）を、ホ
モジネート緩衝′ｇ！１．（８Ｍ塩酸グアニジン、５１
）ｎＭジチオスレイトール、２０ｍＭ酢酸ナトリウム含
有、　　ＮａＯＨでｐ）１７に調整）に懸濁し、ホモジ
ナイヂー等で破壊する。破縫物よジェタノール沈殿、フ
ェノール抽出により全核酸全抽出後、塩化リチウム沈殿
によジ全ＲＮＡ　ｉ回収する。抽出操作はＲＮａｓｅに
よるＲＮＡの分解を防ぐため、器具は乾熱又はジエチル
ピロカーボネート処理後オートクレーブ滅菌し、操作中
はビニル手袋を看用することが好ましい。

■全ＲＮＡよＦ）　ｍＲＮＡの分離 全ＲＮＡから目的とするｍＲＮＡの分離は、ショ糖密度
勾配遠心法、ケ゛ル濾過法、電気泳動による方法、メン
ブランフィルタ−法、オリゴｄＴカラムを用いる方法等
公知の方法、又はこれらを組合わせることによって実施
できる。

ここに得られたｍＲＮＡが目的とするＬＴ　ｉコードす
るものであることを確認するためには、ｍ態へを蛋白質
に翻訳させてその生物活性を調べれはよい。例えばアフ
リカッメガエル〔ゼノパス・レビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　
１ａｅｖｉｓ　）　）の卵母細胞、網状赤血球ライゼー
ト、小麦胚芽のような適当な蛋白合成糸にｍＲＮＡ　全
注入又は添加して蛋白質に翻訳させ、その蛋白質がマウ
スＬ−Ｐ３細胞に対して細＆！ｉ障害活性を示すことを
確認することにより行われる。

尚、アフリカッメガエルの卵母細胞を用いる方法は例え
ば次のようにして行なわれる。

卵母細胞１個当り約５０〜１）００ｎのｍＲＮＡ　ｆマ
イクロインジェクション法で注入し、その２０個全モデ
ィファイド・パース・ソルト液（１ｌｏｄｉ−ｆｉｅｄ
　Ｂａｒｔｈ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　（Ｎ
ａＣｔＯ，１３＆　５ＫＣ１０，０７５＆　％ＮａＨＣ
Ｏ３０，２２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２００，２，！？、Ｃ
ａ（Ｎｏｚ）２・４Ｈ２００，（３８／ｌ　％　ＣａＣ
４２・６Ｈ２００，０９ｇ、ＨＥＰＥＳ　２．３８　、
！９、ストレプトマイシン１００．９．ペニシリンＧ（
１０万単位）を１ｔに溶解；阻７．４、以下ＭＢＳと略
））２００μを中２６°Ｃで４８時間培養する。この培
養上清を試料として、Ｌ−、Ｐ３細胞障害活性を指標と
してＬＴ活性を測定１゛る。

と 本発明のＬＴ畜コードするｍＲＮＡは次の性質により＃
徴つけられる。

■１２．６　Ｓ〜１４．６８のＳ甑を有する。

■３′　　末端にポリアデニル′酸桐造を有する。

■ＬＴのポリペノチドケコードする。

■リンホトキシンｃＤＮＡのクローニング■の操作で得
られたｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴ（ｄＴ　）をプライ
マーとして、（ｉＡＴＰ、　　ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ％　ｄＴＴＰの存在下で逆転写酵素（例えばト
リ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素〕によりｍＲＮ
Ａと相補的な単鎖ｃＤＮＡ　ｆ合成し、熱処理で鋳型ｍ
ＲＮＡ　ｋ変性させる。次いで、この単鎖ｃＤＮＡを鋳
型にして、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウフラ
グメント〕？用いて二重鎖ＤＮＡ　１．ｆ合成する。

この二重鎖ＤＮＡ　’にアルカリ処理及びフェノール抽
出？行い、変性ｍＲＮＡ及び蛋白から分離する。この二
重鎖ＤＮＡに逆転写酵素全作用させ、さらに完全な二重
鎖ＤＮＡを合成する。ここに得られたＤＮＡはヘアピン
栴造會有するのでＳエヌクレアーゼ〔アスペルギルス・
オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ　）　
：米麹因由米Ｓ１ヌクレアーゼ〕によりヘアピン構造を
切断し、完全な二重鎖構造のＤＮＡｔ得る。ここで得ら
れたＤＮＡ　’ｉポリ（ｄＧ）−ポリ（ｄＣ）又はポリ
（ｄＡＪ−ポリ（ｄＴ）ホモポリマー伸長法〔ノダ（Ｎ
ｏｄａ　Ｍ、　）ら、ネイチャー（Ｎａｚｕｒｅ）２９
５　２０２（１９８２）；マニアチス（Ｍａｎｉ−ａｔ
ｉｓ　Ｔ、　）ら、「モレキュラー・クローニング（ア
・ライラリー・マニュアル）　Ｊ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒｃｘｏｎｉｎｇ（ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎ
ｕａｌ　）２１７（１９８２）コールド・スプリング・
ノ・−バー・ラボラトリ−（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）ニューヨーク〕
のような常法に従って、例えばプラスミドｐＢＲ３２２
の制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ切断部位に組み込ませる。得られ
た組換えプラスミドを、例えはペルパル（Ｐｅｒｂａｌ
　Ｂ、　）の「ア・シラクチカル・ガイド・トウ・モレ
キュラー・クローニング」”Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　
Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕ１ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ″２６８（１９８４）、ジョン・ウィリー・アンド・
サン１０１株のような宿主に尋人して形但転換させ、テ
トラサイクリン耐性株全選択してｃ　ＤＮＡライブラリ
ーを作製する。

このｃＤＮＡライブラリーについて合成プローブ全利用
したコロニー・ノ−イブリダイゼーション試験〔モント
ゴメリ−（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ　Ｄ、Ｌ、　）ら、セ
ル（Ｃｅｌ’１）１４　６７３（１９７８）；ｒデル（
Ｇｏｅｄｄｅｌ、　Ｄ、Ｖ、　）ら、ニュークレイツク
・アシツズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ、　）　８４０５７（１９８０））により目的の
クローンをスクリーニングする。即ち、グレイらがネイ
チャー　（Ｎａｔｕｒｅ　）　３１２　７２１　（１９
８４）に報告しているリンホトキシンの４０４から４２
１香目の１８塩基並びに５００から５１７番目の１８塩
基に対応する相補的な塩基配列を化学合成し、ポリヌク
レオチドキナーゼ（Ｔ４ファージが感染した大腸菌白米
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ〕でプローブの５′末端
の水酸基にγ−”２Ｐ−ＡＴＰのリン酸を転移させ、３
２Ｐ：標識した２ａ［のプローブ全作製する。前述のＣ
ＤＮＡライブラリーの中から両プローブに強く結合する
クローン’ｋＡ択する。

ここで得られたクローンからプラスミｖ　ＤＮＡ　を分
離し、加熱又はアルカリ変性により単鎖ＤＮＡとしニト
ロセルロースフィルターに固定する。これにリンホトキ
シンｍＲＮＡ　ｋ　宮むｍＲＮＡ画分を加えハイブリダ
イズさせた後、結合したｍＲＮＡ　ｆ溶出回収し、これ
をアフリカッメガエルの卵母細胞に注入し、回収された
ｍＲＮＡがリンホトキシンをコードしているか否かを検
討する（以下、〕・イブリダイゼーション・トランスレ
ーション試験といつ）。

以上の方法によりリンホトキシンのｍＲＮＡと相補性の
ある塩基配列を含むＤＮＡ断片を組込んだクローン化Ｄ
ＮＡ　ｉ得ることができる。

丈に、この形質転換株のクローン化ＤＮＡ断片を適尚な
制限酵素で切出し、３２ｐで標識したもの全ゾロープと
して用い、前述のｃＤＮＡライブラＩＪ−全再スクリー
ニングすることにより、より大きなサイズのｃＤＮＡ断
片を選択してもよい。

このようにして得られた、クローン化ＤＮＡ断片につい
て、制限酵素地図全作製し、Ｍ１３ファージによりクロ
ーニングし、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ　Ｆ、）ら〔プロ
シーディンゲス・オブ・デ・ナショナル・アカデミ−・
オプ・サイアンシーズ・オブ・デー　Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　
）　７４５４６３（１９７７））のジデオキシシーフェ
ンス法に従って塩基配列全解析し、既に明らかになって
いるリンホトキシンのアミノ酸配列’ｔコ一にひ出すこ
とにより、リンホトキシンのアミノ酸配列を含むポリペ
プチドをコードする塩基配列を有するクローン化ＤＮＡ
　ｉ得ることができる。

■ＬＴポリペゾチドのアミノ酸配列をコードする塩基配
列を含む発埃ベクターの調製 ■ＬＴポリペゾチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮ
Ａの制限酵素による切断 本発明のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの作製のため
には第１表に示す全ｃＤＮＡ　ｆ制限酵素Ｎ５ｉｌｃ　
ＤＮＡ断片を抽出し、回収する。このｃＤＮＡ断片は第
１表に示す全ｃＤＮＡの２２５査目から８４０査目まで
を含む。

＠合成オリゴヌクレオチドとＬ’Ｉ’　ｃＤＮＡ断片の
ライゲーシヨン 下記構造の合成オリゴヌクレオチド ＡＡＴＴＣＴＡＴ（）ＣＡ ＡＴ た後、ＥｃｏＲ［で消化し常法に従って６２３　ｂｐの
ＥｃｏＲ［断片を回収する。

○ＬＴ　ｃＤＮＡ断片の発埃ベクターへの尋人発現ベク
ターｐＫＫ　２２３−３　（ファルマシア社製）　’ｋ
　ＥｃｏＲ［で消化した後、ウシ腸粘膜由来アルカリフ
ォスファターゼで５′末端の脱リン酸化を行う。０で作
成したＥｃｏＲＩ断片と上記の開環ベクターのライゲー
シヨンを行う。反応後閉環したベクターを常法に従って
回収し、大腸菌に形質転換する。

■合成オリゴヌクレオチドプローブによるスクリーニン
グ ■に示した３２ｐ標識した合成オリゴヌクレオチドプロ
ーブとθで作製した大腸菌の形質転換株とをコロニーハ
イブリダイゼーションし、合成オリゴヌクレオチドプロ
ーブとハイブリダイズする菌株全選択する。次いでこの
コロニーからベクターを調製し、制限酵素により切断後
アガロ−スケ”ルミ気泳動法によジ目的とする６　２３
　ｂｐのｃＤＮＡ断片を含むベクター全取得する。

■ＬＴ　ｃＤＮＡの６′宋端非コード領域の除去■で取
得したベクター２　Ｈｉｎａｍで直鎖状ＤＮＡにした後
、ＢＡＬ　３１ヌクレアーゼでＬＴ　ｃＤＮＡの６′末
端非コード領域を除去する。次にＤＮＡポリメラーゼ１
（フレノウフラグメント〕で末端ヶ平滑床端とした後Ｅ
ｃｏＲＩで消化し、ポリアクリルアミドグル電気泳動で
分画し、約４　’６０　ｂｐの断片を回収する。

＠　ＬＴ　ＣＤＮＡとリンカ−とのライダ１−ジョン■
で得た４　６０　ｂｐ断片にＨｉｎｄｌ　Ｌｉｎｋｅｒ
　（全酒造製）七うイｒ−ジョンした後Ｈｉｎｄｌで消
化する。

θＬＴ　ｃＤＮＡと発現ベクターとのライダ１−ジョン
ｐＫＫ　２２３−３　ｋ　ＥｃｏＲＩ　ＭひにＨｉｎｄ
ｌで消化し、４５５５　ｂｐの断片を得る。次に＠で得
た約４６５ｂｐ　ＥｃｏＲｌ　−Ｈｉｎｄｕ断片と結合
させ、常法により大腸菌に形質転換し、約Ａ　６５　ｂ
ｐ　ＬＴ　ｃＤＮＡ断片を有するベクターを取得する。

■多コピー発現ベクターの作成 ｐＡＴ　１５３　（アマジャム社製）　ｆ　Ｂａｚ　Ｈ
１並ひにＰｖｕ　１で消化し、アガロースゲル電気泳動
で分画し２６５５　ｂｐの断片全取得する。一方■で得
たベクターもＢａｍ　ＨＩ並ひＰｖｕ　Ｉで消化し、同
様に約９８０　ｂｐの断片全取得する。上記２櫨類のＢ
ａｍ　Ｈニー　Ｐｖｕ　Ｉ断片全ライプ−ジョンし、Ｌ
ＴｃＤＮＡ断片を有するベクターを取得する。

＠）　ＬＴ　ｃＤＮＡの大腸菌内における発現■で取得
した大腸菌の形質転換体をイソプロピル−β−Ｄ−チオ
ガラクトシド（以下工ＰＴＣ）と略）を含む培地中でＯ
Ｄ　５５０　ｎｍが約１になるまで培養する。

集凶後、超音波処理で菌体を破砕、トリス塩酸緩′＃Ｉ
液（ｐＨ８，０）で抽出、無菌濾過後ＬＴ活性全測定し
最もＬＴポリペプチド発現分の多い形質転換体をスクリ
ーニングする。

■ＬＴポリペプチド産生大腸菌の培養及び精↓■で取得
した形質転換体（ＬＴ産生大腸菌）をＩＰＴ（）　’ｉ
ｉ含む培地中でＬＴポリペゾチドが十分に産生きれるま
で培養する。次いで培養物’ｋ　ＩＪゾチーム消化と凍
結融解、超音波破砕、フレンチプレス、ダイノーミルな
どにより破砕した後遠心分離又は誰過により抽出液を集
める。この抽出液を硫安塩析、限外濾過、イオン交換ク
ロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ケ９ル濾
過、５ＤＳ−ポリアクリルアミドを気泳動等の組合せに
より精製しＬＴポリペプチドを実質的に純品として得る
ことができる。

■［相］で得たＬＴポリペプチドに関し、アミノ酸組成
及びＮ末端アミノ酸配列を測定した結果、実施例に示す
ように式（［）から推定される値と一致した。

以下実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例〕

実施例１ （１）リンホトキシン産生ヒトＴ細胞ノ飄イプリドーマ
の調製 ヒト末梢血リンパ球（以下ＰＢＬと略）１０６個／　祷
’ｉ　’Ｍ’ＭＩ培地中、コンカナバリンＡ（以下Ｃｏ
ｎ　Ａと略）２０μ：ｉ／ｍにより２日間処理後、０．
２Ｍのα−メチル−Ｄ−マンノシドにて細胞に結合した
Ｃｏｎ　Ａ　ｆ可及的に除去した。

他方、ＲＰＭＴ培地中で増殖期にあるヒ）　Ｔ　ＩＪン
パ球系）膿瘍細胞ＣＣＲＦ　−ＣＥＭ　（以下ＣＥＭと
略〕を遠心分離で回収し、ＲＰＭＩ　１６４．０−１０
　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ培地中に２Ｘ１０’個／ＷＬｌに懸
濁し、エメチン塩酸塩（半井化学社）及びアクテノマイ
シンＤ（ＰＬバイオケミカルズ社）をそれぞれ５　Ｘ　
１０−５Ｍ及び０．２５　ｐ９　／　ｒｕｇとなるよう
に添加し、３７°Ｃ１２時間処理した後、培養液中のエ
メチン塩酸塩及びアクチノマイシンＤｉ遠心除去した。

以上のように調製したＰＢＬとＣＥＭ’ａ：１０：１の
割合で混合後、遠心分離して得た細胞ベレットに０．５
　扉ｇ　ＬＤ　４６％示リすチレングリコール（ＰＥＧ
　−１５４０、和光純薬社〕、５μ９　／　ｔｒｔｌの
ポリ−Ｌ−アルギニン及び１５％ジメチルスルホキシド
含南ＭｇＭ培地を加え、６７°０１４５秒間ゆっくり攪
拌して融合させ、１０１！Ｌｌの２５　ｍＭ　ＨＥＰＥ
Ｓ　（ＰＨ７，２）で緩衝化したＭＥＭ培地１０罰をゆ
つくジ添加し、遠心した。

細胞ペレットにＲＰＭＩ培地を加え、細胞数を１０６個
／―とし、その１００μｔとフィーダー・セル（ｆｅｅ
ｄｅｒ　ｃｅＦｌ　）としてマイトマイシンＣ処理した
ＯＥＭ　（４ｘ　１０５個／ｙｔｌ）含有ＲＰＭＩ培地
１００μｔとを混合し、９６穴カルチヤープレートに加
え、ＣＯ２５％−空気９５％の雰囲気下、６７°Ｃで約
３〜４週間培養後、増殖した融合細胞全上記マイトマイ
シンＣ処理ＣＥＭ　ｉフィーダー・セルとして限界稀釈
法によりクローン化し、各クローンの増殖後、リンホト
キシン活性の測定を行った。

なお、培養条件については特に限らない限り、Ｃ０２５
％−空気９５俤の雰囲気下、６７°Ｃで行った。

本発明に用いるリンホトキシン産生クローン化ヒトＴ細
胞ハイブリドーマＡ−０５−８株金、２．５　Ｘ　１０
５個／罰の細胞濃度でＣａｎ　Ａ　２０　μｊ！　／罰
及びＰＭＡ　２０　ｎｇ　／罰で刺激し、゛２４時間培
養して得たリンホトキシン活性は２５０単位／罰であっ
た。他方未刺激のＡ−０５−８株のリンホトキシン活性
は４．０単位／　ｍｅであった。

実施例２ （１）リンホトキシン産生ヒトＴ細胞ハイブリドーマ（
＊−０５−８）の培養 Ａ−０５−３株を５Ｘ１Ｑ６〜１０７個／罰の細胞濃度
で、ＰＭＡ及びＣｏｎ　Ａ　ｋそれぞれ終濃度１０口ｎ
ｇ／　ｒｔｔｌ　ｓ　２０　μｇ／　ｒＩｔｅで添加し
て２，４．８゜２４．４８時間培養した。

（２）全ＲＮＡの調製 Ａ−Ｃ５−８株の全ＲＮＡ　’ｉ油抽出る方法は主に塩
醗グアニジン法で行った。すなわち、実施例２−（１）
の各々の培養時間後のＡ−Ｃ５−８細胞を１）００Ｏｒ
ｐ、５分間遠心して集め、ＰＢＳ　（５ｍＭのリン酸緩
衝液、０．１５ＭのＮａＣｔ含有、ｐ）ｉ　７．４）に
懸濁した後、更に１０００　ｒｐｍで５分間遠心して細
胞を洗浄した。

この細胞〔実施例２−　（１）の各々の培養時間でそれ
ぞれ４Ｘ１０８．６×１０８．３．２　Ｘ　１０Ｂ　、
１．８×１０９及び２Ｘ１０９）ｔ−ホモジネート緩衝
液に懸濁し、ホモジナイズした。このホモジネートに０
．０２５等量の１Ｍ酢酸及び１．５倍量の冷エタノール
（−２０°Ｃ）を加え混合後、−２０°Ｃに６時間以上
放置した。これを−１０°Ｃで１５００Ｏｒｐｍ　（Ｒ
ＰＲ１８−２０−ター、日立製作所要〕で３０分遠心分
離し、生じた沈殿にウオツシング繍衝液（ホモジネート
緩衝液に２　［１ｎＭＥＤＴシ；を更に営々しているも
の、以下刀と略）ヲ加えてピペッティングで均一に溶解
後１Ｍ酢酸金加えてｐＨ５とし、更に冷エタノールヲ１
．５倍針加え、−２０°Ｃに６時間以上放置した。これ
を−１０°Ｃで１５００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離し
、沈殿をｗＢに溶解、１Ｍ酢酸によるＰＨ調整、冷エタ
ノール沈殿７６回繰返した。

エタノール沈殿物に少量の０．１％ＳＤＳ　’ｉ加えて
懸濁し、等量のエクストラクション緩衝液（０，５％Ｓ
ＤＳ　、　　０．１　Ｍ　ＮａＣｔ、　　５０　ｍＭ酢
酸ナトリウム、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ　２Ｎａ含有、２日
５．２）と２等量の水飽和フェノール〔０，１％８−キ
ノリツール含有、１００蜆トリス塩酸緩衝液（ｐ）１８
．０　）飽和〕−クロロホルムーイソアミルアルコール
溶液（体積比５０：５０：１）を加え、１０分間振盪し
た後、６０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。三層に
分離した下層を除去し、上層と中間油に等量のクロロホ
ルム−イソアミルアルコール溶液（体積比５０：１）を
加え、１０分間振盪した後、３０００　ｒｐｍで１０分
間遠心分離し、下層全除去した。このクロロホルＬ−イ
ソアミルアルコール溶液による抽出操作を三回繰返した
。ＤＮＡ％　ＲＮＡ　、糖等を含む上層に６Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５，２）ｋｏ、１等量加え、２部付の冷エ
タノールを加え一２０°Ｃで６時間以上放置後、１５０
００　ｒｐｍ　（ＲＰＲ１８−２０−ター）で６０分間
遠心分離した。生じた沈殿に少量の政凶蒸留水ケ加えて
ギ？解した後、等量の冷４Ｍ塩化リチウムを加え％　０
°Ｃに一夜放置し、１５０００　ｒｐｍで３０分間遠心
分離し、沈殿を少量の２Ｍ塩化リチウムで洗浄後、滅菌
蒸留水を加えて溶解し、１／１０８の６Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ５，２）　ｋ加えた後、２等量の冷エタノール
を加え、−２０°Ｃで３時間以上放置した。１５０００
　ｒｐｍで３０分間遠心分離し、沈殿’ｔｏ、ｏ　Ｉ　
Ｍ　）　ＩＪメス酸緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣＬ、　　
０．１％ＳＤＳ　、　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ３Ｎａ含有、
ｐＨ７，５）に溶解した。次いで、あらかじめ同緩衝液
で緩衝化したオリゴ（ｄＴ）１２−１５セルロース（Ｐ
Ｌバイオケミカルズ社）３罰を直径１ｍのカラムに充填
し、全ＲＮＡを供給した。同緩衝液で２６０　ｎｍの吸
光度が０．０５以下になるまで洗浄後、更にｏ、ｏ　Ｉ
　Ｍのトリス塩酸緩衝液（０，１ＭＮａＣ１，０，１％
ＳＤＳ　−１ｒｎＭＥＤＴＡｒ５Ｎａ含有、−７，５）
で溶出を開始し、２６０　ｎｍの吸光度が０．０５以下
になるまで洗浄した。最後に０．０１　Ｍトリス塩酸緩
衝液（０，１％ＳＤＳ　、　　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ３Ｎ
ａ含有、ＰＨ７，５）でポリアデニル酸結＠ＲＮＡ（ｍ
ＲＮＡ）全カラムから溶出し、７ラクシヨンコレクター
で分取し、２６０　ｎｍの吸光度が検出される画分を集
合した。２，４，８．２４．４８時間の各時間培養した
Ａ−Ｃ５−８細胞からそれぞれ５８゜１６０．１８０．
１２［］、２５８μ、？のｍＲＮＡ　’、、１回収した
。

（３）　ＬＴに対応するｍＲＮＡが卵母細胞で翻訳され
ることの確認 約２年令のアフリカッメガエル（メス、体重５０ｇ以上
、日本生物材料センターより購入）に、血清性性腺刺激
ホルモン（獣医杓ピーメツクス注射剤（三共））２［］
ＯＵ／匹の割合で大腿部に筋注した。翌日、氷水中につ
けて麻酔した後、腹部？切開して卵母細胞全採取し、Ｍ
ＢＳ中で単離した。

直径１）以上の卵母Ｘ田胞ｋｌ（固につき実施例２−（
２）で得たｍＲＮＡ　ｋ　Ｋ菌類留水に溶解（１ｍ９／
ｍｌ）し、５０ｎｚ（５０ｎｇ）づつマイクロキャピラ
リーとマイクロインジェクター〔（株）成茂科学器械研
究所表〕全使用して実用顕微鏡下に注入した２０個の卵
母細ｆｔＭｋ０．２ｍｌのＭＢＳ中２３°Ｃで培養した
。又、同時に滅菌蒸留水のみ５３　ｎｌすつ注入したｌ
卵母細胞２０個も０．２−のＭＢＳ中２３°Ｃで培養、
した（コントロール〕。

２４時間又は４８時間培養後の培養上清のＬＴ活性を測
定した結果、４８時間培養が卵母細胞の最適培養時間で
あることが判明した。更に、Ａ−Ｃ５−８細胞のＣｏｎ
　ＡとＰＭＡの刺激下での培養時間は、２，４．８．２
４．４３時間培養細胞のそれぞれのｍＲＮＡの翻訳され
たＬＴ活性が、それぞれ７．８　、４．６　、４．１　
、２．７　、０単位／ｄとなることより％ｍＲＮＡを取
得するためには、２時間培養がＡ−０５−８細胞の最適
培養時間であることが判明した。コントロールではＬＴ
活性が検出されないことから、ＬＴのｍＲＮＡが卵母細
胞中で翻訳されることを確認した。

（４）Ａ−Ｃ５−８細胞の大量培養とｍＲＮＡの取得実
施例２−　（３１で決定したＣｏｎ　Ａ及びＰＭＡ刺激
下の最適培養条件でＡ−０５−８細胞全培養し３×１０
９個の細胞？集めた。この細胞から実施例２−（２）の
方法に準じてｍ　ＲＮＡｔ単離精製し、５１２漸 μｙのｍＲＮＡ岡分を得た。

（５）ショ糖密度勾配遠心法によるｍＲＮＡの分画とＬ
Ｔ全ｍＲＮＡ５１２μ、ｕｋ［１，０１Ｍ）リス塩酸緩
衝液（０，１Ｍ　ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．２％ＳＤＳ含有
、ｐＨ７，５）　Ｋ溶解し・それを同緩衝液に溶解した
５〜３０％のショ糖密度勾配溶液５酊上に重層し、ＲＰ
Ｒ５５Ｔ−２０８０−ター（日立製作成製）全使用して
２８０００　ｒｐｍで１６時間、１５℃下に遠心した。

次いで内容物を２５本（各２１６μｔ）に分画した。各
分画に３Ｍ酢酸す）　ＩＪウム’ｒ１／１０量、冷エタ
ノール全２等量加えて一２０’Ｏで一夜放置し、ｍＲＮ
Ａを沈殿回収した。

回収したｍＲＮＡを滅菌蒸留水で溶解Ｃ０，５ｍ９／創
〕シ、１００ｎｔ′に実施例２−　（３１の方法に辿じ
て卵母細胞２０個にε人し、０．２だ６のＭＢＳで４８
時間培養後、培養上清甲のＬＴ活性を測定した。

その結果、分画４１３が最大のＬＴ活性全示し、沈降定
数の標準マーカー（５Ｓ　、　１８　Ｓ　、　２８Ｂ）
を用いた検量線から、ＬＴに対応するｍＲＮＡの沈降定
数は１２．６　Ｓ〜１４．６８であることが＋ＩＪ明し
た。

ここで得られた精製ｍＲＮＡ’に％以下の実験に用いた
。

実施例６ ｆｉｌ　ｅＤＮＡの合成 精製ｍＲＮＡ　５μｇｋ使用し、逆転写酵素システム（
３ＺＰ　）　にュー・イングランド・ニュークリア社）
全一部変更してｃ　ＤＮＡを合成した。逆転写酵素反応
緩衝液２０μｔ１デオキシヌクレオシド・トリフオスフ
ェート混合物１０μｔ１　リボヌクレアーゼＡインヒビ
ター２０単位、オリゴ（ｄＴ）　１２−１８１０μ＆、
　６００ｍＭのβ−メルカプトエタノール５μ、９．３
２ｐ標識ｄＣＴＰ〔比活性８００　Ｃ１／　ｍｍｏｔ（
１００μｃｉ））、ｍＲｈＪＡ　５　ｔ４．　５０単位
トリ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素の系で１００
μｔの容量で、４２°０１）時間反応させた後、氷冷し
て反応を停止し、遠心後ｍＲＮＡとｃＤＮＡのノ・イブ
リッドを、沸騰水浴中で６分間の熱処理で分離し、氷水
浴中で５分間急冷した。

変性した蛋白ｉ１２０００ｘ、９．２分間の遠心でペレ
ットとし、再度氷冷した。この反応終了液９９μｔに水
冷下で１６．２μｔの滅菌蒸留水、ＤＮＡポリメラーゼ
■反応緩衝液４６．８μｔ１デオキシヌクレオシド・ト
リフオスフェート混合物１０．４μｔ、　　３２ｐ標識
ｄｃ’ｒｐ　（８００Ｃｉ／ｎｍｏｔ（１００μ丸鳩山 Ｃ１）〕及び１５．６μｔの枦ｚシー由来ＤＮＡポリメ
ラーゼ１（８０００単位／　ｔｕｇ　）　′に加え、１
９８μｔとして、よ（撹拌、遠心後、１５°Ｃで２００
時間反応せた。この反応終了液１９７μｔに０．２ＭＥ
ＤＴＡ２Ｎａ　（３９，４μＬ　）　ｋ加え反応を停止
後、１ＮＮａＯＨ（４９，２５μＬ　）　ｋ加え、６５
°Ｃで１時間アルカリ加温処理を行い、ｍＲＮＡ　′に
分解し、水冷、遠心後にＩ　Ｍ　）　ＩＪメス酸緩衝液
（４９，２５μｔ１ｐＨ８，０）及び１　Ｎ　ＨＣｔ（
ｄ　９．２５μｔ）全加えて中和した。

これ′に１７２等量の水飽和フェノールと１７２等量ノ
クロロホルムーイソアミルアルコール（５０：１）で抽
出し、遠心後の上／Ｍｉ−分取し、下層に等量の１０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（１ａ　ｏ　ｍＭＮａｃｔ。

１　ｍＭ　ＥＤＴＡ２Ｎａ含有、ｐＨ８，０）　＝に加
えて再抽出全行い、その上層も分取した。分取した雨上
ＴＶ　ｋ等号のクロロホルム−イソアミルアルコールで
抽出し、遠心分離後下層（有機ｊ曽）を除去した。この
抽出操作を４回行った後に等量の水飽和エチルエーテル
で６回抽出を行い、有機層全除去後、６ｃｆＣ水浴で加
温処理して混在するエチルエーテルを除去した。

この水層を第２ブタノールで濃縮し、終濃度０．０１　
）ＡのＭｇＣ４２と２等量の冷エタノール（−２０°Ｃ
）を加え、−８０°Ｃで一夜放置した。

１２００［ＩＸ、９で１０分間遠心後の沈殿を減圧下で
乾燥した後、滅菌蒸留水５０μｔに溶解し、逆転写酵素
反応緩衝液２０μｔ、６００ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール５μｔ、デオキシヌクレオシド・トリフオスフェー
ト混合物ＩＤＡｔ及び３２ｐ標識ｄｃＴＰ　　（８００
Ｃｉ／ｍｍｏｌ　　（’Ｉ　　　０　０　　μ　Ｃｉ　
　）　　）ｋ　　加えよく撹拌遠心後５μｔの前述の逆
転写酵素を庖加後、４２℃１時間反応させた。水冷下で
反応を停止し、ヘアピン構造を持つｃＤＮＡ　ｆ得た。

上記反応液９９μ２に滅菌蒸留水９２．１μｔ、前述の
ＤＮＡポリメラーゼＩ反応緩衝液２３．４μｔ。

Ｓ１ヌクレア一ゼ反応緩衝液５５μｔ１アスペルぞルス
・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ　
）由来Ｓｌヌクレアーゼ（５０単位／ｄ）５．５μｔを
加え６７°０１６０分間反応し、ヘアピン構造を切断し
て２重鎖ｃＤＮＡ　ｆ得た。この溶液に０．１　Ｍ　ト
Ｉメス塩酸緩衝液（０，Ｉ　Ｍ　ＥＤＴＡ、Ｎａ含有、
ｐＨ７，５）　ｔ４６μを加え、ベッド容量２０　ｒｕ
εのセファクリルＳ−２００カラム（１，０Ｘ２５Ｃ１
ｎ）に供給し、１０騙トリス塩酸緩衝液（０，１Ｍ　Ｎ
ａＣ４，１ｍＭＥＤＴＡ２ｎａ含有、ｐＨ７，５）にて
溶出した。６００μｔずつ分画し、空隙率付近に溶出し
た分画を第２ブタノールで濃縮を行い、エタノール沈殿
によりｃｐＮＡを回収した。

（２）オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡの調製上記に
より得られた二重鎖ｃＤＮＡに次の組成の反応緩衝液１
６０μｔ２加えて３７°Ｃで５分間反応させ二重鎖ｃＤ
ＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた。

反応緩衝液は、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＣａＣｌ２．
０．２５　ｍｔ；ｉ　／　ｒＩＬｅのＢＳＡ、　５μＭ
ノａｃ’ｒｐ、　　３Ｈ標識ｄＣＴＰ　（２５Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｅ　（１５μＣｉ　）　：）及び３０単位ターミ
ナルデオキシヌクレオチゾルトランス７エラーゼを含有
する０、２Ｍのカコジル酸カリウム−２５ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ６，９）である。

反応は水冷下で停止させ、等をの水飽和フェノール−ク
ロロホルム−イソアミルアルコール（５０：５０：１．
ｌ’に加えて抽出し、再度クロロホルム−イソアミルア
ルコール（５０：１）で抽出し、４０μｙの大腸菌由来
リボゾームＡＮＡ及び１）５０量の５　Ｍ　ＮａＣＬ　
ｆ加え、２等量の冷エタノールを加え、−８０°Ｃで一
夜放置した。遠心分離でオリゴ（ｄリテール付加ｃ　Ｄ
ＮＡを回収し、滅菌蒸留水に溶解し、０．５　ｎｇ　／
μｔの濃度とした。

（３）組換え体プラスミドの作製 オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃＤＮＡ　１．３７５　ｎｇ
　ｋオリゴ（ｄｃ））１ｏ−２ｏテール付加ｐＢＲ３２
２ＤＮＡ　１０　ｎｇ（アマジャム社製つとケアニール
溶液（１００ｍＭ　ＮａＣ１；　０．１　ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ２Ｎａｋ含有する１　０　ｍＭ　）リス塩酸緩衝１（
ｐＨ７，８））２５μを中で６５°０１）５分間インキ
ュベート後インキュベーターを４５°Ｃに設定し、４５
°Ｃになった後さらに２時間インキュベート後、氷冷し
てアニーリングを行へ組換え体プラスミド溶液を調製し
た。

−ブロス１０ｍ１中、３７°Ｃで吸光度（６５００ｎ）
が０．０５となるまで培養し、この５ｍ／ｉ３．１％グ
ルコースを含むＬ−ブロス５００　ｍｌに加え、２「Ｃ
で吸光度（６５０ｎｍ　）が０．６となる１で培養した
。３０分間氷冷後、３０００　ｒｐｍ　（ＲｐＲ９−２
０−ター；日立製作成製）、４°Ｃで５分間遠心して集
菌した。この菌体を冷５　Ｑ　ｍｌＡ　ＣａＣｌ２２５
０罰に分散し、１５分間氷冷した。４°Ｃ，５分間、２
５０　Ｏｒｐｍ　（ＲＰＲ９−２ｏ　　１　　）　テ集
菌し、２０％グリセロールを金山する５　０　ｍＭ　Ｃ
ａＣｌ２２５ＷＬεに分散し、１ｍｌずつ分注し、ドラ
イアイス粉末で凍結後−８０°Ｃに保存した。この保存
菌体分散液を水冷下で解凍し、その０−５ｍ１に前述の
組換え体プラスミド溶液０．１５ａｔｌ及び２０　ｍＭ
　ｃａｃｚ２−６゜ｍＭ　ＭｎＣ２２−２０ｍＭ　Ｒｂ
Ｃ１溶液０．１５ａ／、’に混合し、０℃、２０分間静
置し、更に室温で１０分間静置後、あらかじめ３７°Ｃ
に温めた０、１％グルコニー含有Ｌしプ０　ス２．４　
ｙｔｅ　ｋ添加混合し、３７°Ｃ，１時間振盪培養を行
った。この培養液の一部を取り、前述の成分の他にテト
ラサイクリン１５μｉ／ｌｔｔを含有したＬ−ブロス寒
天平板に広げ６７°Ｃで約１２時間培養し、テトラサイ
クリン耐性菌を選択してｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。

（５）ハイブリダイゼーション試験 前記のｃＤＮＡライブラリーについて、ＬＴｉコードす
るｃＤＮＡを含むプラスミドを持つ形質転換体をスクリ
ーニングするために、３２Ｐ標識合成ｃ　ＤＮＡプロー
ブ全用いるコロニー・ハイブリダイゼーション試験全行
った。

合成ｃ　ＤＮＡプローブは、グレイらがネイチャー（Ｎ
ａｔｕｒｅ　３１２　７２１　（１９８４）　）に報告
しているＬＴ遺伝子の４０４から４２１査目の１８塩基
（５’　−ｏＴｃ′ｒＡｃＴｃｃｃＡｏｏＴｏｏＴｃ−
３’　）並ひに５００から５１７査目の１８塩基に対応
する相補的な塩基配列（５’　−ＣＡＣＡＴＧＧＡＡＧ
Ｇ（）Ｃ）ＴＡＣＴＧ−３’　）を化学合成し、その１
６．６　ｐｍＯ２’ｋ　５単位Ｔ　４７７一シＭ染ｍ由
来Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとｒ　　　Ｐ　ＡＴＰ
　（５μＣｉ／ｐｍｏｌｅ　（２０μＣｉ　）　）　’
に用いて、５０　ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（１０ｍＭＭ
ｇ、Ｃ１０，５ｍＭ　ＤＴＴ　、　　０．１　ｍＭスペ
ルミジン、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ２Ｎａ含有、ｐＨ７，
６）中、３７°Ｃ，３０分間反応させた。

反応はＥＤＴＡ溶液を添加し、０°Ｃに氷冷することで
停止した。この２種の３２ｐ標緘ｃＤＮＡゾローブの両
方に弱い条件で、ハイブリダイズする組換大体プラスミ
ド？有する形質転換体を選別した。

約１万個のコロニーから６個のコロニーが選ひ出された
。

次にこの選択された６つの菌株がら組換天体プラスミド
全分離し、制限酵素Ｈｉ　ｎｄ　ｌｌ！で、切断し、ア
カロースケ”ルミ気泳動七行い、ニトロセルロースフィ
ルターにトランスファーし、再度３２ｐ標識合成ｃＤＮ
八プローブと厳しい条件でハイブリダイズし友。その結
果、１個のクローンが選択された。

次にこの選択された酊株についてノ・イブリダイゼーシ
ョントランスレーション試験ヲ、マニアチス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　Ｔ、　）らのモレキュラー・クローニング（
”　Ｍｏ１ｅｃｕ／ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ”　３２９
　（１９８０）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ
ボラトリ−）に記載の方法に従って行った。この形質転
換体よりシラスミーＤＮＡ　ｉ抽出し、ニトロセルロー
スフィルター上に加熱変性させた後に固定し、これに実
施例２−　（４１で得たｒ、ＴｍＲＮＡ　ｋ含むｍＲＮ
Ａ画分を加え５０°Ｃで３時間反応させ、）１イブリダ
イゼーション？行った。結合したｍＲＮＡ　ｆ溶出回収
した後、た。

その結果、ｐＬＴｌ　３の場合は１０単位／　ｍｅのＬ
Ｔ活性が検出されたが、ｐＢＲ３２２ｋ使用したコント
ロールではＬＴ活性が認められなかった。

このｃＤＮＡ　ｆ制限酵素Ｈ１ｎｄｕで切断し、アガロ
ースグル電気泳動でその大きさを調べたところ、約’３
５　ＫｂｐのｃＤＮＡ部分を有していた口このｃＤＮＡ
　ｆ含む形質転換体（菌体番号：ＬＴ１６、クローン化
ＤＮＡ番号：　ｐＬＴｉｓ　）について、クローン化Ｄ
ＮＡ　ｉ単離し後述の方法で塩基配列全決定した。

実施例４ 実施例３−　＋５）で得られた菌株（ＬＴ１３　）　ｋ
　０．１チグルコース及び１５μ＆／ｍとテトラサイク
リン含有Ｌ−ブロスで培養して菌体を得た。この菌体か
らプラスミドＤＮＡ　ｅ回収し、次項で述べるＭ１３ｍ
Ｆ　８　、９に導入できる制限酵素ＥｃｏＲ１、Ｓｍａ
　Ｉ。

Ｂａｍ　Ｈｌ、　Ｐｓｔ　Ｉ　、　Ｓａｌ　Ｉ　、　Ｈ
ｉｎｄ　ｌの制限＃素地図全作製した。第１図参照。

（２）クローン化ＤＮＡの塩基配列の決定クローン化Ｄ
ＮＡの塩基配列の決定はメツシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ　
）らの方法〔ジーン（Ｃ）ｅｎｅ　）　１９２６９（１
９８２））に従ってｃＤＮＡ断片ｉＭ１３ｍｐ１３また
はｍｐ９でサブクローニングした後、サンガー（Ｓａｎ
ｇｅｔ　）らの方法〔プロシーディンゲス・オシ・デ・
ナショナル・アカデミ−・オシ・サイアンシズ・オシ・
デ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　）　７４　５４６３　（１９７７）
ジャーナル・オシ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　）　１６２　７２９　（１９８２
）　）のジデオキシ・チェイン・ターミネーション法に
より、プライマーのアニール、　　ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのフレノウフラグメントによる相補鎖合成（３２Ｐ標
鍼ｄＣＴＰ　（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ　（２０μＣ１）
〕で標識）ｒルミ気泳動及びオートラジオグラフィーか
ら決定した。

第２図に塩基配列の決定に用いた制限酵素切断部位と塩
基配列を決定した方向及び範囲全矢印で示す。矩形で描
いた部分はＬＴの翻訳領域をコードする部分を示す。

その塩基配列は第１表の通りである。第１番目のＣの上
流に１６個のＧ連鎖チーダル、第１３１０番目のＴの下
流に１８個のＣ連鎖テールがあり、ベクターと付加する
ときに合成したホモポリマーである。第６３から６７７
番目はＬＴの前駆体を構成するに必要なポリペゾチド全
コードするト推定される塩基配列である。

このうち第１６５番目からかＬＴ　７１ｉ−コードして
いると考えられ、グレイ（Ｇｒａｙ　Ｐ、Ｗ、　）らが
〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２　７２１（１９８
４））に報告したＬＴとは、２６番目のアミノ酸がＴｈ
ｒ（ＡＣＣ）であるのに対し、Ａｓｎ（ＡＪＣ）である
点が異なっている。Ｃ床端アミノ酸（ロイシン〕のコド
ンに続いて、終始コドン（ＴＡＧ　）がある。またペプ
チドコード部位以外に第１〜４番目ＧＣＴＣがＣＧ（）
Ｇに、第８６２〜８６５番目Ｃ’ＡＣＡがＡＣＡＣに第
１６０６〜１３１０査目Ｔ（）ＡＡＡがＣＣＣＣＴにお
いて異なっている。

実施例５ −（１）ｐＬＴ　１３のｃ　ＤＮＡ断片の制限酵素によ
る切断部ｃＤＮＡの構造から考えられる制限酵素の中で
Ｎｓｉ　ｌ　（２２２番目）並ひにＥｃｏＲｌ　（８，
３８番目）を使用し、常法に従ってｐＬ’ｒ　１３　’
に切断し、１．５％アガロースデル電気激動？行い６１
６　ｂｐのｃＤＮＡ断片をアガロースゲルから抽出し、
常法によりｃＤＮＡ断片を精製した。このｃＤＮＡ断片
はＬＴのＮ末鴻側２０アミノ酸残基に対応する６０塩基
を欠失している。

ジョン 下記構造の台底オリゴヌクレオチド件千≠≠河１、−一 断片をＴ　４　ＤＮＡリガーゼを用いて６６　ｍＭ　）
　ＩＪメス 塩酸緩衝液（ｐ）１７．６　）、６．６　ｍＭ　ＭｇＣ
ｌ２．１０ｍＭＤＴＴ　、　Ｉ　ｍＭ　ＡＴＰ中で１６
°Ｃで一夜反応させ、合成オリゴヌクレオチド’ｉ　Ｌ
ＴｃＤＮＡ断片に結合させた。この１反応生成物を常法
により精製した後、ＥｃｏＲｌで消化し６２３　ｂｐの
ＥｃｏＲ１断片を回収した。

発現ベクターｐＫＫ　２２３−３　（ファルマシア袈）
’１ＥｃｏＲ（で消化した後ウシ腸粘膜白米アルカリフ
ォスファターゼ（ファルマシア製）を用いて５０圧トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ９，０）、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．
０．１　ｍＭ　ＺｎＣＡ２．１鮨スペルミジン中で６７
°Ｃ１３０分間反応させ、５′末端の脱リン化を行い、
常法により精製した。以上の処理をほどこしたベクター
と実施例５−　（２＋で得た６　２３　ｂｐのＥｃｏＲ
（断丈喝ｊ 片を結合させた後、←−乎与ＪＭ　１０５株に常法に従
って形質転換し、アンピシリン耐性により８．７００個
の形質転換体を得た。

（４）合成ｃＤＮＡＤＮＡプローブスクリーニング実施
例５−　（３）で得た形質転換体を実施例３−　（５１
に示した方法に従って３Ｋｐ標識した合成ｃ　ＤＮＡプ
ローブをコロニーハイブリダイゼーション試験によりス
クリーニングし、１５０個のコロニーを選択した。この
コロニーのうち無作為に２４個を選ひ常法に従ってプラ
スミドを調整し、適当な制限酵素によって切断後、アガ
ロースゲル電気泳動を行い、目的とする断片及びその方
向全検索した。

その結果、目的とする７個のコロニー全選択し、このプ
ラスミドｉ　ｐＤＫ　１０と命名した。ｐＤＫ　Ｉ　Ｑ
の構築工程全第３図に示す。

実施例５−（４）で得たプラスミドｐＤＫ　１０？ｌ−
Ｈｌｎｄｌで消化した後ＢＡＬ　３１ヌクレアーゼ（宝
酒造製〕七用いて２０　ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ＰＨ
８，［］）１）２ｍＭＣａＣｌ２．１２　ｍＭ　Ｍｇ（
ｌｌ’ｔ２．１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、　　６００ｍＭ　Ｎ
ａＣｔ中で３０°０１０分から６０分間反応させ、ＤＮ
Ａ木端全除去した。次にＤＮＡポリメラーゼ（フレノウ
フラグメント）で平滑末端とした後Ｅｃ　ｏＲ１で消化
し、５％ポリアクリルアミドケ゛ル電気泳動で分画し４
８０　ｂｐ付近の断片（望ましくは４６０ｂｐ　）を回
収した。

実施例５−　（５１で得たＤＮＡＩｆｒ片とＢｉｎｄ　
ｌリンカ−（全酒造製）全結合させた後、Ｈｉｎｄ　ｌ
で消化し、常法により私製した。

ｐＫＫ　２２３−３　ｋ　ＦＣＯＲＩ並びにＨｉｎｄ　
ｌで消化ルミ気泳動により分離し、常法により精製≠寺
〇実施例５−　（６）で得たＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄ　
Ｉ　ＤＮＡ断片と結合し、ＬＴ　ｃＤＮＡ断片？有する
ベクター全構築しｐＤＫ　１）の構築工程を第４図に示
す。

実施例５−　（７）で得たプラスミドｆ　Ｂａｍ　Ｈｌ
並ひにＰｖｕ　［で消化した後、アガロースゲル電気泳
動によりＬＴ　ｃＤＮＡ　ｆ含む断片上分画、精製した
。一方プラスミドｐＡＴ　１５３　（アマジャム社より
購入）も同様にＢａｎ　Ｈ１並ひにＰｖｕ　Ｉで消化し
た後、ＤＮＡ複製開始点を含む断片を分画、精製した。

上記の２釉類のＢａｎ　Ｈｌ　−Ｐｖｕ　Ｉ断片全ライ
ク”−シ匁鳴の ヨンさせた後、常法により≠！工＝對ＪＭ　１０５ａに
尋人し、アンぎシリン耐性により、４３００個の形質転
換体？選択した。この中から無作為に２４個の形質転換
体を選択し、常法に従ってプラスミドＤＮＡ　ｋ釉°製
した。適当な制限酵素により、目的とするＬＴｃＤＮＡ
断片の数及び方向について検索した。その結果目的とす
る２４個のコロニー全ｐＤＫ　１２の構築工程を第５図
に示す。

？アンピシリン５０μ９／ｙｎｌ、プロリンを除り１９
＄種類の必須アミノ酸を含むＭ９培地で一投前培養を行
った。翌日培養液が１０倍希釈になるようにアンピシリ
ン２５μ＆／ｄｋ含むＬＢ培地（組成：　Ｉ　Ａｓクバ
クトートリプトン１０．Ｌ　バクトー酵母！＊ス５Ｆ　
　ＮａＣ１）ｏ９：ｐＨ７〜７．５〕に接種した。

Ａ５５゜＝０．６に達した後 ＩＰＴＣ）　ｉ最終濃度１ｍＭになるように加え、ざら
にｆｉ−ｓｓａ　＝　１まで培養した。培養物を超音波
処理によって破壊し、細胞抽出物のＬＴ活性全測定した
。

培養物１）１Ｌｌ当り約３．５　Ｘ　１０５単位の活性
が得られた。

ｐＤＫ　１２で形質１決した　　　　　ＪＭ’ｌｌＪコ
久株をアンピシリン５０μ９／ｍｅ１　プロリンを除く
１９槙類の必須アミノ酸を含むＭ９培地で一夜培養し、
この培養液全２０倍量の以下に示す培地で培養した。

Ｎａ２ＨＰＯ４７，０ ＫＨ２Ｐ○４６・０ （ＮＨａ）２ｓＯ４５・０ Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ　　　　　　　　　　１．０Ｍｇ
ＳＯ４０，１ Ｇｌｕｃｏｓｅ　　　　　　　　　　　２５．ＯＣａｓ
ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　　　　　　　　４，０Ｙｅａｓ
ｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　　　　　　　　４．ＯＴｈｉａｍ
ｉｎｅ　　　　　　　　　　　０．１アンピシリン　　
　　　　　　０．０２　　ｐＨ７，５培地のＡ３５０が
約１０に達した時、ＩＰＴ（）　’ｉ最終濃度５吐にな
るように加えＡ３５０が６０に達する１で培養した。培
養液全限外濾過及び遠心分離によジ回収し、菌体約７５
０　、ｊｉ’　（ｗｅｔ　）　ｆ回収した。

菌体ｔ　５０　ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）
、６０ｍＭ　ＮａＣｔ及び０．０１ｍＭ（ｐ−アミジノ
フェニル）メタンスルホニルフルオライド塩酸塩（（ｐ
−Ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ　）　ｍｅｔｈａｎｅｓ
ｕｌｆｏｎｙｌ　Ｆ’１ｕｏｒｉｄｅＨｙｄｒｏｃｈ’
１ｏｒｉｄｅ　；和光紬薬製）　２；０００ｍ７に懸濁
し、ダイノミルにより破砕後、遠心分離により粗抽出液
を得た。粗抽出液３．７００　ｄの全ＬＴ活性は６０ロ
Ｘ　１０１２単位、比活性は５Ｘ１０’単位／■タンパ
ク質であった。

実施例８ （１）硫安分画 実施例７の粗抽出液３．７００ｍｇに硫酸アンモニウム
に５°Ｃで４０％飽和になるように添加し、６０分後、
遠心分離し、沈殿部’ｚ　５　ｍＭ　ＩＪン酸バッファ
ー（ｐｉ−１７，８）Ｃ以下ＰＢと略す、１５００＋ｘ
Ｊに溶解し、限外濃縮器を用いて濃縮−希釈ケくり看 返し脱塩を行い硫安塩析試料とした。硫安塩析試料１８
５ｍ１の全ＬＴ活性は５．２　ｘ　１０１２単位、比活
性は３．７　ｘ　Ｉ　Ｑ６単位／ｍＱタンパク質であっ
た。

ｓ　ｍＭ　ｐＥｌ　（ｐＨ７，８）であらかじめ平衡化
したＤＥＡＥ−セファローズＣＬ　−６Ｂ　（ファルマ
シア社つのカラム（４，５ｃｍＸ　５　［１ｃｍ　）に
硫安塩析試料１８４ｄｋ付じ、次いで５　ｍＭ　ＰＢ　
３．Ｏｔでカラムを洗浄したのち食塩濃度０から０．６
Ｍまで連続的に上昇させ溶出した。溶出液は１００ｍＪ
すつ分画し、各画分のＬＴ活性を測定し、活性全有する
画分を回収した。回収液約３．Ｏｔ　ｋ分画分子１ｔ１
ｏ、口００の限外濾過膜（ミリポア社’Ａ）ｋ用いて１
７０ＷＬ！！に凝縮した。この濃縮液ｋ　ＤＥＡＥ分画
液とした。

ＤＥＡＥ分画液の、全ＬＴ活性は２．９　Ｘ　１０ｉ２
単位、比活性は２．４　Ｘ　１０’単位／ｍｑタンパク
質であった。

ＰＢで緩衝化した生理食塩水であらかじめ平衡化したフ
ェニルセファローズＣＬ　−６Ｂ　（ファルマシア社〕
のカラム（５，０ｃｆｎＸ　ｉ　５ｃｆｎ）にＤＥＡＥ
分画液１６９１ｎ君を吸着させ、次いでエチレングリコ
ールろ口％を含む１０ｍＭＰＢ（ｐＨ７，８）６００１
で洗浄した後、エチレングリコール濃度を７０第２表　
ＬＴポリペプチドのアミノ酸組成ＩＬＥ　　　　　　　
２・８６ ＶＡＬ　　　　　　　８．９　　　　　　９ＬＥＵ　　
　　　　　２２．０　　　　　　２１ＰＨＥ　　　　　
　　ｉｏ、１　　　　　　１０ｃｙｓ　　　　　　　＜
ｏ、ｉ　　　　　　　。

ＭＥＴ　　　　　　　３．１　　　　　　３ＡＬＡ　　
　　　　　１）．８　　　　　　１２ＧＬＹ　　　　　
　　９　、１　　　　　　９ＴＨＲ７、３７ ＴＲＰ　　　　　　　１．７　　　　　　２ＳＥＲ１９
，４２０ ’ｒＹＲ６、８７ ＰＲＯ１２，２１） ＨＩＳ１０．１９ ＬＹＳ　　　　　　　５．０　　　　　　５訊ｏ　　　
　　　　１．９　　　　　　２分析値は、ＬＴポリペプ
チドをコードｉ　、Ｂ　ＤＮＡの塩基配列から推測され
たアミノ酸組成と良（一致した。

２　　　アミノ酸配列 Ｎ末端アミノ酸配列はエドマン（Ｅｄｍａｎ　）法（Ｐ
、　Ｅｄｍａｎ　；アーキテクチュア　バイオケミスト
リイ　アンド　バイオフィジックス（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　）　、　２２　
４７５　（１９４９））により測定した。

ＬＴポリペプチド（約１００μｇ）ｋフェニルインチオ
シアネートとカップリング反応させ、次いでＮ末端アミ
ノ酸を２−アニリノ−５−チアゾリノン誘導体として切
断し、更にフェニルチオヒダントイン−アミノ酸に変換
し、これに０１８逆相カラムを用いたＨＰＬＣ（ウォー
ターズ社製）により同定しＮ床端部分のアミノ酸を決定
した。さらに、この操作を順次くり返すことにより、Ｎ
末端部分のアミノ酸配列を決定した。

この結果、ＬＴポリペプチドのＮ床端部分のアミノ酸配
列は ＭＥＴ−ＨＩＳ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−ＨＩＳ−３ＥＲ−Ａ
ＳＮ−ＬＥＵ−ＬＹＳ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＨＩ
Ｓ−ＬｇＵ−ＩＬＥ−ＯＬＹ−ＡＳＰ−であった。

〔発明の効果〕

以上に説明した様に、得られた本発明の生理活性ポリペ
プチドは、リンホトキシン活性をもち、実質的に不純物
を含まない新規な生理活性ポリペプチドである。また本
発明の生理活性ポリペブチに、余分のメチオニンの付加
を防ぐことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明実施例による制限酵素地図を示す概路
線図、 第２図は、本発明実施例による塩基配列の決定に用いた
制限酵素切断部位と塩基配列を決定した方向および範囲
を示す概路線図である。 Ｂ　−−−Ｂａｍ　Ｈｌ　　、　Ｅ　・−ｇｃｏＲ［Ｐ
　・・−Ｐｓｔ　Ｉ第６図は実施例５のｔａｃプロモー
ター付形質発現プラスミドｐＤＫ　４０の構築工程を示
す。矢印はプロモーターの働（方向を示す口 第４図は実施例５のｔａｃプロモーター付形質発現プラ
スミドｐＤＫ１）の構築工程を示す。矢印はプロモータ
ーの働く方向を示す。 特許出願人　電気化学工業株式会社 第１図 第２図 第３図 ＩＬＴ１３ ↓Ｎｓ　ｌ　Ｉ＋ＥｃｏＲＩ ↓しｉｇａｔｉｏｎ ↓ＥｃｏＲＩ 第４図 、ｌＢＡＬ３１ ｊＤＨＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　（Ｋｌｅｎｏｗ　
Ｆｒｕｇｍｅｎむン↓ＥｃｏＲＩ ４６０ｂｐ付近のＤＮＡ断片を回収 第５図 ｐＤＫｌｌ　　　　　ｐＡＴ１５３ 手続補正書 手続補正部８月２１日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）次式 【遺伝子配列があります】 で表されるアミノ酸配列を有する生理活性ポリペプチド