JPH05306113A - 人工粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】シリカと、ゼラチン、アラビアゴム及びヘキサ
メタリン酸ナトリウムからなる混合物とを混合して得ら
れる人工粒子である。さらに本粒子は着色した後、グル
タールアルデヒドで処理し、凝集免疫測定用の人工粒子
とすることができる。 【効果】この凝集免疫測定用粒子は、抗原又は抗体をタ
ンニン酸を用い結合させて凝集免疫測定試薬として用い
ることができる。この試薬を用いると、従来から知られ
ている測定試薬に比べ短時間で、良好な測定結果を得る
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、シリカ、ゼラチン、水
溶性多糖類及びメタリン酸塩を混合することにより得ら
れる粒子であって、その粒子中のゼラチン、水溶性多糖
類及びメタリン酸塩からなる混合物がシリカに対して、
０．０２ｍｇ／ｇ〜５０ｍｇ／ｇであり、且つ得られる
粒子の平均粒子径が０．５μｍ〜１０μｍである人工粒
子に関する。この粒子は、例えば抗原又は抗体を結合さ
せ、凝集免疫測定に用いることができる。

【０００２】

【従来の技術】従来より、免疫診断法の一つとして凝集
免疫測定法による診断法が知られている。その方法を実
施するには免疫活性物質例えば抗原、抗体等を結合させ
た粒子を用いて行うものである。この粒子としては、ポ
リスチレンラテックス、カオリン、炭末、動物赤血球、
細菌菌体等が知られ、用いられているのが現状である。
これら粒子は、入手が容易で大量に得ることができもの
の迅速測定にはむいていないこと、任意の一定の粒径の
ものが得にくいこと、製造ロットごとに性状が異なるこ
と、自然凝集や非特異凝集を起こしやすい等の欠点を有
しているため、改良が試みられているが、これら欠点を
克服するには至っていない。そこで、水溶性多糖類、ゼ
ラチン、メタリン酸ナトリウム及びアルデヒド架橋剤よ
りなる粒子（特公昭６３−２９２２３号、特公昭６３−
４８０２１号参照）等が見出された。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この粒
子は、大量に任意の粒径で得られること等従来の粒子の
欠点の一部を解決できるようになったものの、迅速に凝
集免疫測定を行うことには対応できないでいた。

【０００５】

【課題を解決しようとする手段】本発明者等は、新たな
人工粒子について研究の結果、シリカ、ゼラチン、水溶
性多糖類及びメタリン酸塩を混合することにより得られ
る粒子が、従来の欠点を改良し迅速な凝集免疫測定法に
対応できることを見出し、本発明を完成したものであ
る。本発明は、シリカ、ゼラチン、水溶性多糖類及びメ
タリン酸塩を混合することにより得られる人工粒子であ
る。

【０００６】本発明の粒子は、シリカに水溶性多糖類、
ゼラチン及びメタリン酸塩を混合することにより得るこ
とができる。水溶性多糖類、ゼラチン及びメタリン酸塩
からなる混合物は、シリカに対して０．０２ｍｇ／ｇ〜
５０ｍｇ／ｇであり、好ましくは１ｍｇ／ｇ〜１０ｍｇ
／ｇである。この混合物の量がシリカに対して０．０２
ｍｇ／ｇより少ない時には、凝集免疫測定に使用した場
合表面に結合できる抗原又は抗体の量が少なく、測定の
感度を充分に上げることができない点で、またシリカに
対して５０ｍｇ／ｇより多い場合には、粒子製造の際均
一な大きさの粒子を得ることができない点で好ましくな
い。

【０００７】混合され得られる粒子は、以下に記す操作
法を採用することによりその平均粒子径を０．５μｍ〜
１０μｍとすることができる。凝集免疫測定に用いる場
合には１μｍ〜５μｍが好ましい。

【０００８】本発明の人工粒子は、シリカを含んでなる
ものである。シリカは、水又は水と混和性の有機溶媒中
アルカリ条件下でアルキルシリケートを加水分解をする
ことにより単分散のシリカ粒子として製造することがで
きる（日本化学会編、実験化学講座１８巻、３３０〜３
３１ページ参照）。アルキルシリケートとしては、市販
されているメチルシリケート、エチルシリケート（オル
トケイ酸エチル）等を用いることができる。製造される
シリカの大きさは、製造する際に添加するアルカリの量
により調整することができる。

【０００９】また、本発明の粒子の製造に用いられる混
合物は、水溶性多糖類、ゼラチン及び、メタリン酸塩で
ある。水溶性多糖類としては、例えばアラビアゴム、カ
ルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、寒
天、カラゲーナン等を挙げることができるが、分散性よ
く安定な粒子を得ることができる点でアラビアゴムの使
用が好ましい。

【００１０】ゼラチンは、通常市販のゼラチンを用いる
ことができるが、得られる粒子表面の電荷をコントロー
ルし均一な粒子とするために、等電点が８〜９である酸
処理ゼラチンの使用が好ましい。またメタリン酸塩とし
ては、例えば三メタリン酸ナトリウム、四メタリン酸ナ
トリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウム、三メタリン酸
カリウム、四メタリン酸カリウム、ヘキサメタリン酸カ
リウム等を挙げることができるが、中でもヘキサメタリ
ン酸ナトリウムを使用することが好ましい。

【００１１】人工粒子を製造する際、シリカに加えられ
る混合物は、親水性有機溶媒中で調整することができ
る。その際の各成分及び該溶媒の割合は、全体の溶液中
において水溶性多糖類０．０５％〜２．０％好ましくは
０．１％〜１．０％、ゼラチン０．０５％〜２．０％好
ましくは０．１％〜１．０％、親水性有機溶媒４％〜２
５％、メタリン酸塩は、ゼラチン乾燥重量の０．５％〜
２０％（有機溶媒のみは容量％、他は重量％）で用いる
ことができ、必要に応じこの範囲で変えることができ
る。親水性有機溶媒としては、例えばメチルアルコー
ル、エチルアルコール、プロピルアルコール等のアルコ
ール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類を
挙げることができるが、これらアルコール類の中でもメ
チルアルコール、エチルアルコールの使用が好ましい。

【００１２】人工粒子の製造には、親水性有機溶媒水溶
液に攪拌しながらゼラチン水溶液と水溶性多糖類水溶液
とを混合し、さらにメタリン酸塩水溶液を加え酸により
ｐＨ５．５〜８．０好ましくはｐＨ６．０〜７．０に調
整し混合物溶液とする。さらにこの混合物溶液にシリカ
を含む溶液を加え攪拌した後、更に酸によりｐＨ４．０
〜６．５好ましくはｐＨ４．５〜５．５に調整し、冷却
することにより粒子を得ることができる。混合物溶液の
製造の際に用いられる各水溶液は、２８〜６０℃好まし
くは３８〜４０℃に加温して用いることができる。また
ゼラチン水溶液は、アルカリ水溶液でｐＨ９付近に調整
して得られる均一溶液とし、水溶性多糖類水溶液は、水
に溶解したのち不純物があるときには除いておくことが
好ましい。製造にあたってｐＨの調整に用いられる酸は
有機酸、中でも酢酸を粒子の大きさを細かく調整するこ
とができる点で好適に用いることができる。

【００１３】本発明のシリカ、水溶性多糖類、ゼラチン
及び、メタリン酸塩とからなる人工粒子を凝集免疫測定
用試薬として用いる場合には、さらに着色し、アルデヒ
ド化合物を作用させることもできる。得られた人工粒子
は、動物赤血球を担体とした場合と同様な方法（ボイデ
ン法；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，９３，１０７〜１２０
（１９５０）等）に従い免疫活性物質、例えば抗原又は
抗体を結合させた後、凝集免疫測定用試薬とすることが
できる。

【００１４】

【実施例】以下実施例及び試験例により、本発明を更に
詳細に説明する。 （実施例１）フラスコにエタノール１４００ｍｌ、蒸留
水５２０ｍｌ、２５重量％のアンモニア水７１ｍｌ及び
２０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液６ｍｌを加え、室温
（２０〜２５℃）で５分間攪拌した後、オルトケイ酸エ
チル（和光純薬社製）５００ｍｌを３７５ｍｌ／時間の
速度で滴々添加し、シリカ粒子（平均粒子径３．０４μ
ｍ）を作った。得られたシリカ粒子をエタノールで遠心
分離による洗浄を繰り返すことにより精製されたシリカ
粒子を得た。シリカ粒子の粒子径は、表１に示すように
水酸化ナトリウム水溶液濃度により調整することができ
る。

【００１５】 表１ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− シリカ粒子 水酸化ナトリウム濃度（ｍＭ） シリカ粒子径（μｍ） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− シリカ粒子Ａ １０ １．６４ シリカ粒子Ｂ １５ ２．６４ シリカ粒子Ｃ ２０ ３．０４ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００１６】（実施例２）等電点が９であるゼラチン５
ｇを４０℃の温水に１００ｍｌになるように溶解した。
アラビアゴム５ｇを水に溶解して１００ｍｌとし、不純
物を濾別した後、４０℃に加温した。このようにして得
られたゼラチン水溶液４０ｍｌとアラビアゴム水溶液４
０ｍｌを混合し、この混合液を予め４０℃に加温した４
４容量％のエタノール水溶液５０４ｍｌに注ぎ入れ、よ
く攪拌した。これに１０％のヘキサメタリン酸ナトリウ
ム（和光純薬社製）水溶液２０ｍｌ、１０重量％アルキ
ルスルホマレイン酸（商品名デモールＥＰ、花王石鹸社
製、登録商標）水溶液２０ｍｌ、０．５％重量％の染料
であるニューフクシン（東京化成社製）水溶液４０ｍｌ
を加えた後、１０容量％酢酸水溶液を滴下してｐＨ６．
０とした。次いで２５容量％の実施例１で得られたシリ
カ粒子（シリカ粒子Ａ、Ｂ又はＣ）水溶液４００ｍｌを
加え、良く攪拌した後に１０容量％酢酸水溶液を滴下し
てｐＨを４．９に調整し、着色したシリカ、ゼラチン、
アラビアゴム及びヘキサメタリン酸ナトリウムを含む粒
子を得た。

【００１７】このｐＨ調整によって得られた粒子分散液
を氷冷して５℃にしてから、２５容量％のグルタルアル
デヒド水溶液８ｍｌを加え、よく攪拌後この温度で二夜
静置し、粒子を不溶化した。それからこの粒子分散液を
２０００ｒｐｍで５分間遠心分離して粒子をペレットと
して回収した。この粒子を０．０１％デモールＥＰ溶液
に懸濁して遠心分離する洗浄操作を３回繰り返してか
ら、４容量％のホルマリン水溶液に分散し、５℃で１週
間放置することにより着色した人工粒子Ａ、Ｂ又はＣを
得た。

【００１８】（実施例３）等電点が９であるゼラチン５
ｇを４０℃の温水に１００ｍｌになるように溶解した。
アラビアゴム５ｇを１００ｍｌになるように水に溶解
し、不純物を濾別した後、４０℃に加温した。このよう
にして得られたゼラチン水溶液０．５ｍｌとアラビアゴ
ム水溶液０．５ｍｌを混合し、この混合液を予め４０℃
に加温した４１容量％のエタノール溶液２７２ｍｌに注
ぎ入れ、よく攪拌した。これに１０％のヘキサメタリン
酸ナトリウム水溶液２．０ｍｌ、１０重量％のデモール
ＥＰ水溶液２０ｍｌ、１０容量％酢酸水溶液を滴下して
ｐＨ６．０とした。次いで２５容量％の実施例２で得ら
れた人工粒子（粒子Ａ、Ｂ及びＣ）水溶液２００ｍｌを
加え、良く攪拌した後に１０容量％酢酸水溶液を滴下し
てｐＨを４．９に調整した。得られた粒子分散液を氷冷
して５℃にしてから、２５容量％のグルタルアルデヒド
水溶液２．０ｍｌを加え、よく攪拌後この温度で二夜静
置し、粒子を不溶化した。更に実施例２と同じ操作によ
り粒子を回収した。得られた人工粒子Ａ，Ｂ又はＣの粒
子径を表２に示す。平均粒子径は、コールターカウンタ
ーＴＡII（日科機社製）により測定し求めることができ
る。比較としてヒツジ赤血球及びゼラチン粒子の測定結
果を示す。

【００１９】

【００２０】各ゼラチン濃度による、ゼラチン、アラビ
アゴム、ヘキサメタリン酸ナトリウムからなる混合物と
シリカ粒子とからなる人工粒子の混合割合及び凝集免疫
測定用粒子の性状の一つである自然凝集の有無について
の検討を行った。そのシリカ粒子に対する混合物との混
合割合及び自然凝集の検討結果を表３に示す。混合物の
量は、反応容器中に加えた混合物の量から、シリカを加
え反応したのち溶液中から減少した混合物の量から求め
ることができる。

【００２１】 表３ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ゼラチン濃度 シリカ粒子に対する混合物 人工粒子の （％） の割合 （ｍｇ／ｇ） 自然凝集 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ０．８０ ２０．６ 有 ０．４０ ９．０ 有 ０．２０ ４．０ 無 ０．１０ １．３ 無 ０．０５ ０．１ 無 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−

【００２２】（試験例）リウマチ因子の測定試験 実施例３で得られた人工粒子Ａ、Ｂ又はＣを濃度が５％
になるようにｐＨ７．２のリン酸塩緩衝生理食塩水（以
下ＰＢＳという）に分散し、その２０ｍｌを５ｐｐｍの
タンニン酸を含むＰＢＳ（ｐＨ７．２）２０ｍｌと混合
した。この混合液を３７℃で１０分間加温後、遠心分離
して生理食塩水で充分洗浄してから５％になるようにＰ
ＢＳ（ｐＨ６．４）に分散し、全量を２０ｍｌとした。
一方ｐＨ６．４のＰＢＳ中に浮遊させた熱変性ウサギポ
リマーＩｇＧ分画を感作液とした。

【００２３】タンニン酸処理粒子分散液２０ｍｌと感作
液２０ｍｌとを混合して３７℃で６０分間加温した。こ
のようにして得られた感作人工粒子をｐＨ６．４のＰＢ
Ｓで充分洗浄し、粒子濃度が５％になるように１９ｍｌ
の分散用メディウムに分散して凍結乾燥した。この凍結
乾燥品に蒸留水を加え凍結乾燥前と同容量になるよう復
元し、各血清についてマイクロタイター法による受身凝
集反応で測定した。実施例３で得られた感作人工粒子
Ａ、Ｂ又はＣから製造した抗原結合人工粒子を用いて測
定を行い、測定結果を得るために必要な時間（判定時
間）を表４に示す。比較のため感作ゼラチン粒子（製品
名：セロディア（登録商標）ＲＡ；富士レビオ社製）、
ヒツジ赤血球に熱変性ウサギポリマーＩｇＧ分画をタン
ニン酸を用いた常法により結合させて製造した感作ヒツ
ジ赤血球による判定時間を表４に示す。

【００２４】

【００２５】また、陽性血清及び陰性血清について各粒
子を用いマイクロタイター法による受身凝集反応で力価
の測定をした。その結果を表５に示す。 表５ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 血清 血清希釈倍率（×４０） サンプル 粒子 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− １ ２ ４ ８ １６ ３２ ６４ １２８ ２５６ −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 陽性 人工粒子Ｃ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − 陽性 ゼラチン粒子 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − 陽性 ヒツジ赤血球 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ − −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− 陰性 人工粒子Ｃ − − − − − − − − − 陰性 ゼラチン粒子 − − − − − − − − − 陰性 ヒツジ赤血球 − − − − − − − − − −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＋：陽性判定 −：陰性判定

【００２６】

【発明の効果】本発明は、シリカ、ゼラチン、水溶性多
糖類及びメタリン酸塩とを混合することにより得られる
新たな人工粒子である。例えば、この粒子に抗原又は抗
体を結合させて凝集免疫測定用試薬として用いると１５
分で結果を得ることができ、迅速な測定が可能である。
さらに非特異凝集を起こすことなく正確な測定をするこ
とができる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】シリカ、ゼラチン、水溶性多糖類及びメタ
   リン酸塩を混合することにより得られる粒子であって、
   その粒子中のゼラチン、水溶性多糖類及びメタリン酸塩
   からなる混合物がシリカに対して、０．０２ｍｇ／ｇ〜
   ５０ｍｇ／ｇであり、且つ得られる粒子の平均粒子径が
   ０．５μｍ〜１０μｍであることを特徴とする人工粒
   子。
2. 【請求項２】水溶性多糖類が、アラビアゴムである請求
   項１記載の人工粒子。