JPH0526798B2 - - Google Patents
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- JPH0526798B2 JPH0526798B2 JP57135279A JP13527982A JPH0526798B2 JP H0526798 B2 JPH0526798 B2 JP H0526798B2 JP 57135279 A JP57135279 A JP 57135279A JP 13527982 A JP13527982 A JP 13527982A JP H0526798 B2 JPH0526798 B2 JP H0526798B2
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Description
本発明は組換型DNA技術の適用によつてもた
らされる酵母によるヒトのＢ型肝炎ウイルス
（HBV）の抗原の生合成に関するものである。Ｂ
型肝炎ウイルスは世界的な公衆衛生の主な問題と
して認識されている。ウイルス肝炎の広範囲にわ
たる発生率および無症候性保菌者状態の残存のほ
かにＢ型肝炎ウイルスは肝細胞癌の病因に含意さ
れている。Ｂ型肝炎ウイルスの分子生物学の最近
の再調査に関してチオライス．P.等のScience第
213巻、第406頁（1981年）を参照。 この研究の主な努力はウイルス感染に対する防
御免疫性をそなえるための適当なワクチンを産生
することである。適当なワクチンを製造するため
の一方策はウイルスの主な抗原成分、表面抗原を
精製するための試みを包含していた。以下完全な
ウイルス（デイン粒子）の製剤から得られ、ある
いは肝炎保菌者の血清から精製されるHBV表面
抗原と一致する記号HBsAgを用いる。スケリー．
J.等のNature第290巻、第51頁（1981年）は精製
HBsAgの水溶性蛋白質ミセルの精製を報告して
いる。この方法の重要な制限は、製造することが
できる物質の量が供給者の有効性に依存するとい
うことである。培養でウイルスを増殖するための
技術は知られていない、それ故源泉物質の量の制
限のほかに供給者の血清の活性ウイルスまたは他
の成分でのワクチンの汚染の危険および様々な供
給者から得られる生産物に起こりうる異質があ
る。 第二の方法は表面抗原（Ｓ−プロテイン）から
なる蛋白質のアミノ酸配列および最も適当な抗原
決定子を予測するモデル研究に基づくHBsAgに
対する抗体を惹起するペプチドを合成する試みで
あつた。例えばR.A.ラーナー等のPro.Nat.Acad.
Sci.USA第78巻、第3403頁（1981年）参照。かか
る作業は非常に予備的な段階にあり、その方法が
価格に有効な方法で実用的な程度の免疫性を有す
る抗原を生産することができるかどうかを評価す
ることは困難である。 組換型DNA技術を使用する第三の方法は他の
ウイルス遺伝子生産物のないＳ−プロテイン、
HBsAgまたは免疫学的反応性等価物を大量に生
産するために微生物に遺伝的能力を与えることに
よつて微生物によるＳ−プロテイン、HBsAgま
たは免疫学的反応性等価物の合成である。この方
法はウイルスまたは他のウイルス成分による汚染
の可能性を除去し、規模の節約で大規模な生産を
可能にする。さらにその上遺伝子物質の適当な操
作により、副作用を変性するかまたはワクチンを
多価にするためにワクチンからなる蛋白質の配列
を変更することができる。この目的に対して
HBVの完全なゲノムが大腸菌でクローンされて
おり、完全なヌクレオチド配列が決定されている
（チヤーナイ．P.等Nucl.Acid Res.第７巻、第
335頁（1979年）、ガリベルト．F.等、Nature第
281巻、第646頁（1979年）、バレンツエラ．P.等、
Animal Virus Genetics（B.フイールズ、R.ジヤ
エニツシユおよびCFFox版）Academic Press，
ニユーヨーク，N.Y.（1980年）第57頁）。ゲノム
の単一部位はＳ−プロテインに対する、そしてま
た163アミノ酸の大きな予備配列に対するコード
に見出された。HBsAgの構造は二硫酸塩分子間
結合によつて連結した２本のＳ−プロテイン鎖か
らなると考えられ、さらに二硫酸塩分子間結合に
よつて指示された確認に適用できる。２本の鎖の
１本はグリコシル化されていると思われる。保菌
者の血清中、HBsAgはしばしばまさに記載した
Ｓ−プロテイン二量体の集合体とみなされる平均
直径22nmを有する球形粒子の形態と見られ、恐
らく脂質を含有する。ウイルスエンベロープにお
いてHBsAgは脂質含有ウイルスエンベロープと
結合し、宿主細胞の膜成分から誘導されると考え
られる。 HBsAgの抗原性および免疫原性はいくつかの
因子に依存し、そのすべてが十分に理解されてい
ない。二硫酸塩結合の減力が抗原性および免疫原
性を著しく低下することが観察されている（ミク
ロ．S.等、J.Immunol第124巻、第1589頁（1980
年））それ故分子内および分子間の二硫酸塩結合
によつて与えられる第三配置が抗原性および免疫
性に貢献するものと考えられる。グリコシル化の
範囲および性質および脂質との結合のような他の
因子の寄与は不明であるが、ある程度すべてが貢
献するものと考えられる。上記で言及した22nm
のような粒子への集合が免疫原性を高めるために
重大に貢献するものと考えられる。 Ｓ−プロテインは融合蛋白質の形態に大腸菌で
合成されている（エドマン．J.C.等、Nature第
291巻、第503頁（1981年））。産生物はプレ−βラ
クタマースの183アミノ酸、５〜10グリシン残渣
およびアミン末端の22アミノ酸のないＳ−プロテ
インの204アミノ酸を包含している。融合蛋白質
は抗HBsAgIgGで免疫沈降可能であつた。 Ｓ−プロテイン二量体（上記ミシロ等）および
HBsAgを混和する22nm粒子（カブラル．G.A.
等、J.Gen.Viro1第38巻、第339頁（1978年））が
関連Ｓ−プロテインより抗原性であることが知ら
れていることから、HBsAgまたは免疫学的反応
性等価物を直接に実質的な量で生産することがで
きる生物学的系を見出すことは非常に望ましい。 Ｓ−プロテインをHBsAgにまたは22nm粒子に
転化する段階は十分に理解されておらず、また宿
主特異性がどの程度であるかも知られていない。
さらに、その上Ｓ−プロテイン遺伝子は機能の意
味があるとしても知られていない163アミノ酸の
異常に長い予備配列に対してコードしているよう
に思われる。事実予備配列がウイルス感染細胞で
実際に翻訳されるかどうか知られていない。酵母
（サツカロミセスセレビシアエ）は次の理由で
HBsAgの表現を試みるために宿主細胞として選
択された。酵母は大量に培養で容易に増殖するこ
とができる。事実、大規模な酵母培養の科学的知
識は十分に理解されている。また酵母は真核性で
あり、それで正常な宿主細胞で実施される後翻訳
処理段階のいくつかが酵母で実施されることが望
まれた。Ｓ−プロテインをHBsAgに転化する複
合体後翻訳事象、そのいくつかが宿主特異性であ
るために本明細で採用した術語は、本明細書で開
示される作業から認められる異つた抗原形態を区
別することを意味する。表面抗原に対する構造遺
伝子の未処理翻訳生産物をＳ−プロテインと呼
ぶ。感染した供給者の血漿から、デイン粒子から
またはヒトの肝癌細胞培養から分離される抗原を
HBsAgと呼ぶ。酵母の表面抗原遺伝子の表現生
産物をＹ−HBsAgと呼ぶ。HBsAgの免疫学的反
応性等価物なる用語はＹ−HBsAgが１例である
Ｓ−プロテインまたはその一部からなるあらゆる
免疫学的交互反応性組成物に対する一般用語であ
る。 酵母が前に異なる細菌で正常に増殖するウイル
スの遺伝子の表現に用いられたことはいまだかつ
てなかつた。酵母の異種蛋白質を表現する先行技
術の試みは混合した結果を生じている。それ自身
のプロモーターの制御下ウサギグロビンを表現す
る試みは蛋白質の翻訳に不成功であつたと思われ
る（ベツグ．J.D.等、Nature第283巻、第835頁
（1980年））。シヨウジヨウバエ属遺伝子に対して
コードづけている遺伝子は遺伝相補性のための選
択圧の条件下、酵母ade8突然変異体を補足する
ことができることを報告している。酵母菌株から
の機能蛋白質の分離は報告されなかつた。ヒトの
白血球インターフエロンに対する遺伝子は酵母
ADH1（アルコール脱水素酵素）プロモーターの
制御下酵母で表現されている。その場合、活性蛋
白質の成功した生産は後翻訳工程または成分の組
立てを必要としなかつた。 酵母の運搬および複製に適当なDNA運搬媒介
体が開発された（ブローチ．J.R.等のGene第８
巻、第121頁（1979年）、ハートレイ．J.L.等の
Nature第286巻、第860頁（1980年）。この用途の
ほとんどの酵母媒介体は複製の酵母原点
（origin）を挿入しているpBR322のような大腸菌
媒介体から誘導される。酵母複製原点二つのタイ
プが利用される。通例2μ環として言及される遍
在する天然の酵母プラスミドから誘導される一つ
は酵母染色体DNAと無関係に複製する能力があ
る。媒介体のもう一つの種類は自律複製力も生じ
る酵母染色体複製原点から誘導されるars1（自律
複製配列）と呼ばれる複製原点配列を含有する。
細菌および酵母複製原点の両方が同じ媒介体に存
在するためにどちらの細菌でも用いることができ
る。選択はpBR322のアムピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝
子の包含によつて細菌系で供給することができ
る。酵母系の選択は典型的には適当な栄養要求宿
主菌株中突然変異を相補する酵母遺伝子を包含す
ることによつて供給することができる。明細書中
に報告される研究はアルコール脱水素酵素
（ADH1）にコードづけている酵母遺伝子から分
離したプロモーターを含有する酵母媒介体を通例
利用する（ベンネツエン．J.L.等、J.Biol.Chem.
第257巻、第3018頁（1981年）。 ADH1プロモーター部は酵母ADH1遺伝子の
5′−側面部から分離された。コードづけ部内の−
1550〜＋17位置から伸びているADH1配列の約
1600塩基対を含有する部分は酵母CYC1コードづ
け配列に融合した。出発特異性を転写する表示さ
れた付着CYC1コードづけ配列の転写の研究は一
つの酵母遺伝子からもう一つの酵母遺伝子まで運
搬することができた。ADHコードづけ部の全部
がない小部分は次に構成され、ヒトのインターフ
エロンの表現で作用することを示している。921
と呼ばれる、かかる部分の１つは−９位置の後終
結し、本研究で使用された。 抗HBsAg抗体と反応する物質がいくつかの形
態で存在するために、これらの形態を区別するた
めに本明細書中で命名を採用している。HBV表
面抗原遺伝子の翻訳産生物はＳ−プロテインと呼
ばれる。Ｓ−プロテインは配列がその遺伝子のヌ
クレオチド配列から、そして部分配列分析によつ
て推論された226アミノ酸を有する。本明細書で
用いられるHBsAgは感染した患者の血清におよ
びアレキサンダー細胞、合成して22nmHBsAg粒
子を分泌する肝細胞癌の細胞系に見出される
HBVの主な表面抗原成分を包含する（アレキサ
ンダー．J.J.等、S.Afr.Med.J.第50巻、第1124頁
（1976年）。Ｓ−プロテインおよびHBsAgの両方
とも抗原性であるが、後者は抗−HBV抗体に対
してより反応性であり、さらに免疫原性とみなさ
れる。HBsAgの構造は十分に特徴づけられてお
らず、種々の変性段階の抗原性および免疫原性に
対する寄与が十分に理解されていないことから、
HBsAgなる用語は二量化、グリコシル化および
粒子集合を包含するが、それらに限定されない抗
原性および免疫原特性に貢献するＳ−プロテイン
のあらゆる変性形態を包含するために本明細書中
で用いられる。 本発明は酵母におけるHBsAgの合成に関する
ものである。酵母プロモーター、ADH1からなる
酵母表現媒介体が構成されている。可能な163ア
ミノ酸前配列を除くＳ−プロテインにコードづけ
ているHBVゲノムの部品は酵母表現媒介体に運
搬されている。 記載した酵母媒介体を用いて酵母による
HBsAgの成功した合成が得られている。産生物
は抗原性（抗HBsAgと反応）であり、HBV感染
患者の血清中におよびアレキサンダー細胞中に見
出されるものと電子顕微鏡外観で一致している
が、より小さな粒子サイズ直径を有する粒子と結
合される実質的部分が見出される。酵母によつて
合成されたHBsAgは蔗糖勾配沈降によつて測定
される通り、アレキサンダー細胞から精製される
精製天然HBsAg粒子と同様の沈降行動を有する。
本発明は微生物の異種DNAコードづけ部分の表
現から生じる高配列多成分構造の合成および集合
を示すものである。 本発明は異種宿主のウイルス蛋白の生合成およ
び粒子組立の第一段階であると思われ、そこで異
種宿主（この場合酵母）は正常宿主（人）から進
化の度合で除去される。本発明は酵母に対する自
律的複製DNA運搬媒介体の発育によつておよび
細菌のHBVゲノムのクローニングおよび特徴づ
けによつても可能であつた。本発明において酵母
ADH1遺伝子に対するプロモーターは高レベルの
挿入Ｓ−プロテインコードづけ部の転写を提供す
るために用いられた。原則としてあらゆる酵母プ
ロモーターが好適に高レベルの転写を提供する活
性プロモーターよりも使用することができた。酵
母の他の適当な活性プロモーターはグリセルアル
デヒド３−ホスフエート脱水素酵素、アルドラー
ゼ、ピルベートキナーゼおよびホスフオグリセレ
ートキナーゼに対するものを包含する。HBV Ｓ
−プロテインプロモーターのような異種プロモー
ターもまた使用することができる。しかしなが
ら、現在酵母プロモーターの使用が好適である。 核抗原のようなHVの他の蛋白もまた本発明の
原理および技術を使用して合成される。それ以上
に本発明は後翻訳処理がグリコシル化、粒子組立
および恐らく特異蛋白開裂反応を包含する生物学
的機能最終生産物を生成するために望まれるあら
ゆる系で適用することができ特に有利である。 Ｓ−プロテイン遺伝子は翻訳の開始に三つの潜
在点を有する。最初の二つは約70および90塩基対
を推定のHBV Ｓ−プロテインプロモーターから
定めたAUGコードンである。成熟Ｓ−プロテイ
ンの公知のコードづけ配列を始める三番目は各々
一番目および二番目から522および489塩基対にあ
る。それゆえ三番目の出発点はHBV Ｓ−プロテ
インプロモーターからかなり離れている。現在
AUGコードンが翻訳の実際の出発点であること
は知られていない。翻訳が第一または第二潜在出
発コードンで開始される場合、転写は後翻訳処理
によつて除去されねばならない163アミノ酸の異
常に長い前駆物のコードづけ配列からなるか、あ
るいは後翻訳処理で除去される異常なイントロン
を構成する。第三AUGが実際の開始点である場
合には、そのときプロモーターと出発コードン間
に異常に大きな間隔がある。 本明細書中に表わされるデータはＹ−HBsAg
がHBsAgに微粒子物、免疫学的交互反応等価物
であり、電子顕微鏡での形態外観がHBsAgと同
様であるけれどもいくつかの方法で後者と異なる
ことを示す。その上、Ｙ−HBsAgが少なくとも
HBsAgのように単位重量当り抗原性であり、Ｙ
−HBsAgげつ歯類および霊長類のHBsAgに反応
する抗体を惹起するHBsAgのように少なくとも
有効であることができることを示している。 Ｓ−プロテインコードづけ部分の表現割合は
種々の手段で高めることができる。これらは翻訳
開始の割合を最高に利用するためにプロモーター
とコードづけ部分の出発コードンとの間の間隔を
利用する表現媒介体を変更することを包含する。
コードづけ部分の停止コードンに続く3′未翻訳部
の点で転写の読み終りを指令する読み終り暗号配
列の付加が恐らくmRNA転写を安定化すること
によつて表現を高める。読み終り信号がなくて
3′未翻訳部の長さの利用が表現を高めることが観
察されている。 媒介体の安定性を高める手段の採用もまた培養
からの表現産生物の収量を増大する。酵母のクロ
ーニングに適応した多くの媒介体は例えばトリプ
トフアンのない培地中trp1-宿主の増殖を可能に
するTRP1遺伝子を包含することによつて選択圧
下形質転換酵母細胞の増殖を保証する遺伝標識を
包含する。かかる媒介体を含有する宿主細胞培養
は非選択条件下で増殖する場合、特に高細胞密度
に増殖する場合かなり多数の未形質転換分離物を
含有することができる。それゆえ、高密度に増殖
させ未形質転換分離物の割合を最少にするために
選択条件下増殖を必要としない表現媒介体を使用
することが有利である。天然の２環プラスミドの
実質的部分を含有する媒介体は前に2μ環が欠け
ている宿主細胞に形質転換される場合に高細胞密
度でさえも未形質転換細胞の最少分離物で安定に
複製することができる。かかる宿主菌株は環ゼロ
（cirD）菌株と呼ばれる。さらに低細胞密度での
細胞増殖速度はＳ−プロテインコードづけ部の表
現が初期にミドルログ相になるような希薄培養で
最小になり、次に高細胞速度で最大表現に対して
向けられるようにプロモーターに調節制御をとり
込むことによつて増大することができる。このよ
うな調節方法は発酵法における細胞増殖の効率を
高め、さらに未形質転換細胞の分離頻度を低減す
る。 次の実施例において多くの技術、反応および分
離操作はすでに当該技術でよく知られている。特
にことわらない限り、酵素はすべて典型的な二、
三を言及するためにニユーイングランドバイオラ
トリーズ、ベバーリー、マサチユセツツ、コラボ
レイテイブリサーチ、ウオルサム、マサチユセツ
ツ、マイルスラボラトリース、エルクハルト、イ
ンデイアナ、ボエリンガーバイオケミカルスInc.
インデイアナポリス、インデアナおよびベセスダ
リサーチラボラトリー、ロツクビル、マリーラン
ドのような１種またはそれ以上の市販のものから
利用される。制限酵素消化に対する緩衝液および
反応条件は各酵素の製造業者によつて供給される
勧告に従つて用いられた。制限酵素での部分消化
は各酵素バツチに対して予備的実験から予め決定
された低下酵素濃度を用いて行なわれた。他の酵
素反応、ゲル電気泳動分離および大腸菌形質転換
に対する標準方法はMethods in Enzymology，
第68巻，Ray Wu版，アカデミツクプレス（1979
年）に見い出すことができる。酵母原形質体の形
質転換は実質的にベツグによつて記載される通り
実施した（Nature第275巻，第104〜109頁（1978
年）。 形質転換に有用な大腸菌株はX1776，K12菌株
294（ATCC No.31446），RR1およびHB101を包
含する。遺伝子型（ａ ade2 ade6 leu2 lys1
can1）およびGM−3C−２，フアエ，Ｇ等、
Proc.Nat.Acad.Sci.USA 第78巻，第2258頁
（1981年）遺伝子型、（α Leu2 Trp1 His4
CYC1−１ CYP3−１）を有する酵母菌株
XV610−8Cを酵母形質転換に対して用いた。ミ
ラー．J.H.のExperiments in Molecular
Genetics，コールドスプリングハーバーラボラト
リー、コールドスプリングハーバー、N.Y.（1972
年）に記載される操作に従つて細菌を増殖し、選
択した。酵母を次の培地で増殖した。酵母エキス
１％（Ｗ／Ｖ）、ペプトン２％（Ｗ／Ｖ）および
グルコース２％（Ｗ／Ｖ）を含有するYEPDおよ
び平板培地の場合には寒天３％（Ｗ／Ｖ）。酵母
窒素塩基（ジフコラボラトリース、ミネアポリ
ス、ミネソタ）6.7ｇ、アデニン10mg、ウラシル
10m、カサミノ酸（CAA）５ｇ（ジフコ）、グル
コース20ｇを含有するYNBプラスCAAおよび平
板培地の場合には１当り寒天30ｇ。トリプトフ
アン原栄養の選択は酵母窒素塩基（アミノ酸欠
如）6.7ｇを含有するプレート上で行ない、トリ
プトフアンを除く形質転換される菌株の全増殖必
要量に対して補足した。 実施例 １ 酵母媒介体の構造 一つがars1複製原点他が2μ環複製原点からなる
二つの酵母媒介体を作製した。 プラズミドpFRP−921は前にヒツエマン等の
Nature第293巻、第717頁（1981年）に記載され
ている。媒介体はヌクレオチド配列の−９位置の
後で終結される921と呼ばれるADH1プロモータ
ー部分とともにアムピシリンおよびテトラサイク
リン耐性遺伝子および細菌プラスミドpBR322の
複製原点、酵母ars1複製原点およびtrp1遺伝子を
含有する。pFRP−921地図を第１図に示す。 プラズミドpMA56は細胞プラスミドpBR322、
酵母の選択に対する酵母trp1遺伝子、酵母2μ環複
製原点およびヌクレオチド−15後3′−末端で終結
される906と呼ばれるADH1プロモーター部分の
配列を含有する。pMA56の段階および構造は次
の通り略述され第２図に図示する。 pBR322のEcoRIサイトに挿入される酵母trp1
およびars1配列を含有するプラスミドYRp7′（ス
チンクコーム．D.T.等、Nature第282巻、第39頁
（1979年））を出発物質として用いた。酵母配列挿
入の結果としてプラスミドは二つのEcoRI位置を
含有する（第２図）。これらの一つを１分子当り
二つの位置の一つだけを平均して消化するために
EcoRIエンドヌクレアーゼで部分消化によつて欠
失させた。線状分子の生成した不対終未をDNA
ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）による
接触作用をおよぼす反応によつて充填し、生成し
たブランド（blunt）未端を閉鎖環状DNA分子を
再株化するためにDNAリカーゼ接触作用をおよ
ぼす反応によつて連結した。pFRTと呼ばれる生
成プラスミドの一つをars1部に隣接するEcoRI位
置を保持するために選択された。 第２図に示される通り、ars1複製原点はPstI位
置およびEcoRI位置によつて結合された。同時に
2μ環複製原点を含有するプラスミドYEp13（上記
ブローチ等）は同様にPstI位置およびEcoRI位置
によつて結合された。それゆえPstIおよびEcoRI
エンドヌクレアーゼによるpFRTおよびYEp13の
開裂は各々pFRTから酵母複製原点のない大線状
フラグメントとYEp13から2μ環複製原点からな
る小DNAフラグメントを生成した。プラスミド
pFRTを部分消化条件下PstIエンドヌクレアーゼ
で消化してアムピシリン耐性遺伝子内のpstI位置
での開裂頻度を低下させた。所望のフラグメント
を分取用ゲル電気泳動によつて精製し、DNAリ
ガーゼ接触作用を及ぼす反応で共に混合し、共有
連結させた。pMW5と呼ばれる生成プラスミド
をアムピシリン耐性を与えることができるとして
選択した。 ADH1フラグメント906をBamHIとEcoRI位置
の間のpBR322に挿入した。プロモーターフラグ
メントをBamHIおよびEcoRIエンドヌクレアー
ゼで消化して放出した。1.5キロベースのフラグ
メント、ADH1−906フラグメントを分取用ゲル
電気泳動で分離した。プラスミドMW5を同様に
EcoRIおよびBamHIエンドヌクレアーゼで消化
した。EcoRI−特異終末およびBamHI−特異終
末を有する大フラグメントを分取用ゲル電気泳動
で分離し、ADH1−906フラグメントと混合し、
DNA接触作用を及ぼす反応で共有的に連結させ
た。pMA56と呼ばれ、第２図に図示した生成プ
ラスミドを大腸菌のアムピシリン耐性によつて選
択した。 プラスミドpFRP−921およびpMA56は構造上
同じであり、各々ars1複製原点（pFRP−921）
または2μ環複製原点（pMA56）を有することで
本来異なつている。さらに、APH1プロモーター
フラグメントが記載したようにわずかに異なる。
両方とも細菌複製原および大腸菌の増殖に対する
選択標識を有することで類似している。両方とも
酵母trp1宿主細胞で選択することができる酵母
TRP1遺伝子を含有する。 実施例 ２ Ｓ−プロテインコードづけ部を含有する酵母プ
ラスミドの構造 HBV DNAのヌクレオチド配列の分析はＳ−
プロテインコードづけ部の位置を示すAnimal
Virus Geneticsアカデミツクプレス、ニユーヨ
ーク，N.Y.（1980年）、第57頁〜70頁でバレンツ
ラ．P.等によつて報告されている。部位は835塩
基対の長さのTacI−HpaIフラグメント内に含有
する。このフラグメントはＳ−プロテインのＮ−
末端メチオニンに対するAUGコードンの前にあ
る26塩基対を包含する（上記で記載した推定前配
列にコードづけている部位のほとんど、並びに最
初の二つのAUGコードンはTacI−HpaIフラグ
メントからなくなつている。）。フラグメントはま
た完全なＳ−プロテインコードづけ部（678bp）、
TAA停止コードンおよび停止コードンに続く
128bpを含有する。
らされる酵母によるヒトのＢ型肝炎ウイルス
（HBV）の抗原の生合成に関するものである。Ｂ
型肝炎ウイルスは世界的な公衆衛生の主な問題と
して認識されている。ウイルス肝炎の広範囲にわ
たる発生率および無症候性保菌者状態の残存のほ
かにＢ型肝炎ウイルスは肝細胞癌の病因に含意さ
れている。Ｂ型肝炎ウイルスの分子生物学の最近
の再調査に関してチオライス．P.等のScience第
213巻、第406頁（1981年）を参照。 この研究の主な努力はウイルス感染に対する防
御免疫性をそなえるための適当なワクチンを産生
することである。適当なワクチンを製造するため
の一方策はウイルスの主な抗原成分、表面抗原を
精製するための試みを包含していた。以下完全な
ウイルス（デイン粒子）の製剤から得られ、ある
いは肝炎保菌者の血清から精製されるHBV表面
抗原と一致する記号HBsAgを用いる。スケリー．
J.等のNature第290巻、第51頁（1981年）は精製
HBsAgの水溶性蛋白質ミセルの精製を報告して
いる。この方法の重要な制限は、製造することが
できる物質の量が供給者の有効性に依存するとい
うことである。培養でウイルスを増殖するための
技術は知られていない、それ故源泉物質の量の制
限のほかに供給者の血清の活性ウイルスまたは他
の成分でのワクチンの汚染の危険および様々な供
給者から得られる生産物に起こりうる異質があ
る。 第二の方法は表面抗原（Ｓ−プロテイン）から
なる蛋白質のアミノ酸配列および最も適当な抗原
決定子を予測するモデル研究に基づくHBsAgに
対する抗体を惹起するペプチドを合成する試みで
あつた。例えばR.A.ラーナー等のPro.Nat.Acad.
Sci.USA第78巻、第3403頁（1981年）参照。かか
る作業は非常に予備的な段階にあり、その方法が
価格に有効な方法で実用的な程度の免疫性を有す
る抗原を生産することができるかどうかを評価す
ることは困難である。 組換型DNA技術を使用する第三の方法は他の
ウイルス遺伝子生産物のないＳ−プロテイン、
HBsAgまたは免疫学的反応性等価物を大量に生
産するために微生物に遺伝的能力を与えることに
よつて微生物によるＳ−プロテイン、HBsAgま
たは免疫学的反応性等価物の合成である。この方
法はウイルスまたは他のウイルス成分による汚染
の可能性を除去し、規模の節約で大規模な生産を
可能にする。さらにその上遺伝子物質の適当な操
作により、副作用を変性するかまたはワクチンを
多価にするためにワクチンからなる蛋白質の配列
を変更することができる。この目的に対して
HBVの完全なゲノムが大腸菌でクローンされて
おり、完全なヌクレオチド配列が決定されている
（チヤーナイ．P.等Nucl.Acid Res.第７巻、第
335頁（1979年）、ガリベルト．F.等、Nature第
281巻、第646頁（1979年）、バレンツエラ．P.等、
Animal Virus Genetics（B.フイールズ、R.ジヤ
エニツシユおよびCFFox版）Academic Press，
ニユーヨーク，N.Y.（1980年）第57頁）。ゲノム
の単一部位はＳ−プロテインに対する、そしてま
た163アミノ酸の大きな予備配列に対するコード
に見出された。HBsAgの構造は二硫酸塩分子間
結合によつて連結した２本のＳ−プロテイン鎖か
らなると考えられ、さらに二硫酸塩分子間結合に
よつて指示された確認に適用できる。２本の鎖の
１本はグリコシル化されていると思われる。保菌
者の血清中、HBsAgはしばしばまさに記載した
Ｓ−プロテイン二量体の集合体とみなされる平均
直径22nmを有する球形粒子の形態と見られ、恐
らく脂質を含有する。ウイルスエンベロープにお
いてHBsAgは脂質含有ウイルスエンベロープと
結合し、宿主細胞の膜成分から誘導されると考え
られる。 HBsAgの抗原性および免疫原性はいくつかの
因子に依存し、そのすべてが十分に理解されてい
ない。二硫酸塩結合の減力が抗原性および免疫原
性を著しく低下することが観察されている（ミク
ロ．S.等、J.Immunol第124巻、第1589頁（1980
年））それ故分子内および分子間の二硫酸塩結合
によつて与えられる第三配置が抗原性および免疫
性に貢献するものと考えられる。グリコシル化の
範囲および性質および脂質との結合のような他の
因子の寄与は不明であるが、ある程度すべてが貢
献するものと考えられる。上記で言及した22nm
のような粒子への集合が免疫原性を高めるために
重大に貢献するものと考えられる。 Ｓ−プロテインは融合蛋白質の形態に大腸菌で
合成されている（エドマン．J.C.等、Nature第
291巻、第503頁（1981年））。産生物はプレ−βラ
クタマースの183アミノ酸、５〜10グリシン残渣
およびアミン末端の22アミノ酸のないＳ−プロテ
インの204アミノ酸を包含している。融合蛋白質
は抗HBsAgIgGで免疫沈降可能であつた。 Ｓ−プロテイン二量体（上記ミシロ等）および
HBsAgを混和する22nm粒子（カブラル．G.A.
等、J.Gen.Viro1第38巻、第339頁（1978年））が
関連Ｓ−プロテインより抗原性であることが知ら
れていることから、HBsAgまたは免疫学的反応
性等価物を直接に実質的な量で生産することがで
きる生物学的系を見出すことは非常に望ましい。 Ｓ−プロテインをHBsAgにまたは22nm粒子に
転化する段階は十分に理解されておらず、また宿
主特異性がどの程度であるかも知られていない。
さらに、その上Ｓ−プロテイン遺伝子は機能の意
味があるとしても知られていない163アミノ酸の
異常に長い予備配列に対してコードしているよう
に思われる。事実予備配列がウイルス感染細胞で
実際に翻訳されるかどうか知られていない。酵母
（サツカロミセスセレビシアエ）は次の理由で
HBsAgの表現を試みるために宿主細胞として選
択された。酵母は大量に培養で容易に増殖するこ
とができる。事実、大規模な酵母培養の科学的知
識は十分に理解されている。また酵母は真核性で
あり、それで正常な宿主細胞で実施される後翻訳
処理段階のいくつかが酵母で実施されることが望
まれた。Ｓ−プロテインをHBsAgに転化する複
合体後翻訳事象、そのいくつかが宿主特異性であ
るために本明細で採用した術語は、本明細書で開
示される作業から認められる異つた抗原形態を区
別することを意味する。表面抗原に対する構造遺
伝子の未処理翻訳生産物をＳ−プロテインと呼
ぶ。感染した供給者の血漿から、デイン粒子から
またはヒトの肝癌細胞培養から分離される抗原を
HBsAgと呼ぶ。酵母の表面抗原遺伝子の表現生
産物をＹ−HBsAgと呼ぶ。HBsAgの免疫学的反
応性等価物なる用語はＹ−HBsAgが１例である
Ｓ−プロテインまたはその一部からなるあらゆる
免疫学的交互反応性組成物に対する一般用語であ
る。 酵母が前に異なる細菌で正常に増殖するウイル
スの遺伝子の表現に用いられたことはいまだかつ
てなかつた。酵母の異種蛋白質を表現する先行技
術の試みは混合した結果を生じている。それ自身
のプロモーターの制御下ウサギグロビンを表現す
る試みは蛋白質の翻訳に不成功であつたと思われ
る（ベツグ．J.D.等、Nature第283巻、第835頁
（1980年））。シヨウジヨウバエ属遺伝子に対して
コードづけている遺伝子は遺伝相補性のための選
択圧の条件下、酵母ade8突然変異体を補足する
ことができることを報告している。酵母菌株から
の機能蛋白質の分離は報告されなかつた。ヒトの
白血球インターフエロンに対する遺伝子は酵母
ADH1（アルコール脱水素酵素）プロモーターの
制御下酵母で表現されている。その場合、活性蛋
白質の成功した生産は後翻訳工程または成分の組
立てを必要としなかつた。 酵母の運搬および複製に適当なDNA運搬媒介
体が開発された（ブローチ．J.R.等のGene第８
巻、第121頁（1979年）、ハートレイ．J.L.等の
Nature第286巻、第860頁（1980年）。この用途の
ほとんどの酵母媒介体は複製の酵母原点
（origin）を挿入しているpBR322のような大腸菌
媒介体から誘導される。酵母複製原点二つのタイ
プが利用される。通例2μ環として言及される遍
在する天然の酵母プラスミドから誘導される一つ
は酵母染色体DNAと無関係に複製する能力があ
る。媒介体のもう一つの種類は自律複製力も生じ
る酵母染色体複製原点から誘導されるars1（自律
複製配列）と呼ばれる複製原点配列を含有する。
細菌および酵母複製原点の両方が同じ媒介体に存
在するためにどちらの細菌でも用いることができ
る。選択はpBR322のアムピシリンおよびテトラ
サイクリン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝
子の包含によつて細菌系で供給することができ
る。酵母系の選択は典型的には適当な栄養要求宿
主菌株中突然変異を相補する酵母遺伝子を包含す
ることによつて供給することができる。明細書中
に報告される研究はアルコール脱水素酵素
（ADH1）にコードづけている酵母遺伝子から分
離したプロモーターを含有する酵母媒介体を通例
利用する（ベンネツエン．J.L.等、J.Biol.Chem.
第257巻、第3018頁（1981年）。 ADH1プロモーター部は酵母ADH1遺伝子の
5′−側面部から分離された。コードづけ部内の−
1550〜＋17位置から伸びているADH1配列の約
1600塩基対を含有する部分は酵母CYC1コードづ
け配列に融合した。出発特異性を転写する表示さ
れた付着CYC1コードづけ配列の転写の研究は一
つの酵母遺伝子からもう一つの酵母遺伝子まで運
搬することができた。ADHコードづけ部の全部
がない小部分は次に構成され、ヒトのインターフ
エロンの表現で作用することを示している。921
と呼ばれる、かかる部分の１つは−９位置の後終
結し、本研究で使用された。 抗HBsAg抗体と反応する物質がいくつかの形
態で存在するために、これらの形態を区別するた
めに本明細書中で命名を採用している。HBV表
面抗原遺伝子の翻訳産生物はＳ−プロテインと呼
ばれる。Ｓ−プロテインは配列がその遺伝子のヌ
クレオチド配列から、そして部分配列分析によつ
て推論された226アミノ酸を有する。本明細書で
用いられるHBsAgは感染した患者の血清におよ
びアレキサンダー細胞、合成して22nmHBsAg粒
子を分泌する肝細胞癌の細胞系に見出される
HBVの主な表面抗原成分を包含する（アレキサ
ンダー．J.J.等、S.Afr.Med.J.第50巻、第1124頁
（1976年）。Ｓ−プロテインおよびHBsAgの両方
とも抗原性であるが、後者は抗−HBV抗体に対
してより反応性であり、さらに免疫原性とみなさ
れる。HBsAgの構造は十分に特徴づけられてお
らず、種々の変性段階の抗原性および免疫原性に
対する寄与が十分に理解されていないことから、
HBsAgなる用語は二量化、グリコシル化および
粒子集合を包含するが、それらに限定されない抗
原性および免疫原特性に貢献するＳ−プロテイン
のあらゆる変性形態を包含するために本明細書中
で用いられる。 本発明は酵母におけるHBsAgの合成に関する
ものである。酵母プロモーター、ADH1からなる
酵母表現媒介体が構成されている。可能な163ア
ミノ酸前配列を除くＳ−プロテインにコードづけ
ているHBVゲノムの部品は酵母表現媒介体に運
搬されている。 記載した酵母媒介体を用いて酵母による
HBsAgの成功した合成が得られている。産生物
は抗原性（抗HBsAgと反応）であり、HBV感染
患者の血清中におよびアレキサンダー細胞中に見
出されるものと電子顕微鏡外観で一致している
が、より小さな粒子サイズ直径を有する粒子と結
合される実質的部分が見出される。酵母によつて
合成されたHBsAgは蔗糖勾配沈降によつて測定
される通り、アレキサンダー細胞から精製される
精製天然HBsAg粒子と同様の沈降行動を有する。
本発明は微生物の異種DNAコードづけ部分の表
現から生じる高配列多成分構造の合成および集合
を示すものである。 本発明は異種宿主のウイルス蛋白の生合成およ
び粒子組立の第一段階であると思われ、そこで異
種宿主（この場合酵母）は正常宿主（人）から進
化の度合で除去される。本発明は酵母に対する自
律的複製DNA運搬媒介体の発育によつておよび
細菌のHBVゲノムのクローニングおよび特徴づ
けによつても可能であつた。本発明において酵母
ADH1遺伝子に対するプロモーターは高レベルの
挿入Ｓ−プロテインコードづけ部の転写を提供す
るために用いられた。原則としてあらゆる酵母プ
ロモーターが好適に高レベルの転写を提供する活
性プロモーターよりも使用することができた。酵
母の他の適当な活性プロモーターはグリセルアル
デヒド３−ホスフエート脱水素酵素、アルドラー
ゼ、ピルベートキナーゼおよびホスフオグリセレ
ートキナーゼに対するものを包含する。HBV Ｓ
−プロテインプロモーターのような異種プロモー
ターもまた使用することができる。しかしなが
ら、現在酵母プロモーターの使用が好適である。 核抗原のようなHVの他の蛋白もまた本発明の
原理および技術を使用して合成される。それ以上
に本発明は後翻訳処理がグリコシル化、粒子組立
および恐らく特異蛋白開裂反応を包含する生物学
的機能最終生産物を生成するために望まれるあら
ゆる系で適用することができ特に有利である。 Ｓ−プロテイン遺伝子は翻訳の開始に三つの潜
在点を有する。最初の二つは約70および90塩基対
を推定のHBV Ｓ−プロテインプロモーターから
定めたAUGコードンである。成熟Ｓ−プロテイ
ンの公知のコードづけ配列を始める三番目は各々
一番目および二番目から522および489塩基対にあ
る。それゆえ三番目の出発点はHBV Ｓ−プロテ
インプロモーターからかなり離れている。現在
AUGコードンが翻訳の実際の出発点であること
は知られていない。翻訳が第一または第二潜在出
発コードンで開始される場合、転写は後翻訳処理
によつて除去されねばならない163アミノ酸の異
常に長い前駆物のコードづけ配列からなるか、あ
るいは後翻訳処理で除去される異常なイントロン
を構成する。第三AUGが実際の開始点である場
合には、そのときプロモーターと出発コードン間
に異常に大きな間隔がある。 本明細書中に表わされるデータはＹ−HBsAg
がHBsAgに微粒子物、免疫学的交互反応等価物
であり、電子顕微鏡での形態外観がHBsAgと同
様であるけれどもいくつかの方法で後者と異なる
ことを示す。その上、Ｙ−HBsAgが少なくとも
HBsAgのように単位重量当り抗原性であり、Ｙ
−HBsAgげつ歯類および霊長類のHBsAgに反応
する抗体を惹起するHBsAgのように少なくとも
有効であることができることを示している。 Ｓ−プロテインコードづけ部分の表現割合は
種々の手段で高めることができる。これらは翻訳
開始の割合を最高に利用するためにプロモーター
とコードづけ部分の出発コードンとの間の間隔を
利用する表現媒介体を変更することを包含する。
コードづけ部分の停止コードンに続く3′未翻訳部
の点で転写の読み終りを指令する読み終り暗号配
列の付加が恐らくmRNA転写を安定化すること
によつて表現を高める。読み終り信号がなくて
3′未翻訳部の長さの利用が表現を高めることが観
察されている。 媒介体の安定性を高める手段の採用もまた培養
からの表現産生物の収量を増大する。酵母のクロ
ーニングに適応した多くの媒介体は例えばトリプ
トフアンのない培地中trp1-宿主の増殖を可能に
するTRP1遺伝子を包含することによつて選択圧
下形質転換酵母細胞の増殖を保証する遺伝標識を
包含する。かかる媒介体を含有する宿主細胞培養
は非選択条件下で増殖する場合、特に高細胞密度
に増殖する場合かなり多数の未形質転換分離物を
含有することができる。それゆえ、高密度に増殖
させ未形質転換分離物の割合を最少にするために
選択条件下増殖を必要としない表現媒介体を使用
することが有利である。天然の２環プラスミドの
実質的部分を含有する媒介体は前に2μ環が欠け
ている宿主細胞に形質転換される場合に高細胞密
度でさえも未形質転換細胞の最少分離物で安定に
複製することができる。かかる宿主菌株は環ゼロ
（cirD）菌株と呼ばれる。さらに低細胞密度での
細胞増殖速度はＳ−プロテインコードづけ部の表
現が初期にミドルログ相になるような希薄培養で
最小になり、次に高細胞速度で最大表現に対して
向けられるようにプロモーターに調節制御をとり
込むことによつて増大することができる。このよ
うな調節方法は発酵法における細胞増殖の効率を
高め、さらに未形質転換細胞の分離頻度を低減す
る。 次の実施例において多くの技術、反応および分
離操作はすでに当該技術でよく知られている。特
にことわらない限り、酵素はすべて典型的な二、
三を言及するためにニユーイングランドバイオラ
トリーズ、ベバーリー、マサチユセツツ、コラボ
レイテイブリサーチ、ウオルサム、マサチユセツ
ツ、マイルスラボラトリース、エルクハルト、イ
ンデイアナ、ボエリンガーバイオケミカルスInc.
インデイアナポリス、インデアナおよびベセスダ
リサーチラボラトリー、ロツクビル、マリーラン
ドのような１種またはそれ以上の市販のものから
利用される。制限酵素消化に対する緩衝液および
反応条件は各酵素の製造業者によつて供給される
勧告に従つて用いられた。制限酵素での部分消化
は各酵素バツチに対して予備的実験から予め決定
された低下酵素濃度を用いて行なわれた。他の酵
素反応、ゲル電気泳動分離および大腸菌形質転換
に対する標準方法はMethods in Enzymology，
第68巻，Ray Wu版，アカデミツクプレス（1979
年）に見い出すことができる。酵母原形質体の形
質転換は実質的にベツグによつて記載される通り
実施した（Nature第275巻，第104〜109頁（1978
年）。 形質転換に有用な大腸菌株はX1776，K12菌株
294（ATCC No.31446），RR1およびHB101を包
含する。遺伝子型（ａ ade2 ade6 leu2 lys1
can1）およびGM−3C−２，フアエ，Ｇ等、
Proc.Nat.Acad.Sci.USA 第78巻，第2258頁
（1981年）遺伝子型、（α Leu2 Trp1 His4
CYC1−１ CYP3−１）を有する酵母菌株
XV610−8Cを酵母形質転換に対して用いた。ミ
ラー．J.H.のExperiments in Molecular
Genetics，コールドスプリングハーバーラボラト
リー、コールドスプリングハーバー、N.Y.（1972
年）に記載される操作に従つて細菌を増殖し、選
択した。酵母を次の培地で増殖した。酵母エキス
１％（Ｗ／Ｖ）、ペプトン２％（Ｗ／Ｖ）および
グルコース２％（Ｗ／Ｖ）を含有するYEPDおよ
び平板培地の場合には寒天３％（Ｗ／Ｖ）。酵母
窒素塩基（ジフコラボラトリース、ミネアポリ
ス、ミネソタ）6.7ｇ、アデニン10mg、ウラシル
10m、カサミノ酸（CAA）５ｇ（ジフコ）、グル
コース20ｇを含有するYNBプラスCAAおよび平
板培地の場合には１当り寒天30ｇ。トリプトフ
アン原栄養の選択は酵母窒素塩基（アミノ酸欠
如）6.7ｇを含有するプレート上で行ない、トリ
プトフアンを除く形質転換される菌株の全増殖必
要量に対して補足した。 実施例 １ 酵母媒介体の構造 一つがars1複製原点他が2μ環複製原点からなる
二つの酵母媒介体を作製した。 プラズミドpFRP−921は前にヒツエマン等の
Nature第293巻、第717頁（1981年）に記載され
ている。媒介体はヌクレオチド配列の−９位置の
後で終結される921と呼ばれるADH1プロモータ
ー部分とともにアムピシリンおよびテトラサイク
リン耐性遺伝子および細菌プラスミドpBR322の
複製原点、酵母ars1複製原点およびtrp1遺伝子を
含有する。pFRP−921地図を第１図に示す。 プラズミドpMA56は細胞プラスミドpBR322、
酵母の選択に対する酵母trp1遺伝子、酵母2μ環複
製原点およびヌクレオチド−15後3′−末端で終結
される906と呼ばれるADH1プロモーター部分の
配列を含有する。pMA56の段階および構造は次
の通り略述され第２図に図示する。 pBR322のEcoRIサイトに挿入される酵母trp1
およびars1配列を含有するプラスミドYRp7′（ス
チンクコーム．D.T.等、Nature第282巻、第39頁
（1979年））を出発物質として用いた。酵母配列挿
入の結果としてプラスミドは二つのEcoRI位置を
含有する（第２図）。これらの一つを１分子当り
二つの位置の一つだけを平均して消化するために
EcoRIエンドヌクレアーゼで部分消化によつて欠
失させた。線状分子の生成した不対終未をDNA
ポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）による
接触作用をおよぼす反応によつて充填し、生成し
たブランド（blunt）未端を閉鎖環状DNA分子を
再株化するためにDNAリカーゼ接触作用をおよ
ぼす反応によつて連結した。pFRTと呼ばれる生
成プラスミドの一つをars1部に隣接するEcoRI位
置を保持するために選択された。 第２図に示される通り、ars1複製原点はPstI位
置およびEcoRI位置によつて結合された。同時に
2μ環複製原点を含有するプラスミドYEp13（上記
ブローチ等）は同様にPstI位置およびEcoRI位置
によつて結合された。それゆえPstIおよびEcoRI
エンドヌクレアーゼによるpFRTおよびYEp13の
開裂は各々pFRTから酵母複製原点のない大線状
フラグメントとYEp13から2μ環複製原点からな
る小DNAフラグメントを生成した。プラスミド
pFRTを部分消化条件下PstIエンドヌクレアーゼ
で消化してアムピシリン耐性遺伝子内のpstI位置
での開裂頻度を低下させた。所望のフラグメント
を分取用ゲル電気泳動によつて精製し、DNAリ
ガーゼ接触作用を及ぼす反応で共に混合し、共有
連結させた。pMW5と呼ばれる生成プラスミド
をアムピシリン耐性を与えることができるとして
選択した。 ADH1フラグメント906をBamHIとEcoRI位置
の間のpBR322に挿入した。プロモーターフラグ
メントをBamHIおよびEcoRIエンドヌクレアー
ゼで消化して放出した。1.5キロベースのフラグ
メント、ADH1−906フラグメントを分取用ゲル
電気泳動で分離した。プラスミドMW5を同様に
EcoRIおよびBamHIエンドヌクレアーゼで消化
した。EcoRI−特異終末およびBamHI−特異終
末を有する大フラグメントを分取用ゲル電気泳動
で分離し、ADH1−906フラグメントと混合し、
DNA接触作用を及ぼす反応で共有的に連結させ
た。pMA56と呼ばれ、第２図に図示した生成プ
ラスミドを大腸菌のアムピシリン耐性によつて選
択した。 プラスミドpFRP−921およびpMA56は構造上
同じであり、各々ars1複製原点（pFRP−921）
または2μ環複製原点（pMA56）を有することで
本来異なつている。さらに、APH1プロモーター
フラグメントが記載したようにわずかに異なる。
両方とも細菌複製原および大腸菌の増殖に対する
選択標識を有することで類似している。両方とも
酵母trp1宿主細胞で選択することができる酵母
TRP1遺伝子を含有する。 実施例 ２ Ｓ−プロテインコードづけ部を含有する酵母プ
ラスミドの構造 HBV DNAのヌクレオチド配列の分析はＳ−
プロテインコードづけ部の位置を示すAnimal
Virus Geneticsアカデミツクプレス、ニユーヨ
ーク，N.Y.（1980年）、第57頁〜70頁でバレンツ
ラ．P.等によつて報告されている。部位は835塩
基対の長さのTacI−HpaIフラグメント内に含有
する。このフラグメントはＳ−プロテインのＮ−
末端メチオニンに対するAUGコードンの前にあ
る26塩基対を包含する（上記で記載した推定前配
列にコードづけている部位のほとんど、並びに最
初の二つのAUGコードンはTacI−HpaIフラグ
メントからなくなつている。）。フラグメントはま
た完全なＳ−プロテインコードづけ部（678bp）、
TAA停止コードンおよび停止コードンに続く
128bpを含有する。
【表】
TacI 〓
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 酵母複製原点、酵母由来のプロモーター、前
記プロモーターと正しい配置にあるＢ型肝炎ウイ
ルスの表面プロテインをコードするDNA部分を
含む酵母運搬ベクターにより形質転換された酵母
属細胞を増殖させ、この酵母細胞からの酵母Ｂ型
肝炎表面抗原を精製することにより得られ得る酵
母Ｂ型肝炎表面抗原粒子。 ２ 前記酵母由来のプロモーターが、酵母ADH1
プロモーターであることを特徴とする特許請求の
範囲第１項に記載の酵母Ｂ型肝炎表面抗原粒子。 ３ 前記酵母由来のプロモーターが、酵母グリセ
ルアルデヒド−３−ホスフエート脱水素酵素プロ
モーターであることを特徴とする特許請求の範囲
第１項に記載の酵母Ｂ型肝炎表面抗原粒子。 ４ 前記酵母運搬ベクターが、酵母2μ環状プラ
スミドのEcoRI−SphI消化断片のうちの長い方を
含むことを特徴とする特許請求の範囲第１項ない
し第３項のいずれかに記載の酵母Ｂ型肝炎表面抗
原粒子。 ５ 前記酵母運搬ベクターが、前記断片の転写方
向に見て表面プロテインをコードするDNA部分
に続く酵母ターミネーター部分を含むことを特徴
とする特許請求の範囲第１項ないし第４項のいず
れかに記載の酵母Ｂ型肝炎表面抗原粒子。 ６ 前記酵母運搬ベクターが、酵母形質転換体の
選択を可能にする酵母遺伝子をさらに含むことを
特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第５項の
いずれかに記載の酵母Ｂ型肝炎表面抗原粒子。 ７ 前記酵母運搬ベクターが、酵母trp1遺伝子を
含み、酵母株がTrp1であることを特徴とする特
許請求の範囲第１項ないし第６項のいずれかに記
載の酵母Ｂ型肝炎表面抗原粒子。 ８ 前記酵母運搬ベクターが、バクテリア複製原
点をさらに含むことを特徴とする特許請求の範囲
第１項ないし第７項のいずれかに記載の酵母Ｂ型
肝炎表面抗原粒子。 ９ 形質転換された酵母株が、 −ATCC寄託番号20647で得られるAB35−14D／
pHBS16−３ −ATCC寄託番号20646で得られるAB35−14D／
pHBS16−４ −ATCC寄託番号20645で得られるAB35−14D／
pHBS16−５ −2150−２−３／pHBS−56 −ATCC寄託番号20649で得られる2150−２−
３／pHBS−56−３ −ATCC寄託番号20650で得られる2150−２−
３／pHBS−56−５ から選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第
１項ないし第８項のいずれかに記載の酵母Ｂ型肝
炎表面抗原粒子。 １０ Ｂ型肝炎表面抗原に対して選ばれたモノク
ロナール抗体とは結合しない、特許請求の範囲第
１項ないし第９項のいずれかに記載の酵母Ｂ型肝
炎表面抗原粒子。 １１ 前記酵母Ｂ型肝炎表面抗原粒子が実質的に
糖鎖付与のないペプチドから成る、特許請求の範
囲第１項ないし第１０項のいずれかに記載の酵母
Ｂ型肝炎表面抗原粒子。 １２ 酵母複製原点、酵母由来のプロモーター、
前記プロモーターと正しい配置にあるＢ型肝炎ウ
イルスの表面プロテインをコードするDNA部分
を含む酵母運搬ベクターにより形質転換された酵
母属細胞を増殖させ、この酵母細胞からの酵母Ｂ
型肝炎表面抗原を精製することにより得られ得る
酵母Ｂ型肝炎表面抗原粒子を、生理的に許容され
る媒体中に含むワクチン。 １３ 前記酵母運搬ベクターが、酵母2μ環状プ
ラスミドのEcoRI−SphI消化断片のうちの長い方
を含む特許請求の範囲第１２項に記載のワクチ
ン。
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