JPH0532039B2 - - Google Patents
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- JPH0532039B2 JPH0532039B2 JP4527984A JP4527984A JPH0532039B2 JP H0532039 B2 JPH0532039 B2 JP H0532039B2 JP 4527984 A JP4527984 A JP 4527984A JP 4527984 A JP4527984 A JP 4527984A JP H0532039 B2 JPH0532039 B2 JP H0532039B2
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、酵素法による試料中の総ポリアミン
量の迅速、簡便かつ精度のよい測定法に関するも
のである。 ポリアミンは、生物界に広く分布する非蛋白性
低分子量の脂肪族塩基性化合物で、細胞の分裂、
増殖及びその生化学的背景をなす核酸の代謝に重
要な役割を果たしている物質として知られてい
る。 哺乳動物の生体中では、スペルミン、スペルミ
ジン、プトレツシン、カダベリンが主として存在
しており、これらをまとめ総ポリアミンと称して
いる。 近年、癌患者の尿中、血中、リンパ液中などの
いわゆる体液中の総ポリアミン量が正常人に比し
て著しく増加することならびに治療によつて総ポ
リアミン量が減少することが報告されている。 従つて、臨床検査において癌の診断、癌の治療
効果の判定及び予後の診断等において総ポリアミ
ン量の測定が有効な手段となりつつある。 従来、総ポリアミン量の定量法としては、ガス
クロマトグラフイーによる方法〔クリニカル・ケ
ミストリー（Clin.Chem.）第19巻、第904〜907
頁（1973）〕、アミノ酸分析計による方法〔フエブ
ス・レターズ（FEBS Lett.）第46巻、第305〜
307頁（1974）〕、高速液体クロマトグラフイーに
よる方法〔ジヤーナル・オブ・クロマトグラフイ
ー（J.Chromatography）第145巻、第141〜146
頁（1978）〕などの化学的方法が主として用いら
れていた。しかしながらこれら化学的方法は、迅
速性に欠ける上に、処理操作が極めて煩雑で多く
の検体を処理できず、又特殊な機器、設備等を必
要とするため、一般臨床検査への応用は困難であ
つた。一方、最近酵素を用いる総ポリアミン量の
測定法も提案された（特公昭56−36918号、特開
昭59−2700号、特開昭58−141798号及び特開昭58
−146297号）。このうち特公昭56−36918号方法
は、遊離型ポリアミン含有試料に発芽大豆由来の
アミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を発色させ、比色定量する方法であり、特開
昭59−2700号方法は、遊離型及び抱合型ポリアミ
ン含有試料にあらかじめアスコルビン酸オキシダ
ーゼを作用させて反応阻害物質の影響を除去した
のち、発芽大豆由来のアミンオキシダーゼを作用
させ、生成する過酸化水素を発色させ、比色定量
する方法である。 しかしながら、これら酵素法による総ポリアミ
ン量測定法はいずれも次のような欠点を有してい
ることが判明した。 これら酵素法は、発芽大豆由来のアミンオキシ
ダーゼを用いており、この発芽大豆のアミンオキ
シダーゼはスペルミンを基質とするとき１モルの
スペルミンより２モルの過酸化水素を生成するが
他のポリアミン即ちスペルミジン、プトレツシン
及びカダベリンからは１モルの過酸化水素を生成
するので試料中の総ポリアミン量を求める場合、
酵素反応の結果生ずる過酸化水素の総量を比色定
量するのであるが、これらいずれの方法ともスペ
ルミンに関して真の値より高い値が得られること
となりその結果これらの方法は正確性に欠けるこ
ととなつてしまう。特にスペルミン含量の多い血
液を試料として臨床検査に用いる場合にはこれら
酵素法による総ポリアミン測定法は誤差が大きく
なつて使用不可能であつた。 又、発芽大豆由来のアミンオキシダーゼは植物
性の酵素であり、微生物由来の酵素に比して大量
生産出来にくく、そのため臨床検査において大量
に使用する場合、コスト的にも問題を有してい
た。一方特開昭58−141798号方法はポリアミン溶
液にミクロコツカス・フラビダスのプトレツシン
酸化酵素を用いるポリアミンの分析法であるが、
このプトレツシンオキシダーゼは主としてプトレ
ツシン、カダベリン、スペルミジンに作用する酵
素であり、総ポリアミンのうちスペルミンには作
用せず血液を試料として用いられないという欠点
があり、更に特開昭58−146297号方法はペニシリ
ウム属の産生するポリアミンオキシダーゼＭを用
いて試料中のスペルミン、スペルミジン、アセチ
ルスペルミン及びアセチルスペルミジンからなる
総ポリアミンの定量法を開示しているが、このポ
リアミンオキシダーゼＭはプトレツシン及びカダ
ベリンには作用しないこと及びスペルミンに作用
して１モルのスペルミンから２モルの過酸化水素
を生成すること等のためこの方法もやはり正確な
総ポリアミン量の測定方法とはなり得ないもので
あつた。 そこで本発明者らは、これら事情に鑑み、従来
の総ポリアミン量測定法に比較して迅速にしてよ
り正確で精度のよい酵素法による総ポリアミン量
の測定法を開発すべく鋭意検討を重ねた。その結
果、各種ポリアミンを含有する試料中のスペルミ
ンをまずポリアミンオキシダーゼによつてスペル
ミジンおよび／又はプトレツシンに変換せしめ、
かつその際生成する過酸化水素を消去した後、次
いでスペルミジン、プトレツシン、カダベリンに
作用し、かつスペルミジンからプトレツシンを生
成しないアミン酸化酵素を添加し、反応させ、そ
の際生成する過酸化水素を発色させ、比色定量す
ることによつて総ポリアミン量を求めればこの方
法においては試料中のスペルミンと等モル量の過
酸化水素が生成される結果、迅速にして正確な総
ポリアミン量の測定が可能となることを知り、本
発明を完成したものである。 本発明方法の特徴の１つは試料中の総ポリアミ
ン量を酵素を用いて測定するに当り、前処理反応
を施すことにある。 すなわち前処理反応として、あらかじめ総ポリ
アミンを含有する試料にポリアミン酸化酵素を作
用させ、試料中のスペルミンを式に従つて等モ
ルのスペルミジンおよび／又はプトレツシンに変
換してしまう。
量の迅速、簡便かつ精度のよい測定法に関するも
のである。 ポリアミンは、生物界に広く分布する非蛋白性
低分子量の脂肪族塩基性化合物で、細胞の分裂、
増殖及びその生化学的背景をなす核酸の代謝に重
要な役割を果たしている物質として知られてい
る。 哺乳動物の生体中では、スペルミン、スペルミ
ジン、プトレツシン、カダベリンが主として存在
しており、これらをまとめ総ポリアミンと称して
いる。 近年、癌患者の尿中、血中、リンパ液中などの
いわゆる体液中の総ポリアミン量が正常人に比し
て著しく増加することならびに治療によつて総ポ
リアミン量が減少することが報告されている。 従つて、臨床検査において癌の診断、癌の治療
効果の判定及び予後の診断等において総ポリアミ
ン量の測定が有効な手段となりつつある。 従来、総ポリアミン量の定量法としては、ガス
クロマトグラフイーによる方法〔クリニカル・ケ
ミストリー（Clin.Chem.）第19巻、第904〜907
頁（1973）〕、アミノ酸分析計による方法〔フエブ
ス・レターズ（FEBS Lett.）第46巻、第305〜
307頁（1974）〕、高速液体クロマトグラフイーに
よる方法〔ジヤーナル・オブ・クロマトグラフイ
ー（J.Chromatography）第145巻、第141〜146
頁（1978）〕などの化学的方法が主として用いら
れていた。しかしながらこれら化学的方法は、迅
速性に欠ける上に、処理操作が極めて煩雑で多く
の検体を処理できず、又特殊な機器、設備等を必
要とするため、一般臨床検査への応用は困難であ
つた。一方、最近酵素を用いる総ポリアミン量の
測定法も提案された（特公昭56−36918号、特開
昭59−2700号、特開昭58−141798号及び特開昭58
−146297号）。このうち特公昭56−36918号方法
は、遊離型ポリアミン含有試料に発芽大豆由来の
アミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を発色させ、比色定量する方法であり、特開
昭59−2700号方法は、遊離型及び抱合型ポリアミ
ン含有試料にあらかじめアスコルビン酸オキシダ
ーゼを作用させて反応阻害物質の影響を除去した
のち、発芽大豆由来のアミンオキシダーゼを作用
させ、生成する過酸化水素を発色させ、比色定量
する方法である。 しかしながら、これら酵素法による総ポリアミ
ン量測定法はいずれも次のような欠点を有してい
ることが判明した。 これら酵素法は、発芽大豆由来のアミンオキシ
ダーゼを用いており、この発芽大豆のアミンオキ
シダーゼはスペルミンを基質とするとき１モルの
スペルミンより２モルの過酸化水素を生成するが
他のポリアミン即ちスペルミジン、プトレツシン
及びカダベリンからは１モルの過酸化水素を生成
するので試料中の総ポリアミン量を求める場合、
酵素反応の結果生ずる過酸化水素の総量を比色定
量するのであるが、これらいずれの方法ともスペ
ルミンに関して真の値より高い値が得られること
となりその結果これらの方法は正確性に欠けるこ
ととなつてしまう。特にスペルミン含量の多い血
液を試料として臨床検査に用いる場合にはこれら
酵素法による総ポリアミン測定法は誤差が大きく
なつて使用不可能であつた。 又、発芽大豆由来のアミンオキシダーゼは植物
性の酵素であり、微生物由来の酵素に比して大量
生産出来にくく、そのため臨床検査において大量
に使用する場合、コスト的にも問題を有してい
た。一方特開昭58−141798号方法はポリアミン溶
液にミクロコツカス・フラビダスのプトレツシン
酸化酵素を用いるポリアミンの分析法であるが、
このプトレツシンオキシダーゼは主としてプトレ
ツシン、カダベリン、スペルミジンに作用する酵
素であり、総ポリアミンのうちスペルミンには作
用せず血液を試料として用いられないという欠点
があり、更に特開昭58−146297号方法はペニシリ
ウム属の産生するポリアミンオキシダーゼＭを用
いて試料中のスペルミン、スペルミジン、アセチ
ルスペルミン及びアセチルスペルミジンからなる
総ポリアミンの定量法を開示しているが、このポ
リアミンオキシダーゼＭはプトレツシン及びカダ
ベリンには作用しないこと及びスペルミンに作用
して１モルのスペルミンから２モルの過酸化水素
を生成すること等のためこの方法もやはり正確な
総ポリアミン量の測定方法とはなり得ないもので
あつた。 そこで本発明者らは、これら事情に鑑み、従来
の総ポリアミン量測定法に比較して迅速にしてよ
り正確で精度のよい酵素法による総ポリアミン量
の測定法を開発すべく鋭意検討を重ねた。その結
果、各種ポリアミンを含有する試料中のスペルミ
ンをまずポリアミンオキシダーゼによつてスペル
ミジンおよび／又はプトレツシンに変換せしめ、
かつその際生成する過酸化水素を消去した後、次
いでスペルミジン、プトレツシン、カダベリンに
作用し、かつスペルミジンからプトレツシンを生
成しないアミン酸化酵素を添加し、反応させ、そ
の際生成する過酸化水素を発色させ、比色定量す
ることによつて総ポリアミン量を求めればこの方
法においては試料中のスペルミンと等モル量の過
酸化水素が生成される結果、迅速にして正確な総
ポリアミン量の測定が可能となることを知り、本
発明を完成したものである。 本発明方法の特徴の１つは試料中の総ポリアミ
ン量を酵素を用いて測定するに当り、前処理反応
を施すことにある。 すなわち前処理反応として、あらかじめ総ポリ
アミンを含有する試料にポリアミン酸化酵素を作
用させ、試料中のスペルミンを式に従つて等モ
ルのスペルミジンおよび／又はプトレツシンに変
換してしまう。
【表】
↓
H２N(CH２)４NH２(プトレツシン)
上記の前処理時に得られる反応生成物は必ずし
も一定のものが得られるのではなく、温度・PH等
の条件により異なつた状態のものが得られる。す
なわちスペルミンがスペルミジンを経てプトレツ
シンまで完全に分解される場合、スペルミンがス
ペルミジンに分解されそこで止まつてしまう場合
及びスペルミンからスペルミジンを経てスペルミ
ジンの一部がプトレツシンに分解される場合（こ
の場合はスペルミジンとプトレツシンの混合物が
得られる）等である。本発明においてはこれらい
ずれの場合においても次なる第２の反応に使用さ
れ得るが、公知のプトレツシン酸化酵素を用いる
場合には反応性を考慮するとスペルミンが完全に
プトレツシンに変換される場合がより好ましい。 次いで、上記の前処理反応の結果、生成した過
酸化水素を消去してしまうことも本発明法の２番
目の特徴である。この理由は前処理段階で生成し
た過酸化水素が残存すると次なる反応に影響を与
え測定誤差の要因となるので、この段階で生成さ
れる過酸化水素は完全に除去されねばならない。
そのための方法として、カタラーゼを添加し過酸
化水素を分解してしまう方法、或いはペルオキシ
ダーゼの存在下、過酸化水素と反応する色原体の
一つと反応させる方法等の一般的な過酸化水素除
去方法が利用され得る。 こうした前処理反応によつてスペルミンは等モ
ルのスペルミジンおよび／又はプトレツシンに変
換させられてしまう。その後に、総ポリアミンの
定量法を行うのである。すなわちスペルミジン、
プトレツシン及びカダベリンからなるポリアミン
混合試料にスペルミジン、プトレツシン及びカダ
ベリンを分解する能力を有し、かつスペルミジン
からプトレツシンを生成しないアミン酸化酵素を
作用させることによつてスペルミジン、プトレツ
シン及びカダベリンよりそれぞれ等モルの過酸化
水素が生成する。そこで、該過酸化水素を発色さ
せ比色定量することによつて総ポリアミン量を求
めるものである。 以下にこれらの第２の反応に用いるアミン酸化
酵素の反応式の１例を式(a)〜(c)にて示す。
H２N(CH２)４NH２(プトレツシン)
上記の前処理時に得られる反応生成物は必ずし
も一定のものが得られるのではなく、温度・PH等
の条件により異なつた状態のものが得られる。す
なわちスペルミンがスペルミジンを経てプトレツ
シンまで完全に分解される場合、スペルミンがス
ペルミジンに分解されそこで止まつてしまう場合
及びスペルミンからスペルミジンを経てスペルミ
ジンの一部がプトレツシンに分解される場合（こ
の場合はスペルミジンとプトレツシンの混合物が
得られる）等である。本発明においてはこれらい
ずれの場合においても次なる第２の反応に使用さ
れ得るが、公知のプトレツシン酸化酵素を用いる
場合には反応性を考慮するとスペルミンが完全に
プトレツシンに変換される場合がより好ましい。 次いで、上記の前処理反応の結果、生成した過
酸化水素を消去してしまうことも本発明法の２番
目の特徴である。この理由は前処理段階で生成し
た過酸化水素が残存すると次なる反応に影響を与
え測定誤差の要因となるので、この段階で生成さ
れる過酸化水素は完全に除去されねばならない。
そのための方法として、カタラーゼを添加し過酸
化水素を分解してしまう方法、或いはペルオキシ
ダーゼの存在下、過酸化水素と反応する色原体の
一つと反応させる方法等の一般的な過酸化水素除
去方法が利用され得る。 こうした前処理反応によつてスペルミンは等モ
ルのスペルミジンおよび／又はプトレツシンに変
換させられてしまう。その後に、総ポリアミンの
定量法を行うのである。すなわちスペルミジン、
プトレツシン及びカダベリンからなるポリアミン
混合試料にスペルミジン、プトレツシン及びカダ
ベリンを分解する能力を有し、かつスペルミジン
からプトレツシンを生成しないアミン酸化酵素を
作用させることによつてスペルミジン、プトレツ
シン及びカダベリンよりそれぞれ等モルの過酸化
水素が生成する。そこで、該過酸化水素を発色さ
せ比色定量することによつて総ポリアミン量を求
めるものである。 以下にこれらの第２の反応に用いるアミン酸化
酵素の反応式の１例を式(a)〜(c)にて示す。
【表】
↓
H２N(CH２)３CHO(4−アミノブチルアルデヒド)
H２N(CH２)３CHO(4−アミノブチルアルデヒド)
【表】
↓
H２N(CH２)４CHO(5−アミノバレルアルデヒド)
上記の反応式(a)、(b)、(c)において用いられる
アミン酸化酵素はスペルミジン、プトレツシン、
カダベリンに作用して等モルの過酸化水素を生成
するものであればいずれにても用いられ得る。 次に参考例、実施例により本発明を更に詳細に
説明するが、ポリアミン酸化酵素と第２の反応に
用いるアミン酸化酵素活性、ペルオキシダーゼ活
性及びカタラーゼ活性測定法について述べる。な
おポリアミン酸化酵素及びアミン酸化酵素の活性
単位の表示は以下のように測定して、１分間に
1μmolの過酸化水素を生成するに要する酵素量を
もつて１単位として定めたものである。 (1) ポリアミン酸化酵素 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）100mlに４−ア
ミノアンチピリン10mg、フエノール0.2ml、ペ
ルオキシダーゼ（ベーリンガー社製、グレード
）５mgを溶解し、発色液を調製する。 この発色液1.5mlと10ｍＭスペルミジン0.5ml
との混合物を35℃で３分間予熱したのち、酵素
液0.5mlを添加し反応させる。そして505nｍに
おける発色分子吸光係数として6250を用い、生
成する過酸化水素に起因する505nｍの吸光度
変化量（反応開始１分間のΔA）より酵素活性
を求める。 (2) 第２の反応に用いるアミン酸化酵素 代表的な１例としてプトレツシン酸化酵素の
活性測定を示すと次のようである。 基質として10ｍＭプトレツシン0.5ml及び発
色液の緩衝液としてPH8.5のリン酸緩衝液を用
いる以外は(1)と全く同様にして酵素活性を求め
た。 (3) ペルオキシダーゼ活性はピロガロール、過酸
化水素を基質とし、PH6.0、20℃反応において
20秒間に１mgのプルプロガリンを生成する酵素
量を１単位とした。 (4) カタラーゼ活性は過酸化水素を基質とし、PH
7.0、25℃反応において１分間に1μmolの過酸
化水素を分解するに要する酵素量を１単位とし
た。 参考例 １ ４−アミノアンチピリン7.5mg、ペルオキシダ
ーゼ350単位を0.2Mリン酸緩衝液PH7.1の100mlに
溶解し、発色液とした。 (A) 発色液1.35mlにスペルミン溶液100nmol
（1.60ml）を添加し、30℃、３分間予熱後、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフ
オプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム塩
（以下TOOSと略す）0.45mgとポリアミン酸化
酵素AT−１（特開昭56−92788号公報記載）
0.15単位（50μ）を添加した。30℃で10分間
反応後、555nｍの吸光度を測定した（吸光度
Ａ） (B) 発色液1.35mlにスペルミン溶液100nmol
（1.50ml）を添加し、30℃、３分間予熱後、
TOOS0.45mgを含むポリアミン酸化酵素AT−
10.15単位（50μ）を添加した。30℃で10分間
反応後、0.65M NaOH溶液（0.1ml）を添加
し、（このPHにおいてはポリアミン酸化酵素は
作用せず、プトレツシン酸化酵素は作用しやす
くなる。）、次いでプトレツシン酸化酵素〔アグ
リカルチユアル・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Agric.Biol.Chem.）第30巻、第1202頁
（1966）に準じて調製した。〕4.5単位（10μ）
を添加し30℃、10分間反応後555nｍの吸光度
を測定した。（吸光度Ｂ） (C) 発色液1.35mlにスペルミン溶液100nmol
（1.20ml）とカタラーゼ20単位（0.2ml）を添加
し、30℃で３分間予熱後、ポリアミン酸化酵素
AT−１ 0.15単位（10μ、TOOSは含まな
い）を添加した。30℃で10分間反応後、0.65M
NaOH溶液0.1mlと30ｍＭアジ化ナトリウム0.1
mlを添加し、更にTOOSを含むプトレツシン酸
化酵素4.5単位（50μ）を添加した。30℃、10
分間反応後555nｍの吸光度を測定した。（吸光
度Ｃ） 上記の反応における吸光度は次の通りであつ
た。 吸光度Ａ＝1.109 （200nmolの過酸化水素量にほぼ相当する） 吸光度Ｂ＝1.664 （300nmolの過酸化水素量にほぼ相当する） 吸光度Ｃ＝0.552 （100nmolの過酸化水素量にほぼ相当する） 反応Ｃにおいてポリアミン酸化酵素との反応液
にTOOS（0.45mg含有）溶液を添加した場合の吸
光度は0.000であつた。 すなわち、吸光度Ａは反応Ａでスペルミンが完
全にプトレツシンに酸化され２モル量の過酸化水
素が生成されたことを示す。吸光度Ｂは反応Ｂで
スペルミンとポリアミン酸化酵素との反応によつ
て２モル量の過酸化水素と１モル量のプトレツシ
ンが生成し、次いでプトレツシンがプトレツシン
酸化酵素によつて完全に酸化され、計３モルの過
酸化水素が生成されたことを示す。吸光度Ｃは反
応Ｃでポリアミン酸化酵素との反応によつて１モ
ル量のプトレツシンとともに生成した２モル量の
過酸化水素を同時に添加されたカタラーゼによつ
て完全に分解してしまい（この処理ののちアジ化
ナトリウムの添加によりカタラーゼの活性を失活
させる必要がある。）、次いで生成したプトレツシ
ンをプトレツシン酸化酵素で分解することにより
１モルの過酸化水素量が生成されたことを示して
いる。すなわち反応Ｃの方法では、スペルミンと
等モルの過酸化水素が生成されることとなりこの
過酸化水素のモル数がすなわち、試料中のスペル
ミのモル数となつている。 参考例 ２ スペルミン100nmolの代わりにスペルミジン
100nmolを用いて参考例１と同様の検討を行つた
結果は次の通りであつた。 吸光度Ａ＝0.554 （100nmolの過酸化水素量に相当） 吸光度Ｂ＝1.112 （200nmolの過酸化水素量に相当） 吸光度Ｃ＝0.556 （100nmolの過酸化水素量に相当） 尚、反応Ｃのポリアミン酸化酵素との反応液に
TOOS（0.45mg含有）溶液を添加した場合の吸光
度は0.000であつた。 すなわち、吸光度Ａは反応Ａでスペルミジンが
ポリアミン酸化酵素で完全に１モル量のプトレツ
シンに酸化され１モル量の過酸化水素が生成する
ことを示し、吸光度Ｂは反応Ｂでスペルミジンが
ポリアミン酸化酵素によつて酸化され１モル量の
過酸化水素と１モル量のプトレツシンが生成し、
該プトレツシンから更に１モル量の過酸化水素の
計２モルの過酸化水素が生成したことを示す。更
に、吸光度Ｃは反応Ｃでスペルミジンがポリアミ
ン酸化酵素との反応によつて１モル量のプトレツ
シンとともに生成された１モル量の過酸化水素が
カタラーゼで完全に分解され（この後カタラーゼ
はアジ化ナトリウムの添加により完全に失活され
る。）、次いで該生成プトレツシンにプトレツシン
酸化酵素を反応させることによつて１モル量の過
酸化水素量のみが測定されたことを示す。すなわ
ち、反応Ｃの方法をとることによつてスペルミジ
ンより等モルの過酸化水素が生成し、従つて過酸
化水素を定量すれば即、それが試料中のスペルミ
ジン量となつていることがわかる。 参考例 ３ スペルミン100nmol代わりにプトレツシン
100nmol又はカダベリン100nmolを用いて参考例
１と同様の検討を行つた結果は次の通りであつ
た。 プトレツシン カダベリン 吸光度Ａ 0.000 0.000 吸光度Ｂ 0.554 0.555 吸光度Ｃ 0.553 0.554 すなわちポリアミン酸化酵素はプトレツシン、
カダベリンを全く酸化せず、プトレツシン酸化酵
素によつて分解され、等モル量の過酸化水素が生
成することが示された。 参考例 ４ 発色液1.35mlと基質（スペルミン又はスペル
ミジン又はプトレツシン又はカダベリン）の各基
質100nmol（1.50ml）のそれぞれに発色液及び
0.65M NaOH溶液（0.1ml）を添加し、30℃、３
分間予熱後それぞれTOOS0.45mgを含むプトレツ
シン酸化酵素4.5単位（50μ）を添加した。30℃
で10分間反応後555nｍの吸光度を測定した結果
は次の通りであつた。 基質の種類 吸光度 スペルミン 0.000 スペルミジン 0.555 プトレツシン 0.553 カダベリン 0.556 すなわち、プトレツシン酸化酵素はスペルミン
を全く基質としないがスペルミジン、プトレツシ
ン、カダベリンを酸化し、それぞれ等モル量の過
酸化水素を生成することが示された。 参考例 ５ スペルミン又はスペルミジンの10〜100nmolを
基質として用いて参考例１と同様の操作を行つた
結果は表−１に示される。
H２N(CH２)４CHO(5−アミノバレルアルデヒド)
上記の反応式(a)、(b)、(c)において用いられる
アミン酸化酵素はスペルミジン、プトレツシン、
カダベリンに作用して等モルの過酸化水素を生成
するものであればいずれにても用いられ得る。 次に参考例、実施例により本発明を更に詳細に
説明するが、ポリアミン酸化酵素と第２の反応に
用いるアミン酸化酵素活性、ペルオキシダーゼ活
性及びカタラーゼ活性測定法について述べる。な
おポリアミン酸化酵素及びアミン酸化酵素の活性
単位の表示は以下のように測定して、１分間に
1μmolの過酸化水素を生成するに要する酵素量を
もつて１単位として定めたものである。 (1) ポリアミン酸化酵素 0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）100mlに４−ア
ミノアンチピリン10mg、フエノール0.2ml、ペ
ルオキシダーゼ（ベーリンガー社製、グレード
）５mgを溶解し、発色液を調製する。 この発色液1.5mlと10ｍＭスペルミジン0.5ml
との混合物を35℃で３分間予熱したのち、酵素
液0.5mlを添加し反応させる。そして505nｍに
おける発色分子吸光係数として6250を用い、生
成する過酸化水素に起因する505nｍの吸光度
変化量（反応開始１分間のΔA）より酵素活性
を求める。 (2) 第２の反応に用いるアミン酸化酵素 代表的な１例としてプトレツシン酸化酵素の
活性測定を示すと次のようである。 基質として10ｍＭプトレツシン0.5ml及び発
色液の緩衝液としてPH8.5のリン酸緩衝液を用
いる以外は(1)と全く同様にして酵素活性を求め
た。 (3) ペルオキシダーゼ活性はピロガロール、過酸
化水素を基質とし、PH6.0、20℃反応において
20秒間に１mgのプルプロガリンを生成する酵素
量を１単位とした。 (4) カタラーゼ活性は過酸化水素を基質とし、PH
7.0、25℃反応において１分間に1μmolの過酸
化水素を分解するに要する酵素量を１単位とし
た。 参考例 １ ４−アミノアンチピリン7.5mg、ペルオキシダ
ーゼ350単位を0.2Mリン酸緩衝液PH7.1の100mlに
溶解し、発色液とした。 (A) 発色液1.35mlにスペルミン溶液100nmol
（1.60ml）を添加し、30℃、３分間予熱後、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフ
オプロピル）−ｍ−トルイジンナトリウム塩
（以下TOOSと略す）0.45mgとポリアミン酸化
酵素AT−１（特開昭56−92788号公報記載）
0.15単位（50μ）を添加した。30℃で10分間
反応後、555nｍの吸光度を測定した（吸光度
Ａ） (B) 発色液1.35mlにスペルミン溶液100nmol
（1.50ml）を添加し、30℃、３分間予熱後、
TOOS0.45mgを含むポリアミン酸化酵素AT−
10.15単位（50μ）を添加した。30℃で10分間
反応後、0.65M NaOH溶液（0.1ml）を添加
し、（このPHにおいてはポリアミン酸化酵素は
作用せず、プトレツシン酸化酵素は作用しやす
くなる。）、次いでプトレツシン酸化酵素〔アグ
リカルチユアル・バイオロジカル・ケミストリ
ー（Agric.Biol.Chem.）第30巻、第1202頁
（1966）に準じて調製した。〕4.5単位（10μ）
を添加し30℃、10分間反応後555nｍの吸光度
を測定した。（吸光度Ｂ） (C) 発色液1.35mlにスペルミン溶液100nmol
（1.20ml）とカタラーゼ20単位（0.2ml）を添加
し、30℃で３分間予熱後、ポリアミン酸化酵素
AT−１ 0.15単位（10μ、TOOSは含まな
い）を添加した。30℃で10分間反応後、0.65M
NaOH溶液0.1mlと30ｍＭアジ化ナトリウム0.1
mlを添加し、更にTOOSを含むプトレツシン酸
化酵素4.5単位（50μ）を添加した。30℃、10
分間反応後555nｍの吸光度を測定した。（吸光
度Ｃ） 上記の反応における吸光度は次の通りであつ
た。 吸光度Ａ＝1.109 （200nmolの過酸化水素量にほぼ相当する） 吸光度Ｂ＝1.664 （300nmolの過酸化水素量にほぼ相当する） 吸光度Ｃ＝0.552 （100nmolの過酸化水素量にほぼ相当する） 反応Ｃにおいてポリアミン酸化酵素との反応液
にTOOS（0.45mg含有）溶液を添加した場合の吸
光度は0.000であつた。 すなわち、吸光度Ａは反応Ａでスペルミンが完
全にプトレツシンに酸化され２モル量の過酸化水
素が生成されたことを示す。吸光度Ｂは反応Ｂで
スペルミンとポリアミン酸化酵素との反応によつ
て２モル量の過酸化水素と１モル量のプトレツシ
ンが生成し、次いでプトレツシンがプトレツシン
酸化酵素によつて完全に酸化され、計３モルの過
酸化水素が生成されたことを示す。吸光度Ｃは反
応Ｃでポリアミン酸化酵素との反応によつて１モ
ル量のプトレツシンとともに生成した２モル量の
過酸化水素を同時に添加されたカタラーゼによつ
て完全に分解してしまい（この処理ののちアジ化
ナトリウムの添加によりカタラーゼの活性を失活
させる必要がある。）、次いで生成したプトレツシ
ンをプトレツシン酸化酵素で分解することにより
１モルの過酸化水素量が生成されたことを示して
いる。すなわち反応Ｃの方法では、スペルミンと
等モルの過酸化水素が生成されることとなりこの
過酸化水素のモル数がすなわち、試料中のスペル
ミのモル数となつている。 参考例 ２ スペルミン100nmolの代わりにスペルミジン
100nmolを用いて参考例１と同様の検討を行つた
結果は次の通りであつた。 吸光度Ａ＝0.554 （100nmolの過酸化水素量に相当） 吸光度Ｂ＝1.112 （200nmolの過酸化水素量に相当） 吸光度Ｃ＝0.556 （100nmolの過酸化水素量に相当） 尚、反応Ｃのポリアミン酸化酵素との反応液に
TOOS（0.45mg含有）溶液を添加した場合の吸光
度は0.000であつた。 すなわち、吸光度Ａは反応Ａでスペルミジンが
ポリアミン酸化酵素で完全に１モル量のプトレツ
シンに酸化され１モル量の過酸化水素が生成する
ことを示し、吸光度Ｂは反応Ｂでスペルミジンが
ポリアミン酸化酵素によつて酸化され１モル量の
過酸化水素と１モル量のプトレツシンが生成し、
該プトレツシンから更に１モル量の過酸化水素の
計２モルの過酸化水素が生成したことを示す。更
に、吸光度Ｃは反応Ｃでスペルミジンがポリアミ
ン酸化酵素との反応によつて１モル量のプトレツ
シンとともに生成された１モル量の過酸化水素が
カタラーゼで完全に分解され（この後カタラーゼ
はアジ化ナトリウムの添加により完全に失活され
る。）、次いで該生成プトレツシンにプトレツシン
酸化酵素を反応させることによつて１モル量の過
酸化水素量のみが測定されたことを示す。すなわ
ち、反応Ｃの方法をとることによつてスペルミジ
ンより等モルの過酸化水素が生成し、従つて過酸
化水素を定量すれば即、それが試料中のスペルミ
ジン量となつていることがわかる。 参考例 ３ スペルミン100nmol代わりにプトレツシン
100nmol又はカダベリン100nmolを用いて参考例
１と同様の検討を行つた結果は次の通りであつ
た。 プトレツシン カダベリン 吸光度Ａ 0.000 0.000 吸光度Ｂ 0.554 0.555 吸光度Ｃ 0.553 0.554 すなわちポリアミン酸化酵素はプトレツシン、
カダベリンを全く酸化せず、プトレツシン酸化酵
素によつて分解され、等モル量の過酸化水素が生
成することが示された。 参考例 ４ 発色液1.35mlと基質（スペルミン又はスペル
ミジン又はプトレツシン又はカダベリン）の各基
質100nmol（1.50ml）のそれぞれに発色液及び
0.65M NaOH溶液（0.1ml）を添加し、30℃、３
分間予熱後それぞれTOOS0.45mgを含むプトレツ
シン酸化酵素4.5単位（50μ）を添加した。30℃
で10分間反応後555nｍの吸光度を測定した結果
は次の通りであつた。 基質の種類 吸光度 スペルミン 0.000 スペルミジン 0.555 プトレツシン 0.553 カダベリン 0.556 すなわち、プトレツシン酸化酵素はスペルミン
を全く基質としないがスペルミジン、プトレツシ
ン、カダベリンを酸化し、それぞれ等モル量の過
酸化水素を生成することが示された。 参考例 ５ スペルミン又はスペルミジンの10〜100nmolを
基質として用いて参考例１と同様の操作を行つた
結果は表−１に示される。
【表】
すなわち、反応Ｃはスペルミン、スペルミジン
各々10〜100nmolの範囲でスペルミン、スペルミ
ジン量に相当する量の過酸化水素を測定でき、非
常に正確な総ポリアミン量が測定できることが示
された。 参考例 ６ 10ｍＭスペルミン、10ｍＭスペルミジン、10ｍ
Ｍプトレツシン、10ｍＭカダベリンの各単独の試
料、これら４種のポリアミンを各々１：１：１：
１の比で混合した試料（混合試料Ａ）と２：２：
１：１の比で混合した試料（混合試料Ｂ）の６種
類を基質として調製した。各基質（10μ）の
各々に発色液1.35mlと蒸留水1.20ml、カタラー
ゼ20単位（0.2ml）を添加し、30℃で３分間予熱
後ポリアミン酸化酵素0.15単位（10μ）を添加
した。30℃、10分間反応後0.65M NaOH溶液0.1
mlと30ｍＭアジ化ナトリウム0.1mlを添加し、更
にTOOS0.45mgを含むプトレツシン酸化酵素4.5単
位（30μ）を添加した。30℃で10分間反応後
555nｍの吸光度を測定した結果は次の通りであ
つた。 基質の種類 吸光度 スペルミン 0.555 スペルミジン 0.553 プトレツシン 0.554 カダベリン 0.554 混合試料Ａ 0.557 混合試料Ｂ 0.555 すなわち、各ポリアミンの単独液或いはいかな
る混合液においても本方法が使用できることが示
された。 参考例 ７ 発色液Ａ−ｄを下記の様に調製し、Ａ〜Ｄのそ
れぞれ1.35mlと基質（10ｍＭスペルミジン又は
1.0ｍＭスペルミン）0.10ml、30ｍＭアジ化ナト
リウム溶液0.10ml、蒸留水1.25mlを混合し、30℃
で３分間予熱した。この液にポリアミン酸化酵素
AT−10.15単位（50μ）を添加し、30℃で10分
間反応した。反応終了後、発色液Ａ〜Ｄを用いた
反応に対し、それぞれ発色液ａ〜d0.01mlと
0.65M水酸化ナトリウム溶液0.10mlを添加し、
555nｍの吸光度を測定した（吸光度Ａ）。次いで
この反応液にプトレツシン酸化酵素4.5単位（50μ
）を添加し、30℃で10分間反応を続け555nｍ
の吸光度を測定した（吸光度Ｂ）。その結果は表
−２に示される。
各々10〜100nmolの範囲でスペルミン、スペルミ
ジン量に相当する量の過酸化水素を測定でき、非
常に正確な総ポリアミン量が測定できることが示
された。 参考例 ６ 10ｍＭスペルミン、10ｍＭスペルミジン、10ｍ
Ｍプトレツシン、10ｍＭカダベリンの各単独の試
料、これら４種のポリアミンを各々１：１：１：
１の比で混合した試料（混合試料Ａ）と２：２：
１：１の比で混合した試料（混合試料Ｂ）の６種
類を基質として調製した。各基質（10μ）の
各々に発色液1.35mlと蒸留水1.20ml、カタラー
ゼ20単位（0.2ml）を添加し、30℃で３分間予熱
後ポリアミン酸化酵素0.15単位（10μ）を添加
した。30℃、10分間反応後0.65M NaOH溶液0.1
mlと30ｍＭアジ化ナトリウム0.1mlを添加し、更
にTOOS0.45mgを含むプトレツシン酸化酵素4.5単
位（30μ）を添加した。30℃で10分間反応後
555nｍの吸光度を測定した結果は次の通りであ
つた。 基質の種類 吸光度 スペルミン 0.555 スペルミジン 0.553 プトレツシン 0.554 カダベリン 0.554 混合試料Ａ 0.557 混合試料Ｂ 0.555 すなわち、各ポリアミンの単独液或いはいかな
る混合液においても本方法が使用できることが示
された。 参考例 ７ 発色液Ａ−ｄを下記の様に調製し、Ａ〜Ｄのそ
れぞれ1.35mlと基質（10ｍＭスペルミジン又は
1.0ｍＭスペルミン）0.10ml、30ｍＭアジ化ナト
リウム溶液0.10ml、蒸留水1.25mlを混合し、30℃
で３分間予熱した。この液にポリアミン酸化酵素
AT−10.15単位（50μ）を添加し、30℃で10分
間反応した。反応終了後、発色液Ａ〜Ｄを用いた
反応に対し、それぞれ発色液ａ〜d0.01mlと
0.65M水酸化ナトリウム溶液0.10mlを添加し、
555nｍの吸光度を測定した（吸光度Ａ）。次いで
この反応液にプトレツシン酸化酵素4.5単位（50μ
）を添加し、30℃で10分間反応を続け555nｍ
の吸光度を測定した（吸光度Ｂ）。その結果は表
−２に示される。
発色液Ａ：4AA7.5mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH
7.1）の100mlに溶解 発色液Ｂ：4AA7.5mgとペルオキシダーゼ350単位
を0.2Mリン酸緩衝液（PH7.1）の100mlに溶解 発色液Ｃ：TOOS33.7mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH
7.1）の100mlに溶解 発色液Ｄ：TOOS33.7mgとペルオキシダーゼ350
単位を0.2Mリン酸緩衝液（PH7.1）の100mlに
溶解 発色液ａ：TOOS44.5mgとペルオキシダーゼ350
単位を10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）の1.0mlに
溶解 発色液ｂ：TOOS44.5mgを10ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.0）の1.0mlに溶解 発色液ｃ：4AA10.0mgとペルオキシダーゼ350単
位を10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）の1.0mlに溶
解 発色液ｄ：4AA10.0mgを10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）の1.0mlに溶解 表−２より明らかのようにＢとｂすなわちＢ−
ｂ及びＤとｄすなわちＤ−ｄの組み合せで反応液
中のスペルミン及びスペルミジン量が正確に測定
できることがわかつた。 すなわち、スペルミジン、スペルミンをポリア
ミン酸化酵素で酸化した時に生成する過酸化水素
をペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素の測定
に用いられる色原体の一方のみと反応することに
よつて消去し、ひきつづき色原体の混合系におい
てプトレツシン酸化酵素を作用させることによつ
て総ポリアミン量が正確に測定できた。 参考例 ８ TOOS33.7mg、ペルオキシダーゼ350単位を
0.2Mリン酸緩衝液（PH7.1）の100mlに溶解し、
発色液を調製した。この発色液1.35mlにスペル
ミン10〜100nmol、スペルミジン10〜100nmol、
プトレツシン10〜100nmol、カダベリン10〜
100nmol、並びに参考例６と同様に調製した試料
Ａ（10μ）、試料Ｂ（10μ）の各試料に蒸留水を
添加（液量：2.70ml）し、30℃、３分間予熱し
た。次にポリアミン酸化酵素AT−１ 0.15単位
（50μ）を添加し、30℃で10分間反応した。こ
の反応液に４−アミノアンチピリン溶液（1.0
mg／ml）0.1mlと0.65M水酸化ナトリウム溶液を
0.1ml添加し555nｍの吸光度を測定した（吸光度
Ａ）。 更に続いてこの反応液にプトレツシン酸化酵素
4.5単位（50μ）を添加し、30℃で10分間反応を
続けた後555nｍの吸光度を測定した。その結果
は表−３及び表−４に示される。
7.1）の100mlに溶解 発色液Ｂ：4AA7.5mgとペルオキシダーゼ350単位
を0.2Mリン酸緩衝液（PH7.1）の100mlに溶解 発色液Ｃ：TOOS33.7mgを0.2Mリン酸緩衝液（PH
7.1）の100mlに溶解 発色液Ｄ：TOOS33.7mgとペルオキシダーゼ350
単位を0.2Mリン酸緩衝液（PH7.1）の100mlに
溶解 発色液ａ：TOOS44.5mgとペルオキシダーゼ350
単位を10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）の1.0mlに
溶解 発色液ｂ：TOOS44.5mgを10ｍＭリン酸緩衝液
（PH7.0）の1.0mlに溶解 発色液ｃ：4AA10.0mgとペルオキシダーゼ350単
位を10ｍＭリン酸緩衝液（PH7.0）の1.0mlに溶
解 発色液ｄ：4AA10.0mgを10ｍＭリン酸緩衝液（PH
7.0）の1.0mlに溶解 表−２より明らかのようにＢとｂすなわちＢ−
ｂ及びＤとｄすなわちＤ−ｄの組み合せで反応液
中のスペルミン及びスペルミジン量が正確に測定
できることがわかつた。 すなわち、スペルミジン、スペルミンをポリア
ミン酸化酵素で酸化した時に生成する過酸化水素
をペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素の測定
に用いられる色原体の一方のみと反応することに
よつて消去し、ひきつづき色原体の混合系におい
てプトレツシン酸化酵素を作用させることによつ
て総ポリアミン量が正確に測定できた。 参考例 ８ TOOS33.7mg、ペルオキシダーゼ350単位を
0.2Mリン酸緩衝液（PH7.1）の100mlに溶解し、
発色液を調製した。この発色液1.35mlにスペル
ミン10〜100nmol、スペルミジン10〜100nmol、
プトレツシン10〜100nmol、カダベリン10〜
100nmol、並びに参考例６と同様に調製した試料
Ａ（10μ）、試料Ｂ（10μ）の各試料に蒸留水を
添加（液量：2.70ml）し、30℃、３分間予熱し
た。次にポリアミン酸化酵素AT−１ 0.15単位
（50μ）を添加し、30℃で10分間反応した。こ
の反応液に４−アミノアンチピリン溶液（1.0
mg／ml）0.1mlと0.65M水酸化ナトリウム溶液を
0.1ml添加し555nｍの吸光度を測定した（吸光度
Ａ）。 更に続いてこの反応液にプトレツシン酸化酵素
4.5単位（50μ）を添加し、30℃で10分間反応を
続けた後555nｍの吸光度を測定した。その結果
は表−３及び表−４に示される。
【表】
【表】
すなわち、ポリアミン酸化酵素AT−１がスペ
ルミン又はスペルミジンを酸化した時に生成され
た過酸化水素はいずれもTOOS−ペルオキシダー
ゼの存在下による反応で除去され、吸光度Ｂで得
られた値は各々の基質の濃度を反映するものであ
つた。従つて試料Ａ、試料Ｂにおいてもその総量
が測定され、一段目の反応（ポリアミン酸化酵素
との反応）によつて生ずる過酸化水素を除去し、
プトレツシン酸化酵素を作用させることにより容
易に総ポリアミン量を測定できることが示され
た。 こうして参考例１〜８によつて明らかのよう
に、各種ポリアミンを含む試料をまずポリアミン
酸化酵素によつて処理し、その際生成する過酸化
水素をカタラーゼ又はペルオキシダーゼ及び過酸
化水素と反応する色原体を添加することによつて
消去し、しかるのちスペルミジン、プトレツシン
及びカダベリンに作用し、かつスペルミジンから
プトレツシンを生成しないアミン酸化酵素を作用
させれば試料中の総ポリアミン量が正確に容易に
測定できることがわかつたのである。 実施例 １ スペルミン、スペルミジン、プトレツシン、カ
ダベリンの各10ｍＭ溶液を２：２：１：１の比率
で混合して調製した溶液の25μ又は50μを血
液5.0mlに添加し、３分間激しく撹拌後、
3000rpmで５分間遠心分離し上澄液を集めた
（6.2ml）。この上澄液を中和し（PH６〜７付近）
アンバーライトCG−50カラム（0.5×１cm）に吸
着させた。カラムを蒸留水で水洗（3.0ml）後、
0.5M塩酸（3.0ml）でポリアミン類を溶出し、
0.67M水酸化ナトリウム溶液（2.0ml）を添加し
中和した。この中和液を以下の反応の試料として
使用した。 発色液1.35mlに上記中和液1.50mlとカタラーゼ
50単位（25μ）を添加し、30℃で３分間予熱後
ポリアミン酸化酵素AT−１ 0.15単位（25μ）
を添加し、更に10分間加温した。次に1.35M水酸
化ナトリウム溶液（50μ）と60ｍＭアジ化ナト
リウム、0.45mgTOOSを含むプトレツシン酸化酵
素4.5単位（50μ）を添加し、更に30℃で10分間
反応した。反応液の555nｍの吸光度は次のとお
りであつた。 無添加 0.053 25μ添加 0.312 50μ添加 0.575 この値より添加回収率を計算すると、25μ添
加の場合100.4％、50μ添加の場合101.1％と非
常に良好であつた。 実施例 ２ 尿20mlに12N塩酸５mlを添加し、100℃、３時
間加水分解し、結合型ポリアミンを遊離型ポリア
ミンとした。（なお加水分解中に生じた沈澱は遠
心分離（5000rpm、５分）で除去し、次いで上澄
画分は10N水酸化ナトリウム溶液でPH６付近に調
整後蒸留水を添加し60mlとした。）この中和液を
アンバーライトCG−50カラム（１×2.5cm）に吸
着させ、カラムは蒸留水20ml、0.5N塩酸溶液３
mlで洗浄した。次にこのカラムより0.5N塩酸10
mlでポリアミンを溶出し、10N水酸化ナトリウム
溶液でPH7.5付近に調整し、蒸留水で20mlとした。
この中和液を試料として実施例１の反応と同一の
操作を行つた結果、その555nｍの吸光度は0.445
であつた。この値は反応液中に80.1nmolのポリ
アミンが存在したことを示す。すなわち尿１ml中
に53.4nmolのポリアミンを含むことを示した。
又、中和液を５倍濃縮し、その100μを用いて
アミノ酸分析計にてポリアミンの測定を行つた結
果（測定法は〔アグリカルチヤル・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）第44巻、
2467頁〜2475頁（1980）〕に従つて行つた。）尿中
１ml中に52.7nmolのポリアミンを含むことが示
され、本方法が化学的分析法と非常によく相関す
ることが示された。
ルミン又はスペルミジンを酸化した時に生成され
た過酸化水素はいずれもTOOS−ペルオキシダー
ゼの存在下による反応で除去され、吸光度Ｂで得
られた値は各々の基質の濃度を反映するものであ
つた。従つて試料Ａ、試料Ｂにおいてもその総量
が測定され、一段目の反応（ポリアミン酸化酵素
との反応）によつて生ずる過酸化水素を除去し、
プトレツシン酸化酵素を作用させることにより容
易に総ポリアミン量を測定できることが示され
た。 こうして参考例１〜８によつて明らかのよう
に、各種ポリアミンを含む試料をまずポリアミン
酸化酵素によつて処理し、その際生成する過酸化
水素をカタラーゼ又はペルオキシダーゼ及び過酸
化水素と反応する色原体を添加することによつて
消去し、しかるのちスペルミジン、プトレツシン
及びカダベリンに作用し、かつスペルミジンから
プトレツシンを生成しないアミン酸化酵素を作用
させれば試料中の総ポリアミン量が正確に容易に
測定できることがわかつたのである。 実施例 １ スペルミン、スペルミジン、プトレツシン、カ
ダベリンの各10ｍＭ溶液を２：２：１：１の比率
で混合して調製した溶液の25μ又は50μを血
液5.0mlに添加し、３分間激しく撹拌後、
3000rpmで５分間遠心分離し上澄液を集めた
（6.2ml）。この上澄液を中和し（PH６〜７付近）
アンバーライトCG−50カラム（0.5×１cm）に吸
着させた。カラムを蒸留水で水洗（3.0ml）後、
0.5M塩酸（3.0ml）でポリアミン類を溶出し、
0.67M水酸化ナトリウム溶液（2.0ml）を添加し
中和した。この中和液を以下の反応の試料として
使用した。 発色液1.35mlに上記中和液1.50mlとカタラーゼ
50単位（25μ）を添加し、30℃で３分間予熱後
ポリアミン酸化酵素AT−１ 0.15単位（25μ）
を添加し、更に10分間加温した。次に1.35M水酸
化ナトリウム溶液（50μ）と60ｍＭアジ化ナト
リウム、0.45mgTOOSを含むプトレツシン酸化酵
素4.5単位（50μ）を添加し、更に30℃で10分間
反応した。反応液の555nｍの吸光度は次のとお
りであつた。 無添加 0.053 25μ添加 0.312 50μ添加 0.575 この値より添加回収率を計算すると、25μ添
加の場合100.4％、50μ添加の場合101.1％と非
常に良好であつた。 実施例 ２ 尿20mlに12N塩酸５mlを添加し、100℃、３時
間加水分解し、結合型ポリアミンを遊離型ポリア
ミンとした。（なお加水分解中に生じた沈澱は遠
心分離（5000rpm、５分）で除去し、次いで上澄
画分は10N水酸化ナトリウム溶液でPH６付近に調
整後蒸留水を添加し60mlとした。）この中和液を
アンバーライトCG−50カラム（１×2.5cm）に吸
着させ、カラムは蒸留水20ml、0.5N塩酸溶液３
mlで洗浄した。次にこのカラムより0.5N塩酸10
mlでポリアミンを溶出し、10N水酸化ナトリウム
溶液でPH7.5付近に調整し、蒸留水で20mlとした。
この中和液を試料として実施例１の反応と同一の
操作を行つた結果、その555nｍの吸光度は0.445
であつた。この値は反応液中に80.1nmolのポリ
アミンが存在したことを示す。すなわち尿１ml中
に53.4nmolのポリアミンを含むことを示した。
又、中和液を５倍濃縮し、その100μを用いて
アミノ酸分析計にてポリアミンの測定を行つた結
果（測定法は〔アグリカルチヤル・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Agric.Biol.Chem.）第44巻、
2467頁〜2475頁（1980）〕に従つて行つた。）尿中
１ml中に52.7nmolのポリアミンを含むことが示
され、本方法が化学的分析法と非常によく相関す
ることが示された。
Claims (1)
- １ 各種ポリアミン含有試料をポリアミン酸化酵
素で処理し、試料中のスペルミンをスペルミジン
および／又はプトレツシンに変換せしめるととも
にその際生成する過酸化水素を消去した後、更に
スペルミジン、プトレツシン及びカダベリンに作
用し、かつスペルミジンからプトレツシンを生成
しないアミン酸化酵素を添加し、反応させ、生成
する過酸化水素を定量することによつて試料中の
ポリアミン量を求めることを特徴とする総ポリア
ミン量の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4527984A JPS60188096A (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | 総ポリアミン量の測定法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4527984A JPS60188096A (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | 総ポリアミン量の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60188096A JPS60188096A (ja) | 1985-09-25 |
| JPH0532039B2 true JPH0532039B2 (ja) | 1993-05-14 |
Family
ID=12714867
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4527984A Granted JPS60188096A (ja) | 1984-03-08 | 1984-03-08 | 総ポリアミン量の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60188096A (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7319038B2 (en) * | 2002-09-19 | 2008-01-15 | The Johns Hopkins University | Sensor for monitoring an analyte |
| US7560271B2 (en) | 2006-12-20 | 2009-07-14 | Agentase, Llc | Seafood spoilage indicator |
-
1984
- 1984-03-08 JP JP4527984A patent/JPS60188096A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60188096A (ja) | 1985-09-25 |
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