JPS60188096A - 総ポリアミン量の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、酵素法による試料中の総ポリアミン量の迅速
、簡便かつ精度のよい測定法に関するものである。

ポリアミンは、生物界に広く分布する非蛋白性低分子量
の脂肪族塩基性化合物で、細胞の分裂、増殖及びその生
化学的背景をなす核酸の代謝に重要な役割を果たしてい
る物質として知られている。

哺乳動物の生体中では、スペルミン、スペルミジン、プ
トレッシン、カダベリンが主として存在しており、これ
らをまとめ総ポリアミンと称している。

近年、癌患者の尿中、血中、リンパ液中などのいわゆる
体液中の総ポリアミン量が正常人に比して著しく増加す
ることならびに治療によって総ポリアミン量が減少する
ことが報告されている。

従って、臨床検査において癌の診断、癌の治療効果の判
定及び予後の診断等において総ポリアミン量の測定が有
効な手段となりつつある。

従来、総ポリアミン量の定量法としては、ガスクロマト
グラフィーによる方法〔クリニカル・ケミストリー（Ｃ
Ｉ　ｉｎ、ｃｈｅｍ、）第１９巻、第９０４−９０７頁
（１９７３）　）　、アミノ酸分析計による方法〔フェ
ブス・レクーズ（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、）第４６巻、第
３０５〜３０７頁（１９７４）　）　、高速液体クロマ
トグラフィーによる方法〔ジャーナル・オブ・クロマト
グラフィー（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）第１
４５巻、第１４１〜１４６頁（１９７８）　）などの化
学的方法が主として用いられていた。しかしながらこれ
ら化学的方法は、迅速性に欠ける上に、処理操作が極め
て煩雑で多くの検体を処理できず、又特殊な機器、設備
等を必要とするため、一般臨床検査への応用は困難であ
った。一方、最近酵素を用いる総ポリアミン量の測定法
も提案された（特公昭５６−３６９１８号、特開昭５９
−２７００号、特開昭５８．−１４１７９８号及び特開
昭５８−１４６２９７号）。このうち特公昭５６−３６
９１８号方法は、遊離型ポリアミン含有試料に発芽大豆
由来のアミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化
水素を発色させ、比色定量する方法であり、特開昭５９
−２７００号方法は、遊離型及び抱合型ポリアミン含有
試料にあらかじめアスコルビン酸オキシダーゼを作用さ
せて反応阻害物質の影響を除去したのち、発芽大豆由来
のアミンオキシダーゼを作用させ、生成する過酸化水素
を発色させ、比色定量する方法である。

しかしながら、これら酵素法による総ポリアミン量測定
法はいずれも次のような欠点；を有していることが判明
した。

これら酵素法は、発芽大豆由来のアミンオキシダーゼを
用いており、この発芽大豆のアミンオキシダーゼはスペ
ルミンを基質とするとき１モルのスペルミンより２モル
の過酸化水素を生成するが他のポリアミン即ちスペルミ
ジン、プトレッシン及びカダベリンからは１モルの過酸
化水素を生成するので試料中の総ポリアミン量をめる場
合、酵素反応の結果化ずる過酸化水素の総量を比色定量
するのであるが、これらいずれの方法ともスペルミンに
関して真の値より高い値が得られることとなりその結果
これらの方法は正確性に欠けることとなってしまう。特
にスペルミン含量の多い血液を試料として臨床検査に用
いる場合にはこれら酵素法による総ポリアミン測定法は
誤差が大きくなって使用不可能であった。

又、発芽大豆由来のアミンオキシダーゼは植物性の酵素
であり、微生物由来の酵素に比して大量生産出来にくく
、そのため臨床検査において大量に使用する場合、コス
ト的にも問題を有していた。

一方特開昭５８−１４１７９８号方法はポリアミン溶液
にミクロコツカス・フラビダスのプトレッシンオキシダ
ーゼを用いるポリアミンの分析法であるが、このプトレ
ッシンオキシダーゼは主としてプトレッシン、カダヘリ
ン、スペルミジンに作用する酵素であり、総ポリアミン
のうちスペルミンには作用せず血液を試料として用いら
れないという欠点があり、更に特開昭５８−１４６２９
７号方法はペニシリウム属の産生ずるポリアミンオキシ
ダーゼＭを用いて試料中のスペルミン、スペルミジン、
アセチルスペルミン及びアセチルスペルミジンからなる
総ポリアミンの定量法であるが、このポリアミンオキシ
ダーゼＭはプトレッシン及びカダベリンには作用しない
こと及びスペルミンに作用して１モルのスペルミンから
２モルの過酸化水素を生成すること等のためこの方法も
やはり正確な総ポリアミン量の測定方法とはなり得ない
ものであった。

そこで本発明者らは、これら事情に鑑み、従来の総ポリ
アミン量測定法に比較して迅速にしてより正確で精度の
よい酵素法による総ポリアミン量の測定法を開発すべく
鋭意検討を重ねた。その結果、各種ポリアミンを含有す
る試料中のスベルミ　・ンをまずポリアミンオキシダー
ゼによってスペルミジンおよび／又はプトレッシンに変
換せしめ、かつその際生成する過酸化水素を消去した後
、次いでスペルミジン、プトレッシン、カダベリンに作
用し、かつスペルミジンからプトレッシンを生成しない
アミン酸化酵素を添加し、反応させ、その際生成する過
酸化水素を発色させ、比色定量することによって総ポリ
アミン量をめればこの方法においては試料中のスペルミ
ンと等モル量の過酸化水素が生成される結果、迅速にし
て正確な総ポリアミン量の測定が可能となることを知り
、本発明を完成したものである。

本発明方法の特徴の１つは試料中の総ポリアミン量を酵
素を用いて測定するに当り、前処理反応を施すことにあ
る。

すなわち前処理反応として、あらかじめ総ポリアミンを
含有する試料にポリアミン酸化酵素を作用させ、試料中
のスペルミンを式Ｉに従って等モルのスペルミジンおよ
び／又はプトレッシンに変換してしまう。

式１ ％式％） 上記の前処理時にｊηられる反応生成物は必ずしも一定
のものが得られるのではなく、温度・ｐＨ等の条件によ
り異なった状態のものが得られる。すなわちスペルミン
がスペルミジンを経てプトレッシンまで完全に分解され
る場合、スペルミンがスペルミジンに分解されそこで止
まってしまう場合及びスペルミンからスペルミジンを経
てスペルミジンの一部がプトレッシンに分解される場合
（この場合はスペルミジンとプトレッシンの混合物が得
られる）等である。本発明においてはこれらいずれの場
合においても次なる第２の反応に使用され得るが、公知
のプトレッシン酸化酵素を用いる場合には反応性を考慮
するとスペルミンが完全にプトレッシンに変換される場
合がより好ましい。

次いで、上記の前処理反応の結果、生成した過酸化水素
を消去してしまうことも本発明法の２番目の特徴である
。この理由は前処理段階で生成した過酸化水素が残存す
ると次なる反応に影響を与え測定誤差の要因となるので
、この段階で生成される過酸化水素は完全に除去されね
ばならない。

そのための方法として、カタラーゼを添加し過酸化水素
を分解してしまう方法、或いはペルオキシダーゼの存在
下、過酸化水素と反応する色原体の一つと反応させる方
法等の一般的な過酸化水素除去方法が利用され得る。

こうした前処理反応によってスペルミンは等モルのスペ
ルミジンおよび／又はプトレッシンに変換させられてし
まう。その後に、総ポリアミンの定量法を行うのである
。すなわちスペルミジン、プトレッシン及びカダベリン
からなるポリアミン混合試料にスペルミジン、プトレッ
シン及びカダベリンを分解する能力を有し、かつスペル
ミジンからプトレッシンを生成しないアミン酸化酵素を
作用させることによってスペルミジン、プトレッシン及
びカダベリンよりそれぞれ等モルの過酸化水素が生成す
る。そこで、該過酸化水素を発色させ比色定量すること
によって総ポリアミン量をめるものである。

以下にこれらの第２の反応に用いるアミン酸化酵素の反
応式の１例を式ＩＴ　ｆ＆１〜（Ｃ）にて示す。

弐■ （ａｌ　１１ｚＮ（Ｃ１１２）４ＮＩＩ（Ｃ１ｌｚ）：
＋Ｎｌ１ｚ　（スペルミジン）、上記の反応式ＩＩ　ｆ
ａｌ、ｆｂｌ、ｆｃ）において用いられるアミン酸化酵
素は支ベルミジン、プトレッシン、カダベリンに作用し
て等モルの過酸化水素を生成するものであればいずれに
ても用いられ得る。

次に参考例、実施例により本発明を更に詳細に説明する
が、ポリアミン酸化酵素と第２の反応に用いるアミン酸
化酵素活性、ペルオキシダーゼ活性及びカタラーゼ活性
測定法について述べる。なおポリアミン酸化酵素及びア
ミン酸化酵素の活性単位の表示は以下のように測定して
、１分間に１μｍｏ＋の過酸化水素を生成するに要する
酵素量をもって１単位として定めたものである。

＋１１ポリアミン酸化酵素 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，５）　１００ｍｆに４
−アミノアンチピリン１０■、フェノール０．２ｍｅ、
ペルオキシダーゼ（ベーリンガー社製、グレードＩＩ）
　５曙を溶解し、発色液を鋼製する。

この発色液１．５＋＋＋Ｉ！と１０ｍＭスペルミジン０
．５−との混合物を３５℃で３分間予熱したのち、酵素
液０．５ｍを添加し反応させる。そして５０５ｎｍにお
りる発色の分子吸光係数として６２５０を用い、生成す
る過酸化水素に起因する５０５ｎｍの吸光度変化量（反
応開始１分間のΔＡ）より酵素活性をめる。

（２）第２の反応に用いるアミン酸化酵素代表的な１例
としてプトレッシン酸化酵素の活性測定を示すと次のよ
うである。

基質として１０ｍＭプトレッシン０．５−及び発色液の
緩衝液としてｐｔ＋　８．５のリン酸緩衝液を用いる以
外は（１）と全く同様にして酵素活性をめた。

（３）ペルオキシダーゼ活性はピロガロール、過酸化水
素を基質とし、ｐＨ６，０，２０℃反応において２０秒
間に１■のプルプロガリンを生成する酵素量を１ｍ位と
した。

（４）カタラーゼ活性は過酸化水素を基質とし、ｐＨ７
，０，２５°Ｃ反応において１分間に１μｍｏｌの過酸
化水素を分解するに要する酵素量を１ｍ位とした。

参考例１ ４−アミノアンチピリン７．５■、ペルオキシダーゼ３
５０単位を０．２Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７，１の１００ｍ
ｅに熔解し、発色液■とした。

（Ａ）　発色液１１．３５ｍＥにスペルミン溶液１００
ｎｍ１００ｎ、６０ｍｆ）を添加し、３０℃、３分間予
熱後、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルフ
オプロビル）−ｍ−トルイジンナトリウム塩（以下ＴＯ
Ｏ８と略す＞　０．４５■とポリアミン酸化酵素ＡＴ＝
１　（特開昭５６−９２７８８号公報記載＞　０．１５
ｍ位（５０４）を添加した。３０℃で１０分間反応後、
５５５ｎｍの吸光度を測定した。（吸光度Ａ）（Ｂ）　
発色液Ｉ　１．３５艷にスペルミン／８液１００ｎｍ１
００ｎ、５０ｍ１りを添加し、３０℃、３分間予熱後、
ＴＯＯＳ　０．４５■を含むポリアミン酸化酵素ＡＴ−
１０，１５ｍ位（５０ｍ　）を添加した。３０℃で１０
分間反応後、０．６５Ｍ　Ｎａ０１１溶液（０，１ｍＩ
りを添加し、（このｐＨにおいてはポリアミン酸化酵素
は作用せず、プトレッシン酸化酵素は作用しやすくなる
。）、次いでプトレッシン酸化酵素〔アグリカルチュア
ル・バイオロジカル・ケミストリー（＾ｇｒｉｃ、Ｂｉ
ｏｌ。

ＣＩ＋ｅｍ、　）第３０巻、第１２０２頁（１９６６）
に準じて調製した。〕４．５単位（１０ｄ）を添加し３
０℃、ｌＯ分間反応後５５５ｎｍの吸光度を測定した。

・　（吸光度Ｂ）（Ｃ）　発色液１１．３５−にスペル
ミン溶液１００ｎｍ１００ｎ、２０ｍｅ）とカタラーゼ
２０単位（０，２ｄ）を添加し、３０℃で３分間予熱後
、ポリアミン酸化酵素ＡＴ−１０，１５ｍ位（１０４，
ＴＯＯ３は含まない）を添加した。３０’ｃで１０分間
反応後、０．６５Ｍ　Ｎａ０ＩＩ溶液０、’ｈｍ１！と
３０ｍＭアジ化ナトリウム０．１ｍＲを添加し、更にＴ
Ｏ′Ｏ３を含むプトレッシン酸化酵素４．５単位（５０
４）を添加した。３０℃、１０分間反応後５５５ｎｍの
吸光度を測定した。（吸光度Ｃ）上記の反応における吸
光度は次の通りであった。

吸光度Ａ　＝　１．１０９ （２００ｎｍｏｌの過酸化水素量にほぼ相当する）吸光
度Ｂ　＝　１．６６４ （３００ｎｍｏｌの過酸化水素量にほぼ相当する）吸光
度Ｃ＝　０．５５２ （１００ｎｍｏｌの過酸化水素量にほぼ相当する）反応
Ｃにおいてポリアミン酸化酵素との反応液にＴＯＯ３（
０，４５■含有）溶液を添加した場合の吸光度はｏ、’
ｏｏｏであった。

すなわち、吸光度Ａは反応Ａでスペルミンが完全にプト
レッシンに酸化され２モル量の過酸化水素が生成された
ことを示す。吸光度Ｂは反応Ｂでスペルミンとポリアミ
ン酸化酵素との反応によって２モル量の過酸化水素と１
モル量のプトレッシンが生成し、次いでプトレッシンが
プトレッシンオキシダーゼによって完全に酸化され、計
３モルの過酸化水素が生成されたことを示す。吸光度Ｃ
は反応Ｃでポリアミン酸化酵素との反応によって１モル
量のプトレッシンとともに生成した２モル量の過酸化水
素を同時に添加されたカタラーゼによって完全に分解し
てしまい（この処理ののちアジ化ナトリウムの添加によ
りカタラーゼ６活性を失活させる必要がある。）、次い
で生成したプトレツシンをプトレッシン酸化酵素で分解
することにより１モルの過酸化水素量が生成されたこと
を示している。すなわち反応Ｃの方法では、スペルミン
と等モルの過酸化水素が生成されることとなりこの過酸
化水素のモル数がすなわち、試料中のスペルミンのモル
数となっている。

参考例２ スペルミン１００　ｎｍｏｌの代わりにスペルミジン１
００　ｎｍｏｌを用いて参考例１と同様の検討を行った
結果は次の通りであった。

吸光度Ａ　＝　０．５５４ （１００ｎｍｏｌの過酸化水素量に相当）吸光度Ｂ　＝
　１．１１２ （２００ｎｍｏｌの過酸化水素量に相当）吸光度Ｃ＝　
０．５５６ （１００ｎｍｏｌの過酸化水素量に相当）尚、反応Ｃの
ポリアミン酸化酵素との反応液にＴＯＯ３（０，４５■
含有）溶液を添加した場合の吸光度ばｏ、ｏｏｏであっ
た。

すなわち、吸光度Ａは反応Ａでスペルミジンがポリアミ
ン酸化酵素で完全に１モル量のプトレッシンに酸化され
１モル量の過酸化水素が生成することを示し、吸光度Ｂ
は反応Ｂでスペルミジンがポリアミン酸化酵素によって
酸化され１モル量の過酸化水素と１モル量のプトレッシ
ンが生成し、該プトレッシンから更に１モル量の過酸化
水素の計２モルの過酸化水素が生成したことを示す。更
に、吸光度Ｃは反応Ｃでスペルミジンがポリアミン酸化
酵素との反応によって１モル量のプトレッシンとともに
生成された１モル量の過酸化水素がカタラーゼで完全に
分解され（この後カタラーゼはアジ化ナトリウムの添加
により完全に失活される。）、次いで該生成プトレッシ
ンにプトレッシンオキシダーゼを反応させることによっ
て１モル量の過酸化水素量のみが測定されたことを示す
。

すなわち、反応Ｃの方法をとることによってスペルミジ
ンより等モルの過酸化水素が生成し、従って過酸化水素
を定量すれば即、それが試料中のスペルミジン量となっ
ていることがわかる。

参考例３ スペルミン１００　ｎｍｏｌ代わりにプトレッンシン１
００　ｎｍｏｌ又はカダベリン１００　ｎｍｏｌを用い
て参考例１と同様の検剖を行った結果は次の通りであっ
た。

プトレッシン　カダベリン 吸光度へ　ｏ、ｏｏｏ　ｏ、ｏｏ。

吸光度Ｂ　−，０，５５４０，５５５ 吸光度Ｇ　Ｏ，５５３０，５５４ すなわちポリアミン酸化酵素はプトレッシン、カダベリ
ンを全く酸化せず、プトレッシン酸化酵素によって分解
され、等モル量の過酸化水素が生成することが示された
。

参考例４ 発色液１１．３５ｍ１！と基質（スペルミン又はスペル
ミジン又はプトレッシン又はカダベリン）の各基質１０
０　ｎｍｏｌ　（１，５０ｍｆｆ）のそれぞれに発色液
Ｉ及び０．６５Ｍ　Ｎａ０１ｌ溶液（０，１＋ｍりを添
加し、３０℃、３分間予熱後それぞれにＴ　ＯＯＳ　０
．４５■を含むプトレッシン酸化酵素４．５単位（５０
ｍ　）を添加した。３０℃で１０分間反応後５５５ｎｍ
の吸光度を測定した結果は次の通りであった。

基質の種類　吸光度 スペルミン　ｏ、ｏｏ。

スペルミジン　０．５５５ プトレッシン　０．５５３ カダベリン　０．５５６ すなわち、プトレッシン酸化酵素はスペルミンを全く基
質としないがスペルミジン、プトレッシン、カダベリン
を酸化し、それぞれ等モル量の過酸化水素を生成するこ
とが示された。

参考例５ スペルミン又はスペルミジンの１０〜１００　ｎｍｏｌ
を基質として用いて参考例１と同様の操作を行った結果
は表−１に示される。

（以下余白） すなわち、反応Ｃはスペルミン、スペルミジン各々１０
〜１００　ｎｍｏｌの範囲でスペルミン、スペルミジン
量に相当する量の過酸化水素を測定でき、非電に正確な
総ポリアミン量が測定できることが示された。

参考例６ １０ｍＭスペルミン、１０ｍＭスペルミジン、１０ｍＦ
ＩプトレップトレッシンＭカダベリンの各単独の試料、
これら４種のポリアミンを各々１：１：１：１の比で混
合した試料（混合試料Ａ）と２：２：１：１の比で混合
した試料（混合試料Ｂ）の６種類を基質としてｍ製した
。各基質（１０４）の各々に発色液１１．３５＋ｎｌ！
と蒸留水１．２０ｍ１’、カタラーゼ２０単位（０，２
−）を添加し、３０℃で３分間予熱後ポリアミン酸化酵
素０．１５単位（１０りを添加した。３０℃、１０分間
反応後０．６５Ｍ　Ｎａ０１１溶液０．１１ｎｆ！と３
（ｌｎＭアジ化ナトナトリウム０−を添加し、更にＴ　
ＯＯＳ　０．４５■を含むプトレッシン酸化酵素４．５
単位（３ｈＪ’）を添加した。３０℃で１０分間反応後
５５５ｎＩＩｌの吸光度を測定した結果は次の通りであ
った。

基質の種類　吸光度 スペルミン　０．５５５ スペルミジン　０．５５３ プトレッシン　０．５５４ カダベリン　０．５５４ 混合試料Ａ　０．５５７ 混合試料Ｂ　Ｏ，５５５ すなわち、各ポリアミンの単独液或いはいがなる混合液
に冶いても本方法が使用できることが示された。

参考例７ 発色液Ａ−ｄを下記の様に調製し、Ａ−Ｄのそれぞれ１
．３５−と基質（１，０ｍＭスペルミジン又はｌ。

１１１Ｍスペルミン）　０．　ｌＯｍｅ　、　３０＋ｎ
Ｍアジ化ナトリウム溶液０．１０−１蒸留水１．２５−
を混合し、３０’Ｃで３分間予熱した。この液にポリア
ミン酸化酵素Ａｊ−１０，１５単位（５０Ｊ）を添加し
、３０℃で１０分間反応した。反応終了後、発色液Ａ−
Ｄを用いた反応性対し、それぞれ発色液ａ　＝　ｄ　Ｏ
，０１ｍｔ’と０．６５Ｍ水酸化ナトリウム溶液０．ｌ
Ｏ＋ｎｅを添加し、５５５ｎｍの吸光度を測定した（吸
光度Ａ）。次いでこの反応液にプトレッシン酸化酵素４
．５単位（５０ｐＪりを添加し、３０℃で１０分間反応
を続け５５５ｎｎ＋の吸光度を測定した（吸光度Ｂ）。

その結果は表−２に示される。

表−２ （発色液の調製〕 発色液Ａ：４ＡＡ１．５■を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，１＞の１００ｍ１に溶解 発色液Ｂ：４ＡＡ１．５■とペルオキシダーゼ３５０単
位を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）のＬｏｏｓｅ
に溶解 Ｑ色ｉｃ　：　Ｔ　ＯＯＳ　３３．７＋ｎｇヲ０．２Ｍ
　’Ｊ　ン酸Ｈｅ液（ｐＨ７，１）の１００艷に溶解 発色液Ｄ　：　Ｔ　ＯＯ３３３，７■とペルオキシダー
ゼ３５０単位を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋７．１　
）の１００ｍ１’に熔解 発色液ａ　：　Ｔ　ＯＯＳ　４４．５＋ｎｇとペルオキ
シダーゼ３５０単位を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）の１．０ｍｌ！に溶解 発色液ｂ　：　ＴＯＯ３４４，５＋ｎｇを１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐｌ＋７．０　’）の１．０艷に溶解発色液
Ｃ：　４　ＡＡｌｏ、０■とペルオキシダーゼ３５０単
位を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）の１．０ｍｌ
！に溶解 発色液ｄ　：　４ＡＡ１０．０■を１０＋＊Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）の１．０−に溶解 表−２より明らかのようにＢとｂすなわち１３−ｂ及び
ＤとｄすなわちＤ−ｄの組み合せで反応液中のスペルミ
ン及びスペルミジン量が正確に測定できることがわかっ
た。

すなわち、スペルミジン、スペルミンをポリアミン酸化
酵素で酸化した時に生成する過酸化水素をペルオキシダ
ーゼの存在下で過酸化水素の測定に用いられる色原体の
一方のみと反応することによって消去し、ひきつづき色
原体の混合系においてプトレッシン酸化酵素を作用させ
ることによって総ポリアミン量が正確に測定できた。

参考例８ Ｔ　ＯＯＳ　３３．７■、ベルオキシダーセ　３５０単
位を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）の１００ｍに
熔解し、発色液■を調製した。この発色液１．３５−に
スペルミン１０〜１００ｎＩＩｌｏ１２スペルミジン１
０〜１００　ｒ＋ｍｏｌ。

プトレッシン１０〜１００　ｎｍｏｌ、カダベリン１０
〜１００１００ｎ、並びに参考例６と同様に調製した試
料Ａ（１０４）、試料Ｂ　（ＬＭりの各試料に蒸留水を
添加（液量：　２．７０ｍｅ）　Ｌ、３０℃、３分間予
熱した。次にポリアミン酸化酵素ＡＴ−１０，１５単位
（５ｈｊ”）を添加し、３０℃で１０分間反応した。こ
の反応液に４−アミノアンチピリン溶液（１，０■／ｍ
ｅ）　０．１ｄと０．６５Ｍ水酸化ナトリウム溶液０．
１−を添加し５５５ｎｍの吸光度を測定した（吸光度Ａ
）。

更に続いてこの反応液にプトレッシン酸化酵素４．５単
位（５０ｍ）を添加し、３０℃で１０分間反応を続けた
後５５５ｎｍの吸光度を測定した。その結果は表−３及
び表−４に示される。

（以下余白） 表−４ すなわち、ポリアミン酸化酵素ＡＴ−１がスペルミン又
はスペルミジンを酸化した時に生成された過酸化水素は
いずれもＴＯＯ３〜ペルオキシダーゼの存在下による反
応で除去され、吸光度Ｂで得られた値は各々の基質の濃
度を反映するものであった。従って試料Ａ、試料Ｂにお
いてもその総量が測定され、一段目の反応（ポリアミン
酸化酵素との反応）によって生ずる過酸化水素を除去し
、プトレッシン酸化酵素を作用させることにより容易に
総ポリアミン量を測定できることが示され−た。

こうして参考例１〜８によって明らかのように、各種ポ
リアミンを含む試料をまずポリアミン酸化酵素によって
処理し、その際生成する過酸化水素をカタラーゼ又はペ
ルオキシダーゼ及び過酸化水素と反応する色原体を添加
することによって消去し、しかるのちスペルミジン、プ
トレッシン及びカダベリンに作用し、かつスペルミジン
からプトレッシンを生成しないアミン酸化酵素を作用さ
せれば試料中の総ポリアミン量が正確に容易に測定でき
ることがわがったのである。

実施例１ スペルミン、スペルミジン、プトレッシン、カダベリン
の各１０ｍ　Ｍ溶液を２：２：１：１の比率で混合して
調製した溶液の２５度又は５０Ｊｊｆを血液５．Ｃ−に
添加し、３分間激しく攪拌後、３．ＯＯＯｒｐｍで５分
間遠心分離し上澄液を集めた（　６．２＋ｎｆｆ）。こ
の上澄液を中和しくρ１１６〜７付近〉アンバーライト
ＣＧ　−５０カラム（０，５Ｘ　１　ｃｍ）に吸着させ
た。カラムを蒸留水で水洗（３，０ｍｌり後、ｏ、ｓＭ
４酸（３，０ｍｌりでポリアミン類を溶出し、０．６７
Ｍ水酸化ナトリウム溶液（２，０ｒｒｄ！＞を添加し中
和した。

この中和液を以下の反応の試料として使用した。

発色液１．３５ｍｅに上記中和１１．５０−とカタラー
ゼ５０１１位（２５，ｕｊ’）を添加し、３０℃テ３分
間予熱後ポリアミン酸化酵素ＡＴ−１０，１５単位（２
５ｐβ）を添加し、更に１０分間加温した。次に１．３
５Ｍ水酸化すトリウム溶液（５０ｐｅ）と６０ｍＭアジ
化ナトリウム、０．４５ｍｇ　Ｔ　ＯＯＳを含むプトレ
ッシン酸化酵素４．５単位（５０ｐ１りを添加し、更に
３０”Ｃで１０分間反応した。反応液の５５５ｎｍの吸
光度は次のとおりであっ）こ。

無添加　０．０５３ ２５度添加　０．３１２ ５０４添加　０．５７５ この値より添加回収率を計算すると、２５ノに添加の場
合１００．４％、５０４添加の場合１０１．１％と非常
に良好であった。

実施例２ 尿２０−に１２Ｎ塩酸５ｒｎＩ！を添加し、１００　’
ｃ、３時間加水分解し、結合型ポリアミンをＭ離型ポリ
アミンとした。（なお加水分解中に生じた沈澱は遠心分
ＰＩ！Ｉ　（５，００Ｏｒｐｍ、５分）で除去し、次い
で上澄両分はＩＯＮ水酸化ナトリウム／８液でｐＨ６付
近に調整後蒸留水を添加し６嘱とした。）この中和液を
アンバーライトＣＧ　−５０カラム（ｌ　Ｘ　２，５ｃ
ｍ）に吸着させ、カラムは蒸留水２師、０．５Ｎ塩酸溶
液３ｒｄ２で洗浄した。次にこのカラムより　０．５Ｎ
塩酸１０−でポリアミンを溶出し、ＩＯＮ水酸化ナトリ
ウム溶液でｐｌ＋７．５付近に調整し、蒸留水で２０ｒ
ｎＥとした。この中和液を試料として実施例１の反応と
同一の操作を行った結果、その５５５ｎｍの吸光度は０
．４４５であった。この値は反応液中に８０．１　ｎｍ
ｏｌのポリアミンが存在したことを示す。すなわち尿Ｉ
ｄ中に５３．４　ｎｍｏｌのポリアミンを含むことを示
した。又、中和液を５倍濃縮し、そのＩＯＭを用いてア
ミノ酸分析計にてポリアミンの測定を行った結果（測定
法は〔アグリ力ルチャル・バイオロジカル・ケミストリ
ー（八ｇｒｉｃ、Ｂｉｏ１．ｃｈｅｍ、）第４４巻、２
４６７頁〜２４７５頁（１９８０）　）に従って行った
。）尿中１　ｍｅ中に５２．７　ｒ＋ｍｏｌのポリアミ
ンを含むことが示され、本方法が化学的分析法と非常に
よく相関することが示された。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 各種ポリアミン含有試料をポリアミン酸化酵素で処理し
   、試料中のスペルミンをスペルミジンおよび／又はプト
   レッシンに変換せしめるとともにその際生成する過酸化
   水素を消去した後、更にスペルミジン、プトレッシン及
   びカダベリンに作用する酸化酵素を添加し、反応させ、
   生成する過酸化水素を定量することによって試料中のポ
   リアミン量をめることを特徴とする総ポリアミン量の測
   定法。