JPH05271299A

JPH05271299A - プロテインａ固定化吸着体

Info

Publication number: JPH05271299A
Application number: JP9738292A
Authority: JP
Inventors: Yasuki Yabushita; 安紀藪下; Norio Koike; 紀夫小池; Keiji Okada; 圭史岡田
Original assignee: Unitika Ltd
Current assignee: Unitika Ltd
Priority date: 1992-03-25
Filing date: 1992-03-25
Publication date: 1993-10-19

Abstract

(57)【要約】【目的】プロテインＡ特有の抗体（免疫グロブリン）
との特異的吸着性を良好に保持しており、極めて効率的
に分離、精製することができるプロテインＡ固定化吸着
体を提供する。【構成】繊維表面に酸無水物基を有する化合物を反応
させ、プロテインＡを固定化したことを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、繊維表面にプロテイン
Ａを固定化し、抗体の効率的な分離、精製に用いられる
プロテインＡ固定化吸着体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、ポリエステル、ポリアミド、
ポリアクリロニトリルなどの繊維を用いて抗体等の生理
活性物質を吸着させて、分離、精製することが提案され
ている（特公昭４８−２３８９１号公報等参照）。この
ような吸着に使用する吸着体に要求される性能として
は、抗体等の目的物質に対する特異的吸着性が大きいこ
と、単位重量あたりの吸着容量が大きいこと、分離，精
製操作を行う際、十分な機械的強度と安定性を有するこ
となどがあげられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
吸着体においては、これらの性能を十分に満足させるも
のが得られていない。特に、単位重量あたりの吸着容量
が小さいので、吸着に要する装置が大型化するため、効
率的ではなく経済的に不利であった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、この点に
かんがみ、単位重量あたりの吸着容量の大きい抗体特異
的吸着体を開発すべくプロテインＡ固定化吸着体につい
て種々検討した結果、本発明に到達したものである。

【０００５】すなわち、本発明におけるプロテインＡ固
定化吸着体は、繊維表面に酸無水物基を有する化合物を
反応させ、プロテインＡを固定化したことを特徴とする
ものである。

【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
使用する繊維としては、ナイロン４、ナイロン６、ナイ
ロン１２などのポリアミド、ポリウレタンなどの繊維の
ほか、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステ
ル、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアルコール、再
生セルロース等の繊維を使用することができる。また、
これらの繊維は共重合体からなるものでもよい。単糸繊
度は１０〜０．００１デニールが好ましく、特に好まし
くは４〜０．００１デニールである。また、繊維は、紡
績糸，わた，不織布，紙，織物，編物などの各種形状の
繊維集合体として使用することができる。

【０００７】本発明に使用する酸無水物基を有する化合
物としては、例えば無水マレイン酸メチルビニルエーテ
ル共重合体、無水マレイン酸エチレン共重合体、無水マ
レイン酸スチレン共重合体などのポリカルボン酸無水
物、無水マレイン酸、無水フタル酸などがあげられる。

【０００８】本発明に使用するプロテインＡは、細菌細
胞壁に存在する分子量が約４２，０００のタンパク質で
あって、免疫グロブリンと特異的に結合するものであ
る。

【０００９】本発明のプロテインＡ固定化吸着体は、繊
維表面上に酸無水物基を有する化合物を反応させて、酸
無水物基を導入し、次いでプロテインＡを反応させて上
記酸無水物基とプロテインＡのアミノ基とを結合させて
固定化することにより得られる。

【００１０】本発明において、酸無水物基と反応しうる
反応基を有する繊維、例えばアミノ基等がある繊維の場
合は、酸無水物基を有する化合物を繊維表面に直接反応
させることができる。酸無水物基と反応しうる反応基を
有しない場合には、まず、エチレンジアミン、トリメチ
レンジアミン、テトラメチレンジアミンなどのアミン
や、エチレンイミンなどのイミンを、グルタルアルデヒ
ド、ヘキサメチレンジイソシアナートなどの２官能性試
薬あるいは、シクロヘキシルモルホリノエチルカルボジ
イミドメトトルエンスルホン酸、ジシクロヘキシルカル
ボジイミドなどの縮合剤などによりアミノ基を導入した
のち、酸無水物基を有する化合物を繊維表面に反応させ
ることができる。また、繊維表面上に無水マレイン酸を
γ線や電子線によりグラフト重合させ、酸無水物を反応
させることができる。酸無水物基を有する化合物を反応
させた繊維は、繊維表面に活性の酸無水物基を有するの
で、プロテインＡの有するアミノ基との間に温和な条件
で容易に結合が生じ、共有結合により固定化することが
できる。プロテインＡ固定化処理は、プロテインＡを水
あるいは生理食塩水に溶解した溶液に酸無水物基を有す
る化合物を反応させた繊維を加えて、常温で数時間攪拌
することにより達成できる。プロテインＡの溶液中に
酸、塩基、塩などを添加してもよい。

【００１１】

【作用】本発明においては、繊維表面に酸無水物基を有
する化合物を反応させて繊維上に活性な酸無水物基を導
入し、次いでこれにプロテインＡを反応させることによ
り、プロテインＡの活性を低下させることなく繊維上に
固定することができる。このプロテインＡは優れた活性
を保持しているため、プロテインＡ特有の抗体（免疫グ
ロブリン）との特異的吸着性を良好に保持しており、こ
の吸着性を利用して抗体を効率的に分離、精製すること
ができる。

【００１２】

【実施例】以下、実施例によって本発明をさらに具体的
に説明する。実施例１ナイロン６からなる繊維（１デニール）を３Ｎ塩酸中に
３０℃、３０分間浸漬した後、蒸留水にて洗浄した。洗
浄、乾燥後、２％(w/v）無水マレイン酸−メチルビニル
エーテル共重合体の脱水アセトン溶液中に室温で１時間
浸漬し、アセトンにて洗浄後、真空乾燥した。得られた
繊維をプロテインＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０mM酢
酸（ｐＨ４．０）緩衝液中に室温で２時間浸漬すること
によりプロテインＡの固定化を行った。

【００１３】このようにして得られたプロテインＡ固定
化ナイロン繊維１ｇをカラム（０．５×１５cm）に詰
め、０．９％塩化ナトリウムを含む１０mMリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２，以下ＰＢＳ緩衝液と略す。）に０．１％
(w/v）アジ化ナトリウムを加えた溶液で平衡化し、その
後の反応に用いた。

【００１４】ウサギ血液より得られる血清を等量のＰＢ
Ｓ緩衝液で希釈したものを試料とした。この試料を流速
１ml／３min でプロテインＡ固定化ナイロン繊維充填カ
ラムに通し、通過液を分取した。さらに、２８０nmでの
吸光度測定により通過液中のタンパク質の有無を確認し
ながら、この波長でのタンパク質の吸収がなくなるまで
ＰＢＳ緩衝液を通過させた。次いで、１００mMクエン酸
緩衝液（ｐＨ４．０）でカラムに吸着したＩｇＧ（免疫
グロブリンＧ）を溶出し、溶出液に直ちに１ＭのＰＢＳ
緩衝液を加えた。

【００１５】このようにして得られた、カラムの通過液
の画分とカラムに吸着した画分をそれぞれＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動法(Laemmli 1970)を用いること
により含まれるタンパク質を同定した。その結果、プロ
テインＡ固定化ナイロン繊維カラムに吸着した画分には
分子量１５万付近にＩｇＧに相当する単一のバンドが確
認され、一方通過液画分には他の血漿タンパクが確認さ
れたが、ＩｇＧに相当する位置にバンドは検出されず、
ＩｇＧが良好にプロテインＡ固定化ナイロン繊維カラム
に吸着したことが分かった。

【００１６】実施例２ポリエチレンテレフタレートからなる繊維（１デニー
ル）を１Ｎ水酸化ナトリウム中に７０℃、１時間浸漬
し、蒸留水にて洗浄後、０．１Ｎ塩酸中に７０℃、１時
間浸漬処理した。蒸留水にて洗浄、乾燥後、１０％(w/
v）のポリエチレンイミン水溶液とメタノールとの１：
５混合液に室温で３０分間浸漬し、５％(w/v）ジシクロ
ヘキシルカルボジイミドのメタノール溶液を加え、引き
続き室温で２時間浸漬した。メタノールにて洗浄、乾燥
後、２％(w/v）無水マレイン酸−メチルビニルエーテル
共重合体の脱水アセトン溶液中に室温で１時間浸漬し、
アセトンにて洗浄後、真空乾燥した。得られた繊維をプ
ロテインＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０mM酢酸（ｐＨ
４．０）緩衝液中に室温で２時間浸漬することによりプ
ロテインＡの固定化を行った。

【００１７】このようにして得られたプロテインＡ固定
化ポリエステル繊維１ｇをカラム（０．５×１５cm）に
詰め、０．９％塩化ナトリウムを含む１０mMリン酸緩衝
液（ｐＨ７．２）に０．１％(w/v）アジ化ナトリウムを
加えた溶液で平衡化し、その後の反応に用いた。

【００１８】ウサギ血液より得られる血清を等量のＰＢ
Ｓ緩衝液で希釈したものを試料とした。この試料を流速
１ml／３min でプロテインＡ固定化ポリエステル繊維カ
ラムに通過させ、通過液を分取した。さらに、２８０nm
での吸光度測定により通過液中のタンパク質の有無を確
認しながら、この波長でのタンパク質の吸収がなくなる
までＰＢＳ緩衝液を通過させた。次いで１００mMクエン
酸緩衝液（ｐＨ４．０）でカラムに吸着したＩｇＧを溶
出し、溶出液に直ちに１ＭのＰＢＳ緩衝液を加えた。

【００１９】このようにして得られた、カラムの通過液
の画分とカラムに吸着した画分をそれぞれＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動法(Laemmli 1970)を用いること
により含まれるタンパク質を同定した。その結果、プロ
テインＡ固定化ポリエステル繊維カラムに吸着した画分
には分子量１５万付近にＩｇＧに相当する単一のバンド
が確認され、一方通過液画分には他の血漿タンパクが確
認されたが、ＩｇＧに相当する位置にバンドは検出され
なかった。

【００２０】実施例３ポリウレンタンからなる繊維（５デニール）を蒸留水中
に浸漬し、８０℃、１時間熱水処理した。全モノマー濃
度３mol/ml、無水マレイン酸と２ーヒドロキシエチルメ
タクリレートのモノマー組成を１：３としたアセトン溶
液に、熱水処理後、蒸留水にて洗浄、乾燥したポリウレ
タン繊維を浸漬し、⁶⁰ＣＯーγ線を線量率１０kGy/h 、
窒素雰囲気下、常温常圧下で、１時間同時照射すること
によりグラフト重合反応を行った。照射後、繊維を取り
出しアセトンでよく洗浄した後、乾燥させた。得られた
繊維をプロテインＡ（ＳＩＧＭＡ社製）を含む１０mM酢
酸（ｐＨ４．０）緩衝液中に室温で２時間浸漬すること
によりプロテインＡの固定化を行った。

【００２１】このようにして得られたプロテインＡ固定
化ポリウレタン繊維１ｇをカラム（０．５×１５cm）に
詰め、０．９％塩化ナトリウムを含む１０mMリン酸緩衝
液（ｐＨ７．２）に０．１％(w/v）アジ化ナトリウムを
加えた溶液で平衡化し、その後の反応に用いた。

【００２２】ウサギ血液より得られる血清を等量のＰＢ
Ｓ緩衝液で希釈したものを試料とした。この試料を流速
１ml／３min でプロテインＡ固定化ポリウレタン繊維カ
ラムに通過させ、通過液を分取した。さらに、２８０nm
での吸光度測定により通過液中のタンパク質の有無を確
認しながら、この波長でのタンパク質の吸収がなくなる
までＰＢＳ緩衝液を通過させた。次いで１００mMクエン
酸緩衝液（ｐＨ４．０）でカラムに吸着したＩｇＧを溶
出し、溶出液に直ちに１ＭのＰＢＳ緩衝液を加えた。

【００２３】このようにして得られた、カラムの通過液
の画分とカラムに吸着した画分をそれぞれＳＤＳ−ポリ
アクリルアミド電気泳動法(Laemmli 1970)を用いること
により含まれるタンパク質を同定した。その結果、プロ
テインＡ固定化ポリウレタン繊維カラムに吸着した画分
には分子量１５万付近にＩｇＧに相当する単一のバンド
が確認され、一方通過液画分には他の血漿タンパクが確
認されたが、ＩｇＧに相当する位置にバンドは検出され
なかった。

【００２４】比較例１プロテインＡ−Sepharose CL-4B （ファルマシア社製）
１．５ｇを０．９％塩化ナトリウムを含む１０mMリン酸
緩衝液（ｐＨ８．０）に０．１％(w/v）アジ化ナトリウ
ムを加えた溶液で膨潤させた後、カラム（０．５×１５
cm）に詰め、同液で平衡化した。

【００２５】こうして得られたプロテインＡ−Sepharos
e カラムに実施例１と同様にウサギ血清を通過させ、カ
ラムに吸着した画分と通過した画分をそれぞれＳＤＳ−
ポリアクリルアミド電気泳動にかけることによりＩｇＧ
の精製を確認した。その結果、カラムに吸着した画分で
はＩｇＧに相当する位置のバンドの他に少量の血漿タン
パクのバンドが認められ、一方通過液の画分においては
血漿タンパクの他に少量ではあるが、ＩｇＧに相当する
バンドも認められ、カラムへのＩｇＧの選択的吸着が良
好でないことが分かった。

【００２６】

【発明の効果】本発明のプロテインＡ固定化吸着体によ
れば、プロテインＡの活性を低下させることなく繊維上
に固定されているので、プロテインＡ特有の抗体（免疫
グロブリン）との特異的吸着性を良好に保持しており、
抗体を選択的に吸着することにより極めて効率的に分
離、精製することができ、経済的に有利である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】繊維表面に酸無水物基を有する化合物を
反応させ、プロテインＡを固定化したことを特徴とする
プロテインＡ固定化吸着体。