JPH05304957A - 酵素誘導体、それらの製造法およびそれらを含有する医薬組成物 - Google Patents

酵素誘導体、それらの製造法およびそれらを含有する医薬組成物

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JPH05304957A
JPH05304957A JP4207007A JP20700792A JPH05304957A JP H05304957 A JPH05304957 A JP H05304957A JP 4207007 A JP4207007 A JP 4207007A JP 20700792 A JP20700792 A JP 20700792A JP H05304957 A JPH05304957 A JP H05304957A
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benzoyl
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Richard A G Smith
アンソニー ゴドウイン スミス リチヤード
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SmithKline Beecham Ltd
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Beecham Group PLC
SmithKline Beecham Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】フイブリン溶解活性に必須な触媒部位が、ｐＨ
７．４の等脹性水性媒中３７℃での疑似一次加水分解速
度恒数が１０-10 〜１０-3／秒であるような速度で加水
分解によって除去できる基によってブロックされている
生体内フイブリン溶解酵素の誘導体または単離誘導体。 【効果】この酵素誘導体は静脈血栓症の治療に効果があ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は静脈血栓症（ｖｅｎｏｕ
ｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）の治療に使用される酵素誘
導体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】静脈血栓症は血液成分から塊状の固体す
なわち栓（ｐｌｕｇ）を静脈中に形成する。このような
栓は全部または一部分が転移して他の血管部位に移動す
ることがあり、この移転が起るとき、血栓（ｔｈｒｏｍ
ｂｕｓ）またはその断片を塞栓（ｅｍｂｏｌｕｓ）とい
う。血栓または塞栓に関連する状態を一緒にして血栓塞
栓疾患または異常といい、総合的に見ると、これらはヨ
ーロッパ諸国で重疾患および死亡の主な原因となってい
る。
【０００３】現在静脈血栓症の治療のために提案されて
いる２種類の治療剤、すなわち凝固抑制剤および血栓崩
壊剤がある。現在最も一般的に使用されている治療剤は
凝固抑制剤であって、その中でも最も広く使用されてい
るのは、一般的に最も効果的であることが認められてい
るヘパリン（ｈｅｐａｒｉｎ）およびジヒドロキシクマ
リン〔ワルフアリン、（ｗａｒｆａｒｉｎ）〕である。
凝固抑制剤の主な欠点は、これらの凝固抑制剤には凝塊
（ｃｌｏｔ）に対する直接の溶解作用をもたないので、
急性血栓症状の治療に対してほとんど有用性をもたない
ことである。第二に、これらの凝固抑制剤は凝塊系の機
能を低下させるので、この種の医薬を使用するときに特
有な合併症として、相当に危険と思われている出血が抑
制できない。
【０００４】静脈血栓症の治療に使用することを現在ま
でに提案されている血栓溶解剤は２種類に分類される。
その中のひとつはフイブリンを直接溶解することができ
るタンパク質分解酵素であり、他は凝塊を溶解するプラ
スミンを体内で放出する溶解素生成通路（ｌｙｔｉｃ
ｐａｔｈｗａｙ）を活性化させる酵素性活性化剤であ
る。血栓崩壊剤として使用することが提案されているタ
ンパク質分解酵素の例には、たとえば、ブリナーゼ（ｂ
ｒｉｎａｓｅ）、パパイン（ｐａｐａｉｎ）、オクラー
ゼ（ｏｃｈｒａｓｅ）、トリプシンおよびプラスミンが
ある。しかしながら、これらの酵素は、静脈注射によっ
て投与されると、生体内で抑制できないタンパク質分解
変化を誘発することがあるので、きわめて毒性が強い。
たとえば、プラスミン出血症候群を起こすフイブリノー
ゲンその他の凝塊要素に変質する。またこれらの酵素は
プラスミノーゲン欠乏を起こすことによって血栓症状を
生じることがある。これらの理由のために、このタイプ
の酵素を治療薬として使用することはほとんどない。
【０００５】
【発明が解決しようとする問題点】血栓崩壊治療に最も
有用であることが一般に認められている医薬はストレプ
トキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ）とウロキナ
ーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ）の２種類である。これらは
活性化因子であり、プラスミノーゲンをプラスミンに転
換させることによって作用する。ストレプトキナーゼは
溶血性連鎖状球菌（ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃ ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｉ）の分泌物であり、多量に安価に製造す
ることができる。ウロキナーゼは非常に少量しか得られ
ず、きわめて高価である。これらの医薬はともに大きい
凝塊を静脈の深部においてさえも溶解することができる
が、これらによって生じる強力なフイブリン溶解状態は
同様にかなり危険である出血を誘発する傾向をもつ。従
ってこれらの医薬の使用は主静脈中に重症の血栓性閉塞
を持つ患者または肺動脈塞栓症患者だけに厳重に制限さ
れる。さらに活性化因子は天然の溶解素分泌系を刺戟す
るので、その全身系の投与はプラスミノーゲン欠乏を生
じ、そのためにもし治療が長びくと、患者を血栓症にお
かされやすい体質にすることがある。この作用はストレ
プトキナーゼおよびプラスミノーゲンの併用によってあ
る程度克服できるが、この折哀案は、このような併用に
よるプラスミンの全身的な形成が凝塊／溶解素生成通路
制御機構を無力にする傾向があるので、治療としてのフ
イブリン分解の問題の適切な解決とならない。
【０００６】本発明者らは、可逆的に失活できるある種
の酵素の使用によって、今までに知られている血栓溶解
剤のほとんどすべての欠点を克服することが可能である
ことを見出した。プラスミンまたはストレプトキナーゼ
／プラスミノーゲン活性化因子複合体（ａｃｔｉｖａｔ
ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ）のようなある種の酵素が特に生
体内でフイブリンに対してある程度の選択性を示すこと
が認められた。この種の酵素に要求される構造および特
性がまだ完全に決定されていないが、本発明者らは生体
内でフイブリンに対する特異性をもつ酵素を認知できる
試験法を案出した。
【０００７】以下この試験法で陽性を示す酵素のことを
「生体内フイブリン溶解酵素（ｉｎｖｉｖｏ ｆｉｂｒ
ｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅｓ）」と呼ぶことにす
る。
【０００８】本発明者は、触媒活性をおおうと同時にフ
イブリンに対する親和性に影響を与えないでもとのまま
これを保持するが、水性媒中で加水分解して活性酵素を
放出するようにこれらの酵素誘導体を作り得ることを見
出した。
【０００９】
【問題点を解決するための手段】従って本発明によれ
ば、フイブリン溶解活性に必要な触媒部位（ｓｉｔｅ）
が、ｐＨ７．４の等脹性水性媒（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａ
ｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉａ）中３７℃での擬似一次加水
分解速度恒数（ｐｓｅｕｄｏ−ｆｉｒｓｔ ｏｒｄｅｒ
ｒａｔｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｌ
ｙｓｉｓ）が１０-6〜１０-3／秒であるような速度で加
水分解によって除去できる基よってブロックされている
前述の生体内フイブリン溶解酵素と、調薬に供し得るキ
ヤリヤーとよりなる医薬組成物が得られる。
【００１０】生体内フイブリン溶解活性を測定するのに
使用される試験は被験ウサギの下大静脈（ｉｎｆｅｒｉ
ｏｒ ｖｅｎａ ｃａｖａ）中に放射能によってラベル
される凝塊を形成することによって実施される。試験薬
は、確実に静脈血と完全に混合するように、必ず心臓を
通らなければならない点で血流中に導入される。特異性
がない溶解素酵素（ｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ）は血中
のタンパク質をおかし、凝塊の溶解が観察される前に死
に到らしめる。フイブリンに対してある程度の特異性を
もつ酵素は致死量より低い投与量で凝塊を溶解する。溶
解が起ったことは、血流中に放射性の断片が遊離される
ことによって示される。
【００１１】本明細書で使用される「生体内フイブリン
溶解酵素」とは、その酵素が下大静脈中に配置された放
射能でラベルされた凝塊を持つウサギに５時間以内に全
身的に投与されるとき、ウサギを死に到らしめることな
く、投与開始から６時間で血中の放射能レベルをバック
グランドレベルの少なくとも２倍に上昇させる酵素のこ
とである。
【００１２】この試験を実施するひとつの特定方法を次
に示す。
【００１３】体重２．５〜３．５ｋｇのニュージーラン
ド白ウサギに麻酔をかけ、３本のカニューレをそれぞれ
前顔面静脈（本明細書でカニューレ１と呼ぶ）、左頸動
脈（カニューレ２と呼ぶ）および左外腸骨静脈（カニュ
ーレ３と呼ぶ）に挿入する。次にウサギの開腹手術を実
施し、左腎臓静脈との接合部付近で下大静脈を露出させ
る。下大静脈の一部をその接合部付近で結紮し、左腸骨
静脈との接合部寄りに近づいた点で下大静脈上に鉗子を
置くことによって隔離する。１００μｌの放射性ヨウ素
化したヒトフイブリノーゲン（ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｉ
ｎｏｇｅｎ）および１５０μｌのウサギのトロンボプラ
スチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ）よりなる混合
物の５０μｌを静脈の隔離された部分に注射することに
よって放射性凝塊を誘発させる。５０μｌという量は任
意にきめられた量であって、正確に測定できる最低量
と、隔離された静脈の部分内で生理学的条件に過度の障
害を与えることなしに注射できる最大量との間の量を表
わす。血流中に放出される放射能を測定するためには、
静脈に注射される放射性活性体の量が０．２５μＣｉよ
りも少くならないようにすべきであって、一般に０．２
５〜１．０μＣｉの量が便利である。注射を注射部位か
ら滲出液および凝塊しない放射性活性体を吸収するよう
におこなうために下大静脈の外壁の入口点で注射針の上
に凝塊綿棒（ｃｌｏｔ ｓｗａｂ）を置く。フイブリノ
ーゲン／トロンボプラスチン混合物の第２の対照液５０
μｌを計数用ビアルに移し、そのγ−放射線のレベルを
液体シンチレーシヨンカウンターで計数するか、あるい
はヨウ化ナトリウム結晶法を使用して直接γ−計数する
ことによって測定する。対照液は動物に注射された放射
能の目安を与える。第１の凝塊綿棒は全ての最初の滲出
液を採取するのに十分な時間、一般に５分間安置してか
ら第２の綿球にとりかえる。第１の凝塊綿棒を計数用ビ
アルに移し、γ−放射レベルを計数する。カニューレ３
を前述の鉗子からできるだけ離し、フイブリノーゲン／
トロンボプラスミン混合物の注射後１０分後にヘパリン
溶液０．５ｍｌ（５００μ／ｍｌ）をカニューレ３を通
して投与する。ヘパリン注射の目的は試験凝塊中に有意
量のラベルされていない自己発生的ウサギフイブリンが
入りこむことを防止するために、凝塊形成の程度を制限
することである。この理由は、もし有意量の非ラベル物
質が凝塊の中に這入り込むと、非ラベル溶解生成物が血
流中に放出されるので、溶解の検出ができなくなること
にある。もしたとえば放射性凝塊が非放射性物質で包被
されると、この誤差は無視できなくなる。
【００１４】結紮を部分的に開いて、下大静脈をその正
常直径の４０〜６０％に絞窄する絞窄は凝塊の移動を防
止するために必要である。鉗子を除去し、カニューレ２
を通り、ヘパリン溶液１．０ｍｌ（５００μ／ｍｌ）を
投与して被験動物の凝固を防止し、実験の目的に要求さ
れる凝塊以外の凝塊の形成を防止する。次に出血をチェ
ックし、もし持続していたらトロンビン含浸綿棒を使用
することによって止血する。放射性活性物質の注射後１
５分後にカニューレ２から血液試料１．８ｍｌを抜取
り、クエン酸三ナトリウム緩衝液０．２ｇ（３．８％ｗ
／ｖ）を加えることによって凝固を防止する。希釈血液
試料（ＰO ）のγ−放射能を液体シンチレーシヨンカウ
ンターで計数するか、あるいはヨウ化ナトリウム結晶法
を使用して直接γ−計数することによって測定する。こ
の値は血液中の放射性活性の目安となる。次に凝塊を
４．０ｍｌの食塩水を０．２ｍｌ／分の流量でカニュー
レ３を通して注入することによって洗浄し、外因性の放
射性活性物質を循環液中に洗い流し、血栓形成剤を洗い
流すことによって凝塊の成長の防止を助成する、第２の
血液試料（Ｐ10）を前述の如く、クエン酸塩緩衝液中に
取出し、Ｐo から１０分後に前述の如くγ−放射能を計
数する。この計数は余計な放射性活性物質が血液中に洗
い込まれているかどうかをチェックし、凝塊の安定性の
目安を得るためにおこなわれる。
【００１５】試料Ｐo の２０分後に、食塩水の注入をや
め、さらに血液試料を採取（時間ｔ＝０）し、試験酵素
の注入を開始する。ｔ＝０に採取された血液試料の放射
能の量はバックグラウンド放射能量の目安となる。
【００１６】酵素の一投与量を全身注入によって投与
し、注入開始後３０分毎に６時間２ｍｌずつの血液試料
を採取し、各試料の放射能をヨウ化ナトリウム結晶法を
使用する直接γ−計数または液体シンチレーシヨンカウ
ターで計数することによって測定し、遊離プラスミン活
性を生体外で測定する。
【００１７】陽性の結果を得るために、被験動物に投与
すべき投与量は致死をともなわず活性が観測されるまで
試行錯誤法によって決定する。使用すべき投与量の手引
きとして、被験動物の体重ｋｇあたり活性触媒部位の１
×１０-7〜５×１０-6モルのヒトプラスミンの投与量が
試験で陽性の結果を与え、同様にストレプトキナーゼ／
プラスミノーゲン活性化因子複合体の投与量は１×１０
-10 〜１×１０-8モル／ｋｇで陽性になる。従ってタン
パク質分解活性部位の濃度が不明の場合には、色素生成
滴定または螢光生成滴定によるか、あるいは酵素の分析
的に純な試料の分子量および比活性度を測定することに
よって求めることができる。
【００１８】投与量は前述の範囲の選択と同様に人為的
に選択される。選ばれた投与量の２０％を実験の開始に
投与し、残りの量を２時間にわたって投与する。もし活
性が観察されなければ、活性が観察されるまで、あるい
は毒性が実験を制限するまで、投与量を増加して実験を
反復する。注入の期間を５時間まで増すことができる。
【００１９】本願明細書に定義されているような生体内
フイブリン溶解活性を有する酵素はたとえばウロキナー
ゼ、ストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活性化因子
複合体、血管活性化因子、特にヒト血管活性化因子およ
びプラスミン、特に哺乳動物プラスミンたとえばブタ、
ウシ、ウマ、サルおよびヒトのプラスミンである。
【００２０】本発明で使用するのに好ましい酵素はヒト
プラスミンおよびストレプトキナーゼ／ヒトプラスミノ
ーゲン活性化因子複合体である。本発明によって、ヒト
プラスミンおよびストレプトキナーゼ／ヒトプラスミノ
ーゲン活性化因子複合体の混合物のブロックされた誘導
体、特にアシル誘導体を形成すると有利なことが判明し
た。この混合物は常法によってストレプトキナーゼによ
ってヒトプラスミノーゲンを活性化し、すべての活性化
因子複合体を除去しないことによって便利に製造され
る。
【００２１】本発明において、本発明の組成物に使用さ
れるブロックされた酵素は対応する遊離酵素を使用する
よりも次の有利点をもつことがわかった。
【００２２】ａ） ブロックされている方がブロックさ
れていない酵素よりもより効果がある。
【００２３】ｂ） ブロックされている酵素の生理学的
に活性に永続性がある。
【００２４】ｃ） ブロックされている酵素はその毒性
が比較的に低毒性であるために１回の、場合によっては
多量の投与量を静脈注射によって投与することができ
る。これに対して現在おこなわれている治療法では、酵
素、活性化因子又は活性化因子複合体を数時間または数
日間の期間にわたって連続的に静脈注射しなければなら
ない。
【００２５】プラスミンのような酵素は、たとえばチバ
ー等の方法（Ｂ．Ａ．Ｋ．Ｃｈｉｂｂｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３４
巻、４２４〜４３２ページ）およびロビンスおよびスマ
リアの方法（Ｋ．Ｃ．ＲｏｂｂｉｎｓおよびＫ．Ｓｎｍ
ｍａｒｉａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ．，４５巻、２５７〜２７３ページ）のような既知の
方法によって調製することができる。別法としてプラス
ミノーゲンを英国特許第１０１３５０７号、同第１０６
６４６７号、同第１０７８１４１号および同第１０９６
９５３号明細書に記載の方法によって単離し、次にこれ
を標準法によってプラスミンに変換することができる。
【００２６】ヒトの血管活性化因子はペッパー等の方法
（Ｄ．Ｓ．Ｐｅｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅ
ｓｓ ｉｎ Ｃｈｅｍ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ａ
ｎｄＴｈｒｏｍｏｂｏｌｙｓｉｓ，１９７８，３，９１
〜９８．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）によって分離することができる。ストレプトキナー
ゼ／プラスミノーゲン活性化因子複合体はマツククリン
トツクおよびベル（Ｄ．Ｋ．Ｍｃｃｌｉｎｔｏｃｋおよ
びＰ．Ｈ．Ｂｅｌｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．４３，６９４〜７０２，１９７
２）によって述べられている。ウロキナーゼはマカイグ
等の方法（Ｔ．Ｍａｃａｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４，，４５１〜４５
９）およびバーロウの方法（Ｇ．Ｈ．Ｂｏｒｌｏｗ，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４５，２３９〜
２４５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）によってヒト
尿から分離することができる。
【００２７】触媒部位のブロック基の本質的な特徴はブ
ロック基が擬似一次加水分解速度恒数が１０-6／秒以上
であり、１０-3／秒以下であるような速度で加水分解に
よって除去されなければならないことである。好ましく
は速度恒数は１０-5〜１０-3／秒である。
【００２８】１０-3／秒以上の擬似一次速度恒数を有す
る誘導体はフイブリンと結合する前に、許容できないほ
どの高レベルの遊離酵素を放出する。１０-6／秒以下の
擬似一次速度恒数を有する誘導体は著しく緩慢に酵素を
放出するので、臨床用に合わない。
【００２９】本発明による組成物は予防剤としても、ま
た治療剤としても使用することができる。予防の目的に
は、加水分解速度が小さく、従って長い半減期を有する
誘導体が好ましい。この目的に合う誘導体は擬似一次加
水分解速度恒数５×１０-4〜１０-5／秒および半減期
３．５〜１６時間を有する。治療用にはもっと急速に加
水分解する誘導体、すなわち半減期約３０分〜２時間に
相当する擬似一次加水分解速度恒数５×１０-4〜７×１
０-5／秒を有するものが好ましい。
【００３０】擬似一次反応速度恒数は酵素誘導体を生理
学的条件、すなわちｐＨ７．４および３７℃の等脹性水
性媒中で加水分解することによって測定される。定期的
に液を少量ずつ抜取り、Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ
−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐ−ニトロアニリッド２ＨＣｌ）の
ような色素産生または螢光産生プロテアーゼ基質で培養
し、基質の転換率を測定する。
【００３１】加水分解は基質の転換率が最大に達する時
間まで続ける。速度恒数Ｋは時間ｔに対する。
【００３２】Ｉｏｇｅ（１−Ａｔ／Ａｍａｘ）
【００３３】（式中Ａｍａｘは試料が基質を転換させる
最大速度であり、Ａｔは試料が時間ｔで基質を転換する
速度である）をプロットすることによって計算される。
【００３４】本発明の誘導体に使用されるブロック基の
詳細な同定は、選択された酵素の性質および誘導体の使
用目的によってある程度変動する。
【００３５】たとえばプラスミンおよびストレプトキナ
ーゼ／プラスミノーゲン活性化因子の場合には、タンバ
ク質分解活性に必須な触媒部位は遊離ヒドロキシル部分
（ｍｏｊｅｔｙ）を有するセリン残基を含む。好ましく
はこの部位はベンゾイル、置換ベンゾイル、アクリロイ
ルまたは置換アクリロイルのようなアシル基でブロック
される。特定の置換ベンゾイルでブロックされた酵素誘
導体の擬似一次加水分解速度恒数は、特定の置換基と酵
素との間に特別の交互作用がない限り、２種類以上の置
換ベンゾイル誘導体の擬似一次反応速度が測定されてい
れば任意の置換基のハメツトのσ値を基準にして評価す
ることができる。
【００３６】ｍ−およびｐ−置換基に対するハメツト値
σｍおよびσｐは加水分解速度を許容できる程度に予言
することが一般的に認められている。さらにσｍ値およ
びσｐ値の合計は１基以上の置換基を有する他の置換ベ
ンゾイル基の動力学的性質をかなりの精度で計算するこ
とができる。ｏ−置換基に対するハメツト値σｏは合計
しても立体効果のためにσｍ値およびσｐ値と同一信頼
度をもたない。しかしながらｏ−置換基が小さく、立体
効果が無視できる場合、すなわちフッ素、メチルおよび
メトキシの場合にはσｏ値は単独またはσｍ値および
（または）σｐ値と合計して一般に認められている誤差
の範囲内で反応速度の計算に使用することができる。
【００３７】このような制限を受けて、フエニル環が１
基以上の置換基、特にハメツトσ値の合計が０．１〜−
１．１になるｍ−および（または）ｐ−置換基を有する
置換ベンゾイル基は本発明に従ってヒトプラスミンをブ
ロックするのに使用することができる。フエニル環が１
基以上の置換基、特にｍ−および（または）ｐ−置換基
をハメツトのσ値の合計が−０．９〜＋０．３であるよ
うに有する置換ベンゾイル基はブタプラスミンの触媒部
位をブロックするのに使用することができる。
【００３８】好適なベンゾイル基および置換ベンゾイル
基にはベンゾイル基およびハロゲン、Ｃ1 〜Ｃ6 アルキ
ル、Ｃ1 〜Ｃ6 アルコキシ、Ｃ1 〜Ｃ6 アルカノイルオ
キシ、Ｃ1 〜Ｃ6 アルカノイルアミノ（ＲＣＯＮＨ−）
で置換されたベンゾイル基、たとえばベンゾイル、ｐ−
フルオロベンゾイル、ｏ−トルオイル、ｍ−トルオイ
ル、ｐ−トルオイル、ｏ−メトキシベンゾイル、ｍ−メ
トキシベンゾイル、ｐ−メトキシベンゾイル（即ち、ア
ニソイル）、ｏ−エトキシベンゾイル、ｍ−エトキシベ
ンゾイル、ｐ−エトキシベンゾイル、２，４−ジメトキ
シベンゾイル、３，４−ジメチルベンゾイル、４−ブチ
ルベンゾイル、３−メチル−４−メトキシベンゾイル、
ｏ−アセトキシベンゾイル（すなわちアセチルサリシロ
イル）およびｐ−アセタミドベンゾイルがある。別の芳
香族基にナフトイルがある。
【００３９】この一般則に対する例外はベンゾイル基が
塩基性部分、たとえばアミノ、ジメチルアミノおよびグ
アニジノを有する場合である。この種の誘導体の加水分
解速度は計算値より１０倍程度までおそくなる。
【００４０】この種の誘導体の例はｐ−グアニジノベン
ゾイルヒト及びブタプラスミンである。
【００４１】本発明に従ってヒトおよびブタプラスミン
をブロックするのに使用できる他のアシル基のグループ
はアクリロイルおよび置換アクリロイル、特にシンナモ
イルおよび１基以上の置換基、特にｍ−および（また
は）ｐ−置換基を有し、ハメツトのσ値の合計が前述の
制限下に−１．０〜＋０．１５である置換シンナモイル
である。
【００４２】好適な置換アクリロイル基には、Ｃ1 〜Ｃ
6 アルキルアクリロイル、フリルアクリロイル、シンナ
モイル、Ｃ1 〜Ｃ6 アルキルシンナモイル、特に３，３
−ジメチルアクリロイル、３−（２−フリル）アクリロ
イル、シンナモイルおよびｐ−メチルシンナモイルがあ
る。
【００４３】本発明の組成物はヒトに静脈注射によって
投与するのに適する医薬組成物を調剤する常法に従って
調剤される。
【００４４】静脈注射投与用の代表的な組成物は滅菌等
脹性水性緩衝液中の滅菌誘導体の溶液である。必要に応
じて、組成物に誘導体を溶液にしておくための可溶化剤
および注射部位の苦痛を緩和するためのリグノカイン
（Ｉｉｇｎｏｃａｉｎｅ）のような局部麻酔剤を入れる
ことができる。一般に酵素誘導体はたとえば乾燥粉末ま
たは水を含まない原液の形にしてアンプルのような密封
容器または薬袋に入れた単位投与量の形で供給され、活
性単位数で表わされた酵素の量ならびに遊離酵素が放出
される時間を指示する。誘導体を注入によって投与しよ
うとする場合には、誘導体は滅菌製薬級の「注射用水」
を入れた注入ビンとともに配給される。誘導体を注射投
与しようとするときには、誘導体は注射用の滅菌水のア
ンプルとともに配給される。注射用または注入用組成物
は投与前に各成分を混合することのよって調製される。
【００４５】物質の投与量は、フイブリン溶解所要量、
溶解に要求される速度、血栓塞栓症の病状および凝塊の
場所および大きさによって変化する。たとえば肺動脈塞
栓症または生死に関係するような大型の上昇回腸一股動
脈血栓症の患者には急速に作用する物質の１服を投与し
なければならない。一方手術後の血栓形成を防止しよう
とする場合には、緩効物質の少量を必要とする。投与し
ようとする定量的な投与量および投与の方式は状況に応
じて処置を監督する医師によって患者の性質を考慮に入
れて必然的に決定されなければならない。しかしなが
ら、一般に、中程度の大きさの血栓を治療しようとして
いる患者には、体重１ｋｇに対して１日１〜２０ｍｇの
投与量が８回までの回数に分割して、あるいは注入によ
って一般に投与される。
【００４６】本発明の組成物に使用できる数種の誘導体
が知られている。これらの誘導体およびその製造を記載
している文献とともに次に示す。
【００４７】１． ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラ
スミン（Ｔ．Ｃｈａｓｅ ＆ Ｅ．Ｓｈａｗ，Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．８．Ｎｏ．５、２２１２〜２２２４、１９６
９） ２． ｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／
プラスミノーゲン活性化因子複合体（Ｄ．Ｋ．Ｍｃ Ｃ
ｌｉｎｔｏｃｋ ＆ Ｐ．Ｈ．Ｂｅｌｌ，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，４３，６９
４〜７０２，１９７１）
【００４８】過去においてこれらの２種類の誘導体は前
述の酵素の活性部位滴定中に生成された。しかしながら
これらの誘導体の単離および特性はまだ報告されたこと
はない。さらにこれらの酵素誘導体がフイブリン溶解剤
として有用なことは今までに認められていなかった。
【００４９】本発明によれば、フイブリン溶解活性に必
須な触媒部位が、ｐＨ７．４の等脹性水性媒中３７℃で
の擬似一次加水分解速度恒数が１０-6〜１０-3／秒であ
るような速度で加水分解によって除去できる基によって
ブロックされている生体内フイブリン溶解酵素の単離誘
導体、ただし、ブロックされているストレプトキナーゼ
／ヒトプラスミノーゲン活性化因子は除く、が得られ
る。
【００５０】本発明によれば、さらにフイブリン溶解活
性に必須な触媒部位が、ｐＨ７．４等脹性水性媒中３７
℃での擬似一次加水分解速度恒数が１０-6〜１０-3／秒
であるような速度で加水分解によって除去できる基によ
ってブロックされている生体内フイブリン溶解酵素の単
離誘導体、ただし １）ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン、 ２）ｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／プ
ラスミノーゲン活性化因子複合体および ３）ブロックされているストレプトキナーゼ／ヒトプラ
スミノーゲン活性化因子は除く、が得られる。
【００５１】本発明の誘導体は２つの方法、すなわち直
接または逆ブロッキングによって製造することができ
る。
【００５２】直接ブロッキング法は酵素を式 ＡＢ で示される試薬（式中Ａはフイブリン溶解活性に必須で
ある触媒部位に対して選択的且つ基Ｂから触媒部位に移
動し得る基であり、Ｂは酵素と基Ａとの結合を容易にす
る脱離可能な基である）と反応させ、次に必要に応じて
生成酵素誘導体を単離することによりなる。
【００５３】このように作用する試薬は既知であり、た
とえばｐ−グアニジノ安息香酸ｐ−ニトロフエニルであ
る。グアニジノベンゾイル部分は選択的に触媒部位の隣
接位置に近づき、その結合はｐ−ニトロフエニル脱離基
によって助成される。
【００５４】逆ブロッキング法は式 ＥＦ で示される試薬〔式中Ｅは試薬を触媒部位に配置させる
配置基（Ｉｏｃａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）であり、Ｆは
配置基から触媒部位へ移転可能な基である〕を使用し、
次に必要に応じて生成誘導体を単離することよりなる。
【００５５】ブロックしようとする酵素がプラスミンま
たはストレプトキナーゼ／プラスミノーゲン活性化因子
複合体であるきとの基Ｅの例にはｐ−アミジノフエノキ
シおよびｐ−アセトアミジノフエノキシまたはｍ−また
はｐ−位に正電荷部分を含有する類似の構造を有する置
換フエニル基がある。
【００５６】逆ブロッキング試薬はたとえばｐ1 −フル
オロ安息香酸ｐ−アミジノフエニル、Ｐ1 −トルイル酸
ｐ−アミジノフエニル、ｐ1 −アニス酸ｐ−アミジノフ
エニル、安息香酸ｐ−アミジノフエニル、桂皮酸ｐ−ア
ミジノフエニル、ｐ1 −メチル桂皮酸ｐ−アミジノフエ
ニル、３−（２−フリル）−アクリル酸ｐ−アミジノフ
エニル、２−ナフトエ酸ｐ−アミジノフエニル、３，３
ジメチルアクリル酸ｐ−アミジノフエニル、４−ブチル
安息香酸ｐ−アミジノフエニル、２，４−ジメトキシ安
息香酸ｐ−アミジノフエニル、アセチルサリチル酸ｐ−
アミジノフエニル、４−エトキシ安息香酸ｐ−アミジノ
フエニル、ｐ1 −アニス酸ｐ−アセタミジノフエニル、
ｏ−トルイル酸ｐ−アミジノフエニル、３，４−ジメチ
ル安息香酸ｐ−アミジノフエニル３−メチル−４−メト
キシ安息香酸ｐ−アミジノフエニルおよび４−アセタミ
ド安息香酸ｐ−アミジノフエニルである。
【００５７】直接ブロッキング反応および逆ブロッキン
グ反応は、酵素、ブロッキング試薬および製品に有害で
ないｐＨ範囲、たとえばｐＨ４〜８、好ましくは５．０
〜７．５で水性媒中で実施される。
【００５８】反応は一般に等モルの酵素およびブロッキ
ング試薬を使用して実施されるが、過剰のブロッキング
試薬を使用することもできる。また希釈溶液、すなわち
酵素に対しては１０-3モル以下およびブロッキング試薬
に対しては１０-2モル以下の濃度の溶液中で反応をおこ
なうことが好ましい。一般に酵素またはブロッキング試
薬の濃度が１０-7モル以下の溶液では実施されない。
【００５９】ブロッキング反応は中温、すなわち室温ま
たは室温以下、好ましくは１０℃以下であり、また反応
媒の凍結温度以上で実施しなければならない。
【００６０】反応を進行させる時間は使用されるブロッ
キング試薬、反応を実施する温度およびブロッキング反
応に選ばれる酵素によって変化する。ある特定の状況に
対する最適反応時間は反応液の一部を色素または螢光産
生基質で培養することによる酵素活性の低下によって選
ぶことができる。
【００６１】反応が完結してから、誘導体は、透析、ア
フイニテイクロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃ
ｎｒｏｍｔｏｇｒａｐｈｙ）および限外ろ過のような標
準的な方法によって精製され、次に水性媒から凍結乾燥
のような標準的方法によって回収される。また必要に応
じて、ヒトの静脈注射投与に適合させるために、たとえ
ば滅菌する。
【００６２】式ＥＦで示される逆ブロッキング試薬（式
中Ｅはｐ−アミジノフエノキシであり、Ｆはアシル基で
ある）はｐ−ヒドロキシベンザミジンまたはその塩を式 ＦＸ で示されるアシル化誘導体（式中Ｆは前述の基であり、
Ｘはヒドロキシルまたはその活性化アシル化誘導体であ
る）で、場合によっては触媒の存在下にアシル化するこ
とによって製造することができる。
【００６３】活性化アシル化誘導体にはたとえば塩化ま
たは臭化アシルがある。これらの誘導体は標準的方法に
よって製造することができる。
【００６４】アシル化反応に好ましい触媒にはピリジン
のような第三有機塩基およびジシクロヘキシルカルボジ
イミドのようなカップリング剤がある。
【００６５】一般にアシル化反応は反応剤および製品に
対して不活性な極性有機溶媒中で実施される。好適な溶
媒にはＮ，Ｎ−ジメチルホルムイアミドおよびジメチル
スルホキシドがある。別法として触媒がピリジンのよう
な液体である場合には溶媒を使用しないで反応を実施す
ることができる。
【００６６】一般に反応は中温すなわち７０℃以下、好
ましくは４０℃以下、最適には室温で実施される。
【００６７】反応を完結するまで進行させる時間は、使
用する反応剤、溶媒および反応をおこなう温度によって
変化する。反応時間はたとえば薄層クロマトグラフィー
で反応を追跡することによって決定することができる。
【００６８】反応が完結したら、製品を回収し、標準的
な方法によって精製する。
【００６９】Ｆが置換ベンゾイル基である逆ブロッキン
グ試薬は新規化合物であり、本発明の要件の一部を構成
する。
【００７０】
【実施例】次の実施例は本発明を例示する。実施例１〜
１８は逆ブロッキング試薬の製造を例示する。
【００７１】実施例１ 安息香酸のｐ−アミジノフエニルエステル塩酸塩
【００７２】ｐ−ヒドロキシベンズアミジン塩酸塩０．
１７２ｇを乾燥ピリジン１．０ｍｌにとかし、これにピ
リジン１．０ｍｌ中の塩化ベンゾイル０．１４１ｇを溶
液を滴下した。混合物を室温で１時間かきまぜてから、
室温で４日間放置した。混合物を乾固近くまで蒸発し、
残留物を乾燥ジエチルエーテルとすりつぶし、得られる
固体を約３ｍｌの２−プロパノールとジエチルエーテル
の２：１ｖ／ｖの混液から再結晶させ、融点１６０℃の
目的化合物０．２２３ｇを得た。
【００７３】核磁気共鳴スペクトル分析（ｎ．ｍ．
ｒ．）δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、９．６５（二
重線、４Ｈ，Ｄ2 Ｏで交換可能、アミジンのＨ）、約
８．０（多重線，９Ｈ，フエニルおよびアミジノフエニ
ル）実施例２〜１０は実施例１に記載の方法と同様にし
て製造された。
【００７４】実施例２ トランス桂皮酸のｐ−アミジノフエニルエステル塩酸塩
【００７５】融点、１９２℃ ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、９．５
５（二重線、４Ｈ、Ｄ2Ｏと交換可能、アミジンの
Ｈ）、７．９５（多重線、６Ｈ，アミジノフエニルおよ
びアクリロイルのＨ）、７．１０（多重線、５Ｈ，フエ
ニルのＨ）、６．９６（二重線、Ｊ＝１６Ｈｚ，１Ｈ、
アクリロイルのＨ）。
【００７６】実施例３ ｐ−アニス酸のｐ1 −アミジノフエノニルエステル塩酸
塩
【００７７】２−プロパノールから再結晶させた製品の
融点２２５℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシド
ｄ6 ）、９．５０（二重線、４Ｈ）、８．０５（四重
線、Ｊ＝６Ｈｚ、４Ｈ、アミジノフエニルのＨ）、７．
３８（四重線、Ｊ＝９Ｈｚ、４Ｈ、ｐ−アニソールの
Ｈ）、３．９０（シングレット、３Ｈ、メトキシの
Ｈ）。
【００７８】実施例４ ３，３−ジメチルアクリル酸のｐ−アミジノフエニルエ
ステル塩酸塩
【００７９】水から再結晶させた製品の融点、１７３
℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、
９．５０（二重線、４Ｈ、Ｄ2Ｏと交換可能、アミジン
のＨ）、７．９５および７．３７（四重線、Ｊ＝９Ｈ
ｚ、４Ｈ、アミジノフエニルのＨ）、５．９６（広い幅
の二重線、Ｊ＝１Ｈｚ、１Ｈ、アクリロイルのＨ、２．
０９（シングレット、３Ｈ、メチルのＨ）、１．９０
（シングレット、３Ｈ，メチルのＨ）。
【００８０】実施例５ ４−ブチル安息香酸のｐ−アミジノフエニルエステル塩
酸塩
【００８１】イソプロパノールと水との容積比１：４か
ら再結晶させた製品の融点、１９０℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ
（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、９．５５（広い幅の二
重線、４Ｈ、Ｄ2 Ｏと交換可能、アミジンのＨ）、７．
６〜８．１（重復した四重線、８Ｈ、アミジノフエニル
およびベンゾイルのＨ）１．３０（シングレット、９
Ｈ、ｔ−ブチルのＨ）。
【００８２】実施例６ ２，４−ジメトキシ安息香酸のｐ−アミジノフエニルエ
ステル塩酸塩
【００８３】メタノールから再結晶させた製品の融点、
２１３〜２１４℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキ
シドｄ6 ）、９．４８（二重線、４Ｈ、Ｄ2Ｏと交換可
能、アミジンのＨ）、８．０１および７．５０（ＡＡ1
ＢＢ1 四重線、Ｊ＝８Ｈｚ、アミジノフエニルのＨ）、
８．０３および６．７５（多重線、３Ｈ、２，４−置換
フエニルのＨ）３．９０（シングレット、６Ｈ、２×メ
トキシのＨ）
【００８４】実施例７ アセチルサリチル酸のｐ−アミジノフエニルエステル塩
酸塩
【００８５】イソプロパノールから再結晶させた製品の
融点１０９〜１１１℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスル
ホキシドｄ6 ）、９．６２（広い幅の二重線、４Ｈ、Ｄ
2 Ｏと交換可能アミジンのＨ）、８．１２および７．５
５（ＡＡ1 ＢＢ1 四重線、Ｊ＝９Ｈｚ、４Ｈ、アミジノ
フエニルのＨ）２．２６（シングレット、３Ｈ、アセチ
ルのＨ）。
【００８６】実施例８ ４−エトキシ安息香酸のｐ−アミジノフエニルエステル
塩酸塩
【００８７】イソプロパノールから再結晶させた製品の
融点２１１〜２１２℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスル
ホキシド、ｄ6 ）、９．６０（広い二重線、４Ｈ、Ｄ2
Ｏと交換可能、アミジンのＨ）、８．１０および７．５
６（ＡＡ1 ＢＢ1四重線、Ｊ＝９Ｈｚ、４Ｈ、アミジノ
フエニルのＨ）８．１３および７．１５（ＡＡ1 ＢＢ1
四重線、Ｊ＝９Ｈｚ、４Ｈ、４−エトキシフエニルの
Ｈ）、４．１９（四重線、２Ｈ、−ＯＣＨ2 ＣＨ3 ）、
９．３８（三重線、−ＯＣＨ2 ＣＨ3）。
【００８８】実施例９ ｏ−トルイル酸のｐ−アミジノフエニルエステル塩酸塩
【００８９】イソプロパノールとジエチルエーテルとの
混液から２回再結晶させた製品の融点、１５７〜９℃、
ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、（広い
二重線、４Ｈ、Ｄ2 Ｏと交換可能、アミジンのＨ）、
８．２０および７．６２（ＡＡ1 ＢＢ1 四重線、４Ｈ、
アミジノフエニルのＨ）、７．３〜８．２（多重線、４
Ｈ、２−メチルフエニルのＨ）、２．１１（シングレッ
ト、３Ｈ、メチルのＨ）。
【００９０】実施例１０ （ａ）２−（４−ヒドロキシフエニル）アセタミジン塩
酸塩
【００９１】ｐ−ヒドロキシベンジルシアニド５．０ｇ
無水エタノール５０ｍｌにとかした溶液を室温で乾燥Ｈ
Ｃｌガスで４時間にわたって飽和させた。４℃で７２時
間後乾燥ジエチルエーテル２００ｍｌおよび軽質石油１
００ｍｌを加え、２時間にわたって白色結晶を沈澱させ
た。固体をろ過によって単離し、直ちにアンモニア飽和
エタノール３００ｍｌと室温で３時間反応させ、反応混
合物をスチームバス上で蒸発乾固し、残留物をエタノー
ルで再結晶させた。融点２４８℃（分解）
【００９２】収量、４．３６ｇ ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、９．０
〜９．８のエンベローブ（５Ｈ、Ｄ2 Ｏと交換可能、ア
ミジンおよびヒドロキシルのＨ）、６．８５＋７．３７
（ＡＡ1 ＢＢ1 四重線、４Ｈ、Ｊ＝９Ｈｚ、フエニルの
Ｈ）、３．７０（シングレット、２Ｈ、ベンジルの
Ｈ）。
【００９３】（ｂ）４−メトキシ安息香酸のｐ−（ホル
ムアミジノメチル）フエニルエステル
【００９４】イソプロパノールとジエチルエーテルとか
ら再結晶させた製品の融点、１７４〜１７６℃、ｎ．
ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、９．４２
（広い幅の二重線、４Ｈ、Ｄ2 Ｏと交換可能、アミジノ
のＨ）、８．１５および６．２９（ＡＡ1 ＢＢ1 四重
線、Ｊ＝８Ｈｚ、４Ｈ、４−メトキシフエニルのＨ）、
７．６９および７．１３（ＡＡ1 ＢＢ1 四重線、Ｊ＝８
Ｈｚ、４Ｈ、アミジノフエニルのＨ）、３．９０（シン
グレット、３Ｈ、メトキシのＨ）。
【００９５】実施例１１ ｐ−トルイル酸のｐ1 −アミジノフエニルエステル塩酸
塩
【００９６】ｐ−ヒドロキシベンズアミジン塩酸塩１．
７２ｇおよびｐ−トルイル酸１．３６ｇを乾燥ピリジン
５．０ｍｌとジメチルスルホキシド１０．０ｍｌとの
混合物にとかし、溶液をＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド２．１ｇとともに室温で７２時間かきまぜ
た。反応混合物をろ過し、ろ液に乾燥ジエチルエーテル
２００ｍｌを加えて沈澱させ、生成する油状物を沈澱後
に結晶させ、等容積の２−プロパノールと１．４−ジオ
キサンとから再結晶させて、融点１６４℃の製品を得
た。ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、
９．６（広い幅の二重線、Ｄ2Ｏと交換可能、４Ｈ、ア
ミジンのＨ）、８．１５（四重線、Ｊ＝約４Ｈｚ、アミ
ジノフエニルのＨ）、７．６０（四重線、Ｊ＝約９Ｈ
ｚ、４Ｈ、ベンゾイルのＨ）、２．４４（シングレッ
ト、３Ｈ、メチルのＨ）。
【００９７】実施例１２〜１８の化合物は実施例１１に
記載の方法によって製造された。
【００９８】実施例１２ ｐ−フルオロ安息香酸のｐ1 −アミジノフエニルエステ
ル過塩素酸塩
【００９９】エーテルで沈降させた油状液を５％ｗ／ｖ
の過塩素酸１０ｍｌから再結晶させた製品の融点、１８
０℃（分解）、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシド
ｄ6 ）、９．３（二重線、４Ｈ、Ｄ2 Ｏと交換可能、ア
ミジンのＨ）、８．２５（四重線、Ｊ＝約５Ｈｚ、５
Ｈ、ベンゾイルの３−および５−Ｈ）、７．８（重復四
重線、６Ｈ、アミジノフエニルのＨおよびベンゾイルの
２−および６−Ｈ）。
【０１００】実施例１３ ３−（２−フリル）アクリル酸のｐ−アミジノフエニル
エステル過塩素酸塩
【０１０１】ピリジン中でカップリング反応をおこな
い、ろ液は乾固付近まで蒸発し、残留物を希過塩素酸か
ら再結晶させた灰白色の板状結晶。 融点、１５７℃
【０１０２】ｎ．ｍ．ｒδ（ジメチルスルホキシド
ｄ6 ）、９．３５（二重線、Ｄ2 Ｏと交換可能、４Ｈ、
アミジンのＨ）、７．７（四重線、Ｊ＝約８Ｈｚ、４−
アミジノフエニルのＨ）、７．９（二重線、Ｊ＝約３Ｈ
ｚ、１Ｈ、フリルの５−Ｈ）、７．８５および７．４０
（二重線、Ｊ＝２０Ｈｚ、１Ｈ、２−アクリロイルの
Ｈ）７．１０（二重線、Ｊ＝約３Ｈｚ、１Ｈ、フリルの
３−Ｈ）、６．７０（多重線、１Ｈ、フリルの４−Ｈ）
６．４４（二重線、Ｊ＝１５Ｈｚ、１Ｈ、アクリロイル
の３−Ｈ）。
【０１０３】実施例１４ ｐ−メチル−トランス桂皮酸のｐ−アミジノフエニルエ
ステル過塩素酸塩
【０１０４】３−（２−フリル）アクリル酸エステルと
して単離 融点、１５５℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシ
ドｄ6 ）、９．１５（二重線、Ｄ2 Ｏと交換可能、４
Ｈ、アミジンのＨ）、７．２〜８．２（多重線、６Ｈ、
アミジノフエニルおよびフエニルのＨ）、６．８２（二
重線、Ｊ＝１６Ｈｚ、１Ｈ、アクリロイルの２−Ｈ）、
６．４４（二重線Ｊ＝１６Ｈｚ、１Ｈ、アクリロイルの
Ｈ）、２．４２（二重線、Ｊ＝２Ｈｚ、３Ｈ、メチルの
Ｈ）。
【０１０５】実施例１５ ｏ−アニス酸のｐ−アミジノフエニルエステル塩酸塩
【０１０６】イソプロパノールから再結晶させた製品の
融点１４９℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシド
ｄ6 ）、９．５０（広い幅のシングレット、４Ｈ、Ｄ2
Ｏと交換可能、アミジンのＨ）、７．５０および７．９
５（不規則な多重線、５Ｈ、アミジノフエノールのＨお
よび２−Ｈ）、７．０〜７．５（多重線、３Ｈ、ベンゾ
イルの３−Ｈ、４−Ｈおよび５−Ｈ）、３．８６（シン
グレット、３Ｈ、メトキシのＨ）。
【０１０７】実施例１６ ３，４−ジメチル安息香酸のｐ−アミジノフエニルエス
テル塩酸塩
【０１０８】イソプロパノールおよび食塩水から再結晶
させた製品の融点、１０７℃、ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチ
ルスルホキシドｄ6 ）、９．５６（広い幅のシングレッ
ト、４Ｈ、Ｄ2 Ｏと交換可能、アミジンのＨ）、７．５
０〜７．９５（不規則な三重線、７Ｈ、アミジノフエニ
ルおよびベンゾイルのＨ）、２．３０（シングレット、
６Ｈ、メチルのＨ）。
【０１０９】実施例１７ ３−メチル−４−メトキシ安息香酸のｐ−アミジノフエ
ニルエステル塩酸塩
【０１１０】イゾプロパノールと２ＮＨＣｌの容積比１
０：１の混液から再結晶させた製品の融点、２１０℃、
ｎ．ｍ．ｒ．δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、９．５
４（二重線、４Ｈ、Ｄ2Ｏと交換可能、アミジンの
Ｈ）、８．０７（不規則な二重線、４Ｈ、２−Ｈ＋ベン
ゾイルの６−Ｈ、アミジノフエニルの２Ｈおよび６−
Ｈ）、７．６０（二重線、Ｊ＝９Ｈｚ、アミジノフエニ
ルの３−Ｈおよび６−Ｈ）、７．２２（二重線、Ｊ＝９
Ｈｚ、１Ｈ、ベンゾイルの５−Ｈ）、３．９２（シング
レット、３Ｈ、メトキシのＨ）、２．２６（シングレッ
ト、３Ｈ、メトキシのＨ）。
【０１１１】実施例１８ ４−アセタミド安息香酸ｐ−アミジノフエニルエステル
塩酸塩
【０１１２】イアオプロパノールと水との容積比１：２
から再結晶させた製品の融点、２５７℃、ｎ．ｍ．ｒ．
δ（ジメチルスルホキシドｄ6 ）、１０．６２（シング
レット、１Ｈ、Ｄ2 Ｏと交換可能、アミジンのＨ）、
７．９０（ＡＡ1 ＢＢ1 四重線、４Ｈ）、７．５０〜
７．９（重復ＡＡ1 ＢＢ1 四重線、４Ｈ、ベンゾイルお
よびアミジノフエニルＨ）、２．０９（シングレット、
３Ｈ、アセチルのＨ）。
【０１１３】実施例１９ 単離した凍結乾燥ｐ−アニソイルヒトプラスミン
【０１１４】２０％ｖ／ｖグリセロール／０．９％ｗ／
ｖ食塩水溶液４．２ｍｌ中のヒトプラスミン０．１５マ
イクロモルを、ジメチルスルホキシド中の、前記実施例
３の如くに製造したｐ1 −アニス酸ｐ−アミジノフエニ
ルの０．１Ｍ溶液５０μｌと２０℃で処理した。７．５
分後にさらにアシル化剤５０μｌを追加し、生成物を前
述のグリセロール／食塩水混合液に対して２時間透析し
てから、湿潤重量２３ｇのＬ−リシン−セフアローズ４
Ｂ（Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ−ｃａｌｓ製）
およびｐＨ７．０の０．１Ｍトリエタノールアミン塩酸
塩緩衝液２０ｍｌの混合物に加え、４℃で１０分間培養
した。次にろ過しゲルを前記の緩衝液１００ｍｌで洗っ
た。次にゲルを前記の緩衝液中のε−アミノカプロイン
酸の０．２Ｍ溶液と混合し、４℃で１０分間培養した。
ろ過し、ε−アミノカプロイン酸溶液５５ｍｌで洗って
から、ろ液を４℃のｐＨ７．０の５０ｍＭ重炭酸アンモ
ニウム５ｌに対して２時間ずつ２回透析した。最後に残
った液をデキストランＴ７０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と
混合して凍結乾燥し、１．９８ｇの白色固体を得た。こ
の不活性化物質は脱アシル化に指定された条件で、約２
時間で定量的に再活性化されて遊離プラスミンとなっ
た。
【０１１５】実施例１、２および４〜１８のアシル化剤
は実施例１９の方法によってヒトプラスミンと反応し
て、それぞれ相当するブロッキング基でブロックされた
プラスミンを得た。実施例１０のアシル化剤を使用する
場合反応を確実に完結させるために、アシル化剤を高濃
度で使用するか、あるいは反応を長時間進行させること
が好ましい。これらのアシル化化合物の脱アシル化速度
を第１表に示す。
【０１１６】実施例２０ 凍結乾燥ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン
【０１１７】２０％ｖ／ｖグリセロール１．０ｍｌ中の
ヒトプラスミン８．４５×１０-9モルをジメチルスルホ
キシド中の０．１Ｍｐ1-グアニジノ安息香酸ｐ−ニトロ
フエニルの１０μｌで２回０℃で１０分間ずつ処理し、
溶液のｐＨを希塩酸で６．０に調節し、ｐＨ７．０の１
０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液の２ｌに対して２時
間透析し、Ｌ−リシン塩酸塩１００ｍｇを加えて混合物
を凍結乾燥した。加水分解すると活性プラスミンになる
淡黄色の固体９３．５ｍｇを単離した。
【０１１８】実施例２１ トランス−シンナモイルブタプラスミン溶液の製造
【０１１９】１０％ｖ／ｖグリセロールおよび０．９％
ｗ／ｖ食塩水溶液２６ｍｌ中のブタの血プラスミン１．
７３マイクロモルを、０．９％ｗ／ｖ食塩水１ｍｌ中に
懸濁されたトランス桂皮酸ｐ−アミジノフエニル３．０
２ｍｇと４℃で２０分間かきまぜることによって処理
し、混合物を次に−２０℃で凍結し、２０℃で１晩貯蔵
した。融解してから混合物を前記のグリセロール／食塩
水２ｌに対して、４℃で２時間透析し、製品を使用する
で０℃で貯蔵した。この誘導体は原酵素の活性の０．５
％以下の活性をもち、脱アシル化条件で２時間再賦活す
ることができた。
【０１２０】実施例２２ ｐ−アニソイルストレプトキナーゼ−ヒトプラスミノー
ゲン活性化因子複合体溶液の製造
【０１２１】０．９％ｗ／ｖ食塩水溶液１０．５ｍｌ中
のストレプトキナーゼ５×１０4 単位（スエーデン、ス
トックホルムのＡ．Ｂ．Ｋａｌｉ）をヒト溶解プラスミ
ノーゲン０．０２５ｍｌ（４．９×１０-9モル）と混合
し、混合物を２５℃で４０分間培養してから、ｐＨ７．
４の０．１Ｍのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩
酸塩、０．９％ｗ／ｖの食塩および２０％ｖ／ｖのグリ
セロールを含む液２．０ｍｌで希釈した。この溶液を、
原料溶液としてジメチルスルホキシド中０．１Ｍとして
調製したｐ1 −アニス酸ｐ−アミドフエニルが最終的に
０．１ｍＭになるように２５℃で５分間ずつ３回処理
し、アシル化した酵素をＬ−リシンセフアローズ４Ｂの
３３％湿潤重量／容積の沈澱液と０℃で１０分間処理し
た。懸濁液を吸引を過し、前述のトリスヒドロキシメチ
ルアミノエタン塩酸塩／グリセロール／食塩水緩衝液１
００ｍｌで４℃で洗った。ゲルを、さらに０．１Ｍのア
ミノカプロイン酸を含有する前述のトリスヒドロキシメ
チルアミノエタン塩酸塩／グリセロール／食塩水緩衝液
５ｍｌに再懸濁し、０℃に保ち、１０分後にゲルの懸濁
液を１０００ｇで２分間遠心分離することによって清澄
させ、上澄液４ｍｌを前述のトリスヒドロキシメチルア
ミノメタン塩酸塩／グリセロール／食塩水緩衝液２ｌに
対して透析した。生成したアシル化活性化因子複合体の
溶液は擬似一次反応速度恒数２．７×１０-4／秒で３７
℃で遊離酵素に再生することができた。
【０１２２】実施例２３ ３−メチルｐ−アニソイルストレプトキナーゼ−ヒトプ
ラスミノーゲン活性化因子複合体溶液の製造
【０１２３】この溶液は３−メチルｐ−アニス酸ｐ−ア
ミジノフエニルエステルの最終濃度が０．２ｍＭとなる
ように２回にわたって２５℃で１５分間ずつで、続いて
０℃で１時間アシル化をおこなったこと以外は実施例２
２の記載の方法と同様に製造された。擬似一次脱アシル
化反応速度恒数は１×１０-4／秒であった。
【０１２４】実施例２４ ｐ−アニソイルヒトプラスミンおよびｐ−アニソイルス
トレプトキナーゼ−ヒトプラスミノーゲン活性化因子複
合体の混合物の製造
【０１２５】溶解ヒトプラスミノーゲン２１６ｍｇ
（２．５６マイクロモル）をｐＨ７．４の０．１Ｍのト
リスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩、０．９％ｗ
／ｖ食塩および２０％ｖ／ｖグリセロール中に６．８ｍ
ｇ／ｌの濃度になるように溶解した溶液をストレプトキ
ナーゼ（スエーデン、Ａ．Ｂ．Ｋａｌｉ製）１．２×１
０4 単位（約２．６７×１０-9モル）と処理し、混合物
を２５℃で１時間培養し、グリセロールを３３％ｖ／ｖ
とした。この溶液９．０ｍｌをｐ−アニス酸ｐ−アミジ
ノフエニルと２５℃で２回にわけて、最終濃度が０．１
ｍＭになるようにアシル化し、次に前述の緩衝液２ｌに
対して１時間透析した。生成溶液はもとのプラスミン活
性の１％以下の活性を示し、ウサギによる試験系に使用
するのに適した形をしていた。
【０１２６】実施例２５ ｐ1 −アニス酸（３Ｈ−メトキシ）ｐ−アミジノフエニ
ルとヒトプラスミンおよびブタプラスミンとの化学量論
的反応
【０１２７】（ａ） ヒトプラスミン 濃度２．６７×１０-5Ｍのヒトプラスミンの溶液０．２
ｍｌ（５．３４×１０-9モル）をトリチウム化したｐ−
アニス酸ｐ−アミジノフエニルの２０ｍＭの溶液（比放
射能２２．８ｍＣｉ／ミリモル）と２５℃で７．５分間
ずつ２回にわけて反応させた。アセトン中の１０％ｗ／
ｖトリクロロ酢酸１．８ｍｌを加えてから、タンパク質
を沈澱させ、１５００ｇの加速度で３分間遠心分離する
ことによって単離した。タンパク質のペレットをトリク
ロロ酢酸のアセトン溶液２ｍｌで２回にわけて洗い、２
Ｎの水酸化ナトリウム溶液２ｍｌにとかした。この溶液
の液体シンチレーシヨンカウンターによる計数はタンパ
ク質に結合する平均０．１３０μＣｉを示し、この値は
アニス酸の５．７３×１０-9モルに相当していた。
【０１２８】（ｂ） ブタプラスミン ブタの血のプラスミンの５．２９×１０-5Ｍの溶液１
０．５４×１０-9モルを使用した同様の実験はアニス酸
に対して９．５８×１０-9モルの平均放射化学分析値を
与えた。
【０１２９】実施例２６ 凍結乾燥ｐ−アニソイルストレプトキナーゼ／ヒトプラ
スミノーゲン活性化因子複合体
【０１３０】０．９％ｗ／ｖの食塩水０．９ｍｌ中のス
トレプトキナーゼ９×１０-4単位を溶解ヒトプラスミノ
ーゲン１４．９×１０-9モル（０．０７５ｍｌ）と混合
し、混合物を２５℃で３０分間培養してからｐＨ７．４
の０．１Ｍトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩
緩衝液で希釈した。この溶液を３回にわけて、ジメチル
スルホキシド中の１０ｍＭの原溶液として調製したｐ−
アニス酸ｐ−アミジノフエニルと２５℃で５分ずつ処理
し、最終濃度を０．１ｍＭとした。アシル化酵素をＬ−
リシンセフアローズ４Ｂの湿潤重量で３３％ｗ／ｖの懸
濁液と０℃で１０分間混合し、懸濁液を吸引ろ過し、４
℃で前述のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩
緩衝液２００ｍｌで洗い、ゲルを０．１Ｍのアミノカプ
ロイン酸を含むｐＨ７．４の前述の５０ｍＭのトリスヒ
ドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液５．０ｍｌに
再懸濁し、次にろ過し、同じ緩衝液５ｍｌで３回洗浄し
た。ろ液および洗浄液を合わせ、ｐＨ７．４の５．０ｍ
Ｍのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液
中の５％ｗ／ｖマニトール２ｌに対して４℃で２時間透
析してから凍結乾燥して白色粉末０．５６０ｇを得た。
この物質は原料酵素活性の５％以下の活性をもち、水性
媒中３７℃で再生することができた。
【０１３１】
【効果】
加水分解データ
【０１３２】実施例１〜１８に記載のアシル化剤から製
造された酵素誘導体に対する擬似一次加水分解速度恒数
Ｋを実施例２２に記載した方法で決定した。その結果を
表１に示す。
【０１３３】
【表１】ｐＨ７．４、３７℃における活性部位のセリン
置換プラスミンの脱アシル化速度恒数

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フイブリン溶解活性に必須な触媒部位
    が、ｐＨ７．４の等脹性水性媒中３７℃での疑似一次加
    水分解速度恒数が１０-6〜１０-3／秒であるような速度
    で加水分解によって除去できる基によってブロックされ
    ている生体内フイブリン溶解酵素の単離誘導体、ただ
    し、ブロックされているストレプトキナーゼ／ヒトプラ
    スミノーゲン活性化因子は除く。
  2. 【請求項２】 フイブリン溶解活性に必須な触媒部位
    が、ｐＨ７．４の等脹性水性媒中３７℃での疑似一次加
    水分解速度恒数が１０-6〜１０-3／秒であるような速度
    で加水分解によって除去できる基によってブロックされ
    ている生体内フイブリン溶解酵素誘導体、ただし、 １）ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン、 ２）ｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／プ
    ラスミノーゲン活性化因子複合体および ３）ブロックされているストレプトキナーゼ／ヒトプラ
    スミノーゲン活性化因子は除く。
  3. 【請求項３】 酵素がヒトプラスミンである請求項１ま
    たは２記載の誘導体。
  4. 【請求項４】 加水分解によって除去可能な基がアシル
    基である請求項１〜３のいずれか一つの項記載の誘導
    体。
  5. 【請求項５】 アシル基がベンゾイル、置換ベンゾイ
    ル、アクリロイル又は置換アクリロイルである請求項４
    記載の誘導体。
  6. 【請求項６】 アシル基がベンゾイル基、または１基以
    上のｍ−および／又はｐ−置換基を有し、ハメットのσ
    ｍまたはσｐ値の合計が＋０．１〜−１．１である置換
    ベンゾイル基である請求項５記載の誘導体。
  7. 【請求項７】 アシル基がベンゾイル基、またはハロゲ
    ン、Ｃ1 〜Ｃ6 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ6 アルコキシ、Ｃ1
    〜Ｃ6 アルカノイルオキシ、Ｃ1 〜Ｃ6 アルカノイルア
    ミノまたはｐ−グアニジノ基で置換されたベンゾイル基
    である請求項６記載の誘導体。
  8. 【請求項８】 アシル基がアクリロイル基またはＣ1 〜
    Ｃ6 アルキル、フリル、フェニルまたはＣ1 〜Ｃ6 アル
    キルフェニルで置換されたアクリロイル基である請求項
    ５記載の誘導体。
  9. 【請求項９】 ｐ−アニソイルヒトプラスミンである請
    求項１または２記載の誘導体。
  10. 【請求項１０】 生体内フイブリン溶解酵素を式 ＡＢ で示されるブロック剤（式中Ａはフイブリン溶解活性に
    必須な触媒部位に対して選択性を有し且つ基Ｂから触媒
    部位へ移転できる基であり、そしてＢは基Ａが酵素に結
    合することを容易にする基である）と反応させることよ
    りなる、フイブリン溶解活性に必須な触媒部位が、ｐＨ
    ７．４の等脹性水性媒中３７℃での疑似一次加水分解速
    度恒数が１０-6〜１０-3／秒であるような速度で加水分
    解によって除去できる基によってブロックされている生
    体内フイブリン溶解酵素を製造する方法、ただし １）ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン、 ２）ｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／プ
    ラスミノーゲン活性化因子複合体および ３）ブロックされているストレプトキナーゼ／ヒトプラ
    スミノーゲン活性化因子は除く。
  11. 【請求項１１】 ブロック剤ＡＢがｐ−ニトロフェニル
    ｐ−グアニジノベンゾエートである請求項１０記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】 生体内フイブリン溶解酵素を式 ＥＦ で示される化合物〔式中Ｅは触媒部位に対して選択性で
    ある配置基であり、Ｆは配置基から活性部位へ移転動可
    能な基である〕と反応させることよりなる、フイブリン
    溶解活性に必須な触媒部位がｐＨ７．４の等脹性水性媒
    中３７℃での疑似一次加水分解速度恒数が１０-6〜１０
    -3／秒であるような速度で加水分解によって除去できる
    基によってブロックされている生体内フイブリン溶解酵
    素を製造する方法、ただし １）ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン、 ２）ｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／プ
    ラスミノーゲン活性化因子複合体および ３）ブロックされているストレプトキナーゼ／ヒトプラ
    スミノーゲン活性化因子は除く。
  13. 【請求項１３】 Ｆがベンゾイルまたは置換ベンゾイル
    基である請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 Ｅがｐ−アミジノフエノキシまたはｐ
    −アセトアミジノフエノキシである請求項１２記載の方
    法。
  15. 【請求項１５】 フイブリン溶解活性に必須な触媒部位
    が、ｐＨ７．４の等脹性水性媒中３７℃での疑似一次加
    水分解速度恒数が１０-6〜１０-3／秒であるような速度
    で加水分解によって除去できる基によってブロックされ
    ている生体内フイブリン溶解酵素誘導体および製薬的に
    許容し得るキャリヤーよりなるフイブリン溶解剤、ただ
    し酵素誘導体から １）ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン、 ２）ｐ−グアニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／プ
    ラスミノーゲン活性化因子複合体および ３）ブロックされているストレプトキナーゼ／ヒトプラ
    スミノーゲン活性化因子は除く。
  16. 【請求項１６】 酵素がヒトプラスミンである請求項１
    ５記載のフィブリン溶解剤。
  17. 【請求項１７】 酵素がヒトプラスミンおよびストレプ
    トキナーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体で
    ある請求項１５記載のフィブリン溶解剤。
  18. 【請求項１８】 加水分解によって除去できる基がアシ
    ル基である請求項１５〜１７のいずれか一つの項記載の
    フィブリン溶解剤。
  19. 【請求項１９】 アシル基がベンゾイル、置換ベンゾイ
    ル、アクリロイルまたは置換アクリロイル基である請求
    項１８記載のフィブリン溶解剤。
  20. 【請求項２０】 アシル基がベンゾイル基または１基以
    上のｍ−および／またはｐ−置換基を有し、ハメツトの
    σｍ値およびσｐ値の合計が＋０．１〜−１．１である
    置換ベンゾイル基である請求項１９のフィブリン溶解
    剤。
  21. 【請求項２１】 アシル基がベンゾイル基、またはハロ
    ゲン、Ｃ1 〜Ｃ6 アルキル、Ｃ1 〜Ｃ6 アルコキシ、Ｃ
    1 〜Ｃ6 アルカノイルオキシ、Ｃ1 〜Ｃ6 アルカノイル
    アミノまたはｐ−グアニジノ基で置換されたベンゾイル
    基である請求項２０記載のフィブリン溶解剤。
  22. 【請求項２２】 アシル基がアクリロイル基またはＣ1
    〜Ｃ6 アルキル、フリル、フェニルまたはＣ1 〜Ｃ6 ア
    ルキルフェニルで置換されたアクリロイル基である請求
    項１９記載のフィブリン溶解剤。
  23. 【請求項２３】 Ｅがｐ−アミジノフエノキシまたはｐ
    −アセトアミジノフエノキシ基であり、Ｆがベンゾイ
    ル、置換ベンゾイル、アクリロイルまたは置換アクリロ
    イル基である式ＥＦの化合物。
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