JPH0528107B2

JPH0528107B2 -

Info

Publication number: JPH0528107B2
Application number: JP21019386A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Machida; Jun Kimura
Original assignee: Nippon Electric Co Ltd
Current assignee: NEC Corp
Priority date: 1986-09-05
Filing date: 1986-09-05
Publication date: 1993-04-23
Also published as: JPS6368085A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は、固定化菌体または酵素およびその製
造方法に関する。［従来の技術］高濃度の菌体または酵素を担体に固定化し、各
種の反応を行なう装置が医薬品工業や食品工業等
の分野で使用されており、特に近年では生物を利
用した廃水処理、エネルギー生産の分野において
も採用されはじめている。菌体または酵素の固定
化法としては、従来より担体結合法、架橋法、包
括法等が知られており、このうち包括法は、菌体
の漏出が少なく、かつ担体と菌体または酵素自体
との化学的結合がないことから、固定化による菌
体または酵素の活性低下が少ないこと、また様々
な物質との同時固定化が出来る等の利点があり、
広く使用されている。包括固定化に使用される担
体としては、アルギン酸、カラギーナン、寒天、
アルブミン等の天然高分子、アクリルアミド、光
架橋性樹脂、ポリビニルアルコール、ポリスチレ
ン等の合成高分子が知られている。［発明が解決しようとする問題点］このうち、アルギン酸を用いる固定化法は、簡
便な操作で固定化でき、活性の低下が少ないこと
から一般に広く普及しているが、他の天然高分子
も含めて、強度が小さく、耐久性が悪いと共に、
微生物による分解がおこる等の問題点がある。これに対して、微小アルギン酸ゲルをシリカゾ
ルに添加し、シリカをゲル化し、シリカゲル−ア
ルギン酸二重構造の固定化菌体または酵素を得る
方法が知られている（特開昭60−221089号公報）。
しかしこの方法は、製造法が複雑であり、かつシ
リカゲルの部分は微生物の増殖に適さないという
欠点があり、担体内部で微生物が増殖しゲルの活
性が増加するという固定化菌体としての利点が少
ない。また、微小アルギン酸ゲルを別途に作成
し、回収してシリカゾルに添加するので、この点
でも操作が複雑である。一方、合成高分子は強度が大きく、耐久性が良
く、微生物に分解されにくいという利点があり、
特にアクリルアミドが広く利用されている。しかしながらアクリルアミドによる固定化にお
いては、高分子モノマーや架橋剤、重合剤等の毒
性作用により、あるいは重合反応時の熱等によ
り、菌体や酵素の活性が低下することが多い。ア
クリルアミドで固定化する場合の活性低下を小さ
くする方法としては、固定化する菌体懸濁液に凝
集剤を添加し、微小フロツクとした後にアクリル
アミドで包括固定化する方法が知られている（特
開昭61−68196号公報）。しかし、凝集剤によるフロツク化は微生物＋酵
素の種類により差があり、多種の菌体や酵素を均
一なフロツクとすることは困難である。またフロ
ツクが大きすぎた場合には、ゲルの強度が小さく
なる。したがつて、フロツクの大きさは数百ミク
ロンであることが望ましいが、この程度の大きさ
のフロツクを凝集剤で作成する場合には、フロツ
ク化せず、浮遊したまま残存する菌体または酵素
も多く、それらの菌体または酵素はアクリルアミ
ド固定化時に失活する。本発明は上記した従来の問題点を解決するため
になされたもので、物理的強度が大きく、耐久性
が良く、固定化時の活性低下が小さい固定化菌体
または酵素及びその製造方法を提供することを目
的とする。［問題点を解決するための手段］すなわち本発明はアクリルアミドゲルマトリツ
クス中に、微小アルギン酸固定化菌体または酵素
を分散保持させてなることを特徴とする固定化菌
体または酵素であり、またその製造方法は菌体ま
たは酵素とアルギン酸水溶液を混合して混合ゾル
とする工程と、この工程ゾルをアクリルアミドモ
ノマーおよびアルギン酸ゲル化剤の混合液中に噴
霧して微小アルギン酸ゲルを形成させる工程と、
前記微小アルギン酸ゲルが分散した混合液をゲル
化させる工程とを含むことを特徴とする。本発明において固定化する菌体は、任意の株を
純水培養したものでも良いし、活性汚泥のような
混合菌体でもよい。また酵素としては、精製酵素
の他に粗製物として、菌体破砕物、動植物細胞、
細胞器官等でも良い。また、その濃度は任意に調
整できる。一方、アルギン酸水溶液は、アルギン酸のナト
リウム塩、カリウム塩またはアンモニウム塩を水
に溶解し、調整する。濃度が高い場合には、粘性
が大きく、取り扱いが不便であり、噴霧しにくく
なる。濃度が低い場合にはゲル化剤と接触し、ゲ
ル化した時に薄膜状となり、互いに絡み合い、微
小ゲルにならないことがある。したがつて、アル
ギン酸の濃度は、ゲル化させた時に微小塊状とな
り、かつ粘性が大きすぎない濃度が良く、0.3〜
１％が望ましい。また、この微小アルギン酸ゲルをさらに包括す
る高分子マトリツクスとなるアクリルアミドは、
アルギン酸ゲル化剤および必要に応じて架橋剤、
重合開始剤等と混合し、モノマー混合液として貯
えられる。アルギン酸のゲル化剤としては塩化カルシウム
が良く使用され、他に酢酸カルシウム、硫酸アル
ミニウム、塩化アルミニウム等が使用される。こ
れらのゲル化剤の濃度はモノマー混合液中で通常
１〜10％（ｗ／ｖ）程度になるように添加され
る。アクリルアミドモノマーの濃度は10〜35％が
好ましく、架橋剤としてはＮ，N′−メチレンビ
スアクリルアミド、Ｎ，N′−プロピレンビスア
クリルアミド等を使用することができ、モノマー
混合液中の濃度は0.5〜６％が望ましい。重合開
始剤としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリ
ウム等が使用される。次に前記した菌体または酵素含有アルギン酸水
溶液はモノマー混合液中に噴霧される。そして、
前記モノマー混合液中のゲル化剤と反応し、微小
アルギン酸固定化ゲルとなる。噴霧装置としては、加圧噴霧ノズル、ガス噴霧
化ノズル等が知られている。これらのノズルで
は、通常１〜120Kg／cm³程度の圧力で、アルギン
酸水溶液を噴霧するので、受け皿のゲル化剤水溶
液は比較的大容量を必要とする。従つて、生成し
た微小アルギン酸ゲルを分離回収するためには、
遠心法により回収する等の手間がかかる。そこで
本発明の製造方法では、モノマー混合液にゲル化
剤が添加されており、モノマー混合液自体に菌体
又は酵素を含有するアルギン酸水溶液を噴霧する
ので、従来のように別途作成した微小アルギン酸
ゲルを回収し、添加使用するという方法に比べ簡
略化される。こうして作成した微小アルギン酸ゲ
ルは、粒子径が数十ミクロンから数百ミクロンに
なるが、この微小アルギン酸ゲルをさらにアクル
リアミドで包括固定し得られる二重構造のゲルの
強度を考慮すると前記微小アルギン酸ゲルの粒子
径は500ミクロン以下が望ましい。次に、前記のようにいて得られた微小アルギン
酸ゲルを含有するモノマー混合液は、微小アルギ
ン酸ゲルを分散保持するマトリツクスとして重合
させる。アクリルアミドの重合法では、さらに重
合促進剤の添加が必要である。重合促進剤として
は、テトラメチルエチレンジアミン、β−ジメチ
ルアミドプロピオニトリル等が使用できる。このようにして得られる、微小アルギン酸ゲル
を内包するアクリルアミドゲルは、目的に応じ
て、球状、膜状、フアイバー状等の形状を選択
し、使用する。この場合、微小アルギン酸ゲル
は、数十ミクロンから数百ミクロンの大きさであ
り、そのマトリツクスとなるアクリルアミドゲル
から脱離することはない。［実施例］次に実施例にもとづき、本発明を説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。第１図は本発明の固定化菌体または酸素を得る
ための装置の一例を示す構成図である。アルギン酸水溶液槽１に貯えられた所定濃度の
アルギン酸水溶液は濃縮菌体槽２に貯えられてい
る菌体または酵素と共に混合槽３で混合される。
一方、アクリルアミドモノマーはモノマー槽４に
貯えられており、添加剤槽５のアルギン酸ゲル化
剤およびその他の添加剤と共にモノマー混合槽６
で混合される。このモノマー混合液はスプレー室
７に送られ、スプレー室７では前記の菌体または
酵素含有アルギン酸水溶液がモノマー混合液に向
けて噴霧される。このようにして得られた微小ア
ルギン酸ゲルを含有するモノマー混合液は固定化
装置８に送られ、重合される。アクリルアミドの
重合法としては、チユーブ中を循環する有機溶剤
中に、モノマー混合液を滴下する方法がある。こ
の方法によると、任意の粒状の球状のゲルが得ら
れる。この場合は、前記有機溶剤中に重合促進剤
を添加しておけば良い。又、モノマー混合液に重
合促進剤を添加した後に鋳型に注入し、ゲル化す
る方法もある。次にこの装置を用いた菌体の固定化方法の実施
例について述べる。実施例１脱窒菌シユウドモナス・デニトリフイカンス
（Pseudomonas denitrificans）を硝酸カリウム
0.2ｇ／を含む肉汁培地を使用し、30℃で静置
培養した。この培養菌体を集菌し、水に分散して
濃縮菌液（菌体湿重量0.2ｇ／ml）を得た。この
濃縮菌液４mlと0.5％アルギン酸ナトリウム水溶
液８mlを混合する。アルギン酸ナトリウムの濃度
は約30％であつた。一方、20％アクリルアミドモノマー水溶液12ml
と、２％Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド
６ml、1M塩化カルシウム水溶液２mlを混合し、
モノマー混合液を作成しさらに重合開始剤として
過硫酸アンモニウム水溶液（0.4ｇ／ml）を160μ
添加した。このモノマー混合液をスプレー室に
導入し、ここで自作のガス噴霧化ノズルを通し
て、前記の菌体を含有するアルギン酸水溶液を噴
霧した。この結果前記モノマー混合液中に粒径数
十ミクロンから数百ミクロンの微小アルギン酸ゲ
ルが生成した。この工程に引きつづき、微小アル
ギン酸ゲルを含有するモノマー混合液は、内径
3.14mmのタイゴンチユーブ（ノートン社、
TYGON TUBING）中を循環させている大豆
油中に、20μずつ、滴下した。大豆油中に、重
合促進剤としてテトラメチルエチレンジアミン
を、大豆油に対して１％となるように添加してお
く。チユーブ長は２ｍであり、大豆油の循環速度
は100mm／minとした。滴下された微小アルギン
酸ゲルを含有するモノマー混合液は、大豆油には
さまれた状態でチユーブ中を循環し、重合反応が
進行する。以下の様にして得られた固定化菌体は直径約３
mmで、微小アルギン酸ゲルを内包する強度が大き
く、弾力性のある二重構造のゲルであつた。続い
て、得られた固体化菌体を洗浄後、硝酸カリウム
0.2ｇ／を含む合成廃水400mlに接種し、30℃で
攪拌し、脱窒処理を行なつた。処理時間（hr）に
対する窒素濃度（mg／）の変化を測定したとこ
ろ、第２図Ａのようになつた。比較のため、0.5
％アルギン酸ナトリウム８mlの代わりに水８ml混
合し、菌体を直接アクリルアミドに包括固定化し
たゲルを作成し、前記と同じ脱窒処理を行つた。
結果を第２図Ｂに示す。実施例２実施例１と同様にして作成した、二重構造の固
定化菌体を内径30mm長さ150mmのカラムに充填し、
実施例１と同様の合成廃水を１／dayの割合で
流入し、30℃で脱窒処理を行つた。始めの数日
は、脱窒率は低かつたがその後約１ケ月間は、高
い脱窒率を示した。その結果を第１表に示す。

【表】又、約１ケ月の後も、固定化菌体の強度は大き
く、弾力性も変わらなかつた。比較のため、同量
の菌体を含有するアルギン酸球状ゲルを、同様の
カラムに充填し、同様の処理実験を行つたとこ
ろ、該ゲルは数日のうちに溶解し、消滅した。［発明の効果］以上詳述したように、本発明によれば固定化時
に活性低下が少なく、かつ強度が大きく、耐久性
のある固定化菌体又は酵素が得られる。またその
製造方法はモノマー混合液に直接、菌体又は酵素
を含有するアルギン酸水溶液を噴霧し、微小ゲル
を作成するので、工程が簡便である、などの利点
を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る方法を実施するための装
置の一例を示す構成図、第２図は本発明の固定化
菌体を用いて脱窒処理を行なつた場合の処理時間
と窒素濃度との関係を示す図である。１……アルギン酸水溶液槽、２……濃縮菌体
槽、３……混合槽、４……モノマー槽、５……添
加剤槽、６……モノマー混合槽、７……スプレー
室、８……固定化装置。

Claims

【特許請求の範囲】１アクリルアミドゲルマトリツクス中に、微小
アルギン酸固定化菌体または酵素を分散保持させ
てなることを特徴とする固定化菌体または酵素。２菌体または酵素とアルギン酸水溶液を混合し
て混合ゾルとする工程と、この混合ゾルをアクリ
ルアミドモノマーおよびアルギン酸ゲル化剤の混
合液中に噴霧して微小アルギン酸ゲルを形成させ
る工程と、前記微小アルギン酸ゲルが分散した混
合液をゲル化させる工程とを含むことを特徴とす
る固定化菌体または酵素の製造方法。