JPH0691833B2 - 利尿作用を有するポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新しくヒト心房から見出
された利尿作用を有するポリペプチドをコードする新規
な遺伝子（ＤＮＡ）を利用した上記ポリペプチドの製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト心房中には、ペプチドホルモン産生
細胞中に見られる顆粒と形態的に類似する顆粒が存在す
ることが知られている(J.D.Jamieson & G.E.Palade, J.
Cell Biol., 23, 151, 1964)。近年、ラットの心房のホ
モジェネートおよびその顆粒が、ラットにおいてナトリ
ウム利尿をおこすことが知られ(A.J.DeBold ら、Life S
ci.,28, 89, 1981, R.Keeler, Can.J.Physiol.Pharmaco
l., 60, 1078, 1982など) 、またヒト、ウサギ、ブタお
よびラットの心房中にナトリウム利尿作用を有する分子
量が２万〜３万、及び１万以下のペプチド様物質が存在
することが示唆された(G.Mark, S.Currie ら、Science,
221, 71〜73, 1983）。

【０００３】さらに最近になって、Flynn, T. G.らはラ
ット心房から利尿作用を有する２８個のアミノ酸からな
るペプチドを単離した(Biochem.Biophys.Res.Commun.,
118, 131 〜139, 1984)。また、Kangawa, K. とMatsu
o, H.は、ヒト心房から同様な活性を有する２８個のア
ミノ酸からなるペプチドを見出しこれをα−ｈＡＮＰと
命名した。そして、α−ｈＡＮＰは、H-Ser-Leu-Arg-Ar
g-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-
Ala-Glu-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH
（７位のＣｙｓと２３位のＣｙｓはジスルフィド結合し
ている）の構造を示し、薬理活性として顕著な利尿作用
とくにナトリウム利尿作用および血圧降下作用を有する
ことを明らかにした(Biochem.Biophys.Res.Commun., 1
18, 131 〜139, 1984,および特開昭６０−１３６５９
６）。

【０００４】一方、いろいろな生理活性ペプチドは、生
体内でそのものが直接産出されるのではなく、各々の前
駆体がエンドペプチダーゼやエキソペプチダーゼなどの
作用を受け生成されることが知られている。例えば、β
−エンドルフィンとγ−ＬＰＨはβ−ＬＰＨを前駆体と
し、β−ＭＳＨはγ−ＬＰＨを前駆体として生成される
ことが報告されている(Takahashi, H.ら、FEBS Lett. 1
35, 97〜102, 1981)。本発明者らはこのことに注目し、
α−ｈＡＮＰもある前駆体から生成されるのではないか
と考えα−ｈＡＮＰをコードする遺伝子およびその生成
機構について鋭意研究を行った。

【０００５】その結果、α−ｈＡＮＰの前駆体となるペ
プチド（以下γ−ｈＡＮＰと略す）をコードする遺伝子
（ＤＮＡ）を単離・同定することに成功し、さらに該Ｄ
ＮＡを有する組換えＤＮＡの創製を行うとともに該組換
えＤＮＡを利用して利尿作用特にナトリウム利尿作用お
よび血圧降下作用を有するペプチドを製造できることを
見出し、本発明を完成するに至った。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】即ち、本発明はα−ｈ
ＡＮＰをコードする塩基配列を含有するＤＮＡとその組
換えＤＮＡを有する形質転換体の培養によるα−ｈＡＮ
Ｐおよびその前駆体（例えばγ−ｈＡＮＰ；このアミノ
酸配列を図１に示す）さらにはそれらと生物学的活性を
同じくする各種ポリペプチドの大量生産の方法を提供す
るものである。

【０００７】尚、ヒト心房顆粒より単離されたα−ｈＡ
ＮＰの前駆体γ−ｈＡＮＰの構造と薬理活性については
特開昭６０−２６０５９６に詳細に記載されている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】以下本発明について詳し
く説明する。 （１） α−ｈＡＮＰの前駆体であるγ−ｈＡＮＰ遺伝
子の同定（配列番号：１参照） α−ｈＡＮＰをコードする塩基配列を有する遺伝子は以
下のようにして調製された。まず、ヒト心房顆粒から
の、オリゴｄＴカラムを用いて得られるポリＡＲＮＡ
（ｍＲＮＡ）からＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法(Mol.Cel
l.Biol., 2, 161〜170, 1982)を用いてｃＤＮＡライブ
ラリーをつくり次にα−ｈＡＮＰのアミノ酸配列（既
述）のうち１２番目（Ｍｅｔ）から１６番目（Ｇｌｙ）
に対応する化学合成した１４ｍｅｒのオリゴヌクレオチ
ドを混合プローブ（ｍｉｘｅｄ ｐｒｏｂｅ）として用
いて、上記のｃＤＮＡライブラリーから目的とする即ち
³²Ｐでラベル化された上記プローブとハイブリダイズす
るクローンを選択した。

【０００９】この結果、約４０，０００個の形質転換体
（前記ｃＤＮＡライブラリー）から２３個の目的とする
クローンが得られた。この内８クローンからのプラスミ
ドについて、上記の１４ｍｅｒのｍｉｘｅｄ ｐｒｏｂ
ｅをプライマーとしてｄｉｄｅｏｘｙ法による塩基配列
を調べたところ、いずれのプラスミドもα−ｈＡＮＰを
コードする塩基配列を有していた。このうち、長い挿入
ＤＮＡ断片をもつ２つのプラスミドすなわちｐｈＡＮＰ
１およびｐｈＡＮＰ８２（各々約９５０bpと約８５０bp
からなる）について全塩基配列を決定した。塩基配列は
マキサム−ギルバート(Meth.Enzym., 65, 499 〜560, 1
980)およびサンガーら(Proc.Nath.Aced.Sci.USA, 74,
5463〜5467, 1977）の方法によって決定された。

【００１０】両ＤＮＡとも、翻訳開始コドンＡＴＧから
はじまり翻訳終止コドンＴＧＡで終る長いオープンリー
ディングフレーム（翻訳可能領域）を有し、一方が他方
に比べて５′未側において約１００bp短いこと以外は全
く同じ配列を有していた。この翻訳可能領域には、既に
アミノ酸配列が明らかにされている２８個のアミノ酸か
らなるα−ｈＡＮＰ(Kangawa, K.& Matsuo, H., Bioche
m.Biophys.Res.Commun., 118, 131 〜139, 1984)をコー
ドする塩基配列が存在していた（配列番号：１参照）。

【００１１】一方、ヒト心房顆粒から精製された利尿作
用を有するポリペプチド（γ−ｈＡＮＰ）は、そのＮ−
末端がH-Asn-Pro-Met-Tyr-Asn-…でＣ−末端が-Asn-Ser
-Phe-Arg-Tyr-OH である１２６個のアミノ酸からなるこ
とが明らかにされた（図１、及び特開昭６０−２６０５
９６を参照のこと）。この結果と、前記のｐｈＡＮＰ１
及びｐｈＡＮＰ８２上の塩基配列との比較から、γ−ｈ
ＡＮＰ（図１）をコードする遺伝子およびアミノ酸配列
は配列番号：１（ｐｈＡＮＰ８２にクローン化された配
列を示す）に示す通りであると結論される。図中、アミ
ノ酸配列の１から２５までは蛋白の分泌に関与するシグ
ナルペプチドと考えられ、２６番目のＡｓｎからはじま
り１５１番目のＴｙｒで終る１２６個のアミノ酸からな
るポリペプチドがγ−ｈＡＮＰである（シグナルペプチ
ドとγ−ｈＡＮＰとから成るアミノ酸配列を図２に示
す）。

【００１２】興味あることは、α−ｈＡＮＰのアミノ酸
配列（図中１２４番目から１５１番目まで）がγ−ｈＡ
ＮＰのアミノ酸配列のＣ−末端側に存在することであ
る。このことは、特開昭６０−２６０５９６に記載され
ている結果を矛盾なく説明するものである。かくして当
初予想されたようにα−ｈＡＮＰの前駆体即ち、γ−ｈ
ＡＮＰが存在することを確認するとともにその遺伝子を
単離することができた。

【００１３】配列番号：１に示すＤＮＡ、並びにその断
片である図３および図４に示されたＤＮＡは、以下にも
述べるように、α−ｈＡＮＰ、及びγ−ｈＡＮＰさらに
はそれらと生物学的活性（特に利尿作用および血圧降下
作用）を同じくする各種ポリペプチドを大量生産するた
めの材料として産業上有用であることは明らかである。
また、同じくヒト心房から見出された利尿作用を有する
ペプチド（β−ｈＡＮＰ）は、α−ｈＡＮＰの二量体で
あることが示唆されている（特開昭６０−１８４０９８
参照のこと）ことからも該前駆体およびその遺伝子の有
用性がうかがえる。

【００１４】α−ｈＡＮＰがγ−ｈＡＮＰを前駆体とし
て産生されるには、ｐｒｏ−ａｒｇ（配列番号：１では
１２３−１２４番のアミノ酸配列）のＣ−末端が切断さ
れることが必要であるが、哺乳動物の腸管および脊髄に
おいてガストリン放出ホルモン（ＧＲＰ）がその前駆体
に存在するｐｒｏ−ａｒｇ配列のＣ−末端で切断されて
生成されることから(Reave, J.R.ら、J.Biol.Chem., 2
58, 5582〜5588, 1983およびMinamino, N.ら、Biochem.
Biophys.Res.Commun., 119, 14〜20, 1984）、α−ｈＡ
ＮＰも生体内で同様なプロセッシング（多分酵素作用）
を受けγ−ｈＡＮＰから生成されるものと考えられる。 （２） 組換えＤＮＡの作成 α−ｈＡＮＰをコードする塩基配列を含むγ−ｈＡＮＰ
遺伝子の組換えＤＮＡの作成は、以下に詳しく述べるよ
うに、前記のようにして得られたγ−ｈＡＮＰ遺伝子を
含むＤＮＡ断片をＭ１３ＤＮＡにクローニング後、ｉｎ
ｖｉｔｒｏｍｕｔａｔｉｏｎ法(Zoller, M.J.& Smit
h, M., Nucl.Acid.Res.10, 6487, 1982) を利用してγ
−ｈＡＮＰ遺伝子のすぐ上流に制限酵素ＥｃｏＲＩ切断
部位および訳翻開所コドン（ＡＴＧ）を付加し、さらに
該切断部位の上流に適当な発現調節塩基配列領域（プロ
モーター、ＳＤ配列を含む）を挿入することにより行わ
れた。

【００１５】まず、Ｍ１３ｍｐ８ＲＦＤＮＡ（ＰＬ社
製）のＰｓｔＩ切断点に既述（１）で得られたｐｈＡＮ
Ｐ１をＰｓｔＩで切断して得られるγ−ｈＡＮＰ遺伝子
を含むＤＮＡ断片（約７００bp）を挿入し、大腸菌（Ｊ
Ｍ１０３）を形質転換した。次に、上記形質転換株の培
養液より目的とするＤＮＡ断片（約７００bp）が挿入さ
れたファージＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を分離し、インビ
トロミューテーション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｔ
ｉｏｎ）（ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉ
ｏｎとも呼ばれる）法を用いて、γ−ｈＡＮＰ遺伝子の
すぐ上流にＥｃｏＲＩ切断認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）と
ＡＴＧ（Ｍｅｔをコードするトリプレットコドン）の挿
入を行った。

【００１６】該インビトロミューテーションは、Ｅｃｏ
ＲＩ切断認識部位のすぐ３′側にＡＴＧの配列をもつ化
学的に合成した３６ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡと上述の一本
鎖ファージＤＮＡとのｈｅｔｅｒｏ ｄｕｐｌｅｘを形
成させた後、常法(Zoller, J.M.& Smith, M., Nucl.Aci
d.Res.10, 6487, 1982）に従いＤＮＡポリメラーゼＩＫ
ｌｅｎｏｗ断片で二重鎖としたＤＮＡで大腸菌（ＪＭ１
０３）を形質転換することにより行った。

【００１７】目的とする塩基配列（配列番号：１で、６
７番目から７５番目までの塩基配列ＡＣＣ ＡＧＡ Ｇ
ＣＴがＧＡＡ ＴＴＣ ＡＴＧに変換された塩基配列）
を有するプラスミドは、上記形質転換株から得られるＤ
ＮＡ（ＲＦＤＮＡ）を制限酵素（ＥｃｏＲＩ）切断によ
る解析を行うことによって選択され、さらに該塩基配列
周辺をｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎ法(Sanger, F.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74,
5463〜5467, 1977）によって決定することにより確認
された。このプラスミドはＭ１３ｍｐ８−ｈＡＮＰ５２
５と名づけられ次の実験に用いられた。

【００１８】γ−ｈＡＮＰ遺伝子の発現ベクターへのク
ローニングは、上記プラスミドＭ１３ｍｐ８−ｈＡＮＰ
５２５をＥｃｏＲＩとＳａｌＩ（ＳａｌＩ切断部位はＭ
１３ｍｐ８ＤＮＡ由来）で切断して得られる約５１０bp
のＤＮＡ断片を、既に本発明者らによって造成されてい
たプラスミドｐＳ２０（図５参照）のＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩ断片（約４５０bp）と置き換えることにより行われ
た。

【００１９】プラスミドｐＳ２０は、λＰＬプロモータ
ーとλファージＣII蛋白遺伝子のＳＤ配列（シャイン−
ダルガノ配列）を５′非翻訳領域として含み、該領域の
下流（ＥｃｏＲＩ断点）に挿入された外来遺伝子がλＰ
Ｌプロモーター支配下に発現できるようにつくられたプ
ラスミドであり、本プラスミドを含有する大腸菌形質転
換株Ｎ４８３０／ｐＳ２０はＳＢＭ２７１と命名されブ
ダペスト条約に基づき微工研に寄託されている（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５３５）。本発明で造成されたプラスミドｐ
Ｓ２２０（図５参照）は、常法に従い大腸菌Ｎ４８３０
株に形質転換され、該形質転換株（Ｎ４８３０／ｐＳ２
２０）のγ−ｈＡＮＰの生産について調べられた。

【００２０】γ−ｈＡＮＰの生産は、該形質転換株の培
養温度を培養中途において３２℃から４２℃にシフトし
た後、³⁵Ｓ−メチオニンを添加して生成蛋白をパルスラ
ベル（２分）し、そしてラベル化された生成蛋白をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳
動）で検出することによりチェックされた。その結果、
ｐＳ２２０を含まない株（Ｎ４８３０）では見られない
明瞭な蛋白のバンドが該形質転換株の培養においてのみ
見られた（図６参照）。

【００２１】さらに、プラスミドｐＳ２２０のλＰＬプ
ロモーター領域からγ−ｈＡＮＰの翻訳開始コドン（Ａ
ＴＧ）間の領域を大腸菌外膜蛋白（ｌｐｐ）遺伝子のＳ
Ｄ配列およびＭＳ２ファージＡ蛋白遺伝子のＳＤ配列を
含む領域に変換したプラスミド（各々ｐＳ２２３−３お
よびｐＳ２２４−３：図７参照）においても同様な蛋白
の生産が観察された（図６参照）。

【００２２】該蛋白バンドは、γ−ｈＡＮＰの理論分子
量１３，６７９より大きい位置（約２０Ｋｄ）に見られ
たが、ヒト心房から精製されたγ−ｈＡＮＰもＳＤＳ−
ＰＡＧＥで同じ位置に泳動されることから、該蛋白のバ
ンドは形質転換株Ｎ４８３０／ｐＳ２２０が産生したγ
−ｈＡＮＰであると判断された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにお
いて、理論分子量より大きい位置に蛋白が泳動されるこ
とはよくある現象である。

【００２３】さらにこのことは、γ−ｈＡＮＰ構造遺伝
子の末端に、読みわくを３通りにデザインした翻訳終止
コドンを有する化学合成リンカー：

【００２４】

【化１】 を付加した同様なプラスミドにおいても、同じ２０Ｋｄ
の位置にコントロールに見られない蛋白のバンドが見ら
れることからも支持された。この結果は、生体内で翻訳
終止コドンＴＧＡ（配列番号：１で１５１番目のアミノ
酸Ｔｙｒのすぐ下流のコドン）がまちがって翻訳され大
きな歪白ができたのかも知れないという可能性を否定す
るものである。

【００２５】かくして、本発明で得られた遺伝子を用い
て、α−ｈＡＮＰの前駆体であるγ−ｈＡＮＰを微生物
中で製造できることが確認された。尚、ここでは、γ−
ｈＡＮＰのシグナルペプチド部分（配列番号：１の１〜
２５のアミノ酸配列）を除いたアミノ酸配列（２６〜１
５１）をコードする塩基配列の組換えＤＮＡについて述
べたが、シグナルペプチドを含むポリペプチド（図２及
び配列番号：１中アミノ酸１〜１５１）をコードする塩
基配列（図４）、あるいはα−ｈＡＮＰ（配列番号：１
中１２４〜１５１）、さらには適当な位置からはじまる
ポリペプチドをコードする塩基配列についても同様な方
法で組換えＤＮＡをつくることができることは明らかで
ある。また、ここでは、ヒト心房顆粒より得られるｍＲ
ＮＡのｃＤＮＡをγ−ｈＡＮＰの遺伝子として用いた
が、該アミノ酸配列をコードする遺伝子を化学的に合成
してもよい。

【００２６】さらに、組換えＤＮＡの造成において、γ
−ｈＡＮＰ遺伝子の発現にλＰＬプロモーターを用いた
例を示したが、プロモーター領域はこれに限るものでな
い。例えば、大腸菌で発現させる場合には、トリプトフ
ァン（ｔｒｐ）、ラクトース（ｌａｃ）、リポプロティ
ン（ｌｐｐ）、アルカリ性フォスファターゼ（ＰＨＯＡ
ＰＨＯＳなど）および外膜蛋白（ｏｍｐ）遺伝子など
のプロモーター領域、さらにはトリプトファンとラクト
ースプロモーターとの雑種プロモーター（ｔａｃプロモ
ーター）を用いてもよい。

【００２７】また、酵母での発現の場合には、アルコー
ルデハイドロゲナーゼ（ＡＣＨ）、グリセロアルデヒド
デハイドロゲナーゼ（ＧＡＰ−ＤＨ）、フォスフォグリ
セロキナーゼ（ＲＧＫ）や抑制性酸性フォスファターゼ
（ＰＨＯ ５）などの遺伝子のプロモーター領域、さら
に動物細胞の場合はＳＶ４０の初期または後期プロモー
ター領域を用いることもできる。

【００２８】以下、実施例をもってさらに説明するが本
発明はこれらに限定されるものではない。

【００２９】

【実施例】１． α−ｈＡＮＰ ｃＤＮＡライブラリーの造成と遺
伝子の単離・同定 １−１ ｃＤＮＡライブラリーの造成 ８２才の女性と６１才の男性より摘出した２個のヒト心
房より、Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法(Chirgwin, J.M.
ら、Biochemistry 18, 5294〜5299, 1879）に従い４Ｍ
グアニジウムチオシアネートを用い１mgのＲＮＡを抽出
した。次に０．５Ｍ ＬｉＣｌ₂ 、１０ｍＭ ＥＤＴＡ
および０．５％ ＳＤＳを含む１０ｍＭトリス塩酸バッ
ファー（pH７．２）を結合バッファーとして用いてオリ
ゴｄＴセルロースに結合した ｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）７５μｇを分離し
た(Nakazato, H.& Edmonds, D.S., Meth.Enzym., 29,
431 〜443, 1974 参照）。

【００３０】続いて、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇの方法
(Mol.Cell.Biol.,２, 161 〜170, 1982)に従い、１５μ
ｇのｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡと４．２μｇのベクタープ
ライマーＤＮＡを用いることによりｃＤＮＡライブラリ
ー（プラスミド）を作製し、大腸菌ＷＡ８０２株を形質
転換した。形質転換株は４０γ／mlのアンピシリンを含
むＬＢ−寒天培地でスクリーニングし、ｐｏｌｙ（Ａ）
⁺ ＲＮＡ１μｇあたり約４０，０００個のアンピシリン
耐性を示す形質転換株が得られた。１−２ α−ｈＡＮＰクローンの分離 上で得られた約４０，０００個のコロニーをニトロセル
ロースフィルターにレプリカし、４０γ／mlのアンピシ
リンを含むＬＢ寒天プレート上で３７℃６時間培養後さ
らに１８０γ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒
天プレートに移し一夜３７℃で培養した。次に、フィル
ター上に生じたコロニーを０．５Ｎ ＮａＯＨで溶菌後
pH７．０に中和し、フィルターを１．５Ｍ ＮａＣｌを
含む０．５Ｍトリス塩酸バッファー（pH７．０）と３×
ＳＣＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ Ｓｏｄ
ｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）に各々５分間浸した。最後に
ペーパータオルで菌破片を除き風乾後、８０℃で２時間
ｂａｋｉｎｇした。

【００３１】続いて、５′末に³²Ｐで標識された２種類
の化学合成オリゴヌクレオチド（図８）を混合プローブ
として、上記フィルターに固定化されたＤＮＡ分子との
ハイブリダイゼーションを行った(Grunstein, M.& Hogn
ess, D.S.,Pyoc.Natl.Acad.Sci.USA, 72, 3961〜3965,
1975参照）。上記プローブは、α−ｈＡＮＰのアミノ酸
配列中Met-Asp-Arg-Ile-Gly （配列番号：１中１３５番
目から１３９番目までのアミノ酸配列）をコードするｍ
ＲＮＡに相補的な１４mer からなるオリゴヌクレオチド
の混合プローブであり、その５′末が〔γ．³²Ｐ〕ＡＴ
ＰとＴ４キナーゼを用いて標識され比活性が１〜２×１
０⁶cpm／pmolのものである。

【００３２】ハイブリダイゼーションは、１×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔｓ．〔０．２％ ＢＳＡ（アルモーア社）、
０．２％ Ｆｉｃｏｌ（シグマ社）および０．２％ポリ
ビニルピロリドン（和光純薬社）からなる〕、０．１％
ＳＤＳおよび１ml当り５０μｇのサケ精巣ＤＮＡ（Ｐ
Ｌ社）を含む３×ＳＣＣ中で３８℃で１６時間行った。
次に、フィルターを０．１％ ＳＤＳを含む３×ＳＣＣ
により３８℃で洗浄し、風乾後、Ｘ線フィルムに感光さ
せた。この操作で８５個のポジティブクローンが得られ
た。

【００３３】次に、２種のプローブ（プローブＩとプロ
ーブII：図８）を別々に用い、各々４０℃と３８℃で上
記と同様な操作で、上記ポジティブクローンについてコ
ロニーハイブリダイジェーションを行った。その結果、
プローブＩとはハイブリダイズせずプローブIIとのみハ
イブリダイズする２３個のクローンが得られた。続いて
２３個のクローンのうち８クローンよりプラスミドＤＮ
Ａを常法に従い分離し、プローブIIをプライマーとして
用いたｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔ
ｉｏｎ法(Sanger, F. ら, Pyoc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
4, 5463〜5467,1977) による塩基配列の決定を行った。

【００３４】その結果、いずれのプラスミドにも、α−
ｈＡＮＰのアミノ酸に対応する塩基配列が存在していた
ことから、上記の８クローンはα−ｈＡＮＰのｃＤＮＡ
を含むプラスミドを有している形質転換体であると認め
られた。これらのプラスミドの内、長いγ−ｈＡＮＰの
ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド２つ（ｐｈＡＮＰ１と
ｐｈＡＮＰ８２）を選び、挿入されたｃＤＮＡの塩基配
列を決定した。ｐｈＡＮＰ１とｐｈＡＮＰ８２は各々約
９５０bpと８５０bpのｃＤＮＡが挿入されていた。

【００３５】挿入ＤＮＡ領域の制限酵素切断部位と塩基
配列決定のストラテジーを図９に示す。図中、塩基配列
の決定の方向は矢印で示され、実線は二重鎖ＤＮＡのう
ち上方鎖（ｕｐｐｅｒ ｓｔｒａｎｄ）、点線は下方鎖
（ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄ）を示す。塩基配列はマキ
サム・ギルバート法(Meth.Enzym., 65, 499 〜560, 198
0)およびサンガーらの方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 7
4 , 5463〜5467, 1977) を用いて決定された。

【００３６】図９において、Ａはマキサム−ギルバート
法により、Ｂは各々５′と３′を³²Ｐで標識された 5′
-GATCGATCTGCCCTC-3′と 3′-CTAGCTAGACGGGAG-5′化学
合成オリゴマーをプライマーとして用いてサンガーらの
方法により、そしてＣは該プラスミド（ｐｈＡＮＰ１お
よびｐｈＡＮＰ８２）をＰｓｔＩとＰｖｕIIで切断して
得られる３つのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ８(Vieir
a, J.& Messing, J.Gene 19, 259 〜268, 1982)に挿入
後サンガーらの方法により各々決定されたことを示す。

【００３７】上記の塩基配列決定の結果、挿入ＤＮＡの
両塩基配列は５′末側の長さが異なること以外完全に一
致した。その内、ｐｈＡＮＰ１に挿入されたＤＮＡの塩
基配列およびその塩基配列に対応するアミノ酸配列を配
列番号：１に示す。該挿入ＤＮＡの配列には、ＡＴＧか
らはじまり終止コドンＴＧＡで終る長い翻訳可能配列
（オープンリーディングフレーム）が存在し、その３′
末側（アミノ酸配列ではＣ−末端側）にα−ｈＡＮＰを
コードするＤＮＡ配列がみられた。

【００３８】ヒト心房から精製・同定されたγ−ｈＡＮ
ＰのＮ−末端がH-Asn-Pro-Met-Tyr-Asn-…でありＣ−末
端が-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH であることから（特開昭
６０−２６０５９６を参照のこと）、γ−ｈＡＮＰのア
ミノ酸配列は図５において２６番目のＡｓｎからはじま
り１５１番目のＴｙｒで終る１２６個のアミノ酸からな
ると判断される。この結果は、ヒト心房から精製された
γ−ｈＡＮＰのアミノ酸組成及びアミノ酸配列と一致す
る。

【００３９】配列番号：１においてＭｅｔからはじまり
Ａｌａで終る１−２５のアミノ酸配列はその構造から分
泌に関与するシグナルペプチドに相当すると考えられ
る。また、配列番号：１の塩基配列において３′末付近
に真核細胞ｍＲＮＡのポリＡ配列上流に一般的に見られ
るＡＡＴＡＡＡが存在していた。２．γ−ｈＡＮＰ遺伝子発現ベクターの造成 ２−１ Ｍ１３ＤＮＡへのｈＡＮＰ遺伝子の挿入 Ｍ１３ ｍｐ ８ ＲＦ ＤＮＡ（ＰＬ社）０．４４μ
ｇを、２０μｌのＭｅｄｉｕｍ−ｓａｌｔ Ｂｕｆｆｅ
ｒ（５０mM ＮａＣｌ、１０mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM Ｄ
ＴＴを含む１０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液pH７．５）
中でＰｓｔＩ（１６ユニット）を用いて３７℃、１hr加
温することにより、切断した。

【００４０】次に６５℃１０min 加温することにより酵
素反応をとめた。一方、ｃＤＮＡライブラリーから得ら
れたプラスミドｐｈＡＮＰ１ ＤＮＡ ２０μｇを、同
様に１００μｌのＭｅｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｂｕｆｆｅ
ｒ中でＰｓｔＩ（１６０units)を用いて３７℃、１時間
加温することにより切断後、１％アガロースゲル電気泳
動により約７００bpのＤＮＡ断片に相当するゲルを切り
出し、電気泳動法（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｅｌｕｔｅ法）に
より該ＤＮＡ断片を抽出・精製した。

【００４１】次に、上記２種のＤＮＡ断片（ＰｓｔＩ消
化Ｍ１３ ｍｐ ８ ＲＦＤＮＡ６６ngと約７００bpの
ＤＮＡ断片１μｇ）を２０μｌのライゲーション溶液
（１０mM ＭｇＣｌ₂ 、１mM ＡＴＰ、５mM ＤＴＴを
含む２０mM Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液pH７．６）中で、
５．６単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）と１４℃
で１６hr反応させた。この反応液２０μｌを常法通りＣ
ａＣｌ₂ 処理した大腸菌ＪＭ１０３ ５０mM ＣａＣｌ
₂ 懸濁液に加え、形質転換を行なった。形質転換クロー
ンの選択は以下のように行なった。

【００４２】４５℃に保ったＸ−Ｇａｌ及びＩＰＴＧを
含むＹＴ軟寒天（ｓｏｆｔ ａｇａｒ）培地（０．６％
寒天、０．８％バクトトリプトン、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ ＮａＣｌの溶液３mlに１００mM ＩＰＴ
Ｇ １０μｌ、２％ Ｘ−ｇａｌ ５０μｌ及び対数増
殖期のＪＭ１０３懸濁液０．２mlを加えたもの）に適当
に希釈した上記のＣａＣｌ₂ 懸濁液０．３mlを加えＹＴ
寒天培地（１．５％寒天、０．８％バクトトリプトン、
０．５％酵母エキス、０．５％ ＮａＣｌ）上にひろげ
て３７℃で１６hr培養した。生じた白色のプラークより
１０クローンを選択し、２×ＹＴ液体培地（１．６％バ
クトトリプトン、１％酵母エキス、１．０％ ＮａＣ
ｌ）に植菌後３７℃で８hr培養した。次に該培養液１ml
を１０，０００rpm にて、１０分間遠心し、上澄をファ
ージ液として回収した。該ファージＤＮＡ〔一重鎖ＤＮ
Ａ（ｓｓＤＮＡ）〕は以下に述べる様にして分離・精製
した。

【００４３】上記ファージ液８００μｌに２．５Ｍ Ｎ
ａＣｌを含む２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６
０００）を２００μｌ加え、室温で１５分間放置後１
０，０００rpm ５分間遠心することによりファージを沈
殿させた。このファージの沈殿をＴＥ緩衝液（１mM Ｅ
ＤＴＡ、１０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液pH８．０）１
００μｌに溶解し、水飽和フェノール５０μｌを加え５
分間激しく混合後、１０，０００rpm にて５分間遠心分
離した。

【００４４】水相より８０μｌを分取し、これに３Ｍ酢
酸ナトリウム（pH８．０）３μｌ、及びエタノール２０
０μｌを加え、−７０℃にて１０分間冷却した後、１
０，０００rpm にて１０分間遠心分離することによりＤ
ＮＡを沈殿させた。沈殿ＤＮＡをエタノールで１回洗浄
後、上記ＴＥ緩衝液５０μｌに溶解した。１０クローン
のファージＤＮＡのうちｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎｔ
ｅｒｍｉ ｎａｔｉｏｎ法(Methods in Enzymology 6
5, 560 〜580, 1980 Academic Press, New York)により
一部分の塩基配列を決定することにより下方鎖（ｍＲＮ
Ａと相補的な塩基配列を有するＤＮＡ断片）が挿入され
ている２つのクローンを選択した。このファージＤＮＡ
を以下に述べるインビトロミューテーション（ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏｍｕｔａｔｉｏｎ）の鋳型ＤＮＡとして使用し
た。２−２ インビトロミューテーションによるＥｃｏＲＩ
切断部位および翻訳開始コドンの挿入 ５′末端がリン酸化された３６mer の化学合成ＤＮＡ断
片(5′-CTCCTAGGTCAGGAATTCATGAATCCCATGTACAAT-3 ′）
１０pmolを含む２μｌ溶液に、上記（２−１）で得られ
た一本鎖ファージＤＮＡ溶液５μｌおよび０．１Ｍ Ｍ
ｇＣｌ₂ 、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．２Ｍ Ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｌ緩衝液（pH７．５）１μｌ及び水２μｌを加
え、合計１０μｌの溶液中で６５℃５分間加熱し室温で
１０分間放置した。

【００４５】次に、この混合液に、０．１Ｍ ＭｇＣｌ
₂ を含む０．２Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ緩衝液（pH７．
５）を１μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴを２μｌ、１０mM Ａ
ＴＰを１μｌ、それぞれ１０mMのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，
ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰを２μｌ、水を２μｌ、さらに
ＤＮＡポリメラーゼＩクレノ−断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ）（ベーリング−マンハイム社）５ユニ
ット、Ｔ₄ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）２．８ユニットを
加え、１５℃で１６時間反応させた。この反応液２０μ
ｌを用い既述の通り大腸菌ＪＭ１０３を形質転換した。

【００４６】次に前述のようにして、ＹＴ軟寒天培地に
生じたプラークより４８クローンを選択し、２×ＹＴ液
体培地に植菌後、３７℃で８時間培養した。培養液１ml
を１０，０００rpm １０分間遠心し、上澄をファージ液
として回収した。一方沈殿物として得られた菌体からア
ルカリ抽出法(Birnboim, H.C.& Doly, J.Nucl, Acid,Re
s ７, 1513-1523, 1979)によりＲＦＤＮＡを抽出分離
した。

【００４７】続いて該ＲＦＤＮＡをＥｃｏＲＩ緩衝液
（５０mM ＮａＣｌ、５mM ＭｇＣｌ₂ を含む１００mM
Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ pH７．５）２０μ
ｌ中でＥｃｏＲＩ（宝酒造）４．２ユニットを用いて３
７℃にて１時間加温することにより分解した。反応液を
２％アガロースゲル電気泳動にかけ、約５３０bpのＤＮ
Ａ断片が生じるようなクローンを選択した。（４８クロ
ーン中１クローン）このクローンをＭ１３ｍｐ８−ｈＡ
ＮＰ ５２５と名ずけた。

【００４８】次に２×ＹＴ液体培地４００mlに、該ファ
ージクローンで感染させたＪＭ １０３培養液０．４ml
と非感染ＪＭ １０３培養液４mlを加え３７℃で１２hr
培養後、感染菌から常法に従いエチジウムブロマイドを
含む塩化セシウム密度勾配遠心分離によりＲＦ ＤＮＡ
を得、一方上澄のファージ液からは前述の方法でファー
ジＤＮＡを得たのちｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎｔｅｒ
ｍｉｎａｔｉｏｎ法（前述）を用いて塩基配列の決定を
行った。その結果、期待通りの塩基配列、即ちγ−ｈＡ
ＮＰのＮ−末端の直前に翻訳開始コドンＡＴＧとＥＣＯ
ＲＩ切断認識部位ＧＡＡＴＴＣを有する配列ＧＡＡＴＴ
Ｃ ＡＴＧが挿入されていることが確認された。２−３ γ−ｈＡＮＰ遺伝子発現ベクターの造成（図５
および図７参照） γ−ｈＡＮＰ遺伝子発現ベクター造成の材料となるプラ
スミドｐＳ２０は、既に本発明者らにより構築されてお
り、該プラスミドを有する大腸菌形質転換株Ｎ４３８０
／ｐＳ２０はＳＢＭ ２７１と命名し微工研にブタペス
ト条約に基ずく国際寄託を行い寄託番号ＦＥＲＨ ＢＰ
−５３５を得ている。ｐＳ２０は、λファージのＰ_L プ
ロモータ支配下に外来遺伝子が発現できるようになって
いるプラスミドであり、以下のようにして構築されたも
のである。

【００４９】まず、バクテリオファージλＣＩ８５７を
ＢａｍＨＩとＨｉｎｄIII で切断して得られるλＰ_L プ
ロモータを含む２．４KbのＤＮＡ断片をｐＢＲ３２２の
ＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ間に挿入したプラスミドを得
た（尚このプラスミドは、Ｎａｔｕｒｅ ２９２，１２
８，１９８１に記載のプラスミドｐＫＯ ３０と同等の
ものである）。次に、このプラスミドのＨｐａＩ切断部
位にバクテリオファージλｃｙ３０４８（東邦大学医学
部嶋武博之博士より入手）のＨａｅIII ＤＮＡ断片（Ｎ
ｕｔＲ，ｔＲ₁ ＣIIおよびＯの一部を含む１．３Kbの断
片）がλＰ_L の転写方向と同じ方向にＣIIが位置するよ
うに挿入されたプラスミド（ｐＳ９）を得た。

【００５０】続いてこのプラスミド（ｐＳ９）をＢｇｌ
IIとＲｓａＩで切断して得られる０．６５KbのＤＮＡ断
片（Ｐ_L プロモーター、Ｎ蛋白のＣ−末端の欠如した蛋
白Ｎ′のＤＮＡ配列およびＣII遺伝子のシャインダルガ
ノ（ＳＤ）配列領域を含む）のＲｓａＩ断点に、Ｅｃｏ
ＲＩリンカー

【００５１】

【化２】 （ニューイングランドバイオラボズ社より入手）を付加
したのち、ＢｇII断点の粘着末端をＴ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼで平滑末端にし、このＤＮＡ断片に、ｐＢＲ ３
２２をＥｃｏＲＩで切断後Ｔ４ポリメラーゼで平滑末端
にしたＤＮＡ断片を結合させたプラスミド（ｐＳ１３）
を得た。

【００５２】このプラスミド（ｐＳ１３）は、ｐＢＲ３
２２のテトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）の転写方
向と同じ方向にＰ_L プロモーターが位置している。さら
に、このプラスミド（ｐＳ１３）をＥｃｏＲＩとＳａｌ
Ｉで消化し得られる長い断片に、既に造成されていたプ
ラスミドｐＧｌＦ４（特開昭５８−２０１９９５に開示
され、該プラスミドを含む大腸菌はＳＢＭＧ １０５と
命名されて微工研にＦＥＲＭ ＢＰ−２８２の番号で寄
託されている）をＥｃｏＲＩとＳｓｌＩで消化して得ら
れる外来遺伝子（ヒトγ型インターフェロン遺伝子Ｇｌ
Ｆ）を含むＤＮＡ断片を連結することによりプラスミド
ｐＳ２０（図５参照）を得る。

【００５３】γ−ｈＡＮＰ遺伝子発現ベクターの１つｐ
Ｓ２２０は、下記の如く、実施例２−２で得たプラスミ
ドＭ １３ｍｐ８−ｈＡＮＰ ５２５をＥｃｏＲＩとＳ
ａｌＩで消化して得られる断片（約５１０bp）を、ｐＳ
２０をＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化して得られるＧｌＦ
を含む断片と置きかえることにより得られた（図５参
照）。即ち、Ｍ１３ｍｐ８−ｈＡＮＰ５２５ ＤＮＡ
８μｇを含むＥｃｏＲＩ反応液（５０mM ＮａＣｌおよ
び５mM ＭｇＣｌ₂ を含む１００mMトリス塩酸溶液、pH
７．３）７０μｌ中にＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを各々
１５単位加えて３７℃にて１時間反応したあと、１．０
％寒天ゲル電気泳動分離を行った。

【００５４】次に前述の方法（実施例２−１のｅｌｅｃ
ｔｒｏｅｌｕｔｅ法）によりγ−ｈＡＮＰ遺伝子を含む
約５１０bpのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片を抽出
・精製した。一方、前述のｐＳ２０プラスミド２μｇに
ＥｃｏＲＩ反応液５０μｌ中でＥｃｏＲＩおよびＳａｌ
Ｉを各々１０単位加え、３７℃にて１時間反応を行い、
１．０％寒天ゲル電気泳動分離後前述の方法（ｅｌｅｃ
ｔｒｓｅｌｕｔｅ法）によりλＰ_L プロモーターおよび
ＣII遺伝子のＳＤ配列を含むＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ Ｄ
ＮＡ断片（約４．３Kb）を得た。

【００５５】続いて、上述のγ−ｈＡＮＰ遺伝子を含む
ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ断片の水溶液（３μｌ）
とｐＳ２０プラスミドのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡ
断片の水溶液１０μｌとの溶液に、１０倍濃度のライゲ
ーション溶液（実施例２−１に既述）３μｌ、１００mM
ＤＴＴ（ジチオスレイトール）３μｌ、１mM ＡＴＰ
水溶液３μｌ、蒸留水６μｌおよびＴ４ ＤＮＡリガー
ゼ２単位を加え、１６℃で一夜反応を行うことにより、
γ−ｈＡＮＰ遺伝子発現ベクターの１つｐＳ２２０が造
成された。ｐＳ２２０による大腸菌Ｎ４８３０株（ファ
ルマシアジャパン社より購入）への形質転換は、上記の
反応溶液１０μｌを常法に従いＣａＣｌ₂ 処理した３０
０μｌの５０mM ＣａＣｌ₂ を含む大腸菌Ｎ４８３０株
懸濁液に加え、氷中で１時間静置した後、２．５mlのＬ
−ブロスを加え３２℃で１．５時間培養することにより
行なった。形質転換株は、５０μｇ／mlのアンピシリン
を含む栄養寒天培地に増殖するコロニー（アンピシリン
耐性株）を分離することにより選択された。

【００５６】得られた形質転換株から常法に従ってプラ
スミドＤＮＡを分離し、制限酵素による解析を行うこと
により、該プラスミドにおいてはλＰ_L プロモーター下
流にγ−ｈＡＮＰ遺伝子が挿入されていることを確認し
た。この形質転換株をＮ４３８０／ｐＳ２２０と命名
し、次のγ−ｈＡＮＰの生産に関する実験に供した。
尚、γ−ｈＡＮＰ遺伝子発現ベクターは上記のｐＳ２２
０以外にも以下に述べるように造成された。即ち、プラ
スミドｐＳ２０をＥｃｏＲＩで切断後、エキソヌクレア
ーゼＢａｌ３１を用いて加水分解して得られる種々の大
きさのＤＮＡ断片にＸｂａＩリンカー〔ニューイングラ
ンドバイオラボスより購入：ｄ（ＣＴＣＴＡＧＡＧ）〕
を連結したプラスミドｐＳ２０Ｘを造成し、次にｐＳ２
０ＸをＸｂａＩとＳａｌＩで分解後、ｐＩＮ４ＧｌＦ５
４（特開昭６０−２４１８７に開示されている）をＸｂ
ａＩとＳａｌＩで切断して得られる短い方のＤＮＡ断片
（ヒトγ型インターフェロン遺伝子を含む）をｐＳ２０
ＸのＸｂａＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片の代りに挿入した。

【００５７】このように造成されたプラスミドのうち、
該プラスミドによって形質転換された大腸菌の培養にお
いてγ型インターフェロン遺伝子の発現量が高い（発現
量の測定法については特開昭６０−２４１８７に開示さ
れている）プラスミドをｐＳ８３−３と命名した。次
に、図７に示すようにｐＳ８３−３のＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩ断片の代りに、既に得られているプラスミドＭ１３
ｍｐ８−ｈＡＮＰ５２５のＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を
挿入することによりプラスミドｐＳ２２３−３を得た。
ｐＳ２２３−３はλＰ_L プロモーター領域の下流に大腸
菌外膜蛋白（ｌｐｐ）遺伝子のＳＤ配列（特開昭６０−
２４１８７の第１図参照）を有するプラスミドである。
該プラスミドによって大腸菌Ｎ４３８０を形質転換した
形質転換株Ｎ４３８０／ｐＳ２２３−３は、先述のＮ４
３８０／ｐＳ２２０とともにγ−ｈＡＮＰの生産の実験
に供された。

【００５８】さらにもう１つのγ−ｈＡＮＰ遺伝子発現
ベクターｐＳ２２４−３は、既述のプラスミドｐＳ８３
−３をＸｂａＩとＥｃｏＲＩで切断して得られるｌｐｐ
遺伝子のＳＤ配列を含むＤＮＡ断片の代りに、両端に各
々ＸｂａＩとＥｃｏＲＩ切断認識配列を粘着末端として
有する化学合成したバクテリオファージＭＳ２Ａ蛋白遺
伝子のＳＤ配列を有するＤＮＡ断片（ＡＧＧＡＧＧＴ）
を挿入したプラスミドｐＳ８４−３を得、次に図７に示
すように、Ｍ１３ｍｐ８−ｈＡＮＰ５２５ＤＮＡのＥｃ
ｏＲＩ−ＳａｌＩ断片をｐＳ８４−３ＤＮＡのＥｃｏＲ
Ｉ−ＳａｌＩ断片を挿入することにより得られた。ｐＳ
２２４−３によって上記と同様に形質転換された大腸菌
Ｎ４３８０／ｐＳ２２４−３も先述のＮ４３８０／ｐＳ
２２０およびＮ４３８０／ｐＳ２２３−３とともにγ−
ｈＡＮＰ遺伝子の発現の実験に供された。３．形質転換株によるγ−ｈＡＮＰの生産 実施例２−３で得た３株の形質転換株、すなわちＮ４８
３０／ｐＳ２２０，Ｎ４８３０／ｐＳ２２３−３、およ
びＮ４８３０／ｐＳ２２４−３、とプラスミドを含まな
い宿主株Ｎ４８３０とを、５０μｇ／mlのアンピシリン
およびメチオニンを除く１９種類の天然アミノ酸を加え
たＭ９最小培地で３２℃で培養し、ＯＤ６６０が０．４
に達した時点にその１部を４２℃で培養した。

【００５９】４２℃に移して１５分後と３０分後に比活
性８００Ci／ｍモルの³⁵Ｓ−メチオニン（ニューイング
ランドニュクレア社製：日本アイソトープ協会より購
入）を０．３mlの培養液に２μCiを加え、同じ温度で２
分間培養後、最終濃度が１０％になるようにＴＣＡ（ト
リクロロ酢酸）を加え直ちに０℃に冷却した。１０分後
遠心分離により沈澱物を回収し、エタノールで１回洗浄
後常法に従い１５％のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動分離を行った。３２℃で培養を続けたサンプルに
ついても同様な処理を行った。

【００６０】上記ゲルを乾燥後、ラジオオートグラフに
より³⁵Ｓ−メチオニンでラベルされた蛋白のバンドを観
察した結果、図７に示したように、γ−ｈＡＮＰ遺伝子
が挿入されたプラスミドによって形質転換された３株の
形質転換株（Ｎ４８３０／ｐＳ２２０，Ｓ４８３０／ｐ
Ｓ２２３−３、およびＮ４８３０／ｐＳ２２４−３）の
４２℃の培養において、コントロール株（Ｎ４８３０）
および３２℃で培養された形質転換株では見られない約
２０Kbに相当する蛋白のバンドが認められた。

【００６１】ヒト心房から精製されたγ−ｈＡＮＰが同
条件のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動において同じ
位置に泳動されたことから、この蛋白のバンドは形質転
換株が生産したγ−ｈＡＮＰであると判断された。ま
た、この蛋白が４２℃の培養においてのみ認められるこ
とは、γ−ｈＡＮＰ遺伝子がλＰ_L プロモーター支配下
に発現されているを物語っている。

【００６２】尚、上記電気泳動における分子量測定用標
準蛋白キットはＰＬ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製のも
のを使用した。

【００６３】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：８４３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トプロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起原 生物名：ヒト 直接の起原：プラスミド phANP82 配列 ACAGACGTAG GCCAAGAGAG GGGAACCAGA GAGGAACCAG AGGGGAGAGA 50 CAGAGCAGCA AGCAGTGGAT TGCTCCTTGA CGACGCCAGC ATG AGC TCC TTC 102 Met Ser Ser Phe TCC ACC ACC ACC GTG AGC TTC CTC CTT TTA CTG GCA TTC CAG CTC 147 Ser Thr Thr Thr Val Ser Phe Leu Leu Leu Leu Ala Phe Gln Leu 5 10 15 CTA GGT CAG ACC AGA GCT AAT CCC ATG TAC AAT GCC GTG TCC AAC 192 Leu Gly Gln Thr Arg Ala Asn Pro Met Tyr Asn Ala Val Ser Asn 20 25 30 GCA GAC CTG ATG GAT TTC AAG AAT TTG CTG GAC CAT TTG GAA GAA 237 Ala Asp Leu Met Asp Phe Lys Asn Leu Leu Asp His Leu Glu Glu 35 40 45 AAG ATG CCT TTA GAA GAT GAG GTC GTG CCC CCA CAA GTG CTC AGT 282 Lys Met Pro Leu Glu Asp Glu Val Val Pro Pro Gln Val Leu Ser 50 55 60 GAG CCG AAT GAA GAA GCG GGG GCT GCT CTC AGC CCC CTC CCT GAG 327 Glu Pro Asn Glu Glu Ala Gly Ala Ala Leu Ser Pro Leu Pro Glu 65 70 75 GTG CCT CCC TGG ACC GGG GAA GTC AGC CCA GCC CAG AGA GAT GGA 372 Val Pro Pro Trp Thr Gly Glu Val Ser Pro Ala Gln Arg Asp Gly 80 85 90 GGT GCC CTC GGG CGG GGC CCC TGG GAC TCC TCT GAT CGA TCT GCC 417 Gly Ala Leu Gly Arg Gly Pro Trp Asp Ser Ser Asp Arg Ser Ala 95 100 105 CTC CTA AAA AGC AAG CTG AGG GCG CTG CTC ACT GCC CCT CGG AGC 462 Leu Leu Lys Ser Lys Leu Arg Ala Leu Leu Thr Ala Pro Arg Ser 110 115 120 CTG CGG AGA TCC AGC TGC TTC GGG GGC AGG ATG GAC AGG ATT GGA 507 Leu Arg Arg Ser Ser Cys Phe Gly Gly Arg Met Asp Arg Ile Gly 125 130 135 GCC CAG AGC GGA CTG GGC TGT AAC AGC TTC CGG TAC TGAAGATAAC 553 Ala Gln Ser Gly Leu Gly Cys Asn Ser Phe Arg Try 140 145 150 AGCCAGGGAG GACAAGCAGG GCTGGGCCTA GGGACAGACT GCAAGAGGCT 603 CCTGTCCCCT GGGGTCTCTG CTGCATTTGT GTCATCTTGT TGCCATGGAG 653 TTGTGATCAT CCCATCTAAG CTGCAGCTTC CTGTCAACAC TTCTCACATC 703 TTATGCTAAC TGTAGATAAA GTGGTTTGAT GGTGACTTCC TCGCCTCTCC 753 CACCCCATGC ATTAAATTTT AAGGTAGAAC CTCACCTGTT ACTGAAAGTG 803 GTTTGAAAGT GAATAAACTT CAGCACCATG GACAGAAGAC 843

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はγ−ｈＡＮＰのアミノ配列を表わす。

【図２】図２はシグナル配列とγ−ｈＡＮＰのアミノ酸
配列とから成るアミノ酸配列を表わす。

【図３】図３はγ−ｈＡＮＰをコードする塩基配列を表
わす。

【図４】図４はシグナル配列とγ−ｈＡＮＰをコードす
る塩基配列を表わす。

【図５】図５はγ−ｈＡＮＰをコードするＤＮＡ断片と
プラスミドｐＳ２０とからプラスミドｐＳ２２０を造成
する過程を表わす。

【図６】図６はγ−ｈＡＮＰの発現を示す電気泳動図で
あって図面に代る写真である。

【図７】図７はγ−ｈＡＮＰをコードするＤＮＡ断片
と、プラスミドｐＳ８３−３及びｐＳ８４−３とから、
それぞれプラスミドｐＳ２２３−３及びｐＳ２２４−３
を造成する過程を表わす。

【図８】図８はγ−ｈＡＮＰをコードするＤＮＡ断片の
選択に使用したプローブの塩基配列を表わす。

【図９】図９はｐｈＡＮＰ１及びｐｈＡＮＰ８２中の塩
基配列の決定に用いたストラテジーを表わす。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 田中 正治 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 中里 紘 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 俵木 保典 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内 (72)発明者 松尾 壽之 大阪府箕面市小野原東５丁目５−15−141 (56)参考文献 特開 昭60−215698（ＪＰ，Ａ) ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ ＢＩ ＯＰＨＹＳＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＣＯＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ，1984−118！ Ｐ．131−139

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１におけるアミノ酸２６（Ａ
   ｓｎ）からアミノ酸１５１（Ｔｙｒ）までのアミノ酸配
   列を有するか又は該アミノ酸配列を含むヒト利尿作用を
   有するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチ
   ドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転
   換された細菌を培養することにより該ポリペプチドを生
   産させ、次に該ポリペプチドを採取することを特徴とす
   る方法。
2. 【請求項２】 前記ポリペプチドが配列番号：１におけ
   るアミノ酸１（Ｍｅｔ）からアミノ酸１５１（Ｔｙｒ）
   までのアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求
   項１に記載の方法。