JPH05340945A - 微量物質測定方法及び測定キット - Google Patents
微量物質測定方法及び測定キットInfo
- Publication number
- JPH05340945A JPH05340945A JP17165892A JP17165892A JPH05340945A JP H05340945 A JPH05340945 A JP H05340945A JP 17165892 A JP17165892 A JP 17165892A JP 17165892 A JP17165892 A JP 17165892A JP H05340945 A JPH05340945 A JP H05340945A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substance
- measured
- binding
- measuring
- solid phase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims abstract description 30
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 71
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 64
- OMOVVBIIQSXZSZ-UHFFFAOYSA-N [6-(4-acetyloxy-5,9a-dimethyl-2,7-dioxo-4,5a,6,9-tetrahydro-3h-pyrano[3,4-b]oxepin-5-yl)-5-formyloxy-3-(furan-3-yl)-3a-methyl-7-methylidene-1a,2,3,4,5,6-hexahydroindeno[1,7a-b]oxiren-4-yl] 2-hydroxy-3-methylpentanoate Chemical compound CC12C(OC(=O)C(O)C(C)CC)C(OC=O)C(C3(C)C(CC(=O)OC4(C)COC(=O)CC43)OC(C)=O)C(=C)C32OC3CC1C=1C=COC=1 OMOVVBIIQSXZSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 20
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 20
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 16
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 8
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 8
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 5
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPOBTYJRKAJERX-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-n-[(3-ethyl-1,3-benzothiazol-2-ylidene)amino]-1,3-benzothiazol-2-imine Chemical compound S1C2=CC=CC=C2N(CC)C1=NN=C1SC2=CC=CC=C2N1CC CPOBTYJRKAJERX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 結合物質Ａ（１４）を固相（１０，１２）に
固定化する固定化工程と、前記結合物質Ａ（１４）に特
異的に結合する被測定物質Ｂ（１６）を結合させる結合
工程と、前記被測定物質Ｂ（１６）を測定する測定工程
と、を備えたことを特徴とする微量物質測定方法及びそ
のキット。 【効果】 本発明に係る微量物質分析方法によれば、物
質間の特異的相互作用を利用して微量成分の分析を行う
こととしたので、微量物質を複雑な精製工程等を得るこ
となく正確に測定することが可能となる。
固定化する固定化工程と、前記結合物質Ａ（１４）に特
異的に結合する被測定物質Ｂ（１６）を結合させる結合
工程と、前記被測定物質Ｂ（１６）を測定する測定工程
と、を備えたことを特徴とする微量物質測定方法及びそ
のキット。 【効果】 本発明に係る微量物質分析方法によれば、物
質間の特異的相互作用を利用して微量成分の分析を行う
こととしたので、微量物質を複雑な精製工程等を得るこ
となく正確に測定することが可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は微量物質分析方法及び測
定キット、特に抗原−抗体反応等を利用した測定機構の
改良に関する。
定キット、特に抗原−抗体反応等を利用した測定機構の
改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、バイオテクノロジーの長足な進歩
に伴い、生体内の各種微量生理活性物質の測定或いは機
能解明が極めて重要視されている。ところで、一般に生
体内の各種微量活性物質は精製が難しく、多くのステッ
プを経て精製する方法及びアフィニティークロマトグラ
フィー等による精製方法が用いられてきた。
に伴い、生体内の各種微量生理活性物質の測定或いは機
能解明が極めて重要視されている。ところで、一般に生
体内の各種微量活性物質は精製が難しく、多くのステッ
プを経て精製する方法及びアフィニティークロマトグラ
フィー等による精製方法が用いられてきた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の生理活性物質は、精製操作中に用いられる各種高濃度
の試薬或いは処理によって変性を受けることが知られて
いる。そして、一般にこれらの僅かに変性を受けた精製
品を用いて研究が行われているが、勿論これらの変性品
が未変性品と同様な生理活性を生体内で示すか否か不明
である。そこで、生体内の各種微量生理活性物質を、変
性を避けて純化し、その生理活性を生体内における存在
状態が反映された条件下で試験を行い、該生理活性を明
らかとする手法の重要性が指摘され、その必要性が高ま
っている。
の生理活性物質は、精製操作中に用いられる各種高濃度
の試薬或いは処理によって変性を受けることが知られて
いる。そして、一般にこれらの僅かに変性を受けた精製
品を用いて研究が行われているが、勿論これらの変性品
が未変性品と同様な生理活性を生体内で示すか否か不明
である。そこで、生体内の各種微量生理活性物質を、変
性を避けて純化し、その生理活性を生体内における存在
状態が反映された条件下で試験を行い、該生理活性を明
らかとする手法の重要性が指摘され、その必要性が高ま
っている。
【０００４】例えば、ヒトIV型コラーゲン標品に対して
凍結保存血清を共存させると、添加血清濃度に比例して
ＥＬＩＳＡ反応の抑制が認められる。これは血清中のフ
ィブロネクチンが凍結により構造変化を受け、IV型コラ
ーゲンと結合反応を生じることによると考えられるが、
フィブロネクチンの未変性体、変性体を分離・識別・測
定することは、たとえ抗原−抗体反応を用いても極めて
困難である。すなわち、フィブロネクチンの変性体、未
変性体の分離自体が困難であり、それぞれを個別に認識
する抗体を得ることはさらに困難であることによる。本
発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、
その目的は各種微量物質を変性させることなく純化する
微量物質測定方法及び測定キットを提供することにあ
る。
凍結保存血清を共存させると、添加血清濃度に比例して
ＥＬＩＳＡ反応の抑制が認められる。これは血清中のフ
ィブロネクチンが凍結により構造変化を受け、IV型コラ
ーゲンと結合反応を生じることによると考えられるが、
フィブロネクチンの未変性体、変性体を分離・識別・測
定することは、たとえ抗原−抗体反応を用いても極めて
困難である。すなわち、フィブロネクチンの変性体、未
変性体の分離自体が困難であり、それぞれを個別に認識
する抗体を得ることはさらに困難であることによる。本
発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、
その目的は各種微量物質を変性させることなく純化する
微量物質測定方法及び測定キットを提供することにあ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に本発明者らが鋭意検討した結果、特異抗体を固定化し
た固相を用いて不純物を含む試料より微量物質を純化
し、この純化した物質と特異的に相互作用する結合物質
を用いることにより、前記微量物質の解析、定量を行い
得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、請求項１記載の微量物質測定方法は、結合物質Ａを
固相に固定化する固定化工程と、前記結合物質Ａに特異
的に結合する被測定物質Ｂを結合させる結合工程と、前
記被測定物質Ｂを測定する測定工程と、を備えたことを
特徴とする。
に本発明者らが鋭意検討した結果、特異抗体を固定化し
た固相を用いて不純物を含む試料より微量物質を純化
し、この純化した物質と特異的に相互作用する結合物質
を用いることにより、前記微量物質の解析、定量を行い
得ることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわ
ち、請求項１記載の微量物質測定方法は、結合物質Ａを
固相に固定化する固定化工程と、前記結合物質Ａに特異
的に結合する被測定物質Ｂを結合させる結合工程と、前
記被測定物質Ｂを測定する測定工程と、を備えたことを
特徴とする。
【０００６】ここで、結合物質Ａは、該結合物質Ａに対
する抗体を用いて固相に固定されていることが好適であ
る。請求項３記載の微量物質測定方法は、結合物質Ａを
固相に固定化する固定化工程と、前記結合物質Ａと特異
的に反応する被測定物質Ｂ1及び前記結合物質Ａと反応
しない疑似被測定物質Ｂ2が混在する被測定液を前記固
相と反応させる結合工程と、前記結合物質Ａと結合した
被測定物質Ｂ1を、前記被測定物質Ｂ1及び疑似被測定物
質Ｂ2を共に測定可能な方法により測定する測定工程
と、を備え、被測定液中の被測定物質Ｂ1を特異的に測
定することを特徴とする。
する抗体を用いて固相に固定されていることが好適であ
る。請求項３記載の微量物質測定方法は、結合物質Ａを
固相に固定化する固定化工程と、前記結合物質Ａと特異
的に反応する被測定物質Ｂ1及び前記結合物質Ａと反応
しない疑似被測定物質Ｂ2が混在する被測定液を前記固
相と反応させる結合工程と、前記結合物質Ａと結合した
被測定物質Ｂ1を、前記被測定物質Ｂ1及び疑似被測定物
質Ｂ2を共に測定可能な方法により測定する測定工程
と、を備え、被測定液中の被測定物質Ｂ1を特異的に測
定することを特徴とする。
【０００７】ここで、被測定物質Ｂ1及び疑似被測定物
質Ｂ2と共に測定する測定工程は、該被測定物質Ｂ1及び
疑似測定物Ｂ2を共に認識する酵素標識抗体と反応さ
せ、その酵素活性を測定するものであることが好適であ
る。請求項５記載の微量物質測定方法は、被測定物質Ｂ
を固相に固定化する固定化工程と、前記被測定物質Ｂに
特異的に結合する結合物質Ａを結合させる結合工程と、
前記結合物質Ａを測定する測定工程と、を備えたことを
特徴とする。ここで、被測定物質Ｂは、該被測定物質Ｂ
に対する抗体を用いて固相に固定されることを特徴とす
る。
質Ｂ2と共に測定する測定工程は、該被測定物質Ｂ1及び
疑似測定物Ｂ2を共に認識する酵素標識抗体と反応さ
せ、その酵素活性を測定するものであることが好適であ
る。請求項５記載の微量物質測定方法は、被測定物質Ｂ
を固相に固定化する固定化工程と、前記被測定物質Ｂに
特異的に結合する結合物質Ａを結合させる結合工程と、
前記結合物質Ａを測定する測定工程と、を備えたことを
特徴とする。ここで、被測定物質Ｂは、該被測定物質Ｂ
に対する抗体を用いて固相に固定されることを特徴とす
る。
【０００８】請求項７記載の微量物質測定方法は、被測
定液中の被測定物質Ｂ1及び疑似被測定物質Ｂ2を固相に
固定化する固定化工程と、前記被測定物質Ｂ1と特異的
に反応する結合物質Ａを前記固相と反応させる結合工程
と、前記被測定物質Ｂ1と結合した結合物質Ａを測定す
る測定工程と、を備え、被測定液中の被測定物質Ｂ1を
特異的に測定することを特徴とする。ここで、被測定物
質Ｂ1及び疑似被測定物質Ｂ2を共に固定化する固定化工
程は、該被測定物質Ｂ1及び疑似測定物Ｂ2を共に認識す
る固定化抗体と反応させるものであることを特徴とす
る。
定液中の被測定物質Ｂ1及び疑似被測定物質Ｂ2を固相に
固定化する固定化工程と、前記被測定物質Ｂ1と特異的
に反応する結合物質Ａを前記固相と反応させる結合工程
と、前記被測定物質Ｂ1と結合した結合物質Ａを測定す
る測定工程と、を備え、被測定液中の被測定物質Ｂ1を
特異的に測定することを特徴とする。ここで、被測定物
質Ｂ1及び疑似被測定物質Ｂ2を共に固定化する固定化工
程は、該被測定物質Ｂ1及び疑似測定物Ｂ2を共に認識す
る固定化抗体と反応させるものであることを特徴とす
る。
【０００９】請求項９記載の微量物質測定キットは、結
合物質Ａが固定化される固相と、前記結合物質Ａに特異
的に結合する被測定物質Ｂを測定する測定試薬と、を備
えたことを特徴とする。請求項１０記載の微量物質測定
キットは、被測定物質Ｂを固定化する固相と、前記被測
定物質Ｂに特異的に結合された結合物質Ａを測定する測
定試薬と、を備えたことを特徴とする。以下、本発明の
構成を詳述する。本発明に係る測定方法において、使用
する抗体としては、モノクローナル抗体及び／又はポリ
クローナル抗体であり、抗原認識部位及び抗原の種差の
認識に関する情報の明らかな抗体を用いることが好適で
ある。
合物質Ａが固定化される固相と、前記結合物質Ａに特異
的に結合する被測定物質Ｂを測定する測定試薬と、を備
えたことを特徴とする。請求項１０記載の微量物質測定
キットは、被測定物質Ｂを固定化する固相と、前記被測
定物質Ｂに特異的に結合された結合物質Ａを測定する測
定試薬と、を備えたことを特徴とする。以下、本発明の
構成を詳述する。本発明に係る測定方法において、使用
する抗体としては、モノクローナル抗体及び／又はポリ
クローナル抗体であり、抗原認識部位及び抗原の種差の
認識に関する情報の明らかな抗体を用いることが好適で
ある。
【００１０】又、抗体は好ましくは精製抗体を用いる。
本発明に係る分析方法では抗体アフィニティークロマト
におけるような、変性剤による溶出操作を実施すること
なく、次の試験を実施することが可能であるため、リガ
ンド（例えば抗原物質）を変性させることなくその特性
を評価することが出来る。本発明に係る測定方法におい
て、反応するリガンドとしては蛋白質、ペプチド、糖蛋
白質、核酸等が好適である。
本発明に係る分析方法では抗体アフィニティークロマト
におけるような、変性剤による溶出操作を実施すること
なく、次の試験を実施することが可能であるため、リガ
ンド（例えば抗原物質）を変性させることなくその特性
を評価することが出来る。本発明に係る測定方法におい
て、反応するリガンドとしては蛋白質、ペプチド、糖蛋
白質、核酸等が好適である。
【００１１】本発明に係る測定方法において、リガンド
と特異的に相互作用するものとしては、各種リセプータ
ーを介してリガンドと結合する各種細胞、リガンドを特
異的に認識・結合する抗体以外の蛋白質（レクチンを含
む）、リガンドを特異的に認識する病気との関連で生体
内に産生された抗体、リガンドと特異的に結合する糖、
ペプチド、核酸及び脂質、及びハプテンを介する結合を
利用した蛋白質、合成高分子化合物、合成低分子化合物
であることが好適である。尚、本測定方法により、生体
高分子と細胞及び生体高分子間の特異的相互作用の解
析、定量及び病的に産生された抗体の解析、定量、精製
が困難な物質に関しても可能となる。
と特異的に相互作用するものとしては、各種リセプータ
ーを介してリガンドと結合する各種細胞、リガンドを特
異的に認識・結合する抗体以外の蛋白質（レクチンを含
む）、リガンドを特異的に認識する病気との関連で生体
内に産生された抗体、リガンドと特異的に結合する糖、
ペプチド、核酸及び脂質、及びハプテンを介する結合を
利用した蛋白質、合成高分子化合物、合成低分子化合物
であることが好適である。尚、本測定方法により、生体
高分子と細胞及び生体高分子間の特異的相互作用の解
析、定量及び病的に産生された抗体の解析、定量、精製
が困難な物質に関しても可能となる。
【００１２】又、本発明に係る測定方法において、リガ
ンドを認識するものとして各種細胞を用いる場合には、
抗体を固定化する固相として細胞培養用のフラスコ、シ
ャーレ、皿等の培養器及び培養液内で浮遊する粒子を用
いることが好適である。更に、本発明に係る測定方法に
おいて、捕捉抗原を特異的に認識して結合したものを定
性、定量する方法としては、抗体等の結合物を特異的に
認識するもので酵素標識を付与することが好適である。
ンドを認識するものとして各種細胞を用いる場合には、
抗体を固定化する固相として細胞培養用のフラスコ、シ
ャーレ、皿等の培養器及び培養液内で浮遊する粒子を用
いることが好適である。更に、本発明に係る測定方法に
おいて、捕捉抗原を特異的に認識して結合したものを定
性、定量する方法としては、抗体等の結合物を特異的に
認識するもので酵素標識を付与することが好適である。
【００１３】
【実施例】以下、図面に基づき本発明の好適な実施例を
説明する。尚、本発明は以下の実施例によって限定され
るものではない。実施例１ まず、図１に従い本発明の第一実施例に係る測定方法に
ついて概念について説明する。即ち、図１（Ａ）に示す
ようにウエル壁（固相）１０に抗体１２を結合させる。
この抗体１２に対し、一定量の結合物質１４を結合さ
せ、更に結合物質１４に特異的に結合する被測定物質１
６を結合させる（図１（Ｂ））。そして、被測定物質１
６を特異的に認識する酵素標識抗体１８を結合させ（図
１（Ｃ））、酵素活性部位により化学反応を進行させ、
その化学発光量より被測定物質１６の量を測定する方法
である（図１（Ｄ））。
説明する。尚、本発明は以下の実施例によって限定され
るものではない。実施例１ まず、図１に従い本発明の第一実施例に係る測定方法に
ついて概念について説明する。即ち、図１（Ａ）に示す
ようにウエル壁（固相）１０に抗体１２を結合させる。
この抗体１２に対し、一定量の結合物質１４を結合さ
せ、更に結合物質１４に特異的に結合する被測定物質１
６を結合させる（図１（Ｂ））。そして、被測定物質１
６を特異的に認識する酵素標識抗体１８を結合させ（図
１（Ｃ））、酵素活性部位により化学反応を進行させ、
その化学発光量より被測定物質１６の量を測定する方法
である（図１（Ｄ））。
【００１４】従って、被測定物質１６の変性体（疑似被
測定物質）２０が被測定物質１６と共存し、該変性体２
０も酵素標識抗体１８と結合反応を生起してしまう場合
であっても、結合物質１４を認識する被測定物質１６の
みを特異的に測定することが出来る。又、本実施例に係
る測定方法の場合、結合物質１４に対するポリクローナ
ル抗体ないしモノクローナル抗体１２により、該結合物
質１４を固相に固定しているので、被測定物質１６に対
する抗体は酵素標識抗体１８として用いる一種のみで足
り、一般的なサンドイッチ法のように一の被測定物質１
６に対し二種類の抗体が要求されることはない。
測定物質）２０が被測定物質１６と共存し、該変性体２
０も酵素標識抗体１８と結合反応を生起してしまう場合
であっても、結合物質１４を認識する被測定物質１６の
みを特異的に測定することが出来る。又、本実施例に係
る測定方法の場合、結合物質１４に対するポリクローナ
ル抗体ないしモノクローナル抗体１２により、該結合物
質１４を固相に固定しているので、被測定物質１６に対
する抗体は酵素標識抗体１８として用いる一種のみで足
り、一般的なサンドイッチ法のように一の被測定物質１
６に対し二種類の抗体が要求されることはない。
【００１５】更に、結合物質１４を抗体１２に結合させ
る際に、該結合物質１４と共に混在物質２２が存在する
場合にも、該混在物質２２は抗体１２に結合されないた
め、結合物質１４を単離する必要もない。以上のように
本実施例に係る測定方法によれば、結合物質１４ないし
被測定物質１６を単離・精製することなく、被測定物質
１６の測定を行うことが可能となり、結合物質１４との
間で生理活性を有する被測定物質１６のみを、その変性
を避けつつ正確に測定することが可能となる。
る際に、該結合物質１４と共に混在物質２２が存在する
場合にも、該混在物質２２は抗体１２に結合されないた
め、結合物質１４を単離する必要もない。以上のように
本実施例に係る測定方法によれば、結合物質１４ないし
被測定物質１６を単離・精製することなく、被測定物質
１６の測定を行うことが可能となり、結合物質１４との
間で生理活性を有する被測定物質１６のみを、その変性
を避けつつ正確に測定することが可能となる。
【００１６】次に本実施例に係る測定法の具体例を、IV
型コラーゲンと結合反応を生起するフィブロネクチン変
性体を被測定物質として測定する例に基づき説明する。 （ａ）固相担体としてポリスチレン性マイクロプレート
（Flow Laboratories製）の作成 特開昭６３−７８０６７及び特開昭６３−２４６３９６
に記載されたIV型コラーゲンに対するモノクローナル抗
体（ＪＫ１９９）をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．
４）に溶解し、その濃度を１４．５μg/mlに調整した。
この抗体溶液を、固相担体としてのポリスチレン性マイ
クロプレートにコートするために、１ウェル当たり１０
０μl添加し、３７℃、２４時間処理後、ブロックエー
ス（大日本製薬）をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．
４）で１／４希釈したブロッキング緩衝液を１ウェル当
たり３５０μｌ添加し、３７℃、１時間処理してブロッ
キングし、よく水を切ったのちに凍結保存する。使用時
に予め室温に戻してアッセイに使用する（図１
（Ａ））。
型コラーゲンと結合反応を生起するフィブロネクチン変
性体を被測定物質として測定する例に基づき説明する。 （ａ）固相担体としてポリスチレン性マイクロプレート
（Flow Laboratories製）の作成 特開昭６３−７８０６７及び特開昭６３−２４６３９６
に記載されたIV型コラーゲンに対するモノクローナル抗
体（ＪＫ１９９）をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．
４）に溶解し、その濃度を１４．５μg/mlに調整した。
この抗体溶液を、固相担体としてのポリスチレン性マイ
クロプレートにコートするために、１ウェル当たり１０
０μl添加し、３７℃、２４時間処理後、ブロックエー
ス（大日本製薬）をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．
４）で１／４希釈したブロッキング緩衝液を１ウェル当
たり３５０μｌ添加し、３７℃、１時間処理してブロッ
キングし、よく水を切ったのちに凍結保存する。使用時
に予め室温に戻してアッセイに使用する（図１
（Ａ））。
【００１７】（ｂ）IV型コラーゲン特異結合プレートの
作成 抗体結合プレートにブロッキング緩衝液で希釈したIV型
コラーゲン（１２５ng/ml）溶液を１ウェル当たり１０
０μｌ添加し、３７℃、１．５時間反応させて結合させ
る（図１（Ｂ））。反応後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．
４））でよく洗浄する。 （ｃ）フィブロネクチンの特異的結合反応 凍結保存血清及び凍結保存ＥＤＴＡ血漿を洗浄緩衝液と
ブロックエースを９：１に混和した溶液で各種濃度に希
釈した。この希釈液を１ウェル当たり１００μｌ添加
し、３７℃、３時間反応させて、前記IV型コラーゲンと
特異的に反応するフィブロネクチンを結合させる（図１
（Ｃ））。反応後、洗浄緩衝液をよく洗浄する。
作成 抗体結合プレートにブロッキング緩衝液で希釈したIV型
コラーゲン（１２５ng/ml）溶液を１ウェル当たり１０
０μｌ添加し、３７℃、１．５時間反応させて結合させ
る（図１（Ｂ））。反応後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．
４））でよく洗浄する。 （ｃ）フィブロネクチンの特異的結合反応 凍結保存血清及び凍結保存ＥＤＴＡ血漿を洗浄緩衝液と
ブロックエースを９：１に混和した溶液で各種濃度に希
釈した。この希釈液を１ウェル当たり１００μｌ添加
し、３７℃、３時間反応させて、前記IV型コラーゲンと
特異的に反応するフィブロネクチンを結合させる（図１
（Ｃ））。反応後、洗浄緩衝液をよく洗浄する。
【００１８】（ｄ）結合フィブロネクチンの検出 結合したフィブロネクチンは、次のようにして検出し
た。すなわち、Cappel社製の西洋わさび由来ペルオキシ
ダーゼ結合抗ヒトフィブロネクチンポリクローナル抗体
を、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸
緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４））とブロックエースを
９：１に混和した溶液で、７５０倍希釈し、該希釈溶液
を１ウェル当たり１００μｌ添加し、３７℃、１時間反
応させて特異的に反応したフィブロネクチンに結合させ
る。反応後、洗浄緩衝液で良く洗浄する。
た。すなわち、Cappel社製の西洋わさび由来ペルオキシ
ダーゼ結合抗ヒトフィブロネクチンポリクローナル抗体
を、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸
緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４））とブロックエースを
９：１に混和した溶液で、７５０倍希釈し、該希釈溶液
を１ウェル当たり１００μｌ添加し、３７℃、１時間反
応させて特異的に反応したフィブロネクチンに結合させ
る。反応後、洗浄緩衝液で良く洗浄する。
【００１９】次に2,2'-azino-di[3-ethyl-benzthiazoli
ne]sulfonate（ＡＢＴＳ）を基質とするペルオキシダー
ゼ基質システム（Kirregaard & Perry Laboratories）
を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で１時間発色
反応後、マイクロプレートリーダーで波長４０５ｎｍの
吸光度を測定し、盲検と試料の吸光度の差を求める（図
１（Ｄ））。尚、図２にヒト凍結保存血清、ヘパリン血
漿、クエン酸血漿及び凍結保存ＥＤＴＡ血漿中のIV型コ
ラーゲンに特異的に結合するフィブロネクチン量に関し
て検討した結果を示す。同図より明らかなように、ヒト
凍結保存ＥＤＴＡ血漿と比較して、凍結保存血清中のフ
ィブロネクチンが著しい結合性を示した。この結果、IV
型コラーゲン非結合プレートを用いた実験より、この結
合反応はIV型コラーゲンに特異的結合反応であることが
明らかとなった。
ne]sulfonate（ＡＢＴＳ）を基質とするペルオキシダー
ゼ基質システム（Kirregaard & Perry Laboratories）
を１ウェル当たり１００μｌ添加し、室温で１時間発色
反応後、マイクロプレートリーダーで波長４０５ｎｍの
吸光度を測定し、盲検と試料の吸光度の差を求める（図
１（Ｄ））。尚、図２にヒト凍結保存血清、ヘパリン血
漿、クエン酸血漿及び凍結保存ＥＤＴＡ血漿中のIV型コ
ラーゲンに特異的に結合するフィブロネクチン量に関し
て検討した結果を示す。同図より明らかなように、ヒト
凍結保存ＥＤＴＡ血漿と比較して、凍結保存血清中のフ
ィブロネクチンが著しい結合性を示した。この結果、IV
型コラーゲン非結合プレートを用いた実験より、この結
合反応はIV型コラーゲンに特異的結合反応であることが
明らかとなった。
【００２０】実施例２ 次に、本発明の第２実施例について説明する。図３は、
本実施例に係る測定法の概念の説明図であり、前記図１
と対応する部分には同一符合を付して説明を省略する。
本実施例においては、まず同図（Ａ）に示すように、ウ
ェル壁１０に被測定物質１６に対する抗体１２を結合さ
せる。そして、被測定物質１６を反応させると同図
（Ｂ）に示すように被測定物質１６が抗体１２と結合し
固定化される。この状態で結合物質１４を反応させる
と、同図（Ｃ）に示すように被測定物質１６と結合物質
１４が反応し、更に結合物質１４に対する酵素標識抗体
１８を作用させることにより、同図（Ｄ）に示すような
ウェル壁１０−抗体１２−被測定物質１６−結合物質１
４−酵素標識抗体１８の結合構造が完成し、酵素標識抗
体１８の酵素活性を測定することにより、被測定物質１
６の測定を行うことが出来る。
本実施例に係る測定法の概念の説明図であり、前記図１
と対応する部分には同一符合を付して説明を省略する。
本実施例においては、まず同図（Ａ）に示すように、ウ
ェル壁１０に被測定物質１６に対する抗体１２を結合さ
せる。そして、被測定物質１６を反応させると同図
（Ｂ）に示すように被測定物質１６が抗体１２と結合し
固定化される。この状態で結合物質１４を反応させる
と、同図（Ｃ）に示すように被測定物質１６と結合物質
１４が反応し、更に結合物質１４に対する酵素標識抗体
１８を作用させることにより、同図（Ｄ）に示すような
ウェル壁１０−抗体１２−被測定物質１６−結合物質１
４−酵素標識抗体１８の結合構造が完成し、酵素標識抗
体１８の酵素活性を測定することにより、被測定物質１
６の測定を行うことが出来る。
【００２１】一方、被測定物質１６と同様の抗原−抗体
反応を示す変性体２０が存在した場合、同図（Ｂ）に示
すように変性体２０も抗体１２に捕捉されるが、該変性
体２０には結合物質１４が結合せず、この結果酵素標識
抗体１８が結合しないため、酵素活性は被測定物質１６
のみを特異的に示すこととなり、その変性体２０は測定
対象とはならない。次に、第二実施例に係る測定法の具
体例について説明する。
反応を示す変性体２０が存在した場合、同図（Ｂ）に示
すように変性体２０も抗体１２に捕捉されるが、該変性
体２０には結合物質１４が結合せず、この結果酵素標識
抗体１８が結合しないため、酵素活性は被測定物質１６
のみを特異的に示すこととなり、その変性体２０は測定
対象とはならない。次に、第二実施例に係る測定法の具
体例について説明する。
【００２２】（ａ）ビオチン標識モノクローナル抗体の
調整 特開昭６３−７８０６７及び特開昭６３−２４６３９６
に記載されたIV型コラーゲンに対するモノクローナル抗
体を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に１ｍｇ／ｍｌに
なるように溶解させた。この溶液１ｍｌに対してＮ−ヒ
ドロキシサクシイミドビオチンを１ｍｇ／ｍｌの濃度と
なるようにジメチルスルオキサイドに溶解させた溶液を
０．０６ｍｌ加え、攪拌しながら室温で４時間反応させ
た。反応液をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）に対
して充分に透析後、冷蔵又は凍結保存した。
調整 特開昭６３−７８０６７及び特開昭６３−２４６３９６
に記載されたIV型コラーゲンに対するモノクローナル抗
体を０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液に１ｍｇ／ｍｌに
なるように溶解させた。この溶液１ｍｌに対してＮ−ヒ
ドロキシサクシイミドビオチンを１ｍｇ／ｍｌの濃度と
なるようにジメチルスルオキサイドに溶解させた溶液を
０．０６ｍｌ加え、攪拌しながら室温で４時間反応させ
た。反応液をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）に対
して充分に透析後、冷蔵又は凍結保存した。
【００２３】（ｂ）ビオチン化抗体−アビジンＰＯＤ複
合体の調整法 前記（ａ）で調整したビオチン化抗体（０．２ｍｇ）に
アビジンＰＯＤ（２ｍｇ Vector Laboratories）を加
え、３７℃で１時間反応させる。反応液を遠心分離後、
上清をセファロース６Ｂカラム（直径１．５cm×長さ３
０cm 溶出液：０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．
０）にかけ、ビオチン化抗体−アビジンＰＯＤ複合体を
得た。 （ｃ）固相担体としてポリスチレン製マイクロプレート
（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）の作製 Ｃａｐｐｅｌ社製の抗ヒトフィブロネクチンポリクロー
ナル抗体をコーティング緩衝液（炭酸緩衝液）（ｐＨ
９．６）に溶解し、その濃度を１０μｇ／ｍｌに調製し
た。この抗体溶液を固相担体としてのポリスチレン製マ
イクロプレートにコートするために１ウェル当たり１０
０μｌ添加し、４℃、２４時間処理後、ブロックエース
（大日本製薬）をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）
で１／４希釈したブッキング緩衝液を１ウェル当たり３
５０μｌ添加し、３７℃、１時間処理してブロッキング
し、よく水を切った後に凍結保存する。使用時に予め室
温に戻してアッセイに使用する（図３（Ａ））。
合体の調整法 前記（ａ）で調整したビオチン化抗体（０．２ｍｇ）に
アビジンＰＯＤ（２ｍｇ Vector Laboratories）を加
え、３７℃で１時間反応させる。反応液を遠心分離後、
上清をセファロース６Ｂカラム（直径１．５cm×長さ３
０cm 溶出液：０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．
０）にかけ、ビオチン化抗体−アビジンＰＯＤ複合体を
得た。 （ｃ）固相担体としてポリスチレン製マイクロプレート
（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）の作製 Ｃａｐｐｅｌ社製の抗ヒトフィブロネクチンポリクロー
ナル抗体をコーティング緩衝液（炭酸緩衝液）（ｐＨ
９．６）に溶解し、その濃度を１０μｇ／ｍｌに調製し
た。この抗体溶液を固相担体としてのポリスチレン製マ
イクロプレートにコートするために１ウェル当たり１０
０μｌ添加し、４℃、２４時間処理後、ブロックエース
（大日本製薬）をリン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４）
で１／４希釈したブッキング緩衝液を１ウェル当たり３
５０μｌ添加し、３７℃、１時間処理してブロッキング
し、よく水を切った後に凍結保存する。使用時に予め室
温に戻してアッセイに使用する（図３（Ａ））。
【００２４】（ｄ）フィブロネクチンの特異的結合反応 凍結保存血清及び凍結保存ＥＤＴＡ血漿を、洗浄緩衝液
とブロックエースを９：１に混和した溶液で、各種濃度
に希釈した。この希釈液を１ウェル当たり１００μｌ添
加し、３７℃、３時間反応させて特異的に反応するフィ
ブロネクチンを結合させる（図３（ｃ））。反応後、洗
浄緩衝液で良く洗浄する。 （ｅ）IV型コラーゲン特異的結合 各プレートにブロッキング緩衝液で希釈したIV型コラー
ゲン（１．０ｍｇ／ｍｌ）溶液を１ウェル当たり１００
μｌ添加し、３７℃、１．５時間反応させて結合させる
（図３（Ｂ））。反応後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４））
で良く洗浄する。
とブロックエースを９：１に混和した溶液で、各種濃度
に希釈した。この希釈液を１ウェル当たり１００μｌ添
加し、３７℃、３時間反応させて特異的に反応するフィ
ブロネクチンを結合させる（図３（ｃ））。反応後、洗
浄緩衝液で良く洗浄する。 （ｅ）IV型コラーゲン特異的結合 各プレートにブロッキング緩衝液で希釈したIV型コラー
ゲン（１．０ｍｇ／ｍｌ）溶液を１ウェル当たり１００
μｌ添加し、３７℃、１．５時間反応させて結合させる
（図３（Ｂ））。反応後、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４））
で良く洗浄する。
【００２５】（ｆ）結合IV型コラーゲンの検出 フィブロネクチンと特異的に結合したIV型コラーゲンの
定量は、特開昭６３−７８０６７及び特開昭６３−２４
６３９６に記載されたIV型コラーゲンに対するモノクロ
ーナル抗体（ＪＫ１９９）を用いて行った。即ち、ビオ
チン化ＪＫ１９９抗体−アビジンＰＯＤ複合体を０．５
μg/ml濃度となるように、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４））
とブロックエースの９：１混和液で希釈し、その希釈液
の０．５μｌ／ｍｌの溶液を１ウェル当たり１００μｌ
添加し、３７℃、１時間反応させてフィブロネクチンに
特異的に反応・結合したコラーゲンに結合させる（図３
（Ｄ））。反応後、洗浄緩衝液で良く洗浄する。
定量は、特開昭６３−７８０６７及び特開昭６３−２４
６３９６に記載されたIV型コラーゲンに対するモノクロ
ーナル抗体（ＪＫ１９９）を用いて行った。即ち、ビオ
チン化ＪＫ１９９抗体−アビジンＰＯＤ複合体を０．５
μg/ml濃度となるように、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗ
ｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．４））
とブロックエースの９：１混和液で希釈し、その希釈液
の０．５μｌ／ｍｌの溶液を１ウェル当たり１００μｌ
添加し、３７℃、１時間反応させてフィブロネクチンに
特異的に反応・結合したコラーゲンに結合させる（図３
（Ｄ））。反応後、洗浄緩衝液で良く洗浄する。
【００２６】次に、2,2'-azino-di[3-ethyl-benzthiazo
line] sulfonate（ＡＢＴＳ）を基質とするペルオキシ
ダーゼ基質システム（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅ
ｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１ウェル当たり
１００μｌ添加し、室温で１時間発色反応後、マイクロ
プレートリーダーで波長４０５ｎｍの吸光度を測定し、
盲検と試料の吸光度の差を求める（図３（Ｄ））。尚、
図４にヒト凍結保存血清、ヘパリン血漿、クエン酸血漿
及び凍結保存ＥＤＴＡ血漿中のIV型コラーゲンに特異的
に結合するフィブロネクチン量に関して検討した結果を
示した。
line] sulfonate（ＡＢＴＳ）を基質とするペルオキシ
ダーゼ基質システム（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅ
ｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１ウェル当たり
１００μｌ添加し、室温で１時間発色反応後、マイクロ
プレートリーダーで波長４０５ｎｍの吸光度を測定し、
盲検と試料の吸光度の差を求める（図３（Ｄ））。尚、
図４にヒト凍結保存血清、ヘパリン血漿、クエン酸血漿
及び凍結保存ＥＤＴＡ血漿中のIV型コラーゲンに特異的
に結合するフィブロネクチン量に関して検討した結果を
示した。
【００２７】同図より明らかなように、ヒト凍結保存Ｅ
ＤＴＡ血漿と比較して、凍結保存血清中のフィブロネク
チンが著しい結合性を示した。尚、以上の実施例におい
ては被測定物質をフィブロネクチンとした例について説
明したが、本発明は特に生体内の微量生理活性物質の測
定に好適であり、例えば抗原物質と特異的に相互作用す
るものが細胞である場合には、結合細胞数を、例えば試
薬を該細胞内に導入する等して細胞機能を利用した発色
反応を起こさせることにより定量することも可能であ
る。
ＤＴＡ血漿と比較して、凍結保存血清中のフィブロネク
チンが著しい結合性を示した。尚、以上の実施例におい
ては被測定物質をフィブロネクチンとした例について説
明したが、本発明は特に生体内の微量生理活性物質の測
定に好適であり、例えば抗原物質と特異的に相互作用す
るものが細胞である場合には、結合細胞数を、例えば試
薬を該細胞内に導入する等して細胞機能を利用した発色
反応を起こさせることにより定量することも可能であ
る。
【００２８】
【発明の効果】以上説明したように本発明に係る微量物
質分析方法によれば、物質間の特異的相互作用を利用し
て微量成分の分析を行うこととしたので、微量活性物質
を複雑な精製工程等を得ることなく正確に測定すること
が可能となる。
質分析方法によれば、物質間の特異的相互作用を利用し
て微量成分の分析を行うこととしたので、微量活性物質
を複雑な精製工程等を得ることなく正確に測定すること
が可能となる。
【図１】本発明の第一実施例に係る微量物質測定方法の
説明図である。
説明図である。
【図２】図１に示した方法による測定結果の説明図であ
る。
る。
【図３】本発明の第二実施例に係る微量物質測定方法の
説明図である。
説明図である。
【図４】図３に示した実施例による測定結果の説明図で
ある。
ある。
１２…抗体 １４…結合物質 １６…被測定物質 １８…酵素標識抗体
Claims (10)
- 【請求項１】 結合物質Ａを固相に固定化する固定化工
程と、 前記結合物質Ａに特異的に結合する被測定物質Ｂを結合
させる結合工程と、 前記被測定物質Ｂを測定する測定工程と、 を備えたことを特徴とする微量物質測定方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の方法において、結合物質
Ａは、該結合物質Ａに対する抗体を用いて固相に固定さ
れていることを特徴とする微量物質測定方法。 - 【請求項３】 結合物質Ａを固相に固定化する固定化工
程と、 前記結合物質Ａと特異的に反応する被測定物質Ｂ1及び
前記結合物質Ａと反応しない疑似被測定物質Ｂ2が混在
する被測定液を前記固相と反応させる結合工程と、 前記結合物質Ａと結合した被測定物質Ｂ1を、前記被測
定物質Ｂ1及び疑似被測定物質Ｂ2を共に測定可能な方法
により測定する測定工程と、 を備え、被測定液中の被測定物質Ｂ1を特異的に測定す
ることを特徴とする微量物質測定方法。 - 【請求項４】 請求項３記載の方法において、被測定物
質Ｂ1及び疑似被測定物質Ｂ2と共に測定する測定工程
は、該被測定物質Ｂ1及び疑似測定物Ｂ2を共に認識する
酵素標識抗体と反応させ、その酵素活性を測定するもの
であることを特徴とする微量物質測定方法。 - 【請求項５】 被測定物質Ｂを固相に固定化する固定化
工程と、 前記被測定物質Ｂに特異的に結合する結合物質Ａを結合
させる結合工程と、 前記結合物質Ａを測定する測定工程と、 を備えたことを特徴とする微量物質測定方法。 - 【請求項６】 請求項５記載の方法において、被測定物
質Ｂは、該被測定物質Ｂに対する抗体を用いて固相に固
定されることを特徴とする微量物質測定方法。 - 【請求項７】 被測定液中の被測定物質Ｂ1及び疑似被
測定物質Ｂ2を固相に固定化する固定化工程と、 前記被測定物質Ｂ1と特異的に反応する結合物質Ａを前
記固相と反応させる結合工程と、 前記被測定物質Ｂ1と結合した結合物質Ａを測定する測
定工程と、 を備え、被測定液中の被測定物質Ｂ1を特異的に測定す
ることを特徴とする微量物質測定方法。 - 【請求項８】 請求項７記載の方法において、被測定物
質Ｂ1及び疑似被測定物質Ｂ2を共に固定化する固定化工
程は、該被測定物質Ｂ1及び疑似測定物Ｂ2を共に認識す
る固定化抗体と反応させるものであることを特徴とする
微量物質測定方法。 - 【請求項９】 結合物質Ａが固定化される固相と、 前記結合物質Ａに特異的に結合する被測定物質Ｂを測定
する測定試薬と、 を備えたことを特徴とする微量物質測定キット。 - 【請求項１０】 被測定物質Ｂを固定化する固相と、 前記被測定物質Ｂに特異的に結合された結合物質Ａを測
定する測定試薬と、 を備えたことを特徴とする微量物質測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17165892A JPH05340945A (ja) | 1992-06-05 | 1992-06-05 | 微量物質測定方法及び測定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17165892A JPH05340945A (ja) | 1992-06-05 | 1992-06-05 | 微量物質測定方法及び測定キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05340945A true JPH05340945A (ja) | 1993-12-24 |
Family
ID=15927302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17165892A Withdrawn JPH05340945A (ja) | 1992-06-05 | 1992-06-05 | 微量物質測定方法及び測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05340945A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007534951A (ja) * | 2004-04-29 | 2007-11-29 | ファーマ ディヴェロップメント ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | タンパク質ｐｔｘ３測定用の単クローン抗体、ハイブリドーマ、改良方法、及び前記測定用キット |
-
1992
- 1992-06-05 JP JP17165892A patent/JPH05340945A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007534951A (ja) * | 2004-04-29 | 2007-11-29 | ファーマ ディヴェロップメント ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ | タンパク質ｐｔｘ３測定用の単クローン抗体、ハイブリドーマ、改良方法、及び前記測定用キット |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2006058295A (ja) | アッセイ | |
| JP4197393B2 (ja) | ＩｇＡ腎症の検査法 | |
| CN110196334A (zh) | 血栓调节蛋白化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 | |
| RU2232991C1 (ru) | Способ определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
| JPH07325083A (ja) | 糖タンパク質の特定糖鎖割合の測定方法 | |
| KR101255828B1 (ko) | 단백질분해에 의하여 활성화되는 효소의 활성형의 정성적 및 정량적 분석방법 | |
| RU2417375C2 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
| RU2380707C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека по альтернативному пути активации | |
| WO2006123789A1 (ja) | 酵素分析方法 | |
| CN103502813A (zh) | 可溶性lr11的免疫学测定方法 | |
| HU228077B1 (en) | Cobalamin assay | |
| AU703940B2 (en) | Regenerable solid phase for carrying out specific binding reactions | |
| JPH05340945A (ja) | 微量物質測定方法及び測定キット | |
| RU2376605C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора d комплемента человека | |
| RU2251697C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c3 комплемента человека по классическому пути активации | |
| RU2195670C1 (ru) | Способ определения функциональной активности компонента c2 комплемента человека | |
| RU2506594C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности компонента с3 комплемента человека | |
| JPH01295165A (ja) | 免疫学的検定法 | |
| RU2374650C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности фактора в комплемента человека | |
| CN114150037A (zh) | 一种利用活细胞作为基质亲和富集的方法 | |
| RU2425383C1 (ru) | СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
| SU1606940A1 (ru) | Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл | |
| RU2251698C1 (ru) | СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ C1r2s2 ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА | |
| JPH11311624A (ja) | 分析物遊離段階を可能にするアッセイ用表面 | |
| WO2000039586A2 (en) | Tetramethylbenzidine formulation for horseradish peroxidase enzyme assays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19990831 |