JPS5877823A - 酵母ｂ型肝炎表面抗原粒子及びワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 もたらされる酵母によるヒトのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢ
Ｖ）の抗原の生合成に関するものである。Ｂ型肝炎ウイ
ルスは世界的な公衆衛生の主な問題として認識されてい
る。ウィルス肝炎の広範囲にわたる発生率および無症候
性保菌者状態の残存のほかにＢ型肝炎ウイルスは肝細胞
癌の病因に含意されている。Ｂ型肝炎ウイルスの分子生
物学の最近の再調査に関してチオライス．Ｐ．等のＳｃ
ｉｅｎｃｅ牙２１３巻、牙４０６頁（１９８１年）を参
照。

この研究の主な努力はウィルス感染に対する防御免疫性
をそなえるだめの適当なワクチンを産生ずることである
。適当なワクチンを製造するだめの一方策はウィルスの
主な抗原成分、表面抗原を精製するだめの試みを包含し
ていた。以下完全なウィルス（ディン粒子）の製剤から
得られ、あるいは肝炎保菌者の血清から精製されるＨＢ
Ｖ表面抗原と一致する記号ＨＢＳＡｇを用いる。スケ′
リー．Ｊ．等のＮａｔｕｒｅ牙２９０巻、矛５１頁（１
　９８１年）は精製ＨＢＳＡｇの水溶性蛋白質ミセルの
精製を報告している。この方法の重要な制限は、製造す
ることができる物質の量が供給者の有効性に依存すると
いうことである。培養でウィルスを増殖するための技術
は知られていない、それ故源泉物質の量の制限のほかに
供給者の血清の活性ウィルスまたは池の成分でのワクチ
ンの汚染の危険およ゛び様々な供給者から得られる生産
物に起こりうる異質がある。

オニの方法は表面抗原（Ｓ−プロティン）からなる蛋白
質のアミノ酸配列および最も適当な抗原決定子を予測す
るモデル研究に基つ（　ＨＢＳＡｇに対する抗体を一起
するペプチドを合成する試みであった。例えばＲ．Ａ．
ラーナー等のＰｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ矛７８巻、矛６４０３頁（１９８１年〕参照。かか
る作業は非常に予備的な段階にあり、その方法が価格に
有効な方法で実用的な程度の免疫性を有する抗原を生産
することができるかどうかを評価することは困難である
。

組換型ＤＮＡ技術を使用するオニの方法は他のウィルス
遺伝子生産物のないＳ−プロティン、ＨＢＳＡｇまたは
免疫学的反応性等価物を大量に生産するために微生物置
遺伝的能力を与えることによって微生物によるＳ−プロ
ティン、ＨＢＳＡｇまたは免疫学的反応性等価物の合成
である。この方法はウィルスまたは他のウィルス成分に
よる汚染の可能性を除去し、規模の節約で大規模な生産
を可能にする。さらにその上遺伝物質の適当な操作によ
り、副作用を変性するかまたはワクチンを多価にするた
めにワクチンからなる蛋白質の配列を変更することがで
きる。この目的に対してＨＢＶの完全なゲノムが大腸菌
でクローンされており、完全なヌクレオチド配列が決定
されている（チャーナイ、Ｐ０等Ｎｕｃ１．Ａｃ１ｄ　
Ｒｅｓ、矛７巻、矛３６５頁（１９７９年）、ガリベル
ト、Ｆ。

等、Ｎａｔｕｒｅ矛２８１巻、矛６４６頁（１９７９年
）、バレンツエプＰ０等、Ａｎｉｍａｌ　　Ｖｉｒｕｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｂ、フイールズ＋Ｒ，シャエニツシ
ュおよびＣＦ　Ｆｏｘ版）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ
ｓｓ、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、（１９８０年）オ５７頁
）。ゲノムの単一部位はＳ−プロティンに対する、そし
てまた１６３アミノ酸の大きな予備配列に対するコード
に見出された。ＨＢｓＡｇの構造は二値酸塩分子間結合
によって連結した２本のＳ−プロティン鎖からなると考
えられ、さらに二値酸塩分子間結合によって指示された
確認に適用できる。２本の鎖の１本はグリコジル化され
ていると思われる。保菌者の血清中、ＨＢＳＡｇはしば
しばまさに記載したＳ−プロティン二量体の集合体とみ
なされる平均直径２２ｎｍを有する球形粒子の形態と見
られ、恐らく脂質を含有する。ウイルスエンベローフニ
おいてＨＢＳＡｇは脂質含有ウィルスエンベロープと結
合し、宿主細胞の膜成分から誘導されると考えられる。

ＨＢ　ｓ　Ａｇの抗原１＜１および免疫原性はいくつか
の因子に依存し、そのすべてが十分に理解されていない
。二値酸塩結合の減力が抗原性および免疫原性を著しく
低下することが観察されている（ミクｏ、Ｓ４等、Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏ１才１２４巻、牙１５８９頁（１９８０
年））。それ故分子内および分子間の二値酸塩結合によ
って与えられるオニ配置が抗原性および免疫性に貢献す
るものと考えられる。グリコジル化の範囲および性質お
よび脂質との結合のような他の因子の寄与は不明である
が、ある程度すべてが貢献するものと考えられる。上記
で言及した２２ｎｍのような粒子への集合が免疫原性を
高めるために重大に貢献するものと考えられる。

Ｓ−プロティンは融合蛋白質の形態に大腸菌で合成され
ている（エドマン、Ｊ、Ｃ，等、Ｎａｔｕｒｅ矛２９１
巻、牙５０６頁（１９８１年））。

産生物はプレーβラクタマースの１８３アミノ酸、５〜
１０グリシン残渣およびアミン末端の２２アミノ酸のな
いＳ−プロティンの２０４アミノ酸を包含している。融
合蛋白質は抗１１１３ＳＡｇ　ＩｇＧ　で免疫沈降可能
であった。

Ｓ−プロティン二量体（上記ミシロ等）およびＨＢｓＡ
ｇを混和する２２ｎｍ粒子（カブジル、Ｇ、ん等、Ｊ、
　Ｇｅｎ、Ｖｉ　ｒｏ　Ｉ矛６８巻、３１’　５３　ｑ
頁（１９７８年））が関連Ｓ−プロティンより抗原性で
あることが知られていることから、ＨＢｓＡｇまたは免
疫学的反応性等価物を直接に実質的な量で生産すること
ができる生物学的系を見出すことは非常に望ましい。

Ｓ−プロティンをＨＢＳＡｇにまたは２２ｎｍ粒子に転
化する段階は十分に理解されておらず、また宿主特異性
がどの程度であるかも知られてい、ない。さらに、その
上Ｓ−プロティン遺伝子は機能の意味があるとしても知
られていない１６５アミノ酸の異常に長い予備配列に対
してコードしているように思われる。

事実予備配列がウイ゛ルス感染細胞で実際に翻訳される
かどうか知られていない。酵母（サツカロミセスセレビ
シアエ）は次の理由でＨＢｓＡｇ　　の表現を試みるた
めに宿主細胞として選択された。酵母は大量に培養で容
易に増殖することかできる。事実、大規模な酵母培養の
科学的知識は十分に理解されている。また酵母は真核性
であり、それで正常な宿主細胞で実施される後翻訳処理
段階のいくつかが酵母箋 で実施されることが望まれた。Ｓ−プロティンをＨＢｓ
Ａｇに転化する複合体後翻訳事象、そのいくつかが宿主
特異性であるために本明細で採用した術語は、本明細卦
で開示される作業から認められる異った抗原形態を区別
することを意味する。表面抗原に対する構造遺伝子の未
処理翻訳生産物をＳ−プロティンと呼ぶ。感染した供給
者の血漿から、ディン粒子からまたはヒトの肝癌細胞培
養から分離される抗原をＨＢＳＡｇと呼ぶ。酵母の表面
抗原遺伝子の表現生産物をＹ　−ＨＢｓＡｇと呼ぶ。Ｈ
ＢｓＡｇの免疫学的反応性等個物なる用語はＹ−ＨＢｓ
Ａｇが１例であるＳ−プロティンまたはその一部からな
るあらゆる免疫学的交互反応性組成物に対する一般用語
である。

酵母が前に異なる細菌で正常に増殖するウィルスの遺伝
子の表現に用いられたことはいまだかつてなかった。酵
母の異種蛋白質を表現する先行技術の試みは混合した結
果を生じている。それ自身のプロモーターの制御下ウサ
ギグロビンを表現する試みは蛋白質の翻訳に不成功であ
ったと思われる（ベツグ、Ｊ、Ｉ）。

等、Ｎａｔｕｒｅ　　牙２８３巻、牙８６５頁（１９８
０年））。ショウジヨウバエ属遺伝子に対してコードづ
けている遺伝子は遺伝相補性の匁めの選択圧の条件下、
酵母ａｄｅ　８突然変異体°を補足することができるこ
とを報告している。

酵母菌株からの機能蛋白質の分離は報告されなかった。

ヒトの白血球インターフェロンに対する遺伝子は酵母Ａ
ＤＩ１１（アルコール脱水素酵素）プロモーターの制御
上酵母で表現されている。その場合、活性蛋白質の成功
した生産は後翻訳工程または成分の組立てを必要としな
かった。

酵母の運搬および複製に適当なりＮＡ運搬媒介体が開発
された（ブローチ、Ｊ、几０等のＱｅｎｅ　７Ｎ’　８
巻、牙１２１頁（１９７９年〕、ハートレ＜、　ｔｒ、
　Ｌｏ等のＮａｔｕｒｅ　矛２８６巻、牙８６０頁（１
９８０年〕。この用途のほとんどの酵母媒介体は複製の
酵母原点（ｏｒｉｇｉｎ）を挿入しているｐＢＲ３２２
のような大腸菌媒介体から誘導される。酵母複製原点二
つのタイプが利用される。通例２μ項として言及される
遍在する天然の酵母プラスミドから誘導される一つは酵
母染色体ＤＮＡと無関係に複製する能力がある。媒介体
のもう一つの種類は自律複製力も生じる酵母染色体複製
原点から誘導されるａｒｓ　１　（自律複製配列）と呼
ばれる複製原点配列を含有する。細菌および酵母複製原
点の両方が同じ媒介体に存在するためにどちらの細菌で
も用いることができる。選択はｐＢＲ３２２の７ムビシ
リンおよびテトラサイクリン耐性遺伝子のような抗生物
質耐性遺伝子の包含によって細菌系で供給することがで
きる。酵母系の選択は典型的には適当な栄養要求宿主菌
株中突然変異を相補する酵母遺伝子を包含することによ
って供給することができる。明細書中に報告される研究
はアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ１〕にコードづけてい
る酵母遺伝子から分離したプロモーターを含有する酵母
媒介体を通例利用する（ペンネツエン、　Ｊ、Ｌ、等、
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｏｈｅｍ、　　矛２５７巻、矛５０
１８頁（１９８１年）。

ＡＤＨ１プロモータ一部は酵母ＡＤＨ１遺伝子の５°−
側面部から分離された。コードづけ部内の一１５５０〜
＋１７位置から伸びているＡＤＨｌ　配列め約１６００
塩基対を含有する部分は酵母ＣＹＯ１コードづけ配列に
融合した。出発特異性を転写する表示された付着ＣＹＣ
１コードづけ配列の転写の研究は一つの酵母遺伝子から
もう一つの酵母遺伝子まで運搬することができた。ＡＤ
）Ｉコードづけ部の全部がない小部分は次に構成され、
ヒトのインターフェロンの表現で作用することを示して
いる。９２１と呼ばれる、かかる部分の１つは一９位置
の後終結し、本研究で使用された。

抗ＨＢＳＡｇ抗体と反応する物質がいくつかの形態で存
在するために、これらの形態を区別するために本明細書
中で命名を採用している。

ＨＢＶ表面抗原遺伝子の翻訳産生物はＳ−プロティンと
呼ばれる。Ｓ−プロティンは配列がその遺伝子のヌクレ
オチド配列から、そして部分配列分析によって推論され
た２２６アミノ酸を有する。本明細書で用いられるＨＢ
ｓＡｇは感染した患者の血清におよびアレ牛サンダー細
胞、合成して２２　ｎｍ　ＩＩ１３ｓＡｇ粒子を分泌す
る肝細胞癌の細胞系に見出される）ＩＨＶの主な表面抗
原成分を包含する（アレ牛サンダー。

Ｊ、　Ｊ、等、Ｓ、ＡｆｒｏＭｅｄ、Ｊ、３２５０巻、
牙１１２４頁（１９７６年）。Ｓ−プロ′ティンおよび
ｌｌＢ５Ａｇの両方とも抗原性であるが、後者は抗−Ｈ
ＢＶ抗体に対してよシ反応性であり、さらに免疫原性と
みなされる。ＨＢ　ｓ　Ａｇの構造は十分に特徴づけら
れておらず、種々の変性段階の抗原性および免疫原性に
対する寄与が十分に理解されていないことがら、ＨＢｓ
Ａｇなる用語は二量化、グリコジル化および粒子集合を
包含するが、それらに限定されない抗原性および免疫原
特性に貢献するＳ−プロティンのあらゆる変性形態を包
含するために本明細書中で用いられる。

本発明は酵母におけるＨＢＳＡｇの合成に関するもので
ある。酵母プロモーター、ＡＤＩ目からなる酵母表現媒
介体が構成されている。可能な１６３アミノ酸前配列を
除くｓ−プロティンにコードづけているＨＢＶゲノムの
部品は酵母表現媒介体に運搬されている。

記載した酵母媒介体を用いて酵母によるＨＢＳＡｇの成
功した合成が得られている。産生物は抗原性（抗ＨＢ”
ＳＡｇと反応）であり、Ｉ−ＩＢＹ感染患者の血清中に
およびアレキサングー細胞中に見出されるものと電子顕
微鏡外観で一致しているが、より小さな粒子サイズ直径
を有する粒子と結合される実質的部分が見出される。酵
母によって合成されだＨＢｓＡｇは蔗糖勾配沈降によっ
て測定される通り、アレ牛サンダー細胞から精製される
精製天然ＨＢＳＡｇ粒子と同様の沈降行動を有する。本
発明は微生物の異種ＤＮＡコードづけ部分の表現から生
、しる高配列多成分構造の合成および集合を示すもので
ある。

本発明は異種宿主のウィルス蛋白の生合成および粒子組
立の第一段階であると思われ、そこで異種宿主（この場
合酵母〕は正常宿主（人）から進化の度合で除去される
。本発明は酵母に対する自律的複製ＤＮＡ運搬媒介体の
発育によっておよび細菌のＨＢＶゲノムのクローニング
および特徴づけによっても可能であった。本発明におい
て酵母ＡＤＩｒ１遺伝子に対するプロモーターは高レベ
ルの挿入Ｓ−プロティンコードづけ部の転写を提供する
だめに用いられた。原則としてあらゆる酵母プロモータ
ーが好適に高レベルの転写を提供する活性プロモーター
よりも使用することができた。酵母の他の適当な活性ブ
ロモ！ターはグリセルアルデヒド６−ホスフェート脱水
素酵素、アルドラーゼ、ピルベートキナーゼおよびホス
フォグリセレート生テープに対するものを包含する。Ｈ
ＢＶＳ−プロティンプロモーターのような異種プロモー
ターもまた使用することができる。しかしながら、現在
酵母プロモーターの使用が好適である。

核抗原のようなＨＶの他の蛋白もまた本発明の原理およ
び技術を使用して合成される。

それ以上に本発明は後翻訳処理がグリコジル化、粒子組
立および恐らく特異蛋白開裂反応を包含する生物学的機
能最終生産物を生成するために望まれるあらゆる系で適
用することができ特に有利である。

Ｓ−プロティン遺伝子は翻訳の開始に三つの潜在点を有
する。最初の二つは約７０および９０塩基対を推定のＨ
ＢＶ　Ｓ−プロティンプロモーターから定めたＡＵＧコ
ードンである。

成熟８−プロティンの公知のコードづけ配列を始める三
番目は各々一番目および二番目から５２２および４８９
塩基対にある。それゆえ三番目の出発点はＨＢＶ　８−
プロティンプロモーターからかなり離れている。現在Ａ
ＵＧコードンが翻訳の実際の出発点であることは知られ
ていない。翻訳が第一またはオニ潜在出発コードンで開
始される場合、転写は後翻訳処理によって除去されねば
ならない１６６アミノ酸の異常に長い前駆物のコードづ
け配列からなるか、あるいは後翻訳処理で除去される異
常なイントロンを構成する。オニＡＵＧが実際の開始点
である場合には、そのときプロモーターと出発コードン
間に異常に大きな間隔がある。

本明細書中に表わされるデータはＹ−ＨＢｓＡｇがＨＢ
ｓＡｇの微粒子物、免疫学的交互反応等個物であり、電
子顕微鏡での形態外観がＨＢＳＡｇと同様であるけれど
もいくつかの方法で後者と異なることを示す。その上、
Ｙ　−ＨＢｓＡｇが少なくともＨＢｓＡｇのように単位
重量当り抗原性であシ、Ｙ　−ＨＢｓＡｇげつ肉類およ
び霊長類のＨＢＳＡｇに反応する抗体を惹起するＨＢＳ
Ａｇのように少なくとも有効であることができることを
示している。

Ｓ−プロティンコードづけ部分の表現割合は種々の手段
で高めることができる。これらは翻訳開始の割合を最高
に利用するためにプロモーターとコードづけ部分の出発
コードンとの間の間隔を利用する表現媒介体を変（財）
することを包含する。コードづけ部分の停止ニートンに
続＜３１未翻訳部の点で転写の読み終シを指令する読み
終り暗号配列の付加が恐ら（ｍＲＮＡ転写を安定化する
ことによって表現を高める。読み終り信号がなくて６′
未翻訳部の長さの利用が表現を高めることが観察されて
いる。

媒介体の安定性を高める手段の採用もまた培養からの表
現産生物の収量を増大する。酵母のクローニングに適応
した多くの媒介体は例えばトリプトファンのない培地中
ｔｒｐｌ−宿主の増殖を可能にするＴＲＰ　Ｉ　遺伝子
を包含することによって選択圧下形質転換酵母細胞の増
殖を保証する遺伝標識を包含する。かかる媒介体を含有
する宿主細胞培養は非選択条件下で増殖する場合、特に
高細胞密度に増殖する場合かなり多数の未形質転換分離
物を含有することができる。それゆえ、高密度に増殖さ
せ未形質転換分離物の割合を最少にするために選択条件
下増殖を必要としない表現媒介体を使用することが有利
である。天然の２項プラスミドの実質的部分を含有する
媒介体は前に２μ環が欠けている宿主細胞に形質転換さ
れる場合に高細胞密度でさえも未形質転換細胞の最少分
離物で安定に複製することができる。かかる宿主菌株は
環ゼロＣｃｉｒＤ）菌株と呼ばれる。さらに低細胞密度
での細胞増殖速度はＳ−プロティンコードづけ部の表現
が初期にミドルログ相になるような希薄培養で最小にな
り、次に高細胞密度で最大表現に対して向けられるよう
にプロモーターに調節制御をとり込むことによって増大
することができる。このような調節方法は発酵法におけ
る細胞増殖の効率を高め、さらに未形質転換細胞の分離
頻度を低減する。

次の実施例において多くの技術、反応および分離操作は
すでに当該技術でよく知られている。特にことわらない
限り、酵素はすべて典型的な二、三を言及するためにニ
ューイングランドバイオラドリーズ、ベバーリー、マサ
チュセツツ、コラボレイテイプリサーチ。

ウオルサム、マサチュセツツ、マイルスラボラトリース
、エルクハルト、インディアナ。

ボエリンガーバイオケミカルス（ｎｃ、インディアナポ
リス、インディアナおよびベセスダリサーチラボラトリ
ー、ロックビル、マリ−ランドのような１種またはそれ
以上の市販のものから利用される。制限酵素消化に対す
る緩衝液および反応条件は各酵素の製造業者によって供
給される勧告に従って用いられた。制限酵素での部分消
化は各酵素バッチに対して予備的実験から予め決定され
た低下酵素濃度を用いて行なわれた。池の酵素反応、ゲ
ル電気泳動分離および大腸菌形質転換に対する標準方法
はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｇｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｊ
ｙ　６８巻。

Ｒａｙ　Ｗｕ版、アカデミツクプレス（１９７９年）に
見い出すことができる。酵母原形質体の形質転換は実質
的にベツグによって記載される通シ実施した（　Ｎａｔ
ｕｒｅ牙２７５巻、牙１０４〜１０９頁（１９７８年〕
。

形質転換に有用な大腸菌株はＸｉ　７７６゜Ｋ１２菌株
２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、５１４４６　）　。

ＲＲＩ　　およびＨＢｌｏｌを包含する。遺伝子型（ａ
　ａｄｅ２　ａｄｅ　６１ｅｕ２１ｙｓ　１　ｃａｎ　
１　）およびＧＭ−３０−２，７アエ、Ｇ等、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｊ。

Ａｃａｄ、８ｃｉ、ＵＳＡオフ８巻、′Ａ’２２５Ｂ頁
（１９８１年）遺伝子型、（αＬｅｕ’２　　Ｔｒｐ　
ＩＨｉｓ　４　　ＣＹＣ！１−　Ｉ　ＣＹＰ３−りを有
する酵母菌株輝６１０−８０を酵母形質転換に対して用
いた。

ミラー、Ｊ、ＨｏのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ、コールドスプリン
グハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバ−
９Ｎ。

Ｙ、（１９７２年）に記載される操作に従って細菌を増
殖し、選択した。酵母を次の培地で増殖した。酵母工牛
ス１％（Ｗ／Ｖ）、ペプトン２％（Ｗ／Ｖ）およびグル
コース２ダｂ（Ｗ／Ｖ）を含有するＹＥＰＤおよび平板
培地の場合には寒天６％（Ｗ／Ｖ）。酵母窒素塩基（ジ
フコラボラトリース、ミネアポリス、ミネソタ）　６．
７９、アデニン１０１１？、ウラシル１０ｍ、カサミノ
酸（ＯＡＡ）　５　ｊｊ　（ジフコ）、グルコース２０
Ｊを含有するＹＮＢプラスυμおよび平板培地の場合に
は１７！当り寒天５０Ｉ０　トリプトファレ原栄養の選
択は酵母窒素塩基（アミノ酸欠如）　６．７１７を含有
するプレート上で行ない、トリプトファンを除く形質転
換される菌株の全増殖必’ａ　ｊｌｔに対し７て補足し
た。

実施例　１゜ 一つがａｒｓ　１　複製原点能が２μ環複製原点からな
る二つの酵母媒介体を作製した。

プラスミドｐＦＲＰ−９２１はＡｉｌにヒツエマン等の
Ｎａｔｕｒｅ　牙２９６巻、牙７１７頁（１９８１年）
に記載されている。媒介体はヌクレオチド配列の一９位
置の後で終結される９２１と呼ばれるＡＤＨ１プロモー
タ一部分とともに７ムビシリンおよびテトラサイクリン
耐性遺伝子および細菌プラスミドｐＢＲ３２２の複製原
点、酵母ａｒｓ　１複製原点およびｔｒｐ　ｌ遺伝子を
含有する。ｐＦＲＰ　−９２１地図を矛１図に示す、。

プラスミドｐＭＡ５６は細菌プラスミドｐｏＩＬ３２２
、酵母の選択に対・する酵母ｔｒｐ　１遺伝子、酵母２
μ環複製原点およびヌクレオチド−１５後３′−末端１
で終結される９０６と呼ばれるＡＤＨＩプロモータ一部
分の配列を含有する。ｐＭＡ５６の段階および構造は次
の通り略述され矛２図に図示する。

ｐＢＲ１２２のＥｃｏＲｔサイトに挿入される酵母ｔｒ
ｐ　１およびａｒ’ｓｌ配列を含有するプラスミドＹＲ
ｐ７’（スチンクコーム、Ｄ、Ｔ０等、Ｎａｔｕｒｅ矛
２Ｂ２巻、矛６９頁（１９７，９年））を出発物質とし
て用いた。酵母配列挿入の結果としてプラスミドは二つ
のＥｃｏＲ１位置を含有する（１・２図）。これらの一
つを１分子当り二つの位置の一つだけを平均して消化す
るためにＲｃｏｌ’ＬＩエンドヌクレアーゼで部分消化
によって欠失させた。線状分子の生成した不対終末をＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（フレノウフラグメントンによる接
触作用をおよぼす反応によって充填し、生成したブラン
ド（ｂｌｕｎｔ　）末端を閉鎖環状ＤＮＡ分子を再株化
するためにＤＮＡＮカリゼ接触作用をおよぼす反応によ
って連結した。ｐｐＲ’ｒと呼ばれる生成プラスミドの
一つをａｒｓ１部に隣接するＥｃｏＲＩＱ置を保持する
ために選択された。

矛２図に示される通り、ａｒｓ＋　複製原点はＰｓｔＩ
位置およびＥｃｏＲＩ位置によって結合された。同時に
２μ項複製原点を含有するプラスミドＹＥｐ１３（上記
ブローチ等）は同様にｐｓ　ｔＩ位置およびＥｃｏＲＩ
位置によって結合された。それゆえｐｓｔＩ　およびＥ
ｃｏＲＩエンドヌクレアーゼによるｐＦＲＴおよびＹｇ
ｐ１３の開裂は各々ｐＦＲＴから酵母複製原点のない大
線状フラグメントとＹＥｐ１３から２μ環複製原点から
なる小ＤＮＡフラグメントを生成した。プラスミドｐＦ
Ｉ’ＬＴを部分消化条件下ｐｓｔＩ　エンドヌクレアー
ゼで消化してアムビシリン耐性遺伝子内のｐ　ｓｔ■位
置での開裂頻度を低下させた。所望の７ラグメントを分
取用ゲル電気泳動によって精製し、ＤＮＡリガーゼ接触
作用を及ぼす反応で共に混合し、共有連結させた。ｐＭ
Ｗ５と呼ばれる生成プラスミドをアムビシリン耐性を与
えることができるとして選択した。

ＡＤＨ１フラグメント９０６をＢ　ａＩｍ）（ＩとＥ　
ｃｏＲＩ位置の間のｐＢＲ３２２に挿入した。プロモー
ターフラグメントをＢ　ａｍＨＩおよびＢｃｏＲＩエン
ドヌクレアーゼで消化して放出した。１．５キロベース
の７ラグメント、ＡＤＨＩ−９０６７ラグメントを分取
用ゲル電気泳動で分離した。

プラスミドＭＷ５を同様にｇｃｏＲＩおよびＢ　ａｒｎ
ｌ（Ｉエンドヌクレアーゼで消化した。ＢＣＯＲＩ−特
異終末およびＢ　ａｍＷ　Ｉ−特異終末を有する大フラ
グメントを分取用ゲル電気泳動で分離し。

ＡＤＨｌ　−９０６７ラグメントと混合し、ＤＮＡ接触
作用を及ぼす反応で共有的に連結させた。

ｐＭＡ５６と呼ばれ、牙２図に図示した生成プラスミド
を大腸菌のアムピシリン耐性によって選択した。

プラスミドｐＦＲＰ−９２１およびｐＭＡ　５６は構造
上同じであり、各々ａｒｓ　１　複製原点（ｐＦＲＰ−
９２１）または２μ環複製原点（ｐＭＡ５６　）を有す
ることで本来異なっている。さらに、ＡＰＨ１プロモー
ターフラグメントが記載したようにわずかに異なる。両
方とも細菌複製原および大腸菌の増殖に対する選択標識
を有することで類似している。両方とも酵母ｔｒｐ　ｉ
宿主細胞で選択することができる酵母ＴＲＰ１遺伝子を
含有する。

実施例　２゜ ＨＢＶ　ＤＮＡのヌクレオチド配列の分析はＳ−プロテ
インコー（づけ部の位置を示すＡｎ　ｉｍａ　ＩＶｉｒ
ｕｓ　（ｉｅｎｅｔｉｃｓ　　アカデミツクプレス、ニ
ューヨーク、Ｎ、Ｙ、（１９８０年）、矛５７頁〜７０
頁で″バレンツラ、Ｐ１等によって報告されている。部
位は８３５塩基対の長さのＴａｃＩ　−）１ｐａ　Ｉ　
　フラグメント内に含有する。このフラグメントはＳ−
プロティンのＮ−末端メチオニンに対するＡＵＧコード
ンの前にある２６塩基対を包含する（上記で記載した推
定前配列にコードづけている部位のほとんど、並びに最
初の二うのＡＵＧコードンはＴａｃＩ　−１１ｐａＩフ
ラグメントからなくなっている。）。フラグメントはま
た完全な°Ｓ−プロティンコードづけ部（６７８ｂｐ　
　ン、ＴＡＡ停止コードンおよび停止コードンに続（１
２８ｂｐ　を含有する。

７５ｂｐ ２６ｂｐ　　ＡＵＧ　−一−−−−−−−−ＴＡＡ　１
２８ｂｐＳ−プロティン プラスミドｐＨＢＶ　−３３００（バレンツエラ、Ｐ０
等、Ｎａｔｕｒｅ　矛２８０巻、矛８１５貞（１９６９
年））からのＤＮＡ約５００μｙを制限酵素ＢｃｏＲＩ
およびＨｐａＩ　　の組合わせで完全に消化した。９６
５塩基対の７ラグメントＥｃｏ几Ｉ　−ＨｐａＩ　　約
６０μＩをアガロース中分取用ゲル電気泳動によって分
離した。次にこのフラグメントを制限酵素ＴａｃＩ　　
で完全に消化した。８３５塩基対ＴａｃＩ　−ＨｐａＩ
フラグメント約３０μｇを７ガロース中で分取用ゲル電
気泳動によって分離した。

８３５ｂＰフラグメントをｇｃｏＲＩリンカーオリゴヌ
クレチド（コラボラティブリサーチ。

ウオルサム、マサチュセツツから市販で得られる・）の
添加によってＥＣ０ＲＩ特異終末を生じるように処理し
た。リンカ−オリゴヌクレオチドを’Ｉ’　４　ＤＮＡ
リガーゼによって接触作用をおよぼすプラント終点リゲ
ーションによってフラグメント約６〜５μｇに連結した
。次にフラグメントをＢｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで
消化し、未反応および自己リゲートリンカーを開裂しＥ
ｃｏＲＩ特異不対（゛ステイ牛−“°）終末を心成した
。

プラスミドｐＦＲＰ−９２１をｌ：　ｃ　ｏ　ＲＩエン
ドヌクレアーゼで消化し、自己リゲーション（シャイン
、Ｊ、米国特許す４，２６４，７６１号）を防ぐために
アルカリ性ホスファターゼで処理した。

］１ｉｃｏＲｉ終末およびｇｃｏＲＩ−消化ｐｐｎ、ｐ
　−９２１を有するＴａｃＩ　−ＨｐａＩフラグメント
の混合物をＤＮＡリガーゼで培養して酵母媒介床に・挿
入したＳ−プロティ、ノコ−１ドづけフラグメントを有
する共有的に閉鎖した環状ＤＮＡを生成した。生成プラ
スミドをアムピシリン耐性に選択する大腸菌を形質転換
するために用いた。

酵母プロモーターに関するＳ−プロティコードづけ配列
の可能な指向の両方を分離し、ＨＢＶ挿入内に非対称的
にあるサイトで作用する制限酵素での処理で生じる開裂
生成物によって特徴づけた。プラスミドｐＨ５ｓ　−１
１（正しい指向で）およびｐＨＢ５　＝　１２　（反対
指向９を選択し、大腸菌で増幅した。

ＥｃｏＲＩサイトでｐＭＡ　５６にＴａｃＩ−ＨｐａＩ
　Ｓ−プロティンコードづけフラグメントを挿入するた
めにｐｐｇｐ　９２１０代わりにｐＭＡ　５６を用いて
次の操作を記載した通り使用した。二つのプラスミドを
分離し、Ａ　ＤＨ１プロモーターに関して正しい指向で
ウィルス遺伝子を含有するｐＨＢｓ　−１６および反対
の指向でＳ−プロティン遺伝子を有するｐＨＢｓ　−２
０を特徴づけた。

実施例　３゜ 酵母におけるＨＢＳＡｇの合成 酵母受容菌株ＸＶ６１０−８０または０Ｍ３０−２の原
形質体を記載した形質転換条件下４つのプラスミドｐＨ
Ｂ５−１１　、　ｐＨＢｓ　−１２，ｐＨＢｓ−１６お
よびｐＨＢ５−２０の各々からのｌ）　Ｎ　Ａで別々に
培養し、トリプトファンのない培地で寒天培地でおおっ
た。トリプトファン原栄養に形質転換した生存コロニー
を分離し九ＨＢｓＡｇ合成の試験のために４つのプラス
ミドの各々で形質転換した酵母菌株をトリプトファンの
ない培地で液体培養で別々に分離し、ミドーロッグ相を
回収した。細胞を遠心分離で集め、細胞抽出物を００１
Ｍβ−メルカプトエタノールおよび０１％（ｖ／　Ｖ　
）　ＮＰ−４０界面活性剤〔ポリオ牛ジエチレン（９）
オクタフェノール〕を含有する００１Ｍリン酸ナトリウ
ム（ｐＨ７，４）緩衝液中ガラスピーズで細胞をすりつ
ぶすことによって調製した。表面抗原の存在をアボット
ラボラドリース、ノースジカゴ、イリノイから市販で人
手できるラジオイムノアッセイ器具を用いて検定した。

量的に正しい指向で表面抗原コードづけフラグメントを
含有するプラスミド、ｐＨＢｓ　−１１およびｐＨＢｓ
　−１６を容易に検出できる量の表面抗原に生成したが
、検出できる表面抗原はｐＨＢｓ−１２またはｐＨＢｓ
　−２０で形質転換した細胞の抽出液には見られなかっ
た。数的にｐＨＢｓ−６を含有するＸＶ〜６１０−８０
の２００ｍ１培養は表面抗原蛋白質１〜２μｇを生成し
た。ｐＨＢｓ　−１１を含有する細胞は恐ら（ａｒｓ１
複製原複製中るプラスミドの細胞当り複写数が低いため
に表面抗原の／２〜へを生成した。

全細胸抽出液を蔗糖勾配沈降によって分析した。予め生
成した５〜６０％（Ｗ／Ｖ）蔗糖勾配を記載した通シ調
製しだＸＶ６１００−８０　／　ｐＨＢ８〜１６の抽出
液で層にし、対照勾配をアレ牛サンダー細胞培養から精
製したｌｌＢ５Ａｇ　の標本で層にした。勾配をスウイ
ンギングバケツローターで８時間２７，０００　ｒｐｍ
で遠心分離した。遠心分離後フラクションを集め、上述
のラジオイムノアッセイで検定した。驚くべきことに、
酵母で合成し５たｌＩｌｌｓＡｇがアレ牛サンダー細胞
から分離したｌｌｌｌｓＡｇとまさに同一の沈降特性を
有することを賭出した。沈降匝約６Ｏ８は両方のＩｌｌ
＋ＳＡｇｌｌＢ５Ａｇ標本算された。

酵母によって合成されたｌｉｔ（ｓＡｇは塩化セシウム
における平向遠心分離および蔗糖勾配における沈降の併
用によって精製した。６５０ｎｍ　において０．Ｄ、２
．０に増殖した細胞１００ｍ１を遠心分離によって回収
し、パック細胞０．１５０ｍ１を生成した。細胞抽出、
ｇ、を６．００Ｏｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞残
渣を除去した後、抽出液ｏ、　ｓ　ｍｌ全容量が生成す
るようにガラスピーズで細胞を帰砕することによって調
製した。抽出液は蛋白質約３ｏｔｎｇ／ｍｌおよびＨＢ
ｓＡｇ合計約１　μＩを含イ１した３、抽出液を塩化セ
シウム不連続勾配で１１ｇ７ｃｍ　　〜１４ｇ／α　を
層にし、スウィンギングバケツロ−９−（ＳＷ４１．ベ
ツクマンインスツルメンツ、フラートン、カリフォルニ
アンで２４時間５０００　Ｏｒｐｍで遠心分離した。遠
心分離後、フラクションを集め前のように検定した。ア
レ牛サンダー細胞ＨＢｓＡｇを含有する対照管をマーカ
ーとして同様に処理した。酵母ＨＢｓＡｇはｂｏｕｙａ
ｎｔ密度１．１９／ｃｍ　を有するアレ牛すンダー細胞
ＨＢｓＡｇピークで同時遊走した。酵母ＨＢｓＡｇを含
有するフラクションをプールし、透析し、予め生成した
５〜５０　％（Ｗ／Ｖ）蔗糖勾配に置き、５　［１，Ｇ
　ＯＯｒｐｍで６６時間遠心分離した。再び前に観察さ
れたように酵母ＨＢｓＡｇのピークはアレ牛サンダー細
胞からのＨＢｓＡｇとまさに一致した。プールしたピー
クフラクションは全蛋白質濃度００１ｐｇ　／　ｍｌお
よびＨＢｓＡｇの全収量１５％を有した。

沈降データからＨＢｓＡｇが粒子または集合体の形態で
酵母において合成されたことは明白であった。これらの
粒子の性質は、さらに電子顕微鏡によって特徴づけられ
た。酵母から合成され記載したように、精製した１（１
３ｓ　Ａｇ粒子は炭素フィルムグリッドに沈降させ、酢
酸ウラシル染色で染色した（７分間２％（Ｗ／Ｖ））。

電子顕微鏡上酵母で合成したＨ　Ｂ　ｓ　Ａｇ粒子が観
察され、同一外観であったがアレ牛サンダー細胞からの
ＨＢＳＡｇと比較して直径が小さかった。これらの研究
ではアレ牛すンダー細胞ＨＢｓＡｇ粒子は直径２０ｎｍ
を有したが、Ｙ−ＨＢｓＡｇ粒子直径は約１６〜１７ｎ
ｍであった（牙６図参照）。これらの結果は微生物宿主
中の異種蛋白質のより高い順序構造に組立てることをま
ず示すものと思われる。

５倍までの高収量が宿主として酵母菌株０Ｍ３Ｃ−２を
用いて得られている。菌株は小形菌株であり、炭水化物
に依存して増大される機構がＡ　Ｄ　Ｈプロモーターに
対して高い活性を生じることができる。ＧＭ−５０−２
で観察される高表現レベルもまたＡ　Ｉ）　Ｈ１プロモ
ーターフラグメントおよびＡ、　Ｄ　ＩＩ末端フラグメ
ントによって側面にあるＳ〜プロティンコードづけフラ
グメント全含有する変更媒介体、ｐＨＢｓ　−２５を用
いる結果であることができる。Ｔａｃｌ　−ＨｐａＩＨ
ＢＶ　　コードづけ部分は、Ｈｉｎｄｌ　　オリゴヌク
レオチドリンカーと適合し、３１−末端においてＨｉｎ
ｄ　璽リンカー配列で終結されるＡＤＨｌプロモーター
フラグメン）ＡＤＨｌ　−９０６に５１−末端で連結し
た。

ＨＢＶ部分の５１−末端は両方のフラグメントが転写の
同じ方向に指向されるようにＡ　Ｄ　Ｈ１停止コードン
ＴＡＡおよび６１未翻訳部の部分の４５０−末端アミノ
酸に対するコードづけ部を含有するＡＤＨ１遺伝子の４
５０　ｂｐＨ１ｎｄ１−　ＢａｍＨＩフラグメントに連
結した（ベネッエン等のＪ、　ＢＩｏｌ、Ｏｈｅｍ、矛
２５７巻、矛６０１８頁（１９８２年））。生成した複
合部分、ＡＤＨ−Ｈ−５−８−プロティン−Ａ　Ｄ　Ｈ
−読み終り暗号はＢ　ａｍＨＩサイトを両端に有し、ｐ
ＭＡ５６のＢ　ａｍＨＩサイトに挿入することができる
。

ＡＤＨ読み終シ暗号区分がＡＤＨｌ−９０６プロモータ
ーフラグメントに隣接するように挿入される場合、生成
媒介体はｐｉ−１８８−２５と呼ばれる。

ｐＨＢｓ　５６−３およびｐｉｌＢＳ　５６−５　（実
施例６〕に類似の２５系の媒介体の構造はＡ　Ｄ　Ｈプ
ロモーターおよび実施例６で記載される読み終り暗号部
分によって側面にあるＳ〜プロティンに対する複合遺伝
子を用いて容易に達成される。ｐＨＢｓ　１６−３から
誘導さ°れる複合遺伝子はｐＭＡ５６のｓｐｈ　１位置
に榊人され、ｓｐｈ　１消化によって直線になり、アル
カリ性ホスファターゼで処理されてシャインの米国特許
牙４，２６４，３７１号で記載されるように挿入複合遺
伝子のない９Ｍ４，５６の再構成ｆｆ１ｌｆｆｌ止する
。この構造において、ｐＨＢｓ　２５−６およびｐＨＢ
ｓ　２５−５は複合遺伝子がｐＭＡ　５６の近くのＢ　
ａｍ）（Ｉサイトよりも、むしろｐＭＡ　５６の５ｐｈ
１サイトで挿入されるｐＨＢｓ　２５と異なる。

運搬媒介体ｐＨＢｓ　−１６およびプラスミドｐｉｎ’
（Ｓ−１６によって形質転換された菌株ＸＶ６１０−８
９からなる酵母菌はアメリカンタイプ力ルチュアコレク
ション、　１２３０＋パークラウンドライブ、ロックビ
ル、マリ−ランドに寄、、しして置かれている。

実施例　４ 本実施例は）［１３Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａの５゛−未ｄ沢部
の除去を示す。実施例２で記載したように分離したＳ−
プロティン部からなるｌ）　Ｎ　Ａ部分はプロモーター
とＡＴＧ開始コードンの間にあるコードづけ部の５°−
末端に未翻訳２６堪基対部分を包含している。次の操作
はＳ−プロティンコードづけ部の前にあるＩＩ　１１　
Ｖ　　Ｉ）ＮＡの５”−未翻訳部の塩基の全部をまたは
つを除く全部を除去するために開発された。

プラスミドｐＨＢｓ　−５をＢｃｏＲ１リンカ−オリゴ
ヌクレオチド部分によって末端化されるＳ−プロティン
コードづけ部を包含し、３“−および５１〜未翻訳部の
側面にある約８５０塩基対フラグメントを生じるＥｃｏ
Ｒ１エンドヌクレアーゼで消化した。ＨＢ　Ｖ　−Ｄ　
Ｎ　Ａ部分を分取用ゲル電気泳動で再分離し、′電気溶
離し。

そしてＳ７Ｃで０５〜６０分間の時間を変化させて工牛
ソヌクレアーゼＩｔａｒ’　　５　＋で消化した試料に
分割した。工牛ソヌクレアーゼパ）範囲は各試料の一部
をＸｂａｌ工／ドヌクレアーゼで消化することによって
Ｐ■的、こ、トｌ＋徴・５１すｒ−１れた。Ｓ−プロテ
ィンコード−２）汀８１ハ［出発コードンの最初のへ基
から９２鳴活企開始するＸｂａ１位置を含有する。それ
（小えＩｌ；＋（！　−５１消化がＸｂａ１位置より前
にあ乙試料はＸｂａｌエンドヌクレアーゼ培養後、ゲル
電気を水動の際１フラグメントだけを生成するし１、−
　方、除去される小さい方の塩基は２種頑のフラグメン
ト、類似の大フラグメントおよび異なった大きさの小フ
ラグメントを生１戊することになる。１つのＸｂａｌフ
ラグメントだけを生成する試料を捨てた。２つの大きさ
のフラグメントを生じる試料は全部で４つのデオ牛ジヌ
クレオチドトリホスフェートの存在下１）　Ｎ　Ａポリ
メラーゼ１（クレノウフラグメント、クレノウ等のＰｒ
ｏｃ、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　　矛６５巻。

矛１６８頁（１９７０年）で塙養することによってプラ
ント終結した。ＥｃｏＲ１認識部位をＴＡ　ＤＮＡ　　
リガーゼを用いてプラント終末リゲーションによって添
加した。ＢｃｏＲ１特異相補末端がＢＣＯＲ１エンドヌ
クレアーゼで消化することによって生じた。変更ＤＮＡ
をゲル電気泳動によって分離し、ＤＮＡリガーゼ接触作
用を及ぼす反応でＥＣＯ几１−消化アルカリ性ホスファ
ターゼ処理ｐＢ几３２２に連結した。

次に組換型プラスミドを大腸菌１−（Ｂ　−１０１を形
質転換するために用いた。スクリーニングおよび縮小５
°−未翻訳部分を有するクローンを特徴づけるために二
つの方法を使用した。

最初に個々の集落をプローベとして標識Ｓ−プロティン
コードづけＤＮＡを用いるその位置での集落雑種形成に
よってＳ−プロティンコードづけ部の存在をスクリーン
した。Ｓ−プロティンコードづけ部の存在に対して陽性
の集落スクリーニングは媒介体ＤＮＡを調製する培養を
開始するために用いた。媒介体ＤＮＡを８−プロティン
コードづけ部を除去するためにＥｃｏＲ１エンドヌクレ
アーゼによって培養した。このように調製したＳ−プロ
ティンコードづけＤＮＡをＸｂａ　１　エンドヌクレア
ーゼ消化によって、または５１−末端配列のＤＤＮＡ配
列分析によって生じるフラグメントの大きさを決定する
ことによって分析した（マクサム、Ａ９等のＰｒｏｃ、
Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ牙７４巻、矛５６０
頁（１９７７年））。

牙ニスクリーニング方法は５−未翻訳部を完全に除去し
ているが、または出発コードの１つの塩基ショートを末
端にしているクローンを検出するために用いた。方法は
１ＪｃｏＲｉリンカ−オリゴヌクレオチド（（１（］Ａ
ＡＴＴＯＯ）に連結したとき、Ｓ−プロティンコードづ
け配列の最初の４つの塩基が制限エンドヌクレアーゼＮ
ｅｏＩ　　：　０ＣＡＴＧＧに対する標識サイトを生じ
るという観察を利用した。このように生じたＮｃｏｌサ
イトはｐＢＲ３２２かＳ−プロティンコードづけ部がＮ
ｅｏ　Ｉサイトを含有しないために媒介体に特有のもの
である。それゆえＢａ１−３１消化がＡＴＧ出発ニート
ンで正確に終端したあらゆるＳ−プロティンコードづ打
部分はＢｃｏ几１リンカ−オリゴヌクレオチドに連結し
たとき新しいｐＪｃｏ　Ｉ　　サイトの発生によって特
徴づけられるのである。あいに（ＨＢＶ−ＤＮＡで５１
−未翻訳部において８−プロティンのＡＴＧ出発コード
ンに隣接したＣ残渣がある。それゆえ５゛−未翻訳部の
最後のＣだけを維持するＢａＡ’　−３１消化物がＢｃ
ｏＲ１リンカ−オリゴヌクレオチドに連結した場合Ｎｃ
ｏ　ｌ標識サイトもまた生じる。これらの二つの特異構
造はＮｃｏ　ｌとＸｂａ　Ｉエンドヌクレアーゼの組合
せを有するクローンを培養することによって、次に発生
するフラグメントがあるならばゲル電気泳動によってス
クリーンした。それゆえ９６塩基対フラグメントを生成
するそれらのクローンは全部をまたは除去された、しか
しＡＴＧ出発コードンを維持された５１−未翻訳塩基の
一つを除く全部を有するように選択された。そのとき正
確な配列がマクサム等操作を用いるＤＮＡ配列分析によ
って確認された。ＢｃｏＲ１位置で除去され、挿入され
たＳ−プロティン遺伝子の完全な５°−未翻訳部を有す
る改質ＨＢＶ部分とｐＢＲ３２２を結合している生成プ
ラスミドはｐＨＢｓ５−３と呼ばれた（矛４図参照）。

ｐＨＢｓ　５−３のＨＢＶ−ＤＮＡ部分はまた６＋終端
でのＢａ１−６１エキソヌクレアーゼの付随作用のため
に３°未翻訳部の約４０塩基対の除去によって付随的に
変更された。

実施例２で記載したｐＨＢｓ　１６に類似の表現媒介体
構造はｐＨＢｓ　１６の対応部分の代わシにｐＨＢｓ　
５−３の変更ＨＢＶ−ＤＮＡ部分の挿入によって行なわ
れた。この目的のために′°１６−型１１媒型体１媒介 化および再すゲーションによって調製し、次にＨＢＶ−
ＤＮＡを検出する媒介体に対して選択した。１６型媒介
体のＥＣ０ＲＩサイトにおける変更Ｈ　Ｂ　Ｖ　−　Ｄ
　Ｎ　Ａ部分の挿入によって構成された表現媒介体を消
化ｐＨＢｓ　１　６−Ｘにによって特徴づけたｏ’　ｘ
はＥｃｏＲ　１サイトにおいて挿入されたＨＢＶ−ＤＮ
Ａ変更を特徴づける番号である。従ってｐＨＢｓ　５　
−　５から１．６媒介体まで運搬されるＨＢＶ−ＤＮＡ
部分はｐＨＢｓ　１６　−　３と呼ばれる表現プラスミ
ドを生じた（矛５図参照）。全構造をＢａｎｄ（Ｉおよ
びＸｂａ　１　エンドヌクレアーゼ消化を有する混合消
化によるＡＤＨ　１プロモー゛ターに関してＳ−プロテ
ィンコードづけ部の正しい指向にスクリーンした。正し
い指向は長さが約１６００塩基対のＢａｍ　−　Ｘｂａ
フラグメントを生成し、間違った゛指向はより長いフラ
グメントを生成した。

１６系表現媒介体に対する宿主菌株はサツ力ロミセスセ
レピシアエＡ　Ｂ　３　５　−　Ｄ　３　−　１）ａ　
、　ｌｅｕ　２　−　！＋　、　ｌｅｕ　２　−　１　
１　２　、　ｕｒａ　５　−５　２　、　ｔｒｐｌ　　
−　２　８　９　、　ｈｉｓ　４　−　５　８　０　　
。

ａｄｅ　２またはサツ力ロミセスセレビシアＩ　ＡＢ３
５−１４−Ｄであった。ｐＨＢｓ　１　６　　またはｐ
ＨＢｓ１　６　−　５で形質転換された宿主菌株Ｏ試料
培養を等価条件下で増殖し、Ｙ　−　１１１３ｓＡｇを
実施例３で記載したようなラジオイムノアッセイによっ
て質的に検定した。ｐＨＢｓ１６−３で形質転換された
細胞はｐＨＢｓ　１　６によって形質転換されたものと
細抱当り約２２倍のＹ−）ＩＢｓＡｇを生成した。

実施例　５。

実施例４で記載した媒介体構造の変更をさらに行ない、
Ｂａ１−　５　１消化の間に除去された３°−未翻訳部
が回復された。この構造の方法はＳ−プロティンコード
づけ部内部のＸｂａ夏サイトで完全な６”−未翻訳部を
有するｐＨＢｓ５からの未変更フラグメントとともに実
施例４で記載したように変更したｐＨＢｓ　５　−　３
から誘導されたコードづけ部フラグメントを組合わせる
ことであった。

５−未翻訳部およびＳ−プロティンコードづけ部のプロ
モーター近位部分を含有するｐ（出８５のＨ　Ｂ　Ｖ　
−　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉｆＢ分を０ｌａｌエンドヌクレアー
ゼの連結作用によって除去した。プラスミドをまず０ｌ
ａＩエンドヌクレアーゼで開裂した。生成不対終端を４
つのデオ牛ジヌクレオチドトリホスフェートの存在下Ｄ
ＮＡポリメラーゼ１クレノウフラグメントを用いて充填
してプラント末端を有する線状媒介体を生成した。次に
ＤＮＡをＸｂａ　ｌエンドヌクレアーゼおよびアルカリ
性ホスファターゼで消化した。後者の処理は前の系の段
階によって生じた末端がＤ’ＮＡリガーゼの存在下圧い
に再連結することができないことを確立するだめのもの
である（上記シャイン、Ｊ、）。

Ｓ−プロティンに対するコードづけ部のプロモーター近
位部分を含有するｐＨＢｓ　５−５の変更ＨＢＶ−ＤＮ
Ａを連続エンドヌクレアーゼ消化によって調製した。プ
ラスミドｐＩ（ＢＳ　５−３をまずＢｃｏ几１エンドヌ
クレアーゼで開裂し、４つのデオ牛ジヌクレオチドトリ
ホスフェートの存在下ＤＮＡポリメラーゼ１クレノウフ
ラグメントでプラント終末にした。次にＤ　Ｎ　Ａ　′
ｔ−Ｘｂａエンドヌクレアーゼで開裂した。

Ｘｂａｌ開裂、プラントＥｃｏＲ１終端およびＸｂａ　
１終端を有する約１００塩基対から生成する小フラグメ
ントをゲル電気泳動ち・よび電気溶離によって分離した
。両方の場合連続エンドヌクレアーゼ処理の目的は１０
０塩基対フラグメントが開裂媒介体ＤＮＡと正しい指向
で連結することを確立するためであった。ｐＨＢｓ　５
−３から誘導される１００崖基対フラグメントをプラン
ト末端リゲーションを可能にする条件下ＤＮＡリガーゼ
の存在下ｐＨＢｓ　５から誘導される変更媒介体ＤＮＡ
並びにＸｂａ　ｌカットから誘導される対になった終端
の連結と混合した。形質転換を選択し、ｐｌ（ＢＳ　５
−３からの小フラグメントから誘導されるＮｃｏ１サイ
トの存在によって同定された（実施例４参照）。

Ｎｃｏｌサイトに隣接したＥｃｏＲ１サイトが使用した
構造方法によって再゛生ずることが予期された。しかし
な゛がら、充填ＥｏｏＲ・１サイトの１つの塩基対はＤ
ＮＡポリメラ：−ゼ処理で再生しなかった。従ってＥｃ
ｏＲ１サイトは予期したように再生しなかった。しかし
ながら偶然にも再連結した配列は０１ａｌサイトを再生
した。矛５図で図示されるｐＨＢｓ６と呼ばれる生成媒
介体のＤＮＡヌクレオチド配列分析は、媒介体のＨＢＶ
−ＤＮＡ部がｐＨＢｓ５−３に対して記載されるような
５゛未翻訳部の検出とともに完全なＳ−プロティンコー
ドづけ部および３”未翻訳部を含有することが確認され
た。

ｐＨＢｓ　６でのように変更したＨＢＶ−ＤＮＡ部分は
次の通り１６系の表現媒介体に運搬された。ｐＨＢｓ６
のＨＢＶ−ＤＮＡ部はＮｃｏｌおよびＥｃｏ几１エンド
ヌクレアーゼの混合作用によって分離され、４つのデオ
牛ジヌクレオチドトリホスフェートの存在下ＤＮＡポリ
メラーゼ■クレノウフラグメントで培養することによっ
てプラント終末された。生成した８２０塩基対フラグメ
ントをゲル電気泳動および電気溶離によって分離した。

実施例４で記載された表現媒介体ｐＨ８８１６または°
°１６媒介体°“をＥＣ０Ｒ１工ンドヌクレアーゼ作用
によって開裂し、４つのデオ牛ジヌクレオチドトリホス
フェートの存在下ＤＮＡポリメラーゼエクレノウフラグ
メントを用いてプラント終末にし、アルカリ性ホスファ
ターゼで処理した。次にＨＢＶ−ＤＮＡ７ラグメントを
Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いるプラント終末リゲーショ
ンによって処理１６媒介体に連結した。フラグメントの
正しい指向はＳ−プロティンコードづケ部のＡＤＨプロ
モーターと出発コードンの間にＥＣ０Ｒ１サイトを再生
した。ＤＮＡヌクレオチド配列分析は、ｆ５図で図示さ
れるｐＨＢｓ１６−５と呼ばれる生成構成物の構造を確
認して実施された。

ｐＨＢｓ１６−５によって形質転換された酵母細胞に対
するＹ　−ＨＢｓＡｇの表現の相対割合は実施例４で記
載したｐＨＢｓ　１６−３に対するのと同一条件下で測
定した。ｐＨ１３ｓ　１６−５によって形質転換された
サツ力ロミセスセレビシアＩ　ＡＢ−３５−Ｄ３−Ｄに
よるＹ　−ＨＢｓＡｇの表現はｐＨＢｓ　１６で形質転
換した細胞による表現よりラジオイムノアッセイで測定
した通り１細胞当り約２．８倍多かった。

ｐＨＢｓ６１７）ＨＢ　Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａ部分を用いる
関連構造はＨＢＶ−ＤＮＡフラグメントがいくらかのＥ
ｃｏＲｌ　　活性を有−するＥｃｏ几１エンドヌクレア
ーゼ調製によって除去されるのを除く同じ操作を用いて
実施した。前に記載したように調製した１６媒介体でリ
ゲーションの後、表現媒介体がｇｃｏＲ１サイト並びに
Ｓ−プロティンコードづけ部のＡＴＧ出発コードンに隣
接したＮｅｏ　Ｉサイトを失うことを見出しだ。

生成した表現プラスミドはｐＨＢｓ　１６−４と呼ばれ
た。Ｓ−プロティン出発コードンに隣接したヌクレオチ
ド配列は５’００．ＡＣＴＡＴＣＴＧＧＣ！ＡＴＧＧ０
．、３”であった。ｐＨＢ５１６−　４で形質転換され
た酵母細胞の表現の割合は実験誤差内で１）ＨＢＳｌ　
６’−５形質転換細胞のそれに匹敵した。ｐＨＢｓ１６
−４の構造は牙５図に図示される。

ｐＨＢｓ　−１６−３のＳ−プロティン出発コードンに
隣接したヌクレオチド配列は５’、、、　ＡＣＴＡＴＯ
ＴＧＧＡＡＴＴＣＯＣＡＴＱ（］　、、、３’であった
。１６−６と１６−５間の配列差異はｐＨＢｓ−６のＥ
ｃｏＲ１消化後、Ｉ）　Ｎ　Ａをプラント終末している
配列であった。

実施例　６゜ この実施例はＡＤＨプロモーターとＡ　Ｄ　Ｉ（読み終
り暗号の間にはさまれたＳ−プロティンコードづけ部を
有する酵母Ａ　Ｄ　Ｈ遺伝子のプロモーターおよび転写
読み終り暗号配列からなるＤＮＡ部分とともに、それら
の配列内に完全な２μ環プラスミドＤＮＡ配列を有する
ことによって特徴づけられた表現の媒介体系の構造の詳
細を記載する。これらの媒介体は°°５６′系媒介体と
呼ばれ、それらの命名は１６系の表現媒介体の命名と一
致している。

従って表現ベクトルｐＨＢｓ　１６−５はｐｉＢｓ　１
６−３に対して記載されたように変更したＳ−プロティ
ン遺伝子を含有し、一方ｐ…３Ｓ５６−−５は実施例４
および５で各々記載されたｐｌ−ＩＢＳ１６−５に対し
て記載されるように変更しだＨＢＶ−ＤＮＡを含有する
。十分な長さの２μＪＪｉＤＮＡは代謝選択圧なしで環
のない宿主菌株において安定な複製を提供する。Ａ　Ｄ
　Ｈ読み終シ暗号はＳ−プロティンｍＲＮＡ転写の安定
性を高めるために提供された。５６型媒介体の構造に対
する親プラスミドはｐｃｌ、／１であシ、ｐＢ几−３２
２とＥｃｏＦＬ１サイトで連結した２μ項プラスミドの
間の雑種プラスミドであった。２μ環プラスミド部分は
前に酵母の挿入ＬＦｉＵ２遺伝子を含有するために変更
され、ベック、Ｊｏ等のＮａｔｕｒｅ　牙２７５巻、矛
１０４頁（１９７８年）によって記載されるプラスミド
ｐＪＢＤ　２１９から得られた。ｐＣ１／１の制限地図
を矛６図に示す。

エンドヌクレアーゼＳｐｈ　ｉでのｐｃ１／１の消化が
２μｍｐＢＲ−５２２連結点を走査するプラスミドの一
部を検出することが矛６図から見ることができる。ＡＤ
Ｈ１プロモータ一部の活性部分が約６００塩基対の長さ
の５ｐｈｌＨｉｎｄｌ内に含有することが観察された（
ベネツツエン、Ｊ、Ｌ、およびホール、Ｂ、Ｄ、、　Ｊ
、Ｂｉｏ４Ｃｈｅｍ、矛２５７巻、牙３０１貞（１９８
２年〕によるＡＤＨ１遺伝子の配列参照）。Ｓｐｈ　ｉ
に対する認識配列はＧＯＡＴＧＣであり、かかる配列は
位置−４１λで開始するＡＤＨプロモーターに存在する
。同様に酵母読み終シ暗号配列は約６６０塩基対のＨｉ
ｎｄ　＊　ｓｐｈ　１フラグメント内に含有した。両方
の場合５ｐｈｌサイトはコードづけ部に末端であるので
ＨＢ　ＶＳ−プロティンコードづけ部は終端でＨｉｎｄ
ｌサイトであるならば、それらの間に挿入することがで
きた。Ａ　Ｄ　Ｈプロモーターおよび読み終シ暗号部分
に対する前駆物質源はヌクレ上記ヒツツエマン、　Ｒ，
Ａ０等〕およびＡ　Ｄ　Ｈ遺伝子ヌクレオチド配′列め
約４５０塩基対読み終り暗号単位ヌクレ“オチド９１’
２−１３６８からなるプラスミドＰＡＡＨ５であり、フ
ラグメントの間の１−１ｉｎｄｌによって連結され、媒
介体ＹＥｐ１３のＢａ□１サイトにクローンされた（ブ
ローチ、Ｊ、およびヒツクス、Ｊ、ｑｅＩＩＣ１′８巻
、牙１２１頁（１９７９年〕。ｐＨＢｓ５のＩ（ＢＶ−
ＤＮＡ部分をＥｃｏＲ１消化によって除去した。突出し
ている末端をＤＮＡポリメラーゼエクレノウフラグメン
トを用いて充填し、０ＡＡＧＯＴＴＧを有するＨｉｎｄ
１ｇリンカ−オリゴヌクレオチドをもつ両末端で連結し
た。Ｈ−１’３Ｖ−ＤＮＡ部分の不対Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｌ
特異末端を露出するためにＨｉｎｄｌエンドヌクレアー
ゼ消化後、セグメントをＢｉｎｄｕカットプラスミドｐ
Ａ、用５に連結し、それによってＡＤＨプロモーターと
読み終シ暗号フラグメントの間にＨＢ　Ｖ　Ｓ−プロテ
ィンコードづけ配列を配置した。制限分析によって決定
される通り、プロモーターおよび読み終り暗号フラグメ
ントに関して正しく指向のＳ−プロティン遺伝子を有す
るプラスミドをｐＨＢｓ−２２と称した。Ａ　Ｉ）　Ｈ
プロモーターおよび読み終り暗号配列が各々Ｓｐｈ■エ
ンドヌクレアーゼで消化することによってＡＤＨ１プロ
モーターの４００塩基対、［ＩＢＹ　Ｓ　ｌプロティン
部およびＡＤＨＩ読み終り暗号の約３３０塩基対からな
る完全な複合遺伝子を除去することが可能なｓｐｈ　Ｉ
サイト（認識配列ＧＣＡＴＧＣ）を含有することを見出
した。ｓｐｈ　Ｉエンドヌクレアーゼを有するｐＨＢｓ
　２２の消化は約１５００塩基対のフラグメント中に完
全な複合遺伝子を生成した。フラグメントをＳｐｈ　Ｉ
−カット媒介体ｐＣ１／　１で連結した。ｐｏｌ　／　
１の５ｐｌｔ＋エンドヌクレアーゼ消化によって除去し
た部分がｐＢｌ’Ｌ　３２２部分のテトラサイクリン耐
性遺伝子の一部を検出したことから、大腸菌）ＩＢＩＯ
Ｉ被形質転被形全転換体シリン耐性およびテトラサイク
リンに対する感受性をスクリーンした。ｐＨＢｓ５６と
称される生成媒介体の構造をさらに制限分析によって確
認した。リガーゼ反応の生成物から得た大腸菌Ｈ，Ｂ１
０１被形質転換体をアンピシリンを含有するプレート上
でクローンにした。培養で増殖した単一集落分離物から
のプラスミドＤＮＡを８−プロティンコードづけ部挿入
および正しい指向に対する制限エンドスフレアーゼ分析
によってスクリーンした。選択されたプラスミド、ＡＤ
Ｈプロモータおよび読み終り暗号セグメントに関して正
しい指向でＨＢＶ８−プロティンコードづけ部を含有す
るｐＨＢｓ−５６をオ６図に示す。

さらに二つの５６型媒介体をｐＨＢｓ１６−３およびｐ
ＨＢｓ１６−５から寿たＳ−プロティンコードづけ部分
のプロぜ一ターフラグメントおよびプロモーター近位部
を用いて構成した。

これらの構造は、各々ｐＨ８８５６−５およびｐ＋ｓ　
　ＨＢ８５６−５と呼ばれた。両方の場合、５ｐｈＩ−
味 −ｘｂａＩフラグメントをｐＨＢｓ５６の消化によって
得た二つの５ｐｈＩ　　−ｘｂａＩ　　の大きい方とＤ
ＮＡリガーゼ接触作用を及ぼす反応で連結した。大きい
方の７ラグメント約１０８０塩基対はＳ−プロティンコ
ードづけ部内０ｘｂａＩサイトからＡ　Ｉ）　Ｈ読み終
り暗号部の５ｐｈＩサイトまで延長する。このフラグメ
ントをＤＮＡリガーゼ接触作用反応でｐＨＨ８１６−５
またはｐＨ８８１６−５の５ｐｈＩ−ｘｂａＩフラグメ
ントに連結する前にゲル電気泳動および電気溶離によっ
て分離した。従って、構成された二つの複合遺伝子は、
各源泉媒介体、各々ｐＨＢｓ１６−３およびｐＨＢ５１
６−５の差異から生じるＡＤＨプロモーターとＳ−プロ
ティン出発コードン間の５°−未翻訳部の配列のこれら
の差異を除いて同一であった。両複合遺伝子は、複合遺
伝子ＤＮＡの増幅量を得るためにｐＨＢ５２２のＢａｍ
ＨＩサイトと８ａｌ　Ｉサイトの間に位置しているｐＨ
Ｂ３２２の５ｐｈＩサイトで別々の反応でサブクローン
にした。

サブクローニング媒介体を７ムピシリン耐性および大腸
菌ＨＢ１０１被形゛質転換体に対するテトラサイクリン
感受性表現型を与える能力によって選択した。

最終段階でｐＨ８８５６の８１’＋　ｈ　Ｉ開裂によつ
て生じた大フラグメントをアルカリ性ホスファターゼで
処理し、ゲル電気泳動をよび電気溶離によって分離した
。同様に、複合遺伝子をｓｐｈ　Ｉ開裂によるサブクロ
ーニング媒介体から除去し、ホスファターゼ処理せずに
、ゲル電気泳動および電気溶離によって分難した。

これらは、別々の反応でｐＨＢｓ５６の５ｐｈＩ大フラ
グメントと混合し、各々Ｉ）ＨＢＳ５６−６およびｐＨ
Ｂ５５６−５を生成するＤＮＡリガーゼ接触作用反応で
連結した。大腸菌ＨＢ１０１被形質転換体を７ムピシリ
ン耐性およびテトラサイクリン感受性によって選択し、
制限分析によってさらに特徴づけた。関連媒介体の構造
段階および地図の図をオフ図に示す。５６型媒介体の命
名は、１６型媒介体のそれと類似しているが、５６系媒
介体の場合の差異が各場合の５°未翻訳部にだけ言及し
、３°未翻訳部が系の各部分と同一であることは理解さ
れるものである。特にｐＨＢ５５６−３はｐ　ＨＢ　Ｓ
−１６−６で生じる６°未翻訳部の４０塩基対欠失を欠
いている。

クローニング選択および特徴づけ後、５６系の媒介体を
２１５０−２−３と呼ばれる環ノ のない酵母菌株を形質転換するだめに甲いた。

菌株を菌株Ｙ　３７９−５−　Ｄ　ｃｙｈ２　ｎ１ｂｌ
　（ｒｈｏ−）リビングストン、Ｄ、Ｇｅｎｅｌｉｃｓ
オ’８６巻、牙７３頁（１９７７年）およびｂｃ　０４
　ａ　Ａｄｅｌ　ＡｄｅＸｌｅｕ２−０４　（ｃｉｒ’
）　（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　０ｃｌｌｌ、矛２１巻、
牙５０１頁（１９８０年〕の間の遺伝交雑から誘導され
た。交雑から生成する二倍体囚株を胞子形成させ何分子
を標準操作で部分した。生じた一倍５体胞子は菌株２１
５０−２−５　ａ’Ａｄｅｌ　ｈｅｕ２−０４　（ｃｉ
ｒ’　）になる。

酵母被形質転換体をｐＨＢｓ　−５６系のプラスミドの
存在によって与えられるｈｅｕ表現型に対して選択した
。

種々のプラスミド−宿主の組合わせのＹ−ＨＢｓＡｇ表
現の相対割合は次の操作で比較した。

細胞培養１ノ容量を限界細胞密度に増殖し。

細胞を上記に記載したラジオイムノアッセイを用いて全
溶解性蛋白質に対しておよびＹ−ＨＢＳＡｇに対して分
析した粗溶屑物に回収した。

結果を培養１１当りのＹ　−ＨＢｓＡｇｕｇとして両方
を、そして全酵母溶解性蛋白質げ重量％としてＹ　−Ｈ
ＢｓＡｇを表わした。後者はＹ−ＨＢ８Ａｇ産生に委ね
られた細胞代謝量の測定を提供し、一方前者は限界密度
に培養増殖時に得られるＹ　−ＨＢｓＡｇの全収量の測
定を提供する。これらの媒介体を担持する細胞が選択圧
のなしで栄養分のある培地で増殖されるが、１６および
２５系媒介体が未形質転換分離物の蓄積を阻むためにト
リプトファンのない限定培地での増殖を必要とするため
に５６系媒介体の場合に差異が生じる。結果は添付の表
に示す。

表に示されるＹ　−ＨＢＳＡｇの重量はＨＢｓＡｇに対
して生じた抗体を用いて市販のラジオイムノアッセイに
よって定量した。それ故報告されるＹ　−ＨＢｓＡｇ量
は集団の絶対的な量ではなく比較のために実質的に一致
するものとみなすことができる。

Ｙ−ＨＢｓＡｇ収量 〃 １６−３　　ＡＢ−３５−１４Ｄ　　　２．ＯＤ、１％
　　　　２０１６−４　　ＡＢ−５５−１４Ｄ　　　２
．０　　０．１％　　　　２０１６−５　　ＡＢ−５５
−１４Ｄ　　　２．０　　０．１％　　　　２０２５　
　　ＣＭ−３０−２４，００，５％　　　２００５６　
　２１５０−２−５　１２．０　　０．３％　　　６０
０実施例　Ｚ Ｙ　−ＨＢｓＡｇ粒子を実施例乙の方法によってまたは
、例えば米国特許第４，０８８，７４８号または同牙４
，１８１，７１３号に記載されるような当該技術に公知
の適、当な方法によって細胞抽出物から精製する。精製
ＨＢｓＡｇ粒子を生理的食塩水またはリン酸塩緩衝食塩
水に対して透析し。

最終濃度１００μＩ蛋白質／ｍｌに調節する。

モルモットをＺＩＢｓＡｇ製剤１　ｍｌで９１４および
５６日間隔で皮下に受けさせ、ディン粒子またはアレ牛
サンダー細胞から精製したＨＢｓＡｇに対する抗体力価
を検定する。実施例６で記載したラジオイムノアッセイ
を使用し、他方ではホリガー、Ｆ０等のＪ、Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、矛１０７巻、矛１０９９頁（１９７１年〕のラジ
オイムノアッセイを使用する。大部分の動物が粒子の投
与８４日後にＨＢｓＡｇと交互反応する抗体を示す。同
様の結果がサルの注射の際、に得られる。従って酵母で
合成したＨＢｓＡｇは免疫原性であり、天然のＨＢｓＡ
ｇと交互反応する抗体を惹起することができる。

酵母によって合成されたＨＢＳＡｇはディン粒子または
保菌者の血清から得られるよりも重要にも大量に人手で
きるという利点を有する。

より均質な産生物が１単位当り有利な価格で得られ、生
産量が増加するにつれて低下することを予期することが
できる。さらにぞの上酵母から調製した表面抗原には完
全なＨＢＶがなく、完全なＨＢ　Ｖであることができな
いことから、偶発感染の危険がない。対照的に血清また
は池の天然様から精製されるウィルス蛋白は常にウィル
ス汚染の危険がある。

実施例　８゜ 実施例７で示されるように酵母によって合成されたＨＢ
ｓＡｇは天然ＨＢ　ｓＡｇと交〃反応する抗体を惹起す
ることができる。それゆえ記載されるように精製し、生
理的に使用し得る培地に投与した場合、かかる抗原およ
び抗原集合体はＢ型肝炎ウィルスに↓る感染に対する防
御に対するワクチンを構成することになる。

１６匹のチンパンジーを６グループに分ける。Ａグルー
プ（６匹の動物〕に標準ブレアラ（Ｂｕｒｅａｕ　）の
生物学的Ｂ型肝炎ウィルス製剤１ｍｌを静脈に接種する
。Ｂグループ（４匹の動物ンに生理食塩水中酵母で合成
され実施例３で記載される通シ精製したＨＢｓＡｇ　２
００μｇ　を含有する１ｍｌを静脈に接種する。Ｃグル
ープ（６匹の動物）は対照グループであり、接種を受け
ない。Ａグループの全チンパンジーは４０週以内で臨床
Ｂ型肝炎（抗原血症、酵素隆起および／または抗体応答
）が明白である。ＢおよびＣグループの動物はいずれも
同じ４０週間にわたって臨床Ｂ型肝炎感染を明白に示さ
なかった。ＢグループのチンパンジーはＢ　ＯＢＢ型肝
炎ウィルス１．０　ｍｌを静脈接種する場合法の攻撃に
対する免疫となる。

実施例　９ Ｙ　−ＨＢｓＡｇは血漿誘導ＨＢＳＡｇといくつかの点
で異なった。ＨＢｓＡｇおよびＹ　−ＨＢｓＡｇ粒子の
直径は陰性染色電子顕微鏡写真から測定された。酵母誘
導抗原は約１４〜１８　ｎｍの直径を有し、一方血漿誘
導抗原は約２０〜２４ｎｍ　の直径を有した。

Ｙ　−ＨＢＳＡｇはｐＨ２でおよびｐＨ２においてペプ
シンに不安定であるが、血漿誘導）１ｆ３　ｓ　Ａ　ｇ
は同一条件下で安定であった。ｐＨを２．０に低下させ
るためにＩ　ＮＨＣＶ　０．０３１ｎｌを精製Ｙ−ＨＢ
ＳＡｇの１耐懸濁液に添加した。試料を半分に分け、１
／２の一つにペプシン１μｇを添加し、−万能の１／２
には酵素を添加しなかった。

両方の試料を３７Ｃで１６時間医持重１次にｐＨをｚＯ
に上げるために各々にＩ　ＮＮａ０ＨＯ，０３ｍｌを添
加した。一つの試料を歌的ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ）で抗原結合活性に対して測定した。ＲＩＡ活性の９
５％以上が各試料で失われた。同一条件下血漿誘導ＨＢ
ｓＡｇは抗原結合活性のすべてを保持した。

ｖＩ’ＲＹ　−ＨＢｓＡｇの試料をナトリウムドデシル
サルフェト（ＳＤＳ　）および２−メルカプトエタノー
ル中９０Ｕで５分間加熱した。次に０．１％Ｓ　１）　
Ｓを含有する１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動
させた。次に蛋白質染色でのゲル染色は約２５，０００
の分子量等価位置にシングルバンドを示した。同様に処
理した血漿精製ＨＢＳＡｇ試料は染色置部、つのバンド
、約２５，０００ダルトンで−バンドおよヒ約２８，０
００ダルトンで矛−バンドを示しだ。血漿誘導１■Ｂ５
Ａｇと異なる”ｌ’　−１１１１ｓＡｇは、ＨＢｓＡ、
ｇに対して選択された単りローン性抗本（ＨＢｓＡｂ　
）に結合しなかった。表面抗原を含有する酵母細胞の粗
抽出物をアガロースゲルに単クローン性ＨＢｓＡｂを化
学的に共役することによって調製した親和性吸着カラム
に通過させた。カラムに充填しだＹ　−ＨＢｓＡｇをカ
ラム溶出液中充填抗原１０％以下を示す単クローン性Ｈ
Ｂ　ｓ　Ａｂの同一カラムに通過させた。

Ｙ　−ＨＢｓＡｇはマウス効力試論でさらに高い活性を
示した。Ｙ　−ＨＢｓＡｇを投与前：て水酸化アルミニ
ウムゲルに吸着させ、１０，２．５゜０．６２，０．１
５および０．０３７５　１１ｇ／　ｍｌを含有するよう
に希釈した。前述の濃度の１ｍｌ量を生後５週間の雌の
マウスの５つのグ！レープの各々に腹腔内に注射した。

これらの濃度の各々を各グループが１０匹のマウスを含
有する５グループの一つに注射した。酵母産生抗原はｇ
Ｄ、ｓｏ　　（抗原濃度をマウスの１．／２に抗体を産
生するために必要とした。）約０，０５μｇ　／　ｍｌ
を有する一方、同一操作で血漿誘導抗原はＥＤ５Ｑ約５
Ｑμｊｊ　／ｍｌを有した。

記載したように精製したＹ−ＨＢｓＡｇは実質的に汚染
化学薬品がなかった。Ｙ　−ＨＢｓＡｇのローリイ蛋白
質の測定値は５６μ９７ｍ１を示し。

一方この抗原のＲＩＡ抗原結合能測定呟は１２μｐ／ｒ
ｎｌ濃度を示しだ。血漿誘導１（ＢｓＡｇの純粋製剤の
ローリイ蛋白質およびＲＩＡ抗原結合能の測定値は蛋白
質濃度４４μｇ　／　ｍｌおよび結合活性５０μｌ　／
　ｍｌを示した。

ｐＨＢ５−１６　、−２５まだは　５２で形質転換した
細胞から産生したＹ　−ＨＢＳＡｇの物理的、化学的ま
だは抗原特性に差異は見られなかった。

実施例１０ ８０匹の生後５週間の雌のマウス全部を４０匹の二つの
グループに分け、さらに各グループを１０匹のマウスの
す／グループに細別した。各サブグループの１０匹のブ
ウスに媒介体ｐＨＢ８−２５を用いる実施例３から調製
した抗原または血漿誘導抗原を各々１０，２．５゜０６
２５または０１５６μｌ／　／　ｍｌの濃度で腹腔内に
注射した。食塩水−ミョウバンプロセボーを前述の濃度
を得るために必要な抗原濃度を希釈するために希釈剤と
して用いた。マウスを個々に出血させ、２８日で犠性に
した。

抗体決定をアラサブ（アボット）ラジオイムアッセイに
よって行なった。血清学的結果を次の表に要約し、力価
は推定アラサブ単位（”　Ｅｓｔｉｍａｔｅｄ　Ａｕ５
ａｂ　Ｕｎｉｔｓ　”　）として表わす。

８、８０００ 実施例　１１゜ 研究 ３２茜の７フリ力ングリーンモンキー全部を１６匹の二
つのグループに分け、さらに各グループを４匹のモンキ
ーのサブグループに細別した。各サブグループに、濃度
を得るために必要な控原濃度を稀釈するために稀釈剤と
して食塩水−ミョウバンプラセボーを用いて各々ｉ０，
２．５，０．６２５　　または０．１５６／４９／／ｍ
ｌの濃度で酵母誘導抗原または血漿誘導抗原を０および
２８日に筋肉内に注射した。出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ　
）を１４週間に１回の間隔で集め抗体決定を＠Ｅｓｔｉ
ｍａ’ｔ′ｅｄＡｕｓａｂ　Ｕｎｉｔｓ”で表わされる
力価でアラサブ（アボット）放射線免疫検定によって行
なった。結果を次の表に要約する。

一般的な結論所見 本発明は、組換型ＤＮＡ技術を適用して実質的進歩を説
明するものである。微生物宿主においてＨＢｓＡｇを合
成する実用的目的が達成された。当該技術の通常技術の
範囲内になるＨＢ　ｓＡ　ｇ産生の増加および精製時の
ＨＢｓＡｇの収量の改良のだめの変更は、クレームした
発明の範囲内で等価変形と考える。かかる変更の具体例
は、改良されたプロモーター系、さらに生産的な宿主細
胞菌株、精製技術の改良および生産物の抗原性または免
疫原性を改良するための変更を包含することができた。

これらの研究で使用した微生物は酵母であるが、あらゆ
る真核性微生物が十分蓋の抗原が合成されるという条件
でＨＢｓＡｇ粒子を産生ずるための宿主菌株として適す
るとみなされる。使用される他の真核性微生物の具体例
としては、アスペルギルス属、アオカビ属およびニュー
ロスポラ属並びにサツカロミセス属の一部を包含するが
それらに限定されない。

次のプラスミドおよび形質転換酵母菌株をアメリカンタ
イプ力ルチュ７コレクション、１２５０１パークラウン
ドライブ、ロックビル、Ｍｄ、　２０８５２．　Ｕ、Ｓ
、Ａ、に寄託した。

１、　プラスミドｐＨＢ５−１６ ６、　プラスミドｐＨＢ５５６ ４、　プラスミドｐ　ＩＩ　Ｂ　Ｓ　１６−５８、　プ
ラスミドｐ　ＨＢ　８１６−４９　プラスミドｐＨＢｓ
１６．−５ １１、プラスミドｐＨＢｓ５６−５ 寄　託　日　　　　　受は入れ番号 １９８１年８月　４日　　　　４００４３１９８１年８
月　４日　　　　２０６１９１９８２年７月　７日　　
　　４００４７１９８２年７月　７日　　　　４００４
８１９８２年７月　７日　　　　２０　”６４７１９８
２年７月　７日　　　　２０６４６１９８２年７月　７
日　　　　２０６４８１９８２年７月　７日　　　　４
００４６１９８２年７月　７日　　　　４００４５１９
８２年７月　７日　　　　２０６４５１９８２年７月１
４日　　　　４００５１寄託当局に目的／特許手続上の
微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の約条
および条件に従って上記に記載した寄託物を処理するこ
とを依頼した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＦＲＰ−９２１の地図を示す。 第２図はプラスミドｐＭＡ５６の段階および構造を示す
。 第６図はｙ−）出ｓＡｇ粒子直径をボす。 第４図は実施例４に記載の方法を示す。 第５図は実施例５に記載されたｐＨＢｓ　１６媒介体の
製造を示す。 第６図はｐｃ１／１の制限地図を示す。 １９８２年７月１４日　　　　４００５２１９８２年７
月１４日　　　　２０６４９１９８２年７月１４日　　
　　２０６５０図面の浄書（内容に変更なし） Ｐｄｌ ＄ＦＩＰｇ２＋ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１，３識別記号　　　庁内整理番号＠出
（Ｃ１２Ｎ　１５１００ Ｃ１２Ｒ１７８６５） ０発　明　者　パブ口・デー・チー・ヴアレンツエラ アメリカ合衆国９４１３１カリフオ ルニア・サン・フランシスコ・ スイス・アヴエニュー１３９ ０発　明　者　ベンジャミン・デー・ホールアメリカ合
衆国９８００４ワシント ンΦベルレヴユー・ノース・イ ースト・トウニンティシックス ス・ストリート１００３５ ０発　明　者　グスタヴ・アムメーラーアメリカ合衆国
９８１１２ワシント ン・シアトル・イースト・リン ４１７ 願　人　ボード・オブ・リージエンッ・オブ・ザ・ユニ
ヴアーシティ・ オブ・ワシントン アメリカ合衆国９８１９５ワシント ン・シアトル・ユニヴアーシテ ィ・オブ・ワシントン・メイル ・ストップ・ニージー−７０アト ミニストレイジョン・ビルディ ング・ルーム２７５ガヴアメント ・フイスカル・リレイションズ ・エンド・パテント・オフィス （番地なし） 手続補正書Ｃ方式） ％式％ １、事件の表示昭和５７年　特許願第１３５２７９号酵
母によるヒトのウィルス抗原の合成 ３、補正をする者 （外１名） １、代理人 Ｚ　補正の内容　別紙のとおり 明細書１図面の浄書内容Ｃ変更なし く１）、ｌｌｌＩＪ紙の通り、明細書１通を提出致しま
す。 （２）別紙の通り、正式図面１通を提出致します。 （３）明細書゛第８０頁第１９行口の次Ｃ二改行してト
ー記を挿入する。 「第７図は関連媒介体の構造段階および地図の図を示す
。」

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　酵母によって合成されるＢ型肝炎表面抗原。 ２、　アレ牛サンダー細胞から単離されるＨＢｓＡｇ　
   粒子と実質的に同一の電子顕微鏡外観を有し、且つ実質
   的にそれに類似した沈蔚特性を有する粒子からなる特許
   請求の範囲才１項記載の抗原。 ３、　　Ｂ型肝炎ウィルスのＳ−プロティンにコードづ
   けているＤＮＡ部分からなる酵母運搬媒介体によって形
   質転換される酵母菌株によって合成される特許請求の範
   囲士１項記載の抗原。 ４、　　ＸＶ６１０−８Ｃ／ｐＨＢ５−１１　、ＸＶ６
   １０−８０／ＰＨ’ＢＳ−１６または０Ｍ３Ｃ−２／ｐ
   ＨＢ８−２５と呼ばれる酵母菌株のいずれかによって合
   成される特許請求の範囲矛１項記載の抗原。 ５、　　Ｂ型肝炎ウィルスの８−プロティンコードづけ
   順序を含むＤＮＡ運搬媒介体によって形質転換される真
   核微生物によって合成される沈降値約６０８およびアレ
   牛サンダー細胞から精製したＨＢＳＡｇ粒子と実質的に
   同一の球状粒子の電子顕微鏡外観を有する抗ＨＢｓＡｇ
   抗体と交互反応する抗原粒子。 ６、　酵母複製原点、酵母プロモータ一部分および該プ
   ロモータ一部分で正しく方向づけだＢ型肝炎のＳ−プロ
   ティンにコードづけているＤＮＡ部分からなることを特
   徴とするＤＮＡ運搬媒介体。 Ｚ　さらに酵母被形質転換体を選択することができる酵
   母遺伝子からなる特許請求の範囲牙６項記載のＤＮＡベ
   クトル。 ８、＃酵母遺伝子がｔｒｐｌ　遺伝子である特許請求の
   範囲牙７項記載のＤＮＡ媒介体。 ９　さらに細菌複製原点からなる特許請求の範囲第６項
   記載のＤＮＡ媒介体。 １０　Ｓプロティンコードづけ部位がＨＢ　ＶＤＮＡの
   ＴａｃＩ　−ＨｐａＩ部分から得られる特許請求の範囲
   第６項記載のＤＮＡ媒介体。 １１、Ｂ型表面抗原にコードづけている部分からなるＤ
   ＮＡ運搬媒介体によって形質転換される酵母細胞の培養
   を増殖し、該酵母細胞の抽出物を製造し、そして該抽出
   物からＨＢｓＡｇ　を精製することを特徴とするＨＢｓ
   Ａｇの製造方法。 １２、　　運搬媒介体がさらに該Ｓ−プロティンコード
   づけ部に隣接しそして正しく方向づけた酵母プロモータ
   ーフラグメントからなる特許請求の範囲第１１項記載の
   方法。 １３、　　該プロモーターが酵母遺伝子から誘導される
   特許請求の範囲第１２項の方法。 １４、　　該酵母菌株がＸＶ６１０−８０／ｐ）１ＢＳ
   −１１、ＸＶ６１０−８０／ｐＨＢ５−１６またはＧＭ
   −３Ｑ−２／ｐＨＢ５−２５である特許請求の範囲第１
   ３項の方法。 １５　　生理的に使用し得る培地中酵母によって合成さ
   れるＨＢ　ｓ　Ａｇからなることを特徴とするワクチン
   。 １６、　　生理的に使用し得る培地中持許請求の範囲第
   １１．　ｊ　２　、１３または１４項記載の方法のいず
   れかによって生成されるＨＢＳＡｇからなるワクチン。 １Ｚ　　生理的に使用し得る培地中特許請求の範囲第５
   項記載の抗原粒子からなることを特徴とするワクチン。 １Ｂ、　　ＨＢｓＡｇに対して動物を免疫にし、該動物
   の血清から抗体を精製することからなる酵母によって合
   成される）−Ｉ　Ｂ　Ｓ　Ａｇに対する抗体の製造方法
   。 １９　　生理的に使用し得る培地中酵母によって合成さ
   れるＨＢｓＡｇからなるワクチンを該動物に投与するこ
   とからなるＢ型肝炎ウィルスに対して動物を免疫にする
   方法。 ２０　　抗原粒子が粒子サイズ直径約１４〜１８ｎｍお
   よび密度Ｃ８Ｃ１中約１．１９〜１．２１　ｇ／　ｃｃ
   を有するＢ型肝炎表面抗原に対する抗体で免疫複合体を
   形成することができる抗原粒子。 ２１　　抗原粒子が粒子サイズ直径約１４〜１８ｎｍ　
   および密度０ｇ０１　中約１．１９〜１゜２１！ｊ／　
   ｃｃ　を有する哺乳動物にＢ型肝炎表面抗原に対する抗
   体の生成を惹起することができる抗原粒子。 ２２、　　生理的に使用し得る培地中特許請求の範囲第
   ２０項または矛２１項の抗原粒子からなることを特徴と
   するワクチン。 ２６、　　酵母複製原点、酵母プロモーターフラグメン
   トおよびプロモーターフラグメントにより旧しく方向づ
   けだＢ型肝炎表面抗原のプロティンにコードづけている
   ＤＮＡ部分からなるＤＮＡ運搬媒介体を含有することを
   特徴とする酵母細胞。 ２４、　　ＸＶ６１０−８Ｃ！／ｐＨＢ５１１．ＸＶ６
   １０−８０／ｐＨＢ５１６．ＧＭ−３０−２／ｐＨＢｓ
   ２５．ＡＢ５５−１４Ｄ／ｐＨＢｓ１６ｉ、ＡＢ３５−
   １４Ｉ）／ｐＨＢｓ１６−４　、ＡＢ３５−１４Ｄ／ｐ
   ＨＢｓ１６−５　。 ２１５０−２−３／ｐＨＢｓ５６．２１５０−２−！ｌ
   　　／ｐＨＢｓ５６−３または２１５０−２−３／ｐＨ
   Ｂｓ５６−５と呼ばれる酵母菌株のいずれかの特許請求
   の範囲第２６項記載の酵母細胞。 ２５、　　特許請求の範囲第２６項または第２４項記載
   の酵母細胞を含有する酵母発酵ブロス。 ２６、　　酵母によって合成されるＢ型肝炎ウィルスの
   Ｓ−プロティンからなることを特徴とする抗原粒子。 ２Ｚ哺乳動物にＢ型肝炎表面抗原に対する抗体を惹起す
   ることができる特許請求の範囲第２６項記載の抗原粒子
   。 ２Ｂ、　　ＸＶ６１０−８Ｃ！／ｐｔｌＢＳ１１．ＸＶ
   ６１０−８０、／ｐＨＢ５１６　、　ＧＭ”　３０−２
   ／ｐｌＩＢ８２５　、ＡＢ３５−１４Ｄ／ｐＨＢｓ１６
   −３．ＡＢ！１５−１４Ｄ　／ｐＨＢｓ１６−４．ＡＢ
   ３５’−１４Ｄ／ｐｔｌＢｓ１６−５゜２１５０−２−
   ３／ｐＨＢｓ５６，２１５ｏ−ｚ−３／ｐＨＢｓ５６−
   ．３または２１５Ｏ−２−３７ｐＨＢｓ５６−５と呼ば
   れる酵母菌株のいずれかによって合成される特許請求の
   範囲矛２６項記載の抗原粒子。 ２９、　　転写方向に酵母読み終り部分、次にＳ−プロ
   ティンにコードづけている部分からなる特許請求の範囲
   、！ｌ−６または７項記載のＤＮＡ運搬媒介体。 ３０、　　プラスミドｐＨＢｓ２５．ｐＨＢ５５６．ｐ
   ＨＢｓ５６−３またはｐ　ＨＢ　Ｓ　５６−５のいずれ
   かからなる特許請求の範囲矛２９項記載のＤＮＡ運搬媒
   介体。 ３１　　酵母の２ミクロン環プラズミドの実質的部分か
   らなる特許請求の範囲矛７項記載のＤＮＡ運搬媒介体。 ６２　　酵母の２ミクロン項プラズミドのＥｃｏＩｊｌ
   −５ｐｈＩの大きい方の７ラグメントからなる特許請求
   の範囲矛３１項記載のＤＮＡ運搬媒介体。 ６６　　転写方向に酵母読み終りフラグメント次にＳ−
   プロティンにコードづけている部分からなる特許請求の
   範囲牙６１項または６２項記載のＤＮＡ運搬媒介体。 ６４、　　プラスミドｐ）（ＢＳ５６．ｐ）ＩＢＳ５６
   −３またはｐＨＢｓ５６−５のいずれかからなる特許請
   求の範囲矛３１項まだは、３・６２項記載のＤＮＡ運搬
   媒介体。