JPS6368085A - 固定化菌体または酵素およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、固定化菌体または酵素およびその製造方法に
関する。

［従来の技術］ 一〜＼ 高濃度の菌体または酵素を担体に固定化し、各種の反応
を行なう装置が医薬品工業や食品工業等の分野で使用さ
れており、特に近年では生物を利用した廃水処理、エネ
ルギー生産の分野においても採用されはじめている。菌
体または酵素の固定化法としては、従来より担体結合法
、架橋法、包括法等が知られており、このうち包括法は
、菌体の漏出が少なく、かつ担体と菌体または酵素自体
との化学的結合がないことから、固定化による菌体また
は酵素の活性低下が少ないこと、また様々な物質との同
時固定化が出来る等の利点があり、広く使用されている
。包括固定化に使用される担体としては、アルギン酸、
カラギーナン、寒天、アルブミン等の天然高分子、アク
リルアミド、光架橋性樹脂、ポリビニルアルコール、ポ
リスチレン等の合成高分子が知られている。

［発明が解決しようとする問題点］ このうち、アルギン酸を用いる固定化法は、簡便な操作
で固定化でき、活性の低下が少ないことから一般に広く
普及しているが、他の天然高分子も含めて、強度が小ざ
く、耐久性が悪いと共に、微生物による分解がおこる等
の問題点がある。

これに対して、微小アルギン酸ゲルをシリカゾルに添加
し、シリカをゲル化し、シリカゲル−アルギン酸二重構
造の固定化菌体または酵素を得る方法が知られている（
特開昭６０−２２１０８９号公報）。

しかしこの方法は、製造法が複雑であり、かつシリカゲ
ルの部分は微生物の増殖に適さないという欠点があり、
担体内部で微生物が増殖しゲルの活性が増加するという
固定化増殖菌体としての利点が少ない。また、微小アル
ギン酸ゲルを別途に作成し、回収してシリカゾルに添加
するので、この点でも操作が複雑である。

一方、合成高分子は強度が大きく、耐久性が良く、微生
物に分解されにくいという利点があり、特にアクリルア
ミドが広く利用されている。

しかしながらアクリルアミドによる固定化においては、
高分子モノマーや架橋剤、重合剤等の毒性作用により、
あるいは重合反応時の熱等により、菌体や酵素の活性が
低下することが多い。アクリルアミドで固定化する場合
の活性低下を小さくする方法としては、固定化する菌体
懸濁液に凝集剤を添加し、微小フロックとした後にアク
リルアミドで包括固定化する方法が知られている（特開
昭６１−６８１９６号公報）。

しかし、凝集剤によるフロック化は微生物干酵素の種類
により差があり、多種の菌体や酵素を均一なフロックと
することは困難である。またフロックが大きすぎた場合
には、ゲルの強度が小さくなる。したがって、フロック
の大きさは数百ミクロンであることが望ましいが、この
程度の大きさのフロックを凝集剤で作成する場合には、
フロック化せず、浮遊したまま残存する菌体または酵素
も多く、それらの菌体または酵素はアクリルアミド固定
化時に失活する。

本発明は上記した従来の問題点を解決するためになされ
たもので、物理的強度が大きく、耐久性が良く、固定化
時の活性低下が小ざい固定化菌体または酵素及びその製
造方法を提供することを目的とする。

一ミ）３− ［問題点を解決するための手段］ すなわち本発明はアクリルアミドゲルマトリックス中に
、微小アルギン酸固定化菌体または酵素を分散保持させ
てなることを特徴とする固定化菌体または酵素であり、
またその製造方法は菌体または酵素とアルギン酸水溶液
を混合して混合ゾルとする工程と、この混合ゾルをアク
リルアミドモノマーおよびアルギン酸ゲル化剤の混合液
中に噴霧して微小アルギン酸ゲルを形成させる工程と、
前記微小アルギン酸ゲルが分散した混合液をゲル化させ
る工程とを含むことを特徴とする。

本発明において固定化する菌体は、任意の株を純水培養
したものでも良いし、活性汚泥のような混合菌体でもよ
い。また酵素としては、精製酵素の他に粗製物として、
菌体破砕物、動植物細胞、細胞器官等でも良い。また、
その濃度は任意に調整できる。

一方、アルギン酸水溶液は、アルギン酸のナトリウム塩
、カリウム塩またはアンモニウム塩を水に溶解し、調整
する。濃度が高い場合には、粘性が大きく、取り扱いが
不便であり、噴霧しにくくなる。濃度が低い場合にはゲ
ル化剤と接触し、ゲル化した時に薄膜状となり、互いに
絡み合い、微小ゲルにならないことがある。したがって
、アルギン酸の濃度は、ゲル化させた時に微小塊状とな
り、かつ粘性が大きすぎない濃度が良く、０．３〜１％
が望ましい。

また、この微小アルギン酸ゲルをざらに包括する高分子
マトリックスとなるアクリルアミドは、アルギン酸ゲル
化剤および必要に応じて架橋剤、重合開始剤等と混合し
、モノマー混合液として貯えられる。

アルギン酸のゲル化剤としては塩化カルシウムが良く使
用され、他に酢酸カルシウム、硫酸アルミニウム、塩化
アルミニウム等が使用される。これらのゲル化剤の濃度
は七ツマー混合液中で通常１〜１０％（Ｗ／Ｖ）程度に
なるように添加される。アクリルアミドモノマーの濃度
は１０〜３５％が好ましく、架橋剤としてはＮ、Ｎ’　
−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ、Ｎ’　−プロピレ
ンビスアクリルアミド等を使用することができ、モノマ
ー混合液中の濃度は０．５〜６％が望ましい。重合開始
剤としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム等が
使用される。

次に前記した菌体または酵素含有アルギン酸水溶液はモ
ノマー混合液中に噴霧される。そして、前記モノマー混
合液中のゲル化剤と反応し、微小アルギン酸固定化ゲル
となる。

噴霧装置としては、加圧噴霧ノズル、ガス噴霧化ノズル
等が知られている。これらのノズルでは、通常１〜１２
０に’ｊ／ｃｍ３程度の圧力で、アルギン酸水溶液を噴
霧するので、受は朋のゲル化剤水溶液は比較的大容但を
必要とする。従って、生成した微小アルギン酸ゲルを分
離回収するためには、遠心法により回収する等の手間が
かかる。そこで本発明の製造方法では、モノマー混合液
にゲル化剤が添加されており、モノマー混合液自体に菌
体又は酵素を含有するアルギン酸水溶液を噴霧するので
、従来のように別途作成した微小アルギン酸ゲルを回収
し、添加使用するという方法に比べ簡略化される。こう
して作成した微小アルギン酸ゲルは、粒子径が数十ミク
ロンから数百ミクロンになるが、この微小アルギン酸ゲ
ルをざらにアクリルアミドで包括固定し得られる二重構
造のゲルの強度を考慮すると前記微小アルギン酸ゲルの
粒子径は５００ミクロン以下が望ましい。

次に、前記のようにして得られた微小アルギン酸ゲルを
含有するモノマー混合液は、微小アルギン酸ゲルを分散
保持するマトリックスとして重合させる。アクリルアミ
ドの重合法では、ざらに重合促進剤の添加が必要である
。重合促進剤としては、テトラメチルエチレンジアミン
、β−ジメチルアミノプロピオニトリル等が使用できる
。

このようにして得られる、微小アルギン酸ゲルを内包す
るアクリルアミドグルは、目的に応じて、球状、膜状、
ファイバー状等の形状を選択し、使用する。この場合、
微小アルギン酸ゲルは、数十ミクロンから数百ミクロン
の大きさであり、そのマトリックスとなるアクリルアミ
ドグルから脱離することはない。

［実施例］ 次に実施例にもとづき、本発明を説明するが、本発明は
これに限定されるものではない。

第１図は本発明の固定化菌体または酵素を得るための装
置の一例を示す構成図である。

アルギン酸水溶液槽１に貯えられた所定濃度のアルギン
酸水溶液は濃縮菌体槽２に貯えられている菌体または酵
素と共に混合槽３で混合される。

一方、アクリルアミドモノマーはモノマ一槽４に貯えら
れており、添加剤槽５のアルギン酸ゲル化剤およびその
他の添加剤と共にモノマー混合槽６で混合される。この
モノマー混合液はスプレー室７に送られ、スプレー室７
では前記の菌体または酵素含有アルギン酸水溶液が七ツ
マー混合液に向けて噴霧される。このようにして得られ
た微小アルギン酸ゲルを含有する七ツマー混合液は固定
化装置８に送られ、重合される。アクリルアミドの重合
法としては、チューブ中を循環する有機溶剤中に、モノ
マー混合液を滴下する方法がある。この方法によると、
任意の粒径の球状のゲルが智られる。この場合は、前記
有機溶剤中に重合促進剤を添加してあけば良い。又、モ
ノマー混合液に重合促進剤を添加した後に鋳型に注入し
、ゲル化する方法もある。

次にこの装置を用いた菌体の固定化方法の実施例につい
て述べる。

実施例１ 脱窒菌シュウトモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）を硝酸
カリウム０．２ｇ／、ｆ！を含む肉汁培地を使用し、３
０℃で静置培養した。この培養菌体を集菌し、水に分散
して濃縮菌液（菌体湿重量０．２ｇ／Ｗｄ２＞を得た。

この濃縮菌液４ｄと０．５％アルギン酸ナトリウム水溶
液８ｍを混合する。アルギン酸ナトリウムの濃度は約０
．３％であった。

一方、２０％アクリルアミドモノマー水溶液１２ｍＩ！
と、２％Ｎ、Ｎ’　−メチレンビスアクリルアミド６ｍ
ｌ、１Ｍ塩化カルシウム水溶液２ｄを混合し、モノマー
混合液を作成しさらに重合開始剤として過硫酸アンモニ
ウム水溶液（０，４ｙ／ｍ）を１６０μ〃添加した。こ
の七ツマー混合液をスプレー室に導入し、ここで自作の
ガス噴霧化ノズルを通して、前記の菌体を含有するアル
ギン酸水溶液を噴霧した。この結果前記モノマー混合液
中に粒径数十ミクロンから数百ミクロンの微小アルギン
酸ゲルが生成した。この工程に引きつづき、微小アルギ
ン酸ゲルを含有する七ツマー混合液は、内径３．１４ｍ
のタイボンチューブ（ノー１〜ン社、ｒｙＧｏＰＴＵＢ
ＩＮＧ）中を循環させている大豆油中に、２０μρずつ
、滴下した。大豆油中に、重合促進剤としてテトラメチ
ルエチレンジアミンを、大豆油に対して１％となるよう
に添加しておく。

チューブ長は２ｍであり、大豆油の循環速度は１００ｍ
／ｍｉｎとした。滴下された微小アルキン酸ゲルを含有
するモノマー混合液は、大豆油にはさまれた状態でチュ
ーブ中を循環し、重合反応が進行する。

以上の様にして得られた固定化菌体は直径約３＃で、微
小アルギン酸ゲルを内包する強度が大きく、弾力性のあ
る二重構造のゲルであった。続いて、得られた固定化菌
体を洗浄後、硝酸カリウム０．２！？／ｆｌを含む合成
廃水４００７に接種し、３０’Ｃで撹拌し、脱窒処理を
行なった。処理時間（ｈｒ）に対する窒素濃度（ｍｇ／
、ｉｌ）の変化を測定したところ、第２図（Ａ）のよう
になった。比較のため、０．５％アルギン酸ナトリウム
８ｍｌの代わりに水を８ｍ！！混合し、菌体を直接アク
リルアミドに包括固定化したゲルを作成し、前記と同じ
脱窒処理を行った。結果を第２図（Ｂ）に示す。

実施例２ 実施例１と同様にして作成した、二重構造の固定化菌体
を内径３０ｍ長さ１５０＃のカラムに充填し、実施例１
と同様の合成廃水を１．１！　／ｄａｙの割合で流入し
、３０℃で脱窒処理を行った。始めの数日は、脱窒率は
低かったがその後約１ケ月間は、高い脱窒率を示した。

その結果を第１表に示す。

第１表 一′・ぞり　１　− 又、約１ケ月の後も、固定化菌体の強度は大きく、弾力
性も変わらなかった。比較のため、同量の菌体を含有す
るアルギン酸球状ゲルを、同様のカラムに充填し、同様
の処理実験を行ったところ、該ゲルは数日のうちに溶解
し、消滅した。

［発明の効果］ 以上詳述したように、本発明によれば固定化時に活性低
下が少なく、かつ強度が大きく、耐久性のある固定化菌
体又は酵素が得られる。またその製造方法はモノマー混
合液に直接、菌体又は酵素を含有するアルギン酸水溶液
を噴霧し、微小ゲルを作成するので、工程が簡便である
、などの利点を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る方法を実施するだめの装置の一例
を示す構成図、第２図は本発明の固定化菌体を用いて脱
窒処理を行なった場合の処理時間と窒素濃度との関係を
示す図でおる。 １・・・アルギン酸水溶液槽　２・・・濃縮菌体槽３・
・・混合槽　　　　　　　４・・・モノマー（スｖ−１
２“ＩＩ；’　、− ５・・・添加剤槽　　　　　　６・・・モノマー混合槽
７・・・スプレー室　　　　　８・・・固定化装置第１
図 ５：ｆＪマージ晋らＣチＪ婆Ｙ ＴＩＭＥ（ｈｒ　）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）アクリルアミドゲルマトリツクス中に、微小アル
   ギン酸固定化菌体または酵素を分散保持させてなること
   を特徴とする固定化菌体または酵素。
2. （２）菌体または酵素とアルギン酸水溶液を混合して混
   合ゾルとする工程と、この混合ゾルをアクリルアミドモ
   ノマーおよびアルギン酸ゲル化剤の混合液中に噴霧して
   微小アルギン酸ゲルを形成させる工程と、前記微小アル
   ギン酸ゲルが分散した混合液をゲル化させる工程とを含
   むことを特徴とする固定化菌体または酵素の製造方法。