JPH0536030B2 - - Google Patents
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- JPH0536030B2 JPH0536030B2 JP59022574A JP2257484A JPH0536030B2 JP H0536030 B2 JPH0536030 B2 JP H0536030B2 JP 59022574 A JP59022574 A JP 59022574A JP 2257484 A JP2257484 A JP 2257484A JP H0536030 B2 JPH0536030 B2 JP H0536030B2
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- JP
- Japan
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- urokinase
- solution
- group
- international units
- protein
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明はウロキナーゼの精製法に関する。
さらに詳しくは、式、
−（CH2）ｎ−Ｘ （）
（式中、Ｘは水酸基、メチル基、水酸基で置換
されていてもよいフエニル基またはアミノ基を、
ｎは３〜10の整数を示す）で表わされる基をリガ
ンドとして有する水不溶性の担体にウロキナーゼ
を吸着させ、さらに少なくとも２個のアミノ基を
有する化合物又はその塩にて溶出することによる
ウロキナーゼの精製法に関するものである。 ウロキナーゼは人尿、および腎細胞の組織培養
液中に存在する酵素であり、人血漿中に含まれる
プラスミノーゲンを賦活化してフイブリン溶解能
を有するプラスミンを生成する機能がある。この
故にウロキナーゼは人尿等から捕集して精製さ
れ、各種血栓症や心筋梗塞症等の治療に広く臨床
使用されている。のみならず、最近においては制
癌剤と併用することにより、制癌剤の薬効を向上
せしめることが知られている。しかも、ウロキナ
ーゼは人間の尿または腎細胞の組織培養液からの
抽出精製物であるから、抗原性を有さないため、
抗原抗体反応による副作用がなく、広く賞用され
ている。 本発明者らは、ウロキナーゼと疎水性吸着体と
が、疎水的な親和性を有することに着目し、吸着
方法、溶出方法などについて研究を重ねてきたと
ころ、上述の基（）をリガンドとして有する水
不溶性担体を吸着剤とし、さらに少なくとも２個
のアミノ基を有する化合物又はその塩を添加した
溶液を用いることによつて、より高純度、高回収
率でウロキナーゼが得られることを見出し、本発
明を完成するに至つた。 本発明で使用される基（）を有する水不溶性
の担体は水不溶性担体に基（）を導入したもの
であり、基（）としては、具体的にはC4H9−
（ブチル基）、C5H11−（ペンチル基）、C8H17−（オ
クチル基）、−C4H8NH2（アミノブチル基）、−C8
H16NH2（アミノオクチル基）、−C4H8OH（ハイド
ロキシブチル基）、−C8H16OH（ハイドロキシオク
チル基）、
されていてもよいフエニル基またはアミノ基を、
ｎは３〜10の整数を示す）で表わされる基をリガ
ンドとして有する水不溶性の担体にウロキナーゼ
を吸着させ、さらに少なくとも２個のアミノ基を
有する化合物又はその塩にて溶出することによる
ウロキナーゼの精製法に関するものである。 ウロキナーゼは人尿、および腎細胞の組織培養
液中に存在する酵素であり、人血漿中に含まれる
プラスミノーゲンを賦活化してフイブリン溶解能
を有するプラスミンを生成する機能がある。この
故にウロキナーゼは人尿等から捕集して精製さ
れ、各種血栓症や心筋梗塞症等の治療に広く臨床
使用されている。のみならず、最近においては制
癌剤と併用することにより、制癌剤の薬効を向上
せしめることが知られている。しかも、ウロキナ
ーゼは人間の尿または腎細胞の組織培養液からの
抽出精製物であるから、抗原性を有さないため、
抗原抗体反応による副作用がなく、広く賞用され
ている。 本発明者らは、ウロキナーゼと疎水性吸着体と
が、疎水的な親和性を有することに着目し、吸着
方法、溶出方法などについて研究を重ねてきたと
ころ、上述の基（）をリガンドとして有する水
不溶性担体を吸着剤とし、さらに少なくとも２個
のアミノ基を有する化合物又はその塩を添加した
溶液を用いることによつて、より高純度、高回収
率でウロキナーゼが得られることを見出し、本発
明を完成するに至つた。 本発明で使用される基（）を有する水不溶性
の担体は水不溶性担体に基（）を導入したもの
であり、基（）としては、具体的にはC4H9−
（ブチル基）、C5H11−（ペンチル基）、C8H17−（オ
クチル基）、−C4H8NH2（アミノブチル基）、−C8
H16NH2（アミノオクチル基）、−C4H8OH（ハイド
ロキシブチル基）、−C8H16OH（ハイドロキシオク
チル基）、
【式】（フエニルブチ
ル基）、
【式】（フエニルオクチ
ル基）等が好ましいものとして例示される。
水不溶性担体としては、上記の基（）を導入
しうる水不溶性担体ならばいかなるものでも使用
可能であり、具体的にはアガロース、セルロー
ス、セフアクリル（フアルマシア社製）、セフア
デツクス（フアルマシア社製）等の水不溶性の多
糖類、ポリビニル系のゲル等が好適なものとして
列挙される。 かかる基（）を有する水不溶性担体として
は、例えばブチルトヨパール（東洋曹達工業社
製）、アルキルアガロース・シリーズ（マイル社
製）、フエニルオクチル・セフアローズ、オクチ
ル・セフアローズ（フアルマシア社製）、アルキ
ルアガロース・シリーズ（マイルス社製）、ω−
アミノ・アルキル・アガロースシリーズ（マイル
ス社製）等が現在市販されており、これら以外の
ものについても市販品と同様の方法ないしはこれ
に準ずる方法によつて容易に製造することができ
る。 本発明におけるウロキナーゼ吸着工程は、一般
に粗ウロキナーゼを基（）を有する水不溶性担
体に接触させることによつて行われ、当該接触は
吸着操作手段として自体既知の手段、たとえば当
該基（）を有する水不溶性担体を充填したカラ
ムに粗ウロキナーゼを通過させる方法等によつて
行われる。 粗ウロキナーゼは、一般的には水溶液の形で基
（）を有する水不溶性担体による吸着処理に付
される。 この際、ウロキナーゼを吸着せしめるために塩
類を適量添加して、溶媒の疎水性を高めることが
好ましい。添加する塩としては、酵素を吸着体に
吸着するに際して塩濃度を高めるために通常用い
られる塩類であればいずれもが使用できる。特に
好ましい塩類としては、例えば食塩、塩化カリウ
ム、塩化マグネシウムなどの１価の中性塩があげ
られる。 当該塩類は、0.5〜3Mとして添加するのが好適
である。 また、吸着に際してのPHについては特定の範囲
を定める必要はないが、中性域（６〜８）が好ま
しい。 吸着したウロキナーゼの溶出は、溶媒の疎水性
を下げることで行い得るが、塩濃度だけを下げて
も、充分な回収率が得難く、また精製効果が上ら
ないのが常である。 本発明者らは、この問題を解決すべく溶出方法
について研究した結果、少なくとも２個のアミノ
基を有する化合物又はその塩にてウロキナーゼの
溶出を行うことによつて、その回収率が高まるこ
とを見出した。 少なくとも２個のアミノ基を有する化合物にお
けるアミノ基は、アミジノ基の形態でもよく、ま
た塩としては、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩があ
げられる。かかる化合物及びその塩としては、リ
ジン、アルギニン等のジアミノモノカルボン酸、
これらの塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩等があげら
れ、５〜15％（ｗ／ｖ）水溶液で使用することが
好ましい。 かくして精製されたウロキナーゼの溶出液は常
法により脱塩、濃縮、高度精製の処理を行い、医
薬品として使用できるウロキナーゼとすることが
できる。 本発明方法にて使用される吸着用担体及び溶出
剤は、各々より選択的にウロキナーゼを吸着又は
溶出するので、本発明方法によつて粗ウロキナー
ゼから高純度、高収率で精製ウロキナーゼを回収
することが可能である。 従つて、本発明方法は、工業的規模におけるウ
ロキナーゼの製法として極めて有利である。 以下実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例 １ 人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液４ml
（20000国際単位／ml、比活性35000国際単位／mg
蛋白）に1M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.9
に調製した。２ml（カラム体積）のブチルアガロ
ース（マイルス社製）をカラムに充填し、
0.0725Mリン酸塩溶液に1M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のリジン塩酸
塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナーゼを
溶出した。溶出液よりリジン塩酸塩を除去し、比
活性70000国際単位／mg蛋白のウロキナーゼが回
収率85％で得られた。 実施例 ２ 人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液４ml
（20000国際単位／ml、比活性35000国際単位／mg
蛋白）に1M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.9
に調製した。２ml（カラム体積）のブチルトヨパ
ール（東洋曹達工業製）をカラムに充填し、
0.0725Mリン酸塩溶液に1M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のアルギニン
塩酸塩を含むPH6.0の溶液を通過させ、ウロキナ
ーゼを溶出した。この時の溶出率は95％であつ
た。この後、アルギニン塩酸塩を除去し、比活性
75000国際単位／mg蛋白のウロキナーゼを85％の
回収率で得た。 実施例 ３ 電導度を４〜５ｍ mho／cm（25℃）に調製し
た組織培養由来の粗ウロキナーゼ溶液32ml（5000
国際単位／ml、比活性6000国際単位／mg蛋白）に
0.8M量の塩化ナトリウムを溶解し、PHを6.9に調
製した。４ml（カラム体積）のブチルトヨパール
（東洋曹達工業製）をカラムに充填し、0.0725M
リン酸塩溶液に0.8M量の塩化ナトリウムを溶解
し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。こ
れに先に調製したウロキナーゼを吸着させた後、
平衡化溶液で洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）
のアルギニン塩酸塩を含むPH6.0の溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを溶出した。この後、アルギニ
ン塩酸塩を除去し、比活性60000国際単位／mg蛋
白のウロキナーゼを90％の回収率で得た。 実施例 ４ 人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液50ml
（3500国際単位／ml、比活性350国際単位／mg蛋
白）に3.5M量の塩化ナトリウムを溶解し、PHを
6.8に調製した。25ml（カラム体積）のフエニル
オクチル・セフアローズをカラムに充填し、
0.05Mリン酸塩溶液に3.5M量の塩化ナトリウム
を溶解し、PHを6.8に調製した液を通し平衡化し
た。これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過
させ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液
で洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のアルギニ
ン塩酸塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナ
ーゼを溶出した。溶出液よりアルギニン塩酸塩を
除去し、弱酸性カチオン交換体により精製したと
ころ、比活性50000国際単位／mg蛋白のウロキナ
ーゼが回収率80％で得られた。 実施例 ５ 人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した部分精製粗ウロキナーゼ溶液
100ml（20000国際単位／ml、比活性7000国際単
位／mg蛋白）に対し、2.0M量の塩化カリウムを
添加し、PHを6.8に調製した。80ml（カラム体積）
のオクチル・アガロースをカラムに充填し、
0.05Mリン酸塩溶液に2.0M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.8に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のリジン塩酸
塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナーゼを
溶出した。溶出液よりリジン塩酸塩を除去し、
60000国際単位／mg蛋白の精製ウロキナーゼを84
％の回収率で得た。 実施例 ６ 実施例５の粗ウロキナーゼ溶液100mlに2.0M量
の塩化カリウムを溶解し、PHを6.8に調製した。
80ml（カラム体積）のアミノオクチルセフアロー
ズをカラムに充填し、0.05Mリン酸塩溶液に
2.0M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.8に調製
した液を通し平衡化した。これに先に調製したウ
ロキナーゼ溶液を通過させ、ウロキナーゼを吸着
させた後、平衡化溶液で洗浄した。その後、10％
（ｗ／ｖ）のアルギニン塩酸塩を含むPH６の溶液
を通過させウロキナーゼを溶出した。溶出液より
アルギニン塩酸塩を除去し、比活性72000国際単
位／mg蛋白の精製ウロキナーゼを91％の回収率で
得た。
しうる水不溶性担体ならばいかなるものでも使用
可能であり、具体的にはアガロース、セルロー
ス、セフアクリル（フアルマシア社製）、セフア
デツクス（フアルマシア社製）等の水不溶性の多
糖類、ポリビニル系のゲル等が好適なものとして
列挙される。 かかる基（）を有する水不溶性担体として
は、例えばブチルトヨパール（東洋曹達工業社
製）、アルキルアガロース・シリーズ（マイル社
製）、フエニルオクチル・セフアローズ、オクチ
ル・セフアローズ（フアルマシア社製）、アルキ
ルアガロース・シリーズ（マイルス社製）、ω−
アミノ・アルキル・アガロースシリーズ（マイル
ス社製）等が現在市販されており、これら以外の
ものについても市販品と同様の方法ないしはこれ
に準ずる方法によつて容易に製造することができ
る。 本発明におけるウロキナーゼ吸着工程は、一般
に粗ウロキナーゼを基（）を有する水不溶性担
体に接触させることによつて行われ、当該接触は
吸着操作手段として自体既知の手段、たとえば当
該基（）を有する水不溶性担体を充填したカラ
ムに粗ウロキナーゼを通過させる方法等によつて
行われる。 粗ウロキナーゼは、一般的には水溶液の形で基
（）を有する水不溶性担体による吸着処理に付
される。 この際、ウロキナーゼを吸着せしめるために塩
類を適量添加して、溶媒の疎水性を高めることが
好ましい。添加する塩としては、酵素を吸着体に
吸着するに際して塩濃度を高めるために通常用い
られる塩類であればいずれもが使用できる。特に
好ましい塩類としては、例えば食塩、塩化カリウ
ム、塩化マグネシウムなどの１価の中性塩があげ
られる。 当該塩類は、0.5〜3Mとして添加するのが好適
である。 また、吸着に際してのPHについては特定の範囲
を定める必要はないが、中性域（６〜８）が好ま
しい。 吸着したウロキナーゼの溶出は、溶媒の疎水性
を下げることで行い得るが、塩濃度だけを下げて
も、充分な回収率が得難く、また精製効果が上ら
ないのが常である。 本発明者らは、この問題を解決すべく溶出方法
について研究した結果、少なくとも２個のアミノ
基を有する化合物又はその塩にてウロキナーゼの
溶出を行うことによつて、その回収率が高まるこ
とを見出した。 少なくとも２個のアミノ基を有する化合物にお
けるアミノ基は、アミジノ基の形態でもよく、ま
た塩としては、塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩があ
げられる。かかる化合物及びその塩としては、リ
ジン、アルギニン等のジアミノモノカルボン酸、
これらの塩酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩等があげら
れ、５〜15％（ｗ／ｖ）水溶液で使用することが
好ましい。 かくして精製されたウロキナーゼの溶出液は常
法により脱塩、濃縮、高度精製の処理を行い、医
薬品として使用できるウロキナーゼとすることが
できる。 本発明方法にて使用される吸着用担体及び溶出
剤は、各々より選択的にウロキナーゼを吸着又は
溶出するので、本発明方法によつて粗ウロキナー
ゼから高純度、高収率で精製ウロキナーゼを回収
することが可能である。 従つて、本発明方法は、工業的規模におけるウ
ロキナーゼの製法として極めて有利である。 以下実施例により本発明を詳細に説明する。 実施例 １ 人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液４ml
（20000国際単位／ml、比活性35000国際単位／mg
蛋白）に1M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.9
に調製した。２ml（カラム体積）のブチルアガロ
ース（マイルス社製）をカラムに充填し、
0.0725Mリン酸塩溶液に1M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のリジン塩酸
塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナーゼを
溶出した。溶出液よりリジン塩酸塩を除去し、比
活性70000国際単位／mg蛋白のウロキナーゼが回
収率85％で得られた。 実施例 ２ 人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液４ml
（20000国際単位／ml、比活性35000国際単位／mg
蛋白）に1M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.9
に調製した。２ml（カラム体積）のブチルトヨパ
ール（東洋曹達工業製）をカラムに充填し、
0.0725Mリン酸塩溶液に1M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のアルギニン
塩酸塩を含むPH6.0の溶液を通過させ、ウロキナ
ーゼを溶出した。この時の溶出率は95％であつ
た。この後、アルギニン塩酸塩を除去し、比活性
75000国際単位／mg蛋白のウロキナーゼを85％の
回収率で得た。 実施例 ３ 電導度を４〜５ｍ mho／cm（25℃）に調製し
た組織培養由来の粗ウロキナーゼ溶液32ml（5000
国際単位／ml、比活性6000国際単位／mg蛋白）に
0.8M量の塩化ナトリウムを溶解し、PHを6.9に調
製した。４ml（カラム体積）のブチルトヨパール
（東洋曹達工業製）をカラムに充填し、0.0725M
リン酸塩溶液に0.8M量の塩化ナトリウムを溶解
し、PHを6.9に調製した液を通し平衡化した。こ
れに先に調製したウロキナーゼを吸着させた後、
平衡化溶液で洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）
のアルギニン塩酸塩を含むPH6.0の溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを溶出した。この後、アルギニ
ン塩酸塩を除去し、比活性60000国際単位／mg蛋
白のウロキナーゼを90％の回収率で得た。 実施例 ４ 人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した粗ウロキナーゼ溶液50ml
（3500国際単位／ml、比活性350国際単位／mg蛋
白）に3.5M量の塩化ナトリウムを溶解し、PHを
6.8に調製した。25ml（カラム体積）のフエニル
オクチル・セフアローズをカラムに充填し、
0.05Mリン酸塩溶液に3.5M量の塩化ナトリウム
を溶解し、PHを6.8に調製した液を通し平衡化し
た。これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過
させ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液
で洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のアルギニ
ン塩酸塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナ
ーゼを溶出した。溶出液よりアルギニン塩酸塩を
除去し、弱酸性カチオン交換体により精製したと
ころ、比活性50000国際単位／mg蛋白のウロキナ
ーゼが回収率80％で得られた。 実施例 ５ 人尿より抽出し、電導度を４〜５ｍ mho／cm
（25℃）に調製した部分精製粗ウロキナーゼ溶液
100ml（20000国際単位／ml、比活性7000国際単
位／mg蛋白）に対し、2.0M量の塩化カリウムを
添加し、PHを6.8に調製した。80ml（カラム体積）
のオクチル・アガロースをカラムに充填し、
0.05Mリン酸塩溶液に2.0M量の塩化カリウムを
溶解し、PHを6.8に調製した液を通し平衡化した。
これに先に調製したウロキナーゼ溶液を通過さ
せ、ウロキナーゼを吸着させた後、平衡化溶液で
洗浄した。その後、10％（ｗ／ｖ）のリジン塩酸
塩を含むPH６の溶液を通過させ、ウロキナーゼを
溶出した。溶出液よりリジン塩酸塩を除去し、
60000国際単位／mg蛋白の精製ウロキナーゼを84
％の回収率で得た。 実施例 ６ 実施例５の粗ウロキナーゼ溶液100mlに2.0M量
の塩化カリウムを溶解し、PHを6.8に調製した。
80ml（カラム体積）のアミノオクチルセフアロー
ズをカラムに充填し、0.05Mリン酸塩溶液に
2.0M量の塩化カリウムを溶解し、PHを6.8に調製
した液を通し平衡化した。これに先に調製したウ
ロキナーゼ溶液を通過させ、ウロキナーゼを吸着
させた後、平衡化溶液で洗浄した。その後、10％
（ｗ／ｖ）のアルギニン塩酸塩を含むPH６の溶液
を通過させウロキナーゼを溶出した。溶出液より
アルギニン塩酸塩を除去し、比活性72000国際単
位／mg蛋白の精製ウロキナーゼを91％の回収率で
得た。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59022574A JPS60166621A (ja) | 1984-02-08 | 1984-02-08 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59022574A JPS60166621A (ja) | 1984-02-08 | 1984-02-08 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60166621A JPS60166621A (ja) | 1985-08-29 |
| JPH0536030B2 true JPH0536030B2 (ja) | 1993-05-28 |
Family
ID=12086640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59022574A Granted JPS60166621A (ja) | 1984-02-08 | 1984-02-08 | ウロキナ−ゼの精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60166621A (ja) |
-
1984
- 1984-02-08 JP JP59022574A patent/JPS60166621A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS60166621A (ja) | 1985-08-29 |
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