JPH02154687A - 医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は静脈血栓症（ｖｅｎｏｕｓ　ｔｈｒｏｍｂｏｓ
ｉｓ　）の治療に使用される酵素誘導体に関するもので
ある。 静脈血栓症は血液成分から塊状の固体すなわち栓（ｐｌ
ｕｇ　）を静脈中に形成する。このような栓は全部また
は一部分が転移して曲の崩管部位に移動することがあり
、この転移が起るとき、血栓（ｔｈｒｏｍｂｕｓ　）ま
たはその断片を塞栓（ｅｍｂｏｌｕｓ　）という。血栓
または塞栓に関連する状態を一緒にして血栓塞栓疾患ま
たは異常といい、総合的に見ると、これらはヨーロッパ
諸国で重疾患および死亡の主な原因となってｈる。 現在静脈血栓症の治療のために提案されている２１類の
治療剤、すなわち凝固抑制剤および血栓崩壊剤がある。 現在最も一般的に使用されている治療剤は凝固抑制剤で
あって、その中でも最も広く使用されているのは、一般
的に最も効果的であることが認められているヘパリン（
ｈｅｐａｒｉｎ　）およびジヒドロギシクマリン〔ワル
ファリン、（ｗａｒｆａｒｌｎ　）　）である。凝固抑
制剤の主な欠点は、これらの凝固抑制剤には凝塊（ｃｌ
ｏｔ　）に対する直接の溶解作用をもたないので、急性
血栓症状の治療に対してほとんど有用性をもたないこと
である。 第二に、これらの凝固抑制剤は凝塊系の機能を低下させ
るので、このｆ−の医薬を使用するときに特有な合併症
として、相当に危険と思われている出血が抑制できない
。 静脈血栓症の治療に使用することを現在までに提案され
ている血栓溶解剤は２Ｎ類に分類される。 その中のひとつはフィブリンを直接溶解することができ
るタンパク質分解酵素であり、他は凝塊を溶解するプラ
スミンを体内で放出する溶解素生成通路（１７ｔｉｃ　
ｐａｔｈｗａ７　）を活性化させる酵素性活性化剤であ
る。血栓崩壊剤として使用することが提案されているタ
ンパク質分解酵素の例には、たとえば、ブリナーゼ（ｂ
ｒｉｎａｓｅ　）　、パパイン（Ｔｌａｐａｌｎ　）Ｓ
オフラーゼ（ｏｃｈｒａａｅ　）　Ｓ）リブシンおよび
プラスミンがある。しかしながら、これらの酵素は、静
脈注射によって投与されると、生体内で抑制できないタ
ンパク質分解変化を誘発することがあるので、きわめて
毒性が強い。たとえば、プラスミンは出血症候群を起す
フィブリノーゲンその他の凝塊要素に変質する。またこ
れらの酵素はプラスミノーゲン欠乏を起すことによって
血栓症状を生じることがある。これらの理由のために、
このタイプの酵素を治療薬として使用することはほとん
どない。 血栓崩壊治療に最も有用であることが一般に認められて
いる医薬はストレプトキナーゼ（５ｔｒｅ−ｐｔｏｋｉ
ｎａｓｅ　）とウロ中ナーゼ（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ　）
の２１類である。これらは活性化因子であり、プラスミ
ノーゲンをプラスミンに転換させることによっテ作用す
る。ストレプトキナーゼは溶血連鎖状球菌（ｈａｅｍｏ
ｌｙｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　）の分泌物で
あり１多量に安価に製造することができる。ウロギナー
ゼは非常に少量しか得られず、きわめて高価である。こ
れらの医薬はともに大きい凝塊を静脈の深部においてさ
えも溶解することができるが、これらによって生じる強
力なフィブリン溶解状態は同様にかなり危険である出血
を誘発する傾向をもつ。 厳重に制限される。さらに賦活剤は天然の溶解素分泌系
を刺戟するので、その全身系の投与はプラスミノーゲン
欠乏を生じ、そのためにもし治療が長びくと、患者を血
栓症におかされやすい体質にすることがある。この作用
はストレプト牛ナーゼおよびプラスミノーゲンの併用に
よっである程度克服できるが、この折衷案は、このよう
な併用によるプラスミンの全身的な形成が凝塊／溶解素
生成通路制御機構を無力にする傾向があるので、治療と
してのフィブリン分解の問題の適切な解決とならない。 本発明者らは、可逆的に失活できるある種の酵素の使用
によって、今までに知られている血栓溶解削のほとんど
すべての欠点を克服することが可能であることを見出し
た。プラスミンまたはストレプトキナーゼ／プラスミノ
ーゲン活性化因子複合体（ａｃｔｌｖａｔｏｒ　ｃｏｍ
ｐｌｅｘ　）のようなある１の酵素が特に生体内でフィ
ブリンに対しである程度の選択性を示すことが認められ
た。この狸の酵素に要求される構造および特性がまだ完
全に決定されていないが、本発明者らは生体内でフィブ
リンに対する特異性をもつ酵素を認知できる試験法を掌
出した。 以下この試験法で陽性を示す酵素のことを「生体内フィ
ブリン溶解酵素（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｆｉｂｒｉｎｏｌｙ
ｔ−１ｃｅｎｚｙｍｅｓ　）　Ｊと呼ぶことにする。 本発明者らは、触媒活性をおおうと同時にフィブリンに
対する親和性に影響を与えないでもとのままこれを保持
するが、水性媒中で加水分解して活性酵素を放出するよ
うにこれらの酵素誘導体を作り得ることを見出した。 従って本発明によれば、フィブリン溶解活性に必要な触
媒部位（５ｉｔｅ　）が、ｐＨ７，４の等脱性水性媒（
１ｓｏｔｏｎｉｃ　ａｑｕｅｏｕｓ　ｍｅｄｉａ　）中
３７℃での擬似一次加水分解速度恒数（ｐｓｅｕｄｏ　
−ｆｉｒｓｔ　ｏｒｄｅｒ　ｒａｔｅｃｏｎｓｔａｎｔ
　ｆｏｒ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ　）が１０°６〜１０
−３／秒であるような速度で加水分解によって除去でき
る基よってブロックされている前述の生体内フィブリン
溶解酵素と、調薬に供し得る争ヤリャーとよりなる医薬
組成物が得られる。 生体内フィブリン溶解活性を測定するのに使用される試
験は被験ウサギの工大静脈（１ｎｆｅｒｉｏｒｖｅｎａ
　ｃａｖａ　）中に放射能によってラベルされる凝塊を
形成することによって実姉される。試験薬は、確実に静
脈血と完全に混合するように、必らず心、豫を通らなけ
ればならない点で血流中に導入される。特異性がない溶
解素酵素（１ｙｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅ　）は血中のタン
パク質をおかし、凝塊の溶解が観察されろ前に死に到ら
しめる。ブイプリンに対しである程度の特異性をもつ酵
素は致死量より低い投与量で凝塊を溶解する。溶解が起
ったことは、血流中に放射性の断片が遊離されることに
よって示される。 本明細書で使用される「生体内フィブリン溶解酵素」と
は、その酵素が下大靜脈中に配置された放射能でラベル
された凝塊を持つウサギに５時間以内に全身的に投与さ
れるとき、ウサギを死に到らしめることなく、投与開始
から６時間で血中の放射能レベルをバックグランドレベ
ルの少なくとも２倍に上昇させる酵素のことである。 この試験を実施するひとつの特定方法を次に示す。 体ｉ２．５〜３．５　ｋｇのニューシーラント白つサギ
ニ麻酔をかけ、３本のカニユーレをそれぞれ前類面静脈
ｃ本明細書でカニユーレ１と呼ぶ）、左頭動脈Ｃカニユ
ーレ２と呼ぶ）および左外腸骨靜脈Ｃカニユーレ３と呼
ぶ）に挿入する。次にウサギの開腹手術を実姉し、左腎
）臓静脈との接合部付近で工大静脈を露出させる。工大
静脈の一部をその接合部付近で結紮し、左腸骨静脈との
接合部寄りに近づｒた点で下大靜脈上に鉗子を置くこと
によって隔離する。１００μノの放射性ヨク累化したと
トフイプリノーゲン（ｈｕｍａｎ　ｆｉｂｒｉｎｏｇｅ
ｎ　）および１５０μ！のウサギのトロンボプラスチン
（ｔｈｒｏｍｂ−ｏＰｌａｓｔｉｎ　）よりなる混合物
の（資）μｌを静脈の隔離された部分に注射することに
よって放射性凝塊を誘発させる。製μｌという量は任意
にきめられた量であって、正確に測定できる最低量と、
隔離されたことなしに注射できる最大１との間の量を表
わす。 血流中に放出される放射能を測定するためには、静脈に
注射される放射性活性体の蛍が０．２５μＣＩよりも少
くならないようにすべきであって、一般に０．２５〜１
．０ＡＣ１の借が便利である。注射を注射部位から滲出
液および凝塊しない放射性活性体を吸収するようにおこ
なうために工大静脈の外壁の入口点で注射針の上に凝塊
綿棒（ｃｌｏｔ　ｓｗａｂ　）を置・く。フィブリノー
ゲン／トロンボプラスチン混合物の第２の対照液（７）
μｌを計数用ビアルに移し、そのγ−放射線のレベルを
液体シンチレーションカウンターで計数するか、あるい
はヨウ化ナトリウム結晶法を使用して直接γ−計数する
ことによって測定する。対照液は動物に注射された放射
能の目安を与える。第１の凝塊綿棒は全ての最初の滲出
液を採取するのに十分な時間、一般に５分間定置してか
ら第２の綿球にとりかえる。第１の凝塊綿棒を計数用ビ
アルに移し、γ−放射レベルを計数スル。カニユーレ３
を前述の鉗子からできるだけ離し、フィブリノーゲン／
トロンボプラスミン混合物の注射後１０分後にヘパリン
の溶液０．５扉ｔ（５００μ／ｍｌ）をカニユーレ３を
通して投与する。 ヘパリン注射の目的は試、験凝塊中に有意量のう・パル
されていない自己発生的ウサギフィブリンが入りこむこ
とを防止するために、凝塊形成の程Ｌ１を制限すること
である。この理由は、もし有意４１の非ラベル物質が凝
塊の中に這入り込むと、非ラベル溶解生成物が血流中に
放出されるので、溶解の検出ができなくなることにある
。もしたとえば放射性凝塊が非放射性物質で包被される
と、この誤差は無視できなくなる。 結紮を部分的に開いて、工大静脈をその正常直径の４０
〜６０％に絞窄する絞窄は凝塊の移動を防止するために
必要である。鉗子を除去し、カニユーレ２を通り、ヘパ
リン溶液１，０　耐（５００μ／ｍｌ）を投与して被験
動物の凝固を防止し、実験の目的に要求される凝塊以外
の凝塊の形成を防止する。次に出血をチエツクし、もし
持続していたらトロンビン含浸綿棒を使用することによ
って止血する。 放射性活性物質の注射後１５分後にカニユーレ２から血
液試料１．８扉ｔを次項り、クエン酸三ナトリウム緩衝
液０．２９　（３，８％ｖｒ／ｖ　）を加えるコトニよ
って凝固を防止する希釈血液試料（Ｐｏ）のγ−放射能
を液体シンチレーションカウンターで計数するか、ある
いはヨウ化す）　ＩＪウム結晶法を使用して直接γ−計
数することによって測定する。この値は血液中の放射性
活性の目安となる。次に凝塊を４．Ｏｍｌの食塩水をＱ
、２ｙｎｌ／分の渡世でカニユーレ３を通して注入する
ことによって洗浄し、外因性の放射性活性物質を循環液
中に洗い流し、血栓形成剤を洗い流すことによって凝塊
の生長の防止を助成する、第２の血液試料（Ｐｒｏ）を
前述の如く、クエン酸塩緩衝液中に取出し、ＰＯから１
０分後に前述の如くγ−放射能を計数する。この計数は
余計な放射性活性物質が血液中に洗い込まれているかど
うかをチエツクし、凝塊の安定性の目安を得るためにお
こなわれる。 試料Ｐｏ　の艶分後に、食塩水の注入をやめ、さらに血
液試料を採取ｃ時間ｔ−０）ｔ、、試験酵素の注入を開
始する。１＝０に採取されたＩｆＪｌ液試料の放射能の
量はバックグラウンド放射能量の目安となる。 酵素の一投与量を全身注入によって投与し、注入開始後
（資）分毎に６時間ｚＷＬｔずつの血液試料を採取し、
各試料の放射能をヨウ化ナトリウム、結晶法を使用する
直接γ−計数または液体シンチレーションカクンターで
計数することによって測定し、遊離プラスミン活性を生
体外で測定する。 陽性の結果を得るために、被験動物に投与すべき投与１
は致死をともなわず活性が観測されるまで試行錯誤法に
よって決定する。使用すべき投与量の手引きとして、被
験動物の体重１ｃ９あたり活性触媒部位のＩ　Ｘ−ｔｏ
”〜５　Ｘ　１０−６　モルのヒトプラスミンの投与量
が試験で陽性の結果を与え、同様にストレプト争ナーゼ
／プラスミノーゲン活性化因子複合体の投与量はＩ　Ｘ
　１０−”〜Ｉ　Ｘ　１０−’モル／ｋｇで陽性になる
。従ってタンパク質分解活性部位の濃度が不明の場合に
は、色素生成滴定または螢光生成滴定によるか、あるい
は酵素の分析的に純な試料の分子量および比活性度を測
定することによって求めることができる。 投与１は前述の範囲の選択と同様に人為的に選択される
。選ばれた投与量の２０％を実験の開始に投与し、残り
の量を２時間にわたって投与する。 もし活性が観察されたければ、活性が観察されるまで、
あるいは毒性が実験を制御層するまで、投与量を増加し
て実験を反復する。注入の期間を５時間まで増すことが
できる。 本願明細書に定義されているような生体内フィブリン溶
解活性を有する酵素はたとえばウロキナーゼ、ストレプ
トキナーゼ／プラスミノーゲン活性化因子複合体、血管
活性化因子、特にヒト血管活性化因子およびプラスミン
、特に補乳動物プラスミンたとえばブタ、ウシ、ウマ、
サルおよびヒトのプラスミンである。 本発明で使用するのに好ましい酵素はヒトプラスミンお
よびストレプトキナーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化
因子複合体でちる。本発明によって、ヒトプラスミンお
よびストレプトキナーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化
因子複合体の混合物のブロックされた誘導体、特にアシ
ル誘導体を形成すると特に有利なことが判明した。この
混合物は常法によってストレプトキナーゼによってヒト
プラスミノーゲンを活性化し、すべての活性化因子複合
体を除去しないことによって便利に製造される。 本発明において、本発明の組成物、に使用されるブロッ
クされた酵素は対応する遊離酵素を使用するよりも次の
有利点をもつことがわかった。 ｂ）ブロックされている酵素の生理学的活性に永続性が
ある。 Ｃ）ブロックされている酵素はその毒性が比較的に低毒
性であるために１回の、場合によっては多量の投与量を
静脈注射によって投与することができる。これに対して
現在おこなわれている治療法では、酵素、活性化因子又
は活性化因子複合体を数時間または数日間の期間にわた
つて連続的に静脈注入しなければならない。 プラスミンのような酵素は、たとえばチバー等の方法（
Ｂ、Ａ、に、Ｃｈｉｂｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ、ｓＭｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｍＥｎｚ７ｍｏ　ｌ　、　ｓ　３４巻、４２
４〜４３２ページ）およびロビンスおよびスマリアの方
法（Ｋ、Ｃ，Ｒｏｂｂｉｎｓおよび■ぐ、Ｓｎｍｒｒ、
ａｒｉａ＊Ｍｅｔｈｏｄｓ　　　ｉｎ　　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、ｅ４５　　巻　、　　２５７〜２７３ページ）のよ
うな既知の方法によって調製することができる。別法と
してプラスミノーゲンを英国特許第１０１３５０７号、
同ｉ　１０６６４６７号、同第１０７８１４１号および
同第１０９６９５３号明細書に記載の方法によって単離
し、次にこれを標準法によってプラスミンに変換するこ
とができる。 ヒトの血管活性化因子はペラパー等の方法ＣＤ、Ｓ、Ｐ
ｅｐｐｅｒ　＠ｔ　ａｌ、＊Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　
Ｃｈｅｍ、Ｆｉｂｒｉ−ｎｏｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈ
ｒｏｍｏｂｏｌｙｓｉｓ、１９７８．３ｍ　９１′９８
　。 ＦＬａｖｅｎ　Ｐｒａｓｓ＊Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）によ
って分離することができる。ストレプトキナーゼ／プラ
スミノーゲン活性化因子複合体はマツククリントツクお
よびベルＣＤ、に、ＭｃｃｌｌｎｔｏｃｋおよびＰ、Ｈ
，Ｂｅ１ｌ　（Ｂｌｏｃｈｅｍ。 Ｂｉｏｐｈ）’ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、４３　＃　６９
４〜７０２　ｅ　１９７２　）によって述べられている
。ウロキナーゼはマヵイグ等の方法（Ｔ、Ｍａｃａｉｇ
　ｅｔ　ａｌ、ｅＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ。 ３４　＃　４５１〜４５９）およびバーロウの方法ＣＧ
、Ｈ。 ＢｏｒｌｏｗｓＭｅｔｈｏｄｇ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
、４５　＃　２３９〜２４５　ｅＡｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ　）によってヒト尿から分離することができる
。 触媒部位のブロック基の本質的な特徴はブロック基が擬
似一次加水分解速度恒数が１０−６７秒以上であり、１
０″″３／秒以下であるような速度で加水分解によって
除去されたければならないことである。 好ましくは速度恒数は１０−５〜１０−’　７秒である
。 １０−３／秒以上の擬似一次速度恒数を有する誘導体は
フィブリンと結合する前に、許容できないほどの高レベ
ルの遊離酵素を放出する。１０−’　７秒以下の擬似一
次速度恒数を有する誘導体は著しく緩慢に酵素を放出す
るので、臨床用に合わない。 本発明による組成物は予防剤としても、また治療剤とし
ても使用することができる。予防の目的には、加水分解
速度が少さく、従って長い半減期を有する誘導体が好ま
しい。この目的に合う誘導体は擬似一次加水分解速度恒
数５　Ｘ　１０−４〜１０−５７秒および半減期３．５
〜１６時間を有する。治療用にはもつと急速に加水分解
する誘導体、すなわち半減期約加分〜２時間に相当する
擬似一次加水分解速度恒数５　Ｘ　１０−’〜７　Ｘ　
１０−’　７秒を有するものが好ましい。 擬似一次反応速度恒数は酵素誘導体を生理学的条件、す
なわちｐＨ７，４および３７℃の等脹性水性媒中で加水
分解することによって測定される。定期。 的に液を少量ずつ抜取り、Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａ
ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ７ｓ−ｐ−ニトロアニリッド２　Ｈ（Ｊ
　）のような色素産生または螢光産生プロテアーゼ基質
で培養し、基質の転換率を測定する。 加水分解は基質の転換率が最大に達する時間まで続ける
。速度恒数には時間ｔに対する。 Ｉｏｇ　（１−Ａｔ／Ａｍａｘ　） ｃ式中Ａｍａｘは試料が基質を転換させる最大速度であ
り、Ａｔは試料が時間ｔで基質を転換する速度である）
をプロットすることによって計算される。 本発明の誘導体に使用されるブロック基の詳細謔同定は
、選択された酵素の性質および誘導体の使用目的によっ
である程度変動する。 たとえばプラスミンおよびストレプトギナーゼ／プラス
ミノーゲン活性化因子の場合には、タンパク質分解活性
に必須な触媒部位は遊離ヒドロキシル部分（ｍｏｊｅｔ
ｙ　）を有するセリン残基を含む。 好ましくはこの部位はベンゾイル、置換ベンゾイル、ア
クリロイルまたは置換アクリロイルのようなアシル基で
ブロックされる。特定の置換ベンゾイルでブロックされ
た酵素誘導体の擬似一次加水分解速度恒数は、特定の置
換基と酵素との間に特別の交互作用がない限り、２種類
以上の置換ベンゾイル誘導体の擬似一次反応速度が測定
されていれば任意の置換基のハメットのσ値を基準にし
て評価することができる。 ｍ−およびｐ−ｔｚ置換基対するハメット値−σｍおよ
びσｐは加水分解速度を許容できる程度に予言すること
が一般的に認められている。さらにσｍ値およびσｐ値
の合計は１基以上の置換基を有する他の置換ベンゾイル
基の動力学的性質をかなりの精度で計算することができ
る。〇−置換基に対するハメット値σ０は合計しても立
体効果のためにσｍ値およびσρ値と同一信頼度をもた
ない。しかしながら〇−置換基が小さく、立体効果が無
視できる場合、すなわちフッ素、メチルおよびメトキシ
の場合にはσ０値は単独またはσｍ値および（または）
σｐ値と合計して一般に認められている誤差の範囲内で
反応速度の計算に使用することができる。 このような制限を受けて、フェニル環が１基以上の置換
基、特にハメットσ値の合計が０．１〜−１．１になる
ｍ−およびＣまたは）ｐ−置換基を有する置換ベンゾイ
ル基は本発明に従ってヒトプラスミンをブロックするの
に使用することができる。 フェニル環が１基以上の置換基、特にｍ−および（また
は）ｐ−置換基をハメットのσ値の合計が一〇、９〜十
０．３であるように有する置換べｙジイル基はブタプラ
スミンの触媒部位をブロックするのに使用することがで
きる。 好適なベンゾイル基および置換ベンゾイル基にはベンゾ
イル基およびハロゲン、ｃｌ−０６アル中ル、ＣＩ　Ｎ
　Ｃｓアルコキシ％Ｃ１〜ｃ６アルカノイルオキシ、０
１〜Ｃ６アルカノイルアミノ（ＲＣＯＮＨ−）で置換さ
れたベンゾイル基、たとえばベンゾイル、ｐ−フルオロ
ベンゾイル、ｏ−トルオイル、ｍ　−）ルオイル、ｐ−
トルオイル、０−メトキシベンゾイル、ｍ−エトキシベ
ンゾイル、ｐ−メトキシベンゾイルＣ即ち、アニンイル
）、０−エトキシベンゾイル、ｍ−エトキシベンゾイル
、ｐ−エトキシベンゾイル、２，４−ジェトキシベンゾ
イル、３．４−ジメチルベンゾイル、４−７’チルベン
ゾイル、３−メチル−４−メトキシベンゾイル、〇−丁
セトキシベンゾイル（スなわちアセチルサリシロイル）
およびｐ−アセタミドベンゾイルがある。別の芳香族基
にす７トイルがある。 この−膜剤に対する例外はベンゾイル基が塩基性部分、
たとえばアミン、ジメチルアミノおよびグアニジノを有
する場合である。この種の誘導体の加水分解速度は計算
値より１０倍程度までおそくなる。 この種の誘導体の例はｐ−グアニジノベンゾイルヒト及
びブタプラスミンである。 本発明に従ってヒトおよびブタプラスミンをブロックす
るのに使用できる他のアシル基のグループはアクリロイ
ルおよび置換アクリロイル、特にシンナモイルおよび１
基以上の置換基、特にｍ−およびＣまたは）ｐ−置換基
を有し、ハメットのσ値の合計が前述の制限下に−１，
０〜＋０．１５である置換シンナモイルである。 好適な置換アクリロイル基には、０１〜Ｃ６アルキルア
クリロイル、フリルアクリロイル、シンナモイル、ｃｌ
〜Ｃ６アルキルシンナモイル、特に３，３−ジメチルア
クリロイル、３−（２−７リル）アクリロイル、シンナ
モイルおよびｐ−メチルシンナモイルがある。 本発明の組成物はヒトに静脈注射によって投与するのに
適する医薬組成物を調剤する常法に従ってＨ周到される
。 静脈注射投与用の代表的な組成物は滅菌等張性水性緩衝
液中の滅菌誘導体の溶液である。必要に応じて、組成物
に誘導体を溶液にしておくための可溶化剤および注射部
位の苦痛を緩和するためのリグノカイン（Ｉｉｇｎｏｃ
ａｉｎｅ　）のような局部麻酔剤を入れることができる
。一般に酵素誘導体はたとえば乾燥粉末または水を含ま
ない原液の形にしてアンプルのような密封容器または薬
袋に入れた単位投与量の形で供給され、活性単位数で表
わされた酵素の景ならびに遊離酵素が放出される時間を
指示する。誘導体を注入によって投与しようとする場合
には、誘導体は滅菌裂薬級の「注射用水」を入れた注入
ビンとともに配給される。誘導体を注射投与しようとす
るときには、誘導体は注射用の滅菌水のアンプルととも
に配給される。注射用または注入用組成物は投与前に各
成分を混合することによって調製される。 物質の投与量は、フィブリン溶解所要量、溶解に要求さ
れる速度、血栓塞栓症の病状および凝塊の場所および大
きさによって変化する。たとえば肺動脈塞栓症または生
死に関係するような大型の上昇回陽一般動脈面栓症の患
者には急速に作用する物質の１服を投与しなければなら
ない。−男手術後の血栓形成を防止しようとする場合に
は、緩効物質の少量を必要とする。投与しようとする定
量的な投与量および投与の方式は状況に応じて処置を監
督する医師によって患者の性質を考慮に入れて必然的に
決定されたければならない。しかしながら、一般に、中
和度の大きさの血栓を治療しようとしている患者には、
体重１　ｋｇに対して１日１〜２０■の投与量が８回ま
での回数に分割して、あるいは注入によって一般に投与
される。 本発明の組成物に使用できる数種の誘導体が知られてい
る。これらの誘導体およびその製造を記載している文献
とともに次に示す。 １、ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン（Ｔ、Ｃ
ｈａｓｅ　＆　Ｅ、ＳｈａｗＪｉｏｃｈｅｍ、８　、　
Ｎ１５．２２１２〜２２２４．１９６９） ２、　　ｐ−グアニジノベンゾイルストレプト中ナーゼ
／プラスミノーゲン活性化因子複合体ＣＤ、に１Ｍｅ　
Ｃｌ１ｎｔｏｃｋ　＆　Ｐ、Ｈ，ＢｅＩＩＪｌｏｃｈｅ
ｍ。 Ｂｉｏｐｈ）’ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｒｒｒｎ、ｅ　４３　
ｍ　６９４〜７０２　ｅ　１９７２　）過去においてこ
れらの２種類の誘導体は前述の酵素の活性部位滴定中に
生成された。しかしながらこれらの誘導体の単離および
特性はまだ報告されたことはない。さらにこれらの酵素
誘導体がフィブリン溶解剤として有用なことは今までに
認められていなかった。 本発明の別の態様によれば、フィブリン溶解活性に必須
な触媒部位が、誘導体の擬似一次加水分解速度恒数がｐ
ｉ（７，４の等脹性水性媒中３７°Ｃで１０−６〜１０
−３／秒であるような速度で加水分解によって除去し得
る基によってブロックされている本願明細書で定義され
ているような生体内フィブリン溶解酵素の単離誘導体が
得られる。 本発明のさらに別の態様によれば、 （１）　　ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン（
２）　ｐ−グア二ジノベンゾイルストレブトキナーゼ／
プラスミノーゲン活性化因子複合体ｆを除き、ｐＨ７，
４の等脹性水性媒中３７℃で誘導体の擬似一次加水分解
速度恒数が１０−６〜１０−３７秒であるような速度で
加水分解によって除去できる基によってフィブリン溶解
活性に必須な触媒部位をブロックした本ム酉明細書で定
義されているような生体内フィブリン溶解酵素の誘導体
が得られる。 本発明の誘導体は２つの方法、すなわち直接または逆ブ
ロッキングによって製造することができる。 直接ブロッキング法は酵素を式 で示される試薬ｃ式中人はフィブリン溶解活性に必須で
ある触媒部位に対して選択的且つ基Ｂから触媒部位に移
動し得る基であり、Ｂは酵素と基Ａとの結合を容易にす
る脱離可能な基である）と反応させ、次に必要に応じて
生成酵素誘導体を単離することによりなる。 このように作用する試薬は既知であり、たとえばｐ−グ
アニジノ安息香酸ｐ−ニトロフェニルである。グアニジ
ノベンゾイル部分は選択的に触媒部位の隣接位置に近づ
き、その結合はｐ−ニトロフェニル脱離基によって助成
される。 逆ブロッキング法は式 で示される試薬〔式中Ｅは試薬を触媒部位に配ｆ１りさ
せる配置１％　（Ｉｏｃａｔｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　）で
あり、Ｆは配位基から触媒部位へ転移可能な法である〕
を使用し、次に必要に応じて生成誘導体を単離すること
よりなる。 ブロックしようとする酵素がプラスミンまたはストレプ
トキナーゼ／プラスミノーゲン活性化因子複合体である
ときのＴ８Ｅの例にはｐ−アミジノフェノキシおよびｐ
−アセトアミジノフェノキシまたはｍ−またはｐ−位に
正電荷部分を含有する責似の構造を有する置換フェニル
基がある。 逆ブロッキング試薬はたとえばｐｌ−フルオロ安、１１
香酸ｐ−アミジノフェニル、ｐｌ−トルイＡＬｐ−アミ
ジノフェニル　ｐｉ−アニス酸ｐ−アミジノフェニル、
安息香酸ｐ−アミジノフェニル、桂皮酸ｐ−アミジノフ
ェニル　ｐｌ−メチル桂皮ｅｐ−アミジノフェニル、３
−（２−７リル）−アクリル酸ｐ−アミジノフェニル、
２−ナフトエ酸ｐ−アミジノフェニル、３，３−ジメチ
ルアクリル酸ｐ−アミジノフェニル、４−ブチル安息香
酸ｐ−アミジノフェニル、２．４−ジメト牟シ安息香酸
ｐ−アミジノフェニル、アセチルサリチル酸ｐ−アミジ
ノフェニル、４−エトキシ安息香酸ｐ−アミジノフェニ
ル　ｐｌ−アニス酸ｐ−アセタミジノ７工二ｌ’、ｏ　
−トルイル酸ｐ−アミジノフェニル、３．４−ジメチル
安息香（＊ｐ−アミジノフェニル３−　メｆ　ｋ　−４
−メト牛シ安息香酸ｐ−アミジノフェニルおよび４−ア
セタミド安息香酸ｐ−アミジノフェニルである。 直接ブロッキング反応および逆プロッ午ング反応は、酵
素、プロラギング試薬および製品に有害でない声範囲、
たとえばｐＨ４−８、好ましくは５．０〜７．５で水性
媒中で実権される。 反応は一般に等モルの酵素およびブロッキング試薬を使
用して実権されるが、過剰のブロッキング試薬を使用す
ることもできる。また希釈溶液、すなわち酵素に対して
は１０−３モル以下およびプロラギング試薬に対しては
１０１モル以下の濃度の浴液中で反応をおこなうことが
好ましい。一般に酵素またはブロッキング試薬の濃度が
１０−７モル以下のＦＪ液では実施されたｈｏ ブロッキング反応は中温、すなわち室温または室温以下
、好ましくは１０℃以下であり、また反応媒の凍結温度
以上で実殉しなければならない。 反応を進行させる時間は使用されるブロッキング試薬、
反応を実施する温度およびブロッキング反応に選ばれる
酵素によって変化する。ある特定の状況に対する最適反
応時間は反応液の一部を色素または螢光産生基質で培養
することによる酵素活性の低下によって選ぶことができ
る。 反応が完結してから、誘導体は、透析、アフイニテイク
ロマトグラフイー（ａｆｆｉｎｉｔ）’　ｃｎｒｏｍａ
ｔ−ｏｇｒａｐｈｙ　）および限外ろ過のような標準的
な方法によって精製され、次に水性媒から凍結乾燥のよ
うな標準的方法によって回収される。また必要に応じて
、ヒトの静脈注射投与に適合させるために、たとえば滅
菌する。 弐ＥＦで示される逆ブロッキング試薬Ｃ式中Ｅはｐ−ア
ミジノフェノキシであり、Ｆはアシル基である）はｐ−
ヒドロキシベンザミジンまたはその塩を式 で示されろアシル化誘導体ｃ式中Ｆは前述の基であり、
Ｘはヒドロキシルまたはその活性化アシル化誘導体であ
る）で、場合によっては触媒の存在下にアシル化するこ
とによって製造することができる。 活性化アシル化誘導体にはたとえば塩化または臭化アシ
ルがある。これらの誘導体は標準的方法によって製造す
ることができる。 アシル化反応に好ましい触媒にはピリジンのような第三
有機塩基およびジシクロへキシルカルボジイミドのよう
なカップリング剤がある。 一般にアシル化反応は反応剤および製品に対して不活性
な極性有機溶媒中で実施される。好適な溶媒にはＮ、Ｎ
−ジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドが
ある。別法として触媒がピリジンのような液体である場
合には溶媒を使用しないで反応を実施することができる
。 一般に反応は中温すなわち７０℃以下、好ましくは４０
℃以下、最適には室温で実施される。 反応を完結するまで進行させる時間は、使用する反応剤
、溶媒および反応をおこなう温度によって変化する。反
応時間はたとえば薄ｔａクロマトグラフィーで反応を追
跡することによって決定することができる。 反応が完結したら、製品を回収し、標準的な方法によっ
てｆ＃製する。 Ｆが置換ベンゾイル基である逆プロツ牟ング試薬は新規
化合物であり、本発明の要件の一部を構成する。 次の実施例は本発明を例示する。実施例１〜１８は逆ブ
ロッキング試薬の製造を例示する。 実施例１ ｐ　−ヒ）”ロキシペンズアミジン塩Ｃｌ１ｋＡ　Ｏ，
１７２ｇを乾燥ピリジン１．９ｍｔにとかし、これにピ
リジン１、Ｏｍｚ中の塩化ベンゾイル０．１４１　ｇを
溶液を滴下した。混合物を室温で１時間かきまぜてから
、室温で４日間放置した。混合物を乾固近くまで蒸発し
、残留物を乾燥ジエチルエーテルとすりつぶし、得られ
る固体を約３Ｎの２−プロパツールとジエチルエーテル
の２　：　１　ｖ　／　ｖの混液から再結晶させ、融点
１６０°Ｃの目的化合物０．２２３９を得た。 核磁気共鳴スペクトル分析（ｎ、ｍ、ｒ、）δ（ジメチ
ルスルホキシドｄ６）、９．６５　（二重線、４Ｈ。 ＤｔＯで交換可能、アミジンのＨ）、約８．０（多Ｍ１
．３Ａ、９Ｈ，フェニルおよびアミジノフェニル）実症
例２〜１０は実施例１に記載の方法と同様にして製造さ
れた。 実施例２ トランス桂皮酸のｐ−アミジノフェニルエステル塩酸塩 融点、１９２℃ ｎ１ｍ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシドｄ・）、９．５
５Ｃ二重線、４　ＨＮ　ＤｚＯと交換可能、アミジンの
Ｈ）、７．９５　（多重線、６Ｈ，アミジノフェニルお
よびアクリロイルのＨ）、７，１０（多電線、５Ｈ，フ
ェニルのＨ）、６，９６（二を線、Ｊ−１６Ｈｚ、ｌＨ
ｑアクリロイルのＨ）。 実施例３ ｐ−アニス酸のｐ？−アミジノフェノニルエステル塩酸
塩 ２−プロパツールから再結晶させた製品の融点２２５℃
、 ｎ、ｍ、ｒ、δ〔ジメチルスルホキシドｄ６）、９．５
゜（二重線、４Ｈ）、８．０５　（四重線、Ｊ　”　６
　Ｈｚ　ｓ４Ｈ，アミジノフェニルのＨ）、７．３８（
四重線、Ｊ　＝　９Ｈｚ　１４　ＨＳｐ−アニソールの
Ｈ）、３．９０（シングレット、３Ｈ１メト−＋シのＨ
）。 実施例４ 水から再結晶させた製品の融点、１７３℃、ｎ、ｍ、ｒ
、δ

【ジメチルスルホキシドｄ１１）、９．５０（二を
線、４　ｌｌ５ＤｘＯと交換可能、アミジンのＨ）、７
．９５および７．３７　（四重線、Ｊ　＝　９　Ｈｚ　
Ｎ　４Ｈ１アミジノフエニルのＨ）、５．９６（広い幅
の二重に賽、Ｊ＝＝ＩＨｚ１１Ｈ１アクリロイルのＨ１
２，０９（シングレット、３Ｈ，メチルのＨ）、１．９
０　（シングレット、３Ｈ，メチルのＨ）。 実施例５ ４−ブチル安息香酸のｐ−アミジノフェニルエステル塩
１２塩 インプロパツールと水との容積比１：４から再結晶させ
た製品の融点、１９０℃、 ｎ、ｍ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシドｄ’）、９．５
５（広い幅の二重線、４　Ｈ１ＤｚＯと交換可能、アミ
ジンのＨ）、７．６〜８．ＩＣ重復した四重線、８１（
、アミジノフェニルおよびベンゾイルのＨ）１．３０　
（シングレット、９Ｈｓｔ−ブチルのＨ）。 実施例６ Ｈ）　、　８．ｏｌオ、Ｊ−ヒフ、５０　（ＡＡ’ＢＢ
’　ＩＩ！１ｇｔ＃Ｊ、　Ｊ　＝８Ｈｚ−１アミジノフ
ェニルのＨ）、８．０３および６．７５　（多重線、３
Ｈ，２，４−置換フェニルのＨ）３．９０　（シングレ
ット、６　Ｈ１２×メトキシのＨ）実姉例７ テル塩酸塩 イソプロパツールから再結晶させた製品の、＠点１０９
〜１１１°Ｃ１ ｎ、ｍ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシドｄ’）、９．６
２　（広い幅の二重線、４　Ｈ％　ＤｚＯと交換可能ア
ミジンのＨ）、８．１２および７，５５　（ＡＡ’ＢＢ
’四重線、Ｊ　＝　９　Ｈｚ　ｓ　４　Ｈ１アミジノフ
エニルのＨ）２．２６　（シングレット、３Ｈ１アセチ
ルのＨ）。 実施例８ メタノールから再結晶させた製品の融点、２１３〜２１
４°Ｃ１ ｎ、ｍ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシドｄ’）、９．４
８〔二重、ｌＪ　、４　Ｈ％　ＤｚＯと交換可能、アミ
ジンのインプロパツールから再結晶させた製品の融点２
１１〜２１２℃、 ｎ、ｍ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシド、ａｌｌ）、９
．６０　（広い二重線、４Ｈ，ＤｚＯと交換可能、アミ
ジン（７）Ｈ）、８．１０および７，５６　（ＡＡ”Ｂ
Ｂ’四重線、Ｊ　＝　９Ｈｚｑ　４　Ｈ％アミジノフェ
ニルのＴＩ　）８．１３および７，１５　（ＡＡ’ＢＢ
”四重線、Ｊ　−９Ｈｚ　ｓ４　Ｈｚ　４−−Ｃト＃シ
フェニルノＨ）、４．１９　（ＶＡ重線、２　Ｈ１−０
ＣＨ２ＣＨｓ　）、９．３８　（Ｅ重線、−０ＣＨ２Ｃ
Ｈｓ　）。 実姉例９ ｏ−トルイル酸のｐ−アミジノフェニルエステル塩酸塩 インプロパツールとジエチルエーテルとの混液から２回
再結晶させた製品の融点、１５７〜９℃、ｎ１ｍ、ｒ、
δ（ジメチルスルホキシドｄ・）、（広い二重線、４Ｈ
１Ｄ！ｏと交換可能、アミジンのＨ）　、８．２０およ
び７，６２　（ＡＡ’ＢＢ’四重線、４Ｈ，アミジノフ
ェニルのＨ）、７．３〜８．２（多重ｆｍ　、４　Ｈ１
２−メチルフェニルのＨ）、２．１１　（シングレット
、３Ｈ，メチルのＨ）。 実施例１０ 塩酸塩 ｐ−ヒドロキシベンジルシアニ）’　５．０９　ｔｔｍ
水エタノール５０ｒＲ１にとかした溶液を室温で乾燥Ｈ
Ｃｌガスで４時間にわたって飽和させた。４℃で７２時
間後乾燥ジエチルエーテル２００ｒｎｔおよび軽質石油
ｉｏｏ　ａｆを加え、２時間にわたって白色結晶を沈殿
させた。固体をろ過によって単離し、直チにアンモニア
飽和エタノール３００ＩｒＬｔと室温で３時間反応させ
、反応混合物をスチームバス上で蒸発乾固し、残留物を
エタノールで再結晶させた。融点２４８℃Ｃ分解） 収量、４．３６ｇ ｎ、ｍ、ｒ、δＣジメチルスルホキンドｄ＠）、９．０
〜９．８のエンベロープ（ｓ　ＨＳＤｍＯと交換可能、
アミジンおよびヒドロキシルの）ｔ　）　、８．８５　
＋７．３ｆ７　（ＡＡ’ＢＩ３’四重線、４　ＨＮ　Ｊ
　＝　９ＩＩｚ　１フエニルのｌ（）、３．７Ｏｒシン
グレツト、２Ｈ１ベンジルのＨ）。 メチル）フェニルエステル インプロパツールとジエチルエーテルとかう再結晶させ
た製品の融点、１７４〜１７６℃、ｎ、ｍ、ｒ、δ（ジ
メチルスルホキシドｄ’）、９．４２（広い幅の二重線
、４　Ｈ、ＤｚＯと交換可能、アミジノのＨ）、８．１
５および６．２９　（ＡＡ’ＢＢ’四重Ｍ　、Ｊ　＝　
８Ｈｚ　１４　Ｈ１４−メトギシフェニルのＨ）、７．
６９および７，１３　（ＡＡ’　ＢＢ’四重線、Ｊ＝８
Ｈｚｓ４Ｈ１アミジノフェニルのＨ）、３．９０　（シ
ングレット、３Ｈ１メトキシの）Ｌ）。 実施例１１ ｐ−トルイル酸のｐ＋−アミジノフェニルエステル塩酸
塩 ｐ−ヒドロ中ジベンズアミジン塩酸塩１．７２　Ｆおよ
びｐ−）ルイル酸１，３６　ｇを乾燥ピリジン５．０ｒ
ｎｔとジメチルスルホキシド１０．０　ｌｆｆ１ｔとの
混合物にノ・と力↓、溶液をＮ、Ｎ−ジシクロへキシル
カルボジイミド２．１９とともに室温で７２時間かきま
ぜた。反応混合物をろ週し、ろ液に乾燥ジエチルエーテ
ル２００ｍ１を加えて沈殿させ、生成する油状物を沈澱
後に結晶させ、等容積の２−プロノ（ノールと１．４−
ジオキサンとから再結晶させて、融点１６４℃の製品を
得た。 ｎ、ｍ、ｒ、δＣジメチルスルホギシドｄ６）、９．６
Ｃ広い幅の二重線、ＤｚＯと交擬可能、４Ｉ（、アミジ
ンのＨ）、８．１５　（四重線、Ｊ＝約４Ｅ（ｚ　Ｎア
ミジノフェニルのＨ）、７．６Ｃ１四ｆｆｌ線、Ｊ＝約
９Ｈｚｓ４ＨｓベンゾイルのＨ）、２．４４　（シング
レット、３Ｈ，メチルのＨ）。 実施例１２〜１８の化合物は実施例１１に記載の方法に
よって製造された。 実施例１２ エーテルで沈降させた油状液を５％ｗ／ｖの過塩素ｅｌ
Ｑｍから再結晶させた製品の融点、１８０℃（分解）、 ｎ１ｍ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシドｄ’）、９．３
（二重ｌｉｔ、４　Ｈ，ＤｚＯと交換可能、アミジンの
Ｈ）、８，２５　（四重線、Ｊ＝約５Ｈ２％５Ｈ−１ベ
ンゾイルの３−および５−Ｈ）、７．８〔重復四■７ｍ
　、ｓ　ＨＮアミジノ７エニルのＨおよびベンゾイルの
２−および６−Ｈ）。 実施例１３ ピリジン中でカップリング反応をおこない、ろ融点、１
５７°Ｃ ｎ、ｍ、ｒδＣジメチルスルホキシドｄ６）、９．３５
（二重線、ＤｚＯと交換可能、４Ｈ１アミジンの■（）
、７．７〔四重線、Ｊ＝約８ＨｚＮ４−アミジ／７Ｘ、
二にのＨ）、７．９ｔ二重線、Ｊ＝約３Ｈｚ　％ＩＨ，
フリルの５−Ｈ）、７．８５および７，４０　（二重線
、Ｊ　”　２０　Ｈｚ　ｓ　Ｉ　Ｈｓ　２−アクリロイ
ルのＨ）７．１０　ｒ二重線、Ｊ＝約３Ｈｚ％ＩＨ％フ
リルの３−Ｈ）、６，７０　（多重線、ＩＨ１７リルの
４−Ｈ）６．４４　（二重線、Ｊ　＝　１５　Ｈｚ　１
１　Ｈｓアクリロイルの３−Ｈ）。 実施例１４ ｐ−メチル−トランス桂皮酸のｐ−アミジノ７エ３−（
２−７リル）アクリル酸エステルとして単離 融点、１５５℃、 ｎ、ｍ、ｒ、δＣジメチルスルホキシドｄ６）、９．１
５　（二重線、Ｄ、０と交換可能、４Ｈ，アミジンのＨ
）、７．２〜８．２　（多重線、６Ｈ％アミジノフェニ
ルおよびフェニルのＨ）、６，８２ｒ二重線、Ｊ　＝１
６　Ｈｚ　％ＩＴ（、アクリロイルの２−Ｈ）、６．４
４（二重線Ｊ　＝１６Ｈｚ　、　Ｉ　Ｈ１アクリロイル
のＨ）、２．４２（二重線、Ｊ＝２Ｈｚｓ３Ｈｓメチル
のＨ）。 実施例１５ 酸塩 インプロパツールから再結晶させた製品の融点１４９℃
、 ｎ０ｍ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシドａｄ）、９．５
０（広い幅のシングレット、４　Ｈ１ＤｓＯと交換可能
、アミジンのＨ）、７．５０および７，９５　（不規則
な多重線、５Ｈ１アミジノフエノールのＨおよび２−Ｈ
）、７．０〜７．５Ｃ多重線、３Ｈ％ベンゾイルの３−
Ｈ，４−Ｈおよび５−Ｈ）、３．８６（シングレット、
３Ｈ１メトキシのＨ）。 実（壱例］６ イソプロパツールおよび食塩水から再結晶させた製品の
融点、１０７℃、 ｎ、ｍ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシドｄ’）、９．５
６（広い幅のシングレット、４　Ｈ５ＩｈＯと交換可能
、アミジンのＨ）　、７．５０〜７，９５　　（不規則
な三重線、７Ｈ１アミジノフエニルおよびベンゾイルの
Ｈ）　、２，３０　（シングレット、６Ｈ１メチルのＴ
Ｉ　）。 実（１例１フ イソプロパツールと２　Ｎ　ＨＣｆｆｌの容積比１０：
１の混液から再結晶させた製品の融点、２１０℃、ｎ　
６　ｍ＊　ｒ　ａδＣジメチルスルホキシドｄ’）、９
．５４（二重線、４　Ｈ％　ＤｚＯと交換可能、アミジ
ンのＨ）、８．０７　（不規則な二重線、４Ｈ，２−Ｈ
＋ベンゾイルの６−Ｈ１アミジノフェニルの２Ｈおよび
６−Ｈ）、７．６０　（二重線、Ｊ　＝９Ｈｚ　ｓアミ
ジノフェニルの３−　Ｈおよび６−Ｈ）、７．２２（二
重線、Ｊ＝９Ｈｚ、ＩＨ、ベンゾイルの５−Ｈ）、３，
９２　（シングレット、３Ｈ％メトキシのＨ）、２．２
６　（シングレット、３Ｈ，メトキシのＨ）。 実施例１８ イソプロパツールと水との容積比１：２から再結晶させ
た製品の融点、２５７℃、 Ｈ，ｒｎ、ｒ、δ（ジメチルスルホキシドｄ’）、１０
，６２Ｃシングレツト、ＩＨ１Ｄ２０と交換可能、アミ
ジンのＨ）、７，９０　（ＡＡ’ＢＢ’四重線、４Ｈ）
、７．５０〜７．９ＣＭ復ＡＡ’Ｂ　Ｂ’四重線、４Ｅ
（、ベンゾイルおよびアミジノフェニルＨ）、２．０９
（シングレット、３Ｈ１アセチルのＨ）。 実施例１９ ４．２Ｍ中のヒトプラスミン０．１５マイクロモルを、
ジメチルスルホキシド中の、前記実施例３の如くに製造
したｐ′−アニス酸ｐ−アミジノフェニルの０．１Ｍ溶
ｉ５０μｌと冗℃で処理した。７．５分後にさらにアシ
ル化剤刃μｌを追加し、生成物を前述のグリセロール／
食塩水混合液に対して２時間透析してから、湿潤重電２
３ｇのＬ　−ＩＪシン−セファローズ４　Ｂ　（Ｌ−Ｌ
ｙｓｉｎｅ　−５ｅｌ）ｈａｒｏｓｅ４　Ｂ　（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉ　−ｃａｌｓ　Ｈ
）およびｐＨ７，０の０．１　Ｍ　）リエタノールアミ
ン塩酸塩緩衝液２０ｍ１の混合物に加え、４℃で１０分
間培養した。次にろ過しゲルを前記の緩衝液１００　Ｉ
Ｌｌで洗った。次にゲルを前記の緩衝液中の慮−アミノ
カプロイン酸の０．２Ｍ溶液と混合し、４℃で１０分間
培養した。ろ過し、−一アミノカプロイン酸溶液５５ｒ
ｎｔで洗ってから、ろ液を４℃の…７．０の５０　ｍ　
Ｍ　ＩＩＩ　Ｒ酸アンモニウム５ノに対して２時間ずつ
２回透析した。最後に残った液をデ牟ストランＴ　７０
　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）と混合して凍結乾燥し、１
．９８ｇの白色固体を得た。この不活性化物質は脱アシ
ル化に指定された条件で、約２時間で定量的に再活性化
されて遊離プラスミンとなった。 実施例１．２および４〜１８のアシル化剤は実施例１９
の方法によってヒトプラスミンと反応して、それぞれ相
当するブロッキング基でブロックされたプラスミンを得
た。実を１例１０のアシル化剤を使用する場合反応を確
実に完結させるために、アシル化剤を高濃度で使用する
か、あるいは反応を長時間進行させることが好ましい。 これらのアシル化化合物の脱アシル化速度を第】１表に
示す。 実施例Ｉ ２０　％　ｖ　／　ｖグリセロール１．０ｄ中のヒトプ
ラスミン８，４５　ＸＩＯ’　　モルをジメチルスルホ
キシド中Ｉ）　０．Ｉ　Ｍ　ｐ’−グアニジノ安息香酸
ｐ−二トロフェニルの１０μｌで２回ｏ℃で１Ｑ分間ず
つ処理し、溶液のｐＨを希塩酸で６．０に調節し、ｐＨ
７，ｏの１０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液の２１に
対して２時間透析し、Ｌ−１シン塩酸塩１００７Ｑを加
えて混合物を凍結乾燥した。加水分解すると活性プラス
ミンになる淡黄色の固体９３．５■を単離した。 実施例２１ 造 １０％マ／Ｖグリセロールおよび０，９　％　ｗ／ｖ食
塩食塩水溶液２中 ロモルを、０，９　％　ｗ／ｖ食塩水１縦中に懸濁され
タトランス桂皮酸ｐーアミジノフェニル３．０２〜と４
℃で加分間かきまぜることによって処理し、混合物を次
に一２０’Ｃで凍結し、９℃で１晩貯蔵した。融解して
から混合物を前記のグリセロール／食塩水２１に対し、
４℃で２時間透析し、製品を使用するまで０℃で貯蔵し
た。この誘導体は原酵素の活性の０．５％以下の活性を
もち、脱アシル化条件で２時間で再賦活することができ
た。 実施例２２ ０、９％Ｗ／Ｖ食塩水溶ａ　１０，５　ｍ中のストレプ
トキナーゼ５Ｘ１０４単位（スエーデン、ストックホル
ムのＡ．Ｂ，Ｋａｌｉ　）をヒト溶解プラスミノーゲン
０，０２５　ｔｎｔ　（　４，９　Ｘ　１０→モル）と
混合し、混合物を２５℃で４０分間培養してから、ｐＨ
７．４の０．１Ｍのトリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン塩酸塩、０．９％ｗ／ｖの食塩および２０　％　ｖ　
／　ｖのグリセロールを含む液２．０ｍｌで希釈した。 この溶液を、原料溶液としてジメチルスルホキシド中０
、１Ｍとして調製したｐ＋−アニス酸ｐ−アミドフェニ
ルが最終的に０．１ｍＭになるように２５°Ｃで５分間
ずつ３回処理し、アシル化した酵素をＬ−１シンセフア
ローズ４Ｂの３３％湿ｆｌ！ｆ／容積の沈＃液と０℃で
１Ｑ分間処理した．Ｗ＆濁液を吸引ろ過し、前述のトリ
スヒドロキシメチルアミノエタン塩酸塩／グリセロール
／食塩水緩衝液１００ｍ１で４℃で洗った。ゲルを、さ
らに０，１Ｍのアミ７カブロイン酸を含有する前述のト
リスヒドロキシメチルアミノエタン塩酸塩／グリセロー
ル／食塩水緩衝液５反に再懸濁し、０℃に保ち、１０分
後にゲルの懸濁液を１０００　、９で２分間遠心分離す
ることによって清澄させ、上澄液４　ｒｎｌを前述のト
リスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩／グリセロー
ル／食塩水緩衝液２１に対して透析した。生成したアシ
ル化活性化因子複合体の溶液は擬似一次反応速度恒数２
．７×１０−４　７秒で３７”Ｃで遊離酵素に再生する
ことができた。 実施例ｎ 造 この溶液は３−メチルｐ−アニス酸ｐ−アミジノフェニ
ルエステルの最終濃度が０．２ｍＭとなるように２回に
わたって２５℃で１５分間ずつで、続いて０℃で１時間
アシル化をおこなったこと以外は実施例四の記載の方法
と同様に製造された。擬似一次脱アシル化反応速度恒数
はＩ　ＸＩＯ″′４／秒であった。 実施例２４ 溶解ヒトプラスミノーゲン２１６　ｍｇ（　２．５６マ
イクロモル）をｐＨ７．４のＵ．Ｉ　Ｍのトリスヒドロ
キシメチルアミノメタン塩酸塩、０．９％Ｗ／　Ｖ食塩
および２０％マ／Ｖグリセロール中に６．８１Ｒ９／ｌ
の濃度になるように溶解した溶液をストレプトキナーゼ
（スエーデン、Ａ．Ｂ；Ｋａｌｉ製）１，２Ｘ１０４単
位（約２，６７　Ｘ　１０−　　モル）と処理し、混合
物を５℃で１時間培養し、グリセロールを３３　％　ｖ
　／　ｖとした。この溶液９．０　ｍをｐ−アニス酸ｐ
−アミドフェニルと５℃で２回にわけて、最終濃度が０
．１ｍＭになるようにアシル化し、次に前述の緩衝液２
１に対して１時間透析した。生成溶液はもとのプラスミ
ン活性の１チ以下の活性を示し、ウサギによる試験系に
使用するのに適した。形をしていた。 実施例が （ａ）　　ヒトプラスミン 濃度２．６７　Ｘ　１０−’　Ｍのヒトプラスミンの溶
液０．２ｒｒＬｔ　（５，３４Ｘ　１０’モル）をトリ
チウム化したｐ−アニス酸ｐ−アミジノフェニルの２０
　ｍ　Ｍの溶液（比放射能２２．８　ｍＣ１／ミリモル
）と５℃で７．５分間ずつ２回にわけて反応させた。ア
セトン中の１０　％　ｗ／　ｖ　）リクロロ酢酸１．ｆ
３ｍｔを加えてから、タンパク質を沈澱させ、１５０（
ｌの加速度で３分間遠心分９１ｆｕすることによって単
離した。タンパク質のペレットをトリクロロ酢酸のアセ
トン溶液２ｍｌで２回にわけて洗い、２Ｎの水酸化ナト
リウム溶Ｍ２１ｍにとかした。この溶液の液体シンチレ
ーションカウンターによる計数はタンパク質に結合する
平均０．１３０μＣ１を示し、この値はアニス酸の５，
７３　Ｘ　ＩＱ−９モルに相当していた。 伽）　ブタプラスミン ブタの血のプラスミンの５，２９　Ｘ　１０−５Ｍの溶
液１０．５４　Ｘ　１０−”モルを使用した同様の実験
はアニス酸に対して９．５８　Ｘ　１０＝モルの平均放
射化学分析値を与えた。 実施例２６ ０．９％Ｗ／Ｖの食塩水０．９−中のストレプ）＝？ナ
ーゼ９　Ｘ　１０−’単位を溶解ヒトプラスミノーゲン
１４．９　Ｘ　１０””モ＃　（０，０７５ｒｒｔｔ　
）と混合し、混合物を５℃で加分間培養してからｐＨ７
，４００，Ｉ　Ｍ　トリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン塩酸塩緩衝液で希釈した。この溶液を３回にわけて、
ジメチルスルホギシド中の１０　ｍ　Ｍの原溶液として
調製したｐ−アニスｆｉＰ−アミジノフェニルとゐ℃で
５分ずつ処理し、最終濃度を０．１ｍＭとした。アシル
化酵素をＬ−リシンセファローズ４Ｂの湿潤重量で３３
％Ｗ／マの懸濁液と０℃で１０分間混合し、懸濁液を吸
引ろ過し、４℃で前述のトリスヒドロキシメチルアミノ
メタンｔＪ［［ｌ清液２００ｍ１で洗い、ゲルを０．１
Ｍのアミノカプロイン酸を含むｐＨ７，４の前述の５０
　ｍ　Ｍのトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩
緩衝液５、ＯＭに再懸濁し、次にろ過し、同じ緩衝液５
ｍｔで３回洗浄した。ろ液および洗浄液を合せ、ｐＨ７
，４の５．ＯｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタ
ン塩酸塩緩衝液中の５％Ｗ／Ｖマニトール２１に対して
４℃で２時間透析してから凍結乾燥して白色粉末０，５
６０１！を得た。この物質は原料酵素活性の５％以下の
活性をもち、水性媒中３７℃で再生することができた。 加水分解データ 実施例１〜１８に記載のアシル化剤から製造された酵素
誘導体に対する擬似一次加水分解速度恒数Ｋを実施例ｎ
に記載した方法で決定した。その結果を第１表に示す。 第１表 １）Ｈ７，４，３７℃における活性部位のセリンｆＲ換
プラスミンの脱アシル化速度恒数 他　ｆ　名

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）フィブリン溶解活性に必須な触媒部位が、ｐＨ７
   ．４の等脹性水性媒中３７℃での擬似一次加水分解速度
   恒数が１０＾−＾６〜１０＾−＾３／秒であるような速
   度で加水分解によつて除去できる基によつてブロックさ
   れている生体内フィブリン溶解酵素の単離誘導体ただし
   、ストレプトキナーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因
   子は除く。
2. （２）フィブリン溶解活性に必須な触媒部位が、ｐＨ７
   ．４の等脹性水性媒中３７℃での擬似一次加水分解速度
   恒数が１０＾−＾６〜１０＾−＾３／秒であるような速
   度で加水分解によつて除去できる基によつてブロックさ
   れている生体内フィブリン溶解酵素誘導体、ただし１）
   ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン、２）ｐ−グ
   アニジノベンゾイルストレプトキナゼ／プラスミノーゲ
   ン活性化因子複合体、および３）ストレプトキナーゼ／
   ヒトプラスミノーゲン活性化因子は除く。
3. （３）酵素がヒトプラスミンである特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の誘導体。
4. （４）加水分解によつて除去可能な基がアシル基である
   特許請求の範囲第１項ないし第３項のうちのいずれか一
   つの項記載の誘導体。
5. （５）アシル基がベンゾイル、置換ベンゾイル、アクリ
   ロイルまたは置換アクリロイルである特許請求の範囲第
   ４項記載の誘導体。
6. （６）アシル基がベンゾイル基、または１基以上のｍ−
   および／又はｐ−置換基を有し、ハメツトのσ＿ｍまた
   はσ＿ｐ値の合計が＋０．１〜−１．１である置換ベン
   ゾイル基である特許請求の範囲第５項記載の誘導体。
7. （７）アシル基がベンゾイル基、またはハロゲン、Ｃ＿
   １〜Ｃ＿６アルキル、Ｃ＿１〜Ｃ＿６アルコキシ、Ｃ＿
   １〜Ｃ＿６アルカノイルオキシ、Ｃ＿１〜Ｃ＿６アルカ
   ノイルアミノまたはｐ−グアニジノ基で置換されたベン
   ゾイル基である特許請求の範囲第６項記載の誘導体。
8. （８）アシル基がアクリロイル基またはＣ＿１〜Ｃ＿６
   アルキル、フリル、フェニルまたはＣ＿１〜Ｃ＿０アル
   キルフェニルで置換されたアクリロイル基である特許請
   求の範囲第５項記載の誘導体。
9. （９）ｐ−アニソイルヒトプラスミンである特許請求の
   範囲第１項または第２項記載の誘導体。
10. （１０）生体内フィブリン溶解酵素を式 ＡＢ で示されるブロック剤（式中Ａはフィブリン溶解、活性
    に必須な触媒部位に対して選択性を有し且つ基Ｂから触
    媒部位へ転移できる基であり、そしてＢは基Ａが酵素に
    結合することを容易にする基である）と反応させること
    よりなる、フィブリン溶解活性に必須な触媒部位が、ｐ
    Ｈ７．４の等脹性水性媒中３７℃で擬似一次加水分解速
    度恒数が１０＾−＾６〜１０＾−＾３／秒であるような
    速度で加水分解によつて除去できる基によつてブロック
    されている生体内フィブリン溶解酵素を製造する方法、
    ただし １）ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン、２）ｐ
    −グアニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／プラスミ
    ノーゲン活性化因子複合体、および３）ストレプトキナ
    ーゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子は除く。
11. （１１）ブロック剤ＡＢがｐ−ニトロフェニルｐ−グア
    ニジノベンゾエートである特許請求の範囲第１０項記載
    の方法。
12. （１２）生体内フィブリン溶解酵素を式 ＥＦ で示される化合物〔式中Ｅは触媒部位に対して選択性で
    ある配置基であり、Ｆは配置基から活性部位へ転移動可
    能な基である〕と反応させることよりなる、フィブリン
    溶解活性に必須な触媒部位がｐＨ７．４の等脹性水性媒
    中３７℃での擬似一次加水分解速度恒数が１０＾−＾６
    〜１０＾−＾３／秒であるような速度で加水分解によつ
    て除去できる基によつてブロックされている生体内フィ
    ブリン溶解酵素を製造する方法、ただし １）ｐ−グアニジノベンゾイルヒトプラスミン、２）ｐ
    −グアニジノベンゾイルストレプトキナーゼ／プラスミ
    ノーゲン活性化複合体、および３）ストレプトキナーゼ
    ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子は除く。
13. （１３）Ｆがベンゾイルまたは置換ベンゾイル基である
    特許請求の範囲第１２項記載の方法。
14. （１４）Ｅがｐ−アミジノフェニルまたはｐ−アセトア
    ミジノフェニルである特許請求の範囲第１２項記載の方
    法。。
15. （１５）フィブリン溶解活性に必須な触媒部位が、ｐＨ
    ７．４の等脹性水性媒中３７℃での擬似一次加水分解速
    度恒数が１０＾−＾６〜１０＾−＾３／秒の速度で加水
    分解によつて除去できる基によつてブロックされている
    生体内フィブリン溶解酵素および調薬に供し得るキャリ
    ヤーよりなる医薬組成物。
16. （１６）酵素がヒトプラスミンである特許請求の範囲第
    １５項記載の組成物。
17. （１７）酵素がストレプトキナーゼ／ヒトプラスミノー
    ゲン活性化因子複合体である特許請求の範囲第１５項記
    載の組成物。
18. （１８）酵素がヒトプラスミンおよびストレプトキナー
    ゼ／ヒトプラスミノーゲン活性化因子複合体である特許
    請求の範囲第１５項記載の組成物。
19. （１９）加水分解によつて除去できる基がアシル基であ
    る特許請求の範囲第１５項ないし第１８項のうちのいず
    れか一つの項記載の組成物。
20. （２０）アシル基がベンゾイル、置換ベンゾイル、アク
    リロイルまたは置換アクリロイル基である特許請求の範
    囲第１９項記載の組成物。
21. （２１）アシル基がベンゾイル基または１基以上のｍ−
    および／またはｐ−置換基を有し、ハメツトのσ＿ｍ値
    およびσ＿ｐ値の合計が＋０．１〜−１．１である置換
    ベンゾイル基である特許請求の範囲第２０項記載組成物
    。
22. （２２）アシル基がベンゾイル基、またはハロゲン、Ｃ
    ＿１〜Ｃ＿６アルキル、Ｃ＿１〜Ｃ＿６アルコキシ、Ｃ
    ＿１〜Ｃ＿６アルカノイルオキシ、Ｃ＿１〜Ｃ＿６アル
    カノイルアミノまたはｐ−グアニジン基で置換されたベ
    ンゾイル基である特許請求の範囲第２１項記載の組成物
    。
23. （２３）アシル基がアクリロイル基またはＣ＿１〜Ｃ＿
    ６アルキル、フリル、フェニルまたはＣ＿１〜Ｃ＿６ア
    ルキルフェニルで置換されたアクリロイル基である特許
    請求の範囲第２０項記載の組成物。
24. （２４）Ｅがｐ−アミジノフェノキシまたはｐ−アセト
    アミジノフェノキシ基であり、Ｆがベンゾイル、置換ベ
    ンゾイル、アクリロイルまたは置換アクリロイル基であ
    る式ＥＦの化合物。