JPH0739374A - 新規なｔ−ＰＡ改変体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡ
のアミノ酸配列の２７６位から３０６位に相当するアミ
ノ酸配列の少なくとも一部が対応関係を有するＵＫのア
ミノ酸配列に置換されており、さらにその置換領域に含
まれる塩基性アミノ酸の少なくとも一つが非塩基性アミ
ノ酸に置換されていることを特徴とするｔ−ＰＡ改変
体、該改変体をコードしているＤＮＡを発現させ得る組
み換え発現ベクター、該ベクターで形質転換された原核
性生物細胞または真核性生物細胞、並びに該改変体を有
効成分として含有する血栓症治療剤。 【効果】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、フィブリン特異性
が上昇しているので、全身性の出血傾向というｔ−ＰＡ
の副作用を減じた血栓症治療剤としての利用が期待され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡと略す）の改変体に
関する。更に詳しくは、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列中、天
然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６位までに相当する
アミノ酸配列の少なくとも一部が尿プラスミノーゲン活
性化因子（以下、ＵＫと略す）の対応するアミノ酸配列
に置換されており、さらにその置換領域中に含まれる塩
基性アミノ酸の少なくとも一つが非塩基性アミノ酸に置
換されていることにより、フィブリン特異性が向上した
新規なｔ−ＰＡ改変体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】天然型のｔ−ＰＡは、血漿中に存在する
不活性型酵素前駆体であるプラスミノーゲンを加水分解
することによって活性型酵素であるプラスミンに変換す
る。プラスミンは、血管内に種々の原因によって生じた
フィブリン塊（血栓）を分解する（文献ａ）。ＵＫやス
トレプトキナーゼなどの既存の血栓溶解剤がフィブリン
特異性を全く有していないのに対し、ｔ−ＰＡは比較的
高いフィブリン特異性を有している。このためフィブリ
ン、ひいては血栓を特異的に溶解する性質を有し、そし
て出血等の副作用の少ない血栓溶解剤として注目されて
きた。しかしながら、実際ｔ−ＰＡを臨床に用いた場
合、閉塞冠動脈の再開通には予想されていたよりも遙か
に多量の投与量が必要であることが明らかとなった（文
献ｂ）。大量投与の結果、ｔ−ＰＡはフィブリン特異的
であるとはいえ若干は血液中のフィブリノーゲンをも分
解してしまうため、結局全身性の出血傾向が生じてしま
うという副作用が無視できない問題となっている。

【０００３】この様な観点から、より高い血栓特異性の
付与を目的としたｔ−ＰＡ改変体の作製も行われ、多数
の報告（文献ｃ，ｄ）がなされているが、未だ目的を充
分に達成したものは数少ない。成功例としては文献ｅに
おいて、天然型のｔ−ＰＡの２９６位から２９９位まで
の４個のアミノ酸をすべてアラニンに置換することによ
り血栓特異性が向上したｔ−ＰＡ改変体を作製している
が、その効果はフィブリン特異性がせいぜい４．４倍、
血漿塊特異性が３倍程度である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、天然型のｔ
−ＰＡと比較してフィブリン特異性が向上した新規なｔ
−ＰＡ改変体を提供することを目的とする。さらに詳し
くは、フィブリノーゲン存在下ではプラスミノーゲン活
性化活性が非常に低いが、フィブリン存在下では天然型
のｔ−ＰＡに近いあるいは同等のプラスミノーゲン活性
化活性を発現し、それゆえフィブリン特異性が向上した
新規なｔ−ＰＡ改変体を提供するものである。本発明の
ｔ−ＰＡ改変体はフィブリン特異性が向上しているの
で、血液中を循環している時はプラスミノーゲンの活性
化およびそれに引き続くフィブリノーゲンの分解を引き
起こし難く、フィブリンの存在する血栓局所に到達して
初めて天然型のｔ−ＰＡに近いあるいは同等のプラスミ
ノーゲン活性化活性を発現して血栓を溶解するので、天
然型のｔ−ＰＡと同等の投与量で使用しても全身性の出
血傾向という副作用を生じ難いことが期待される。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは最近、ｔ−
ＰＡのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡの２７６位か
ら３０６位までに相当するアミノ酸配列の少なくとも一
部がＵＫの対応アミノ酸配列に置換されたｔ−ＰＡ改変
体が、優れたフィブリン特異性を示すことを見いだして
いる（ＰＣＴ／ＪＰ９２／００４１５号明細書）。さら
に研究を継続した結果、上記のような置換変異を有し、
さらにその置換領域中に含まれる塩基性アミノ酸の少な
くとも一つを非塩基性アミノ酸に置換することにより、
フィブリン特異性がより向上した新規なｔ−ＰＡ改変体
が得られることを見いだした。

【０００６】すなわち、本発明の要旨は、（１）ｔ−Ｐ
Ａのアミノ酸配列中、天然型のｔ−ＰＡのアミノ酸配列
の２７６位から３０６位までに相当するアミノ酸配列の
少なくとも一部が下記に示すような対応関係を有するＵ
Ｋのアミノ酸配列に置換されており、さらにその置換領
域に含まれる塩基性アミノ酸の少なくとも一つが非塩基
性アミノ酸に置換されていることを特徴とするｔ−ＰＡ
改変体、

【０００７】

【化２】

【０００８】（２）形質転換された原核性生物細胞また
は真核性生物細胞において、前記（１）記載のｔ−ＰＡ
改変体をコードしているＤＮＡを発現させ得る組換え発
現ベクター、（３）前記（２）記載の組換え発現ベクタ
ーで形質転換された原核性生物細胞または真核性生物細
胞、並びに（４）前記（１）記載のｔ−ＰＡ改変体を有
効成分として含有することを特徴とする血栓症治療剤に
関する。

【０００９】本発明において、天然型のｔ−ＰＡのアミ
ノ酸配列とは、Ｐｅｎｎｉｃａらにより既に報告された
５２７個のアミノ酸からなる配列をいう（文献ｆ）。ま
た、ＵＫのアミノ酸配列とはＨｏｌｍｅｓらにより既に
報告された４１１個のアミノ酸からなる配列をいう（文
献ｊ）。

【００１０】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、天然型のｔ−
ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３０６位に相当する
アミノ酸配列の少なくとも一部が、下記の対応関係を有
するＵＫのアミノ酸配列に置換されている。ここに言う
天然型のｔ−ＰＡの２７６位は一本鎖から二本鎖への開
裂部位の直後の位置にあって、これに対応するＵＫのア
ミノ酸配列領域は、ＵＫの一本鎖前駆体であるプロＵＫ
の二本鎖型（すなわちＵＫ）への開裂部位直後のアミノ
酸残基である１５９位を指し、以下順次上段のｔ−ＰＡ
のアミノ酸配列が下段のＵＫのアミノ酸配列に対応する
関係を指す。また、本発明でいう対応関係を有するＵＫ
におけるアミノ酸配列は、天然型のｔ−ＰＡの置換領域
におけるアミノ酸配列よりアミノ酸が１個少なく、天然
型のｔ−ＰＡの２９５位に対応するＵＫのアミノ酸（上
記の配列表示における−で示される部分）は、ＵＫのア
ミノ酸配列への置換においてアミノ酸が欠失した状態で
対応するものとする。従って、本発明において天然型の
ｔ−ＰＡの２７６位から３０６位に対応するＵＫのアミ
ノ酸配列とは、ＵＫの１５９位から１８８位のアミノ酸
配列を指す。本明細書において、このような天然型のｔ
−ＰＡの２７６位から３０６位までの間のアミノ酸置換
の領域について、「置換領域」あるいは「ＵＫへの置換
領域」と称する場合がある。

【００１１】

【化３】

【００１２】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、置換領域に含
まれる塩基性アミノ酸の少なくとも一つが非塩基性アミ
ノ酸に置換されていることを特徴とするが、本発明にお
いて塩基性アミノ酸とは、具体的にリジン、アルギニ
ン、ヒスチジンを指す。中でも塩基性アミノ酸としてア
ルギニン（ＵＫの１７８位、１７９位及び１８１位）の
全部又は一部を非塩基性アミノ酸に置換させるのが好ま
しい。ここで、非塩基性アミノ酸とはリジン、アルギニ
ン、ヒスチジン以外のアミノ酸を指し、特に限定されな
いが、好ましくはグルタミン酸等の酸性アミノ酸であ
る。

【００１３】本発明のｔ−ＰＡ改変体として、置換領域
中のアルギニンが置換されるものを例示すると、例え
ば、次のようなものが好適である。 ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列がこれに対応するＵＫの１５９位から１８８
位のアミノ酸配列に置換されていると共に、さらにその
置換領域中、天然型のｔ−ＰＡの２９６位、２９７位及
び２９９位にそれぞれ相当するＵＫのアミノ酸配列であ
る１７８位、１７９位及び１８１位のアルギニンをグル
タミン酸に置換した、配列番号：１に示すアミノ酸配列
に置換されているもの、 ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列がこれに対応するＵＫの１５９位から１８８
位のアミノ酸配列に置換されていると共に、さらにその
置換領域中、天然型のｔ−ＰＡの２９９位に相当するＵ
Ｋのアミノ酸配列である１８１位のアルギニンがグルタ
ミン酸に置換した、配列番号：２に示すアミノ酸配列に
置換されているもの、 ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３０６位のア
ミノ酸配列がこれに対応するＵＫの１５９位から１８８
位のアミノ酸配列に置換されていると共に、さらにその
置換領域中、天然型のｔ−ＰＡの２９６位及び２９７位
に相当するＵＫのアミノ酸配列である１７８位、１７９
位のアルギニンがグルタミン酸に置換した、配列番号：
３に示すアミノ酸配列に置換されているもの、並びに ｔ−ＰＡのアミノ酸配列の２９４位から３０６位のア
ミノ酸配列がこれに対応するＵＫの１７７位から１８８
位のアミノ酸配列に置換されていると共に、さらにその
置換領域中、天然型のｔ−ＰＡの２９６位、２９７位及
び２９９位に相当するＵＫのアミノ酸配列である１７８
位、１７９位及び１８１位のアルギニンがグルタミン酸
に置換された、配列番号：４に示すアミノ酸配列に置換
されているもの。

【００１４】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、前記のような
置換領域を有するが、置換領域以外のアミノ酸配列につ
いては特に限定されない。即ち、天然型のｔ−ＰＡのア
ミノ酸配列と同一であってもよく、あるいは本発明のｔ
−ＰＡ改変体の特性に影響を与えない範囲で変異体のア
ミノ酸であってもよい。

【００１５】本発明のｔ−ＰＡ改変体の調製は、例えば
天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６位に対応するア
ミノ酸配列の全部又は一部をＵＫの対応する部分のアミ
ノ酸配列からなるペプチドと置換し、さらに置換配列中
の特定の塩基性アミノ酸を非塩基性アミノ酸に置換する
ことによって、あるいは、ＵＫのアミノ酸配列中の特定
の塩基性アミノ酸を非塩基性アミノ酸に置換したアミノ
酸配列からなるペプチドと置換することによって行うこ
とができる。具体的に置換を行うにあたり、さまざまな
方法が可能であるが、例えばｔ−ＰＡの当該領域のアミ
ノ酸配列をコードするｃＤＮＡの一部を、上記に対応す
るアミノ酸配列をコードする合成ＤＮＡ断片と置換し、
適当な発現ベクターと連結してこれを宿主内に導入し、
本発明の最終目的であるｔ−ＰＡ改変体タンパクを発現
・生産させることにより行うことができる。以下、その
詳細について述べる。

【００１６】本発明のｔ−ＰＡ改変体の製造には、通常
天然型のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡを用いることが
できる。天然型のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡは、た
とえばボーズメラノーマ細胞からのクローニングによっ
て、たとえば文献ｆに記載されているように既に取得さ
れており、従ってそのｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列も知
られている。また、天然型のｔ−ＰＡを改変すべく例え
ば半減期を長くしたｔ−ＰＡ類似体（文献ｇ，ｈ等）の
ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列も知られており、これらも
用いることができる。プラスミド中にクローニングした
ｔ−ＰＡｃＤＮＡの特定の配列を置換する方法も当業界
において既によく知られており、本発明においても常法
によりｔ−ＰＡのアミノ酸配列を置換することができ
る。

【００１７】置換の方法としては、天然型のｔ−ＰＡの
ｃＤＮＡを利用する場合、本発明における置換領域周辺
には合成ＤＮＡ断片の挿入による置換に都合の良い適当
な制限酵素部位がないので、ｔ−ＰＡの２７４位〜２７
６位（ＴＴＣＧＣＡ）及び３０９位〜３１１位（ＧＣＡ
ＴＡＣ）のアミノ酸の位置に、これらのアミノ酸を変化
させることなくＮｓｐＶ（ＴＴＣＧＡＡ）、ＡｃｃＩ
（ＧＴＡＴＡＣ）という制限酵素の認識部位を部位特異
的変異により導入したｐＨＳＧＢ−０００ＮＡ（文献
ｉ）のようなプラスミドを出発材料として利用すること
が好ましい。このような部位特異的変異導入法の手法に
ついては、ゾラー及びスミスらの方法が参照される（文
献ｋ）。ｐＨＳＧＢ−０００ＮＡは、制限酵素ＮｓｐＶ
あるいはＡｃｃＩにより唯一カ所のみが切断されるの
で、これら両酵素で切断することによりｔ−ＰＡ配列を
切り出し、代わりに目的の配列を含む合成ＤＮＡ断片を
この部位に連結（ライゲーション）させることができ
る。

【００１８】置換されるべき塩基配列を含むＤＮＡ断片
の作製は、ホスホアミダイト法（文献ｌ）により合成さ
れたオリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニーリングし
て二本鎖にする方法が便利である。オリゴヌクレオチド
の合成と精製は、アプライドバイオシステムズ社のモデ
ル３８１Ａ ＤＮＡシンセサイザー及び同社のオリゴヌ
クレオチド精製用カートリッジが有効に利用される。な
お、必要に応じてより短い合成オリゴヌクレオチドを複
数本作製し、これらをつなぎ合わせる手法もとることが
できる。また、目的とする置換、あるいは挿入されたＤ
ＮＡ配列を確認するためには、ジデオキシ法（文献ｍ）
の原理を用い、例えばＴａｑポリメラーゼを利用したサ
イクルシークエンスの手法により行うことができる。そ
のためには、アプライドバイオシステムズ社のモデル３
７３Ａ ＤＮＡシークエンサーが有効に用いられる。

【００１９】その他、後述の実施例に記載されているよ
うな制限酵素によるＤＮＡの切断、欠失、それらにより
生ずるＤＮＡ断片のポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる分離、回収、あるいは連結等の遺伝子操作は全て公
知であり、主として文献ｎが参照される。

【００２０】このようにして得られたｔ−ＰＡ改変体を
コードするｃＤＮＡは、ＣＤＭ８（ｏｒｉ^- ）等、周知
の発現ベクターに連結された後、適当な宿主に導入され
ることにより、本発明の最終目的物質であるｔ−ＰＡ改
変体タンパクを発現・生産することができる。宿主とし
ては、原核性生物細胞又は真核性生物細胞のいずれでも
よく、例えば大腸菌株や動物細胞株は、とくに記載のな
い限り既に広く普及しており入手は容易である。例えば
動物細胞宿主としては、ＣＯＳ−１，ＣＨＯ細胞が挙げ
られる。発現プラスミドを用い適当な宿主を形質転換す
るには、電気パルス法（文献ｏ）を用いればよい。形質
転換された細胞の培養上清は、適当な希釈によりそのま
ま種々の活性測定に使用され得る程度のｔ−ＰＡ改変体
を含んでいる。

【００２１】培養上清中に産生されたｔ−ＰＡ類似体
は、亜鉛キレートアガロース、コンカナバリンＡアガロ
ース、セファデックスＧ−１５０等を用いる公知の方法
（文献ｐ）等によって、容易に精製することができる。

【００２２】このようにして得られた本発明のｔ−ＰＡ
改変体は、高いフィブリン特異性を有するので、血栓症
治療剤として生体内に投与された場合、天然のｔ−ＰＡ
と比較して全身性の出血傾向という副作用が減少した血
栓症治療剤の有効成分とすることができる。本発明のｔ
−ＰＡ改変体は、常法により容器に必要量分注し、凍結
乾燥を行うことにより製剤として極めて容易に得ること
ができる。この凍結乾燥品は、製剤学的に容認されるキ
ャリアー物質、例えば生理食塩水に溶解し、静脈内また
は動脈または心臓内への注射によって投与される。投与
量については、現在臨床で用いられている天然型のｔ−
ＰＡの投与量程度でも良いが、本発明のｔ−ＰＡ改変体
は副作用が少ないので該投与量よりも多く使用すること
も可能である。投与方法は、持続静注あるいは投与予定
量の一部を最初に静注し残りを持続静注するなどの通常
のｔ−ＰＡの投与方法で行われる。

【００２３】

【実施例】以下に、本発明の一例として実施例を示す
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお、以
下の実施例で引用されるＣＳ１とは、天然型のｔ−ＰＡ
の２７６位から３０６位のアミノ酸配列がＵＫの１５９
位から１８８位のアミノ酸配列（配列番号：５）に置換
されたｔ−ＰＡ改変体であり、文献ｉにいうＣＳＴＵを
改称したものである。

【００２４】実施例１ ＵＫへの置換領域内に３カ所のアミノ酸置換を有するＣ
Ｓ１類似体（ＣＳ１Ｅ）を哺乳類細胞で発現し得るプラ
スミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｅの構築 天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６位のアミノ酸配
列がＵＫの１５９位から１８８位の配列に置換されてお
り、さらにその配列中の天然型のｔ−ＰＡの２９６位、
２９７位及び２９９位に対応するＵＫの１７８位、１７
９位、１８１位のアルギニンが全てグルタミン酸に置換
されたアミノ酸配列（配列番号：１）をコードする４種
のオリゴヌクレオチド（ＣＳ１Ｍ（配列番号：６），Ｃ
Ｓ１Ｒ（配列番号：７），ＣＳ２ＥＭ（配列番号：８）
及びＣＳ２ＥＲ（配列番号：９））を合成した。これら
の合成オリゴヌクレオチドを５’末端のリン酸化後アニ
ールさせ、これと文献ｉにより公知のｐＨＳＧＢ−００
０ＮＡをＮｓｐＶ及びＡｃｃＩで消化したものとをライ
ゲートさせた。これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換させることにより、ＵＫへの置換領域内に上記３カ
所のアミノ酸置換を有するＣＳ１類似体（ＣＳ１Ｅ）を
コードするプラスミドｐＨＳＧＢ−ＣＳ１Ｅを得た（図
１）。

【００２５】哺乳類細胞においてＣＳ１Ｅを発現させる
ためのベクターには、ｐＣＤＭ８（ＢｇｌII）を利用し
た。本ベクターはＣＤＭ８（ｏｒｉ^- ）のＣＭＶプロモ
ーター下流のスタッファー配列を除いてＢｇｌIIサイト
を導入したものである（文献ｑ）。ｐＣＤＭ８（Ｂｇｌ
II）をＢｇｌIIで消化後、５’末端を脱リン酸化したも
のと、ｐＨＳＧＢ−ＣＳ１ＥをＢａｍＨＩで消化したも
のとをライゲートさせ、大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３を形
質転換させることにより、哺乳類細胞でＵＫへの置換領
域内に３カ所のアミノ酸置換を有するＣＳ１類似体（Ｃ
Ｓ１Ｅ）を発現させ得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１
Ｅを得た（図２）。

【００２６】実施例２ ＵＫへの置換領域内に１カ所のアミノ酸置換を有するＣ
Ｓ１類似体（ＣＳ１Ｆ）を哺乳類細胞で発現し得るプラ
スミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｆの構築 実施例１におけるＣＳ２ＥＭ及びＣＳ２ＥＲの代わりに
ＣＳ２ＦＭ（配列番号：１０）及びＣＳ２ＦＲ（配列番
号：１１）を用いる以外は実施例１と同様の手法を用い
て、天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６位のアミノ
酸配列がＵＫの１５９位から１８８位の配列に置換され
ており、さらにその配列中の天然型のｔ−ＰＡの２９９
位に対応するＵＫの１８１位のアルギニンがグルタミン
酸に置換された、ＵＫへの置換領域内に１カ所のアミノ
酸置換を有するＣＳ１類似体（ＣＳ１Ｆ）を哺乳類細胞
で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｆを得た。

【００２７】実施例３ ＵＫへの置換領域内に２カ所のアミノ酸置換を有するＣ
Ｓ１類似体（ＣＳ１Ｇ）を哺乳類細胞で発現し得るプラ
スミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｇの構築 実施例１におけるＣＳ２ＥＭ及びＣＳ２ＥＲの代わりに
ＣＳ２ＧＭ（配列番号：１２）及びＣＳ２ＧＲ（配列番
号：１３）を用いる以外は実施例１と同様の手法を用い
て、天然型のｔ−ＰＡの２７６位から３０６位のアミノ
酸配列がＵＫの１５９位から１８８位の配列に置換され
ており、さらにその配列中の天然型のｔ−ＰＡの２９６
位、２９７位に対応するＵＫの１７８位、１７９位のア
ルギニンがグルタミン酸に置換された、ＵＫへの置換領
域内に２カ所のアミノ酸置換を有するＣＳ１類似体（Ｃ
Ｓ１Ｇ）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ
８−ＣＳ１Ｇを得た。

【００２８】実施例４ ＵＫへの置換領域内に３カ所のアミノ酸置換を有するＣ
Ｓ３類似体（ＣＳ３Ｅ）を哺乳類細胞で発現し得るプラ
スミドｐＣＤＭ８−ＣＳ３Ｅの構築 まず、実施例１におけるＣＳ１Ｍ，ＣＳ１Ｒ，ＣＳ２Ｅ
Ｍ及びＣＳ２ＥＲの代わりにＣＳ４Ｍ（配列番号：１
４），ＣＳ４Ｒ（配列番号：１５），ＣＳ２Ｍ（配列番
号：１６）及びＣＳ２Ｒ（配列番号：１７）を用いる以
外は実施例１と同様の手法を用いて、天然型のｔ−ＰＡ
の２９４位から３０６位のアミノ酸配列がＵＫの対応す
る配列、すなわちＵＫの１７７位から１８８位の配列に
置換された、ＣＳ１類似体（ＣＳ３）を哺乳類細胞で発
現し得るプラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ３を得た。次に、
前記のＣＳ２Ｍ及びＣＳ２Ｒの代わりにＣＳ２ＥＭ（配
列番号：８）及びＣＳ２ＥＲ（配列番号：９）を用いる
以外は前記と同様の手法を用いて、天然型のｔ−ＰＡの
２９４位から３０６位のアミノ酸配列がＵＫの１７７位
から１８８位の配列に置換されており、さらにその配列
中の天然型のｔ−ＰＡの２９６位、２９７位、２９９位
に対応するＵＫの１７８位、１７９位、１８１位のアル
ギニンがグルタミン酸に置換された、ＵＫへの置換領域
内に３カ所のアミノ酸置換を有するＣＳ３類似体（ＣＳ
３Ｅ）を哺乳類細胞で発現し得るプラスミドｐＣＤＭ８
−ＣＳ３Ｅを得た。

【００２９】実施例５ 本発明のｔ−ＰＡ改変体のＣＯＳ−１細胞での発現及び
分泌 ｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｅ、ｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｆ、ｐＣＤ
Ｍ８−ＣＳ１Ｇ及びｐＣＤＭ８−ＣＳ３Ｅを用いて既述
の電気パルス法によりＣＯＳ−１細胞を形質転換した。
リジンセファロースクロマト処理した牛胎児血清１０％
およびアプロチニン１０μｇ／ｍｌを含有するＤＭＥＭ
培地で２４時間培養後、培地を無血清かつアプロチニン
無含有ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに９６時間培養を継
続した。培養液を遠心後その上清を回収し、これに１％
牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＤＭＥＭ培地を１／９
量添加し、凍結保存した。この凍結保存上清を本発明の
改変体試料（ＣＳ１Ｅ、ＣＳ１Ｆ、ＣＳ１Ｇ、ＣＳ３
Ｅ）と称し、以後の評価に用いた。尚、コントロールと
して天然型のｔ−ＰＡを発現するｐＣＤＭ８−０００
（文献ｑ）、ＣＳ１を発現するｐＣＤＭ８−ＣＳ１（文
献ｉ）、およびＣＳ３を発現するｐＣＤＭ８−ＣＳ３を
用いて、前記と同様の方法により得られた凍結保存上清
を以後の評価に用いた。

【００３０】実施例６ 蛋白量の定量 前記の各培養上清中の改変体試料の蛋白量は、市販のキ
ット（バイオプール社製）を用いた酵素免疫測定法（Ｅ
ＬＩＳＡ）により測定された。

【００３１】実施例７ フィブリン特異性の評価 発色性合成基質Ｓ−２２５１を用いるｔ−ＰＡのプラス
ミノーゲン活性化活性測定系に種々のフィブリンコファ
クターを添加し、フィブリン特異性の評価を行った。 １）フィブリン系 まず、９６穴プレートのウェル中に６０国際単位／mlの
トロンビン（0.01％ Tween 80 含有ＰＢＳ）１０μl を
添加した。次に0.01％ Tween 80 含有ＰＢＳで２００ng
／mlに希釈された各改変体試料２０μl を添加し、さら
に反応混合液〔プラスミノーゲン１３５nM、フィブリノ
ーゲン 0.8μＭ、Ｓ−２２５１ ３７８μＭ（0.09％(v
/v) Tween 80及び４．４mg／mlゼラチン含有０．１３Ｍ
トリス塩酸ｐＨ７．８溶液）〕２００μl を添加した。
３７℃でインキュベートを開始後、プレートリーダーを
用いて４０５nmにおける吸光度（ＯＤ₄₀₅ ）を経時的に
測定した。同時にフィブリンによる濁度の影響を補正す
るため、４９０nmにおける吸光度（ＯＤ₄₉₀ ）を測定
し、各時間でそのＯＤ₄₉₀ 値をＯＤ₄₀₅ から差し引い
た。スタンダードとして種々の濃度に希釈した天然型ｔ
−ＰＡを同様の方法で測定し、濃度に対する一定時間後
の吸光度（ＯＤ₄₀₅ −ＯＤ₄₉₀ ）値をプロットした検量
線を作製し、この検量線をもとに天然型ｔ−ＰＡに対す
る各ｔ−ＰＡ類似体の相対活性を決定した。

【００３２】２）フィブリノーゲン系 フィブリン系と同様に行った。ただし、トロンビンの代
わりに０．０１％ Tween 80 含有ＰＢＳを用いた。

【００３３】表１に各改変体試料の天然型ｔ−ＰＡに対
する相対活性を示す。フィブリン系においては反応２０
分後、フィブリノーゲン系においては反応１時間後の吸
光度（ＯＤ₄₀₅ −ＯＤ₄₉₀ ）を評価に用いた。得られた
吸光度に対応する天然型ｔ−ＰＡの濃度を前記検量線よ
り求めた。フィブリン特異性は、「フィブリン系におけ
る活性」／「フィブリノーゲン系における活性」の比で
表した。

【００３４】

【表１】

【００３５】表中のスティミュレーターの表示において
は、Ｆｇはフィブリノーゲン系、Ｆｎはフィブリン系を
示す。また、Ｆｎ／Ｆｇは「フィブリン系における活
性」／「フィブリノーゲン系における活性」の比を示
す。表１より、本発明のｔ−ＰＡ改変体（ＣＳ１Ｅ，Ｃ
Ｓ１Ｆ，ＣＳ１Ｇ）は、天然のｔ−ＰＡ、ＣＳ１と比較
してフィブリノーゲン系ではプラスミノーゲン活性化活
性が非常に低く、従ってフィブリン特異性（Ｆｎ／Ｆ
ｇ）は、天然のｔ−ＰＡ、ＣＳ１に比べてかなり高い値
を有しており、天然のｔ−ＰＡ、ＣＳ１に比べてかなり
高いフィブリン特異性を有していることが明らかとなっ
た。特にＣＳ１と比較した場合、ＵＫへの置換領域内に
塩基性アミノ酸をさらに置換させることにより本発明の
ｔ−ＰＡ改変体のフィブリン特異性が顕著に向上したこ
とが明らかとなった。この点については、本発明のｔ−
ＰＡ改変体（ＣＳ３Ｅ）と置換領域内に塩基性アミノ酸
の置換がされていないＣＳ３とを比較した場合も同様で
あった。

【００３６】引用文献 ａ）欧州特許出願公開 No.0041766 A2 ｂ）The TIMI study group : N. Engl. J. Med., 320,
618, 1989. ｃ）特開昭62-24 号公報 ｄ）特開昭62-253380 号公報 ｅ）国際公開No.9002798 ｆ）Pennica et al. : Nature, 301, 214, 1983. ｇ）特表昭63-501335 号公報 ｈ）S. Yoshitake et al. ： Thromb. Haemostasis, 6
2, 542, 1982. ｉ）特開平4-144682号公報 ｊ）Holmes et al. ：BIO/TECHNOLOGY,3,923,1985 ｋ）M.J.Zoller et al. ： Methods in Enzymology, 10
0, 468, 1983. ｌ）S. L. Beaucage et al. : Tetrahedron Letters, 2
2, 1859, 1981. ｍ）F. Sanger et al. : Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74, 5463, 1977. ｎ）T. Maniatis et al. : Molecular Cloning, A Labo
ratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory. 1982. ｏ）高山伸一郎、細胞工学 6, 771, 1987. ｐ）D. C. Rijken et al.: Biochemica Biophysyca Act
a, 580, 140-153, 1979. ｑ）特願平2-87005 号

【００３７】

【発明の効果】本発明のｔ−ＰＡ改変体は、フィブリン
特異性が上昇した新規なｔ−ＰＡ改変体であり、全身性
の出血傾向というｔ−ＰＡの副作用を減じた血栓症治療
剤としての利用が期待される。

【００３８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Glu Glu His Glu Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val 20 25 30

【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Glu Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val 20 25 30

【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Glu Glu His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val 20 25 30

【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Glu Glu His Glu Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val 20 25 30

【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val 20 25 30

【００４３】配列番号：６ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CGC ATT ATT GGG GGA GAA TTC ACC ACC ATC GAG AAC CAG CCC TGG TTT 48 GC 50

【００４４】配列番号：７ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 T GGC CGC AAA CCA GGG CTG GTT CTC GAT GGT GGT GAA TTC TCC CCC 46 AAT AAT G 53

【００４５】配列番号：８ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 G GCC ATC TAC GAG GAG CAC GAG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG TGT 46 GGA GGC 52

【００４６】配列番号：９ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AT GCC TCC ACA CAC GTA GGT GAC AGA GCC CCC CTC GTG CTC CTC GTA 47 GA 49

【００４７】配列番号：１０ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 G GCC ATC TAC AGG AGG CAC GAG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG TGT 46 GGA GGC 52

【００４８】配列番号：１１ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AT GCC TCC ACA CAC GTA GGT GAC AGA GCC CCC CTC GTG CCT CCT GTA 47 GA 49

【００４９】配列番号：１２ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 G GCC ATC TAC GAG GAG CAC AGG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG TGT 46 GGA GGC 52

【００５０】配列番号：１３ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列： AT GCC TCC ACA CAC GTA GGT GAC AGA GCC CCC CCT GTG CTC CTC GTA 47 GA 49

【００５１】配列番号：１４ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 CGC ATC AAA GGA GGG CTC TTC GCC GAC ATC GCC TCC CAC CCC TGG CAG 48 GC 50

【００５２】配列番号：１５ 配列の長さ：５３ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 T GGC CGC CTG CCA GGG GTG GGA GGC GAT GTC GGC GAA GAG CCC TCC 46 TTT GAT G 53

【００５３】配列番号：１６ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｎｏ 配列 G GCC ATC TAC AGG AGG CAC AGG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG TGT 46 GGA GGC 52

【００５４】配列番号：１７ 配列の長さ：４９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ アンチセンス：Ｙｅｓ 配列 AT GCC TCC ACA CAC GTA GGT GAC AGA GCC CCC CCT GTG CCT CCT GTA 47 GA 49

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドｐＨＳＧＢ−ＣＳ１Ｅの構
築の概念図を示す。

【図２】図２は、プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＳ１Ｅの構
築の概念図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組織プラスミノーゲン活性化因子（以
   下、ｔ−ＰＡと略す）のアミノ酸配列中、天然型のｔ−
   ＰＡのアミノ酸配列の２７６位から３０６位に相当する
   アミノ酸配列の少なくとも一部が下記に示すような対応
   関係を有する尿プラスミノーゲン活性化因子（以下、Ｕ
   Ｋと略す）のアミノ酸配列に置換されており、さらにそ
   の置換領域に含まれる塩基性アミノ酸の少なくとも一つ
   が非塩基性アミノ酸に置換されていることを特徴とする
   ｔ−ＰＡ改変体。 【化１】 （なお、アミノ酸配列において対応関係とは、天然型の
   ｔ−ＰＡの２７６位がＵＫの１５９位に対応し、以下順
   次上段の配列が下段の配列に対応する関係を示す。ま
   た、上記の配列表示における−は、ＵＫのアミノ酸配列
   への置換においてアミノ酸が欠失した状態で対応するも
   のとする。）
2. 【請求項２】 置換領域に含まれる塩基性アミノ酸の少
   なくとも一つが酸性アミノ酸に置換されていることを特
   徴とする請求項１記載のｔ−ＰＡ改変体。
3. 【請求項３】 酸性アミノ酸がグルタミン酸である請求
   項２記載のｔ−ＰＡ改変体。
4. 【請求項４】 置換領域に含まれる塩基性アミノ酸がア
   ルギニンである、請求項１、２または３記載のｔ−ＰＡ
   改変体。
5. 【請求項５】 形質転換された原核性生物細胞または真
   核性生物細胞において、請求項１〜４いずれかに記載の
   ｔ−ＰＡ改変体をコードしているＤＮＡを発現させ得る
   組換え発現ベクター。
6. 【請求項６】 請求項５記載の組換え発現ベクターで形
   質転換された原核性生物細胞または真核性生物細胞。
7. 【請求項７】 請求項１〜４いずれかに記載のｔ−ＰＡ
   改変体を有効成分として含有することを特徴とする血栓
   症治療剤。