JPS5820190A - ウロキナ−ゼの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はウロキナーゼの精製法に関する０さらに詳しく
は、式 ％式％（） （式中、Ｘは水酸基、メチル基、水酸基で置換されてい
てもよいフェニル基またはアよ）基？、ｎは５〜ｌＯの
整数を示す）で表わされる基をリガンドとして有する水
不溶性担体にウロキナーゼを吸着させることによるウロ
キナーゼの８Ｍ法に関するものである。

ウロキナーゼは人尿、および腎細胞の組織培養液中に存
在する酵素であり、人血漿中に含まれるプラスミノーゲ
ンを賦活化してフィブリン溶解能を有するプラスミンを
生成する機能がある。この故につ田キナーゼ拡人尿等か
ら捕集して精製され、各種血栓症や心筋硬塞症等の治療
に広く臨床使用されている。のみならず最近においては
制癌剤と併用することによシ、制癌剤の薬効を向上せし
めることが知られている。しかも、つｐキナーゼは人間
の尿または腎細胞の組織培養液からの抽出精製物である
蜘ち、抗原性ｆｔｖさないため、抗原抗体反応による副
作用がなく、広く賞月されているＯ 本発明者らは、ウロキナーゼと疎水性吸着体とが、疎水
的な親和性を有することに着目し、吸着方法、溶出方法
などについて研究ｔ−重ねてきたところ、上述の基＜Ｉ
）をリガンドとして有する水不溶性担体を吸着剤とする
ことにより、ウロキナーゼが収率よく、高純度で得られ
ることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明で使用される基（Ｉ）を有する水不溶性の担体は
水不溶性担体に基（υを導入したものでＩｈシ、基（Ｉ
）としては、具体的にはＣ８Ｆ１８−（オクチル基）　
、−Ｃ，Ｈ，、ＮＨ，（アζノオクチル基）　、−Ｃ，
Ｈｏ。

ＯＨ（ハイドロキシオクチル基）　、−Ｃ，Ｈｌ、−Ｃ
＞（フェニルオクチル基）等が好ましいものとして例示
される。

水不溶性担体としては、上記の基（Ｉ）を導入しりろ水
不溶性担体ならばいかなるものでも使用可能であシ、具
体的には、アガ讐−ス、セルレース、セファクリル（フ
ァルマシア社製）、セファデックス（ファルマシア社製
）等の水不溶性多糖類が好適なものとして列挙される。

かかる基（Ｉ）を有する水不溶性担体としては、フェニ
ルオクチル・セフ７四−ズ、オクチル−セフ、乏肚最）
等が現在市販されてお夛、これら以外のものについても
市販品と同様の方法ないしはこれに準する方法によって
容易に製造することができる０ 本発明の方法は、一般に粗ウロキナーゼを基（Ｉ）を有
する水不溶性担体に接触させることによって行われ、当
該接触は吸着操作手段として自体既知の手段、たとえば
当該基（Ｉ）を有する水不溶性担体を充填し九カラムに
粗り田キナーゼを通過させる方法によって行われる。

粗ウロキナーゼは、一般的には水溶液の形で基（Ｉ）　
を有する水不溶性担体による吸着処理に付される０ この際、ウロキナーゼを吸着せしめるために塩類を適量
添加して、溶媒の疎水性を高めることが好ましい。添加
する塩としては、酵素を吸着体に吸着するに際して塩濃
度を高めるために通常用いられる塩類であればいずれも
が使用できる。特に好ましい塩類としては、たとえに食
塩、塩化カリウム、塩化マグネシウムなどの１価の中性
塩があげられる。

当該塩類は、１．５〜４Ｍとして添加するのが好適で哉
る。

また、吸着に際してのｐＨについては特定の範囲を定め
る必要はないが、中性域（６〜８）が好ましい。

吸着したウロキナーゼの溶出は、溶媒の疎水性を下げる
ことで行い得るが、塩濃度だけを下げても、充分な回収
率が得難く、また精製効果が上らないのが常である。

本発明者らは、この問題を解決すべく溶出方法について
、研究した結果、０．０１−１０チ（ｗ／マ）、好まし
くは０．１〜５　％　（ｗ／　’Ｉ　）　、さらに好ま
しくは２％（ｖ／マ）前後の極性低下剤を添加した溶出
液を使用することによシ、ウロキナーゼが高収率で溶出
されること、特に非イオン性界面活性剤ｋ　Ｇ％加した
もので社、特異的に溶出されることを見出した。

従って、溶出液にかかる極性低下剤を添加することが好
ましく、極性低下剤としては、たとえば非イオン性界面
活性剤〔たとえばソルビタンモノアルキルエステル型（
友とえば各種のＴＶ・ｅｎ■）、アルキルエーテル型（
たとえば各種のＴｒｉｔ−ｏｎ■）、アルキルエステル
型（たとえば各種のポリエチレンクリコール）、ポリオ
キシエチレンポリオキシプロピレン共重合体く九とえば
各種のＰｌｕｒｏｎｉｅ■）〕等が好ましいものとして
例示される。その際溶出液の塩濃度會αＩＭ〜０．３Ｍ
とし、さらにｐＨ１−７〜９に維持させることがより効
果的である。

かくして精製されたウロキナーゼの溶出液は常法により
脱塩、濃縮、高度精製の処理を行い、医薬品として使用
できるウロキナーゼとすることができる。

本発明方法にて使用される吸着用担体は、よシ選択的に
ウロキナーゼを吸着するので、本発明方法によって粗ウ
ロキナーゼから高収率で８製クロキナーゼを回収するこ
とが可能である。

従って、本発明方法は、工業的規模におけるつロキナー
ゼの製法として極めて有利である。

以下実施例によシ本発明の詳細な説明する。

実施例１ 人尿よシ抽出し、電気伝導度を４〜５　ｍ　ｗｈｏ／傷
／２５℃に調整した粗ウロキナーゼ溶液５０ｍ（３，５
００国際国際年Ｗ、比活性３５０国際単位／■蛋白）に
、３．５Ｍ量の塩化ナトリウムを溶解しＰＨ？６．８に
調整した。２５ｄ（カラム体積）のフェニルオクチル・
セファローズをカラムに充填し、０．０５Ｍ９ン酸塩溶
液に１５Ｍ量の塩化ナトリウムを溶解しＳ　ｐＨを６．
８に調整した液を通過させ平衡化した。これに先に調整
したウロキナーゼ溶液全通過させウロキナーゼを吸着さ
せたのち、平衡化溶液で洗浄した。その後、１％（Ｖ／
マ）のポリオキシエチレン系ソルビタン脂肪酸エステル
型の非イオン性界面活性剤（商品名、Ｔｖｅ−ｅｎ■８
０）を含むｐＨ８の溶１％Ｉを通過させ、ウロキナーゼ
を溶出した。溶出液より界面活性剤を除去し、弱酸性カ
チオン交換体によ）Ｎ製したところ、比活性ｓ　ｏ、ｏ
　ｏ　ｏ国際単位／ダ蛋白のウロキナーゼが回収率８０
チで得られた。

実施例２ 人尿よシ抽出し電気伝導度４〜５ｍｍｈｏ／ｃＭ／２５
℃に調整した部分精製粗ウロキナーゼ溶液１００ｍ（２
０，０００国際国際年ａｔ、比活性７，０００国際単位
／ダ蛋白）に対し、２．０Ｍ量の塩化カリウムを添加し
ｐＨを６．８に調整した。８０ｄ（カラム体積）のオク
チル・アガロースをカラムに充填し、０．０５Ｍ９ン酸
塩溶液に２．．０Ｍ量の塩化カリウムを溶解しｐＨ’！
ｉ６．８に調整した溶Ｗ、管通過させ平衡化した。これ
に先に調製したつμキナーゼ溶液を通過させウロキナー
ゼを吸着させたのち平衡化溶液で洗浄した０その後、２
チ（ｖ／ｖ）　　・のポリエチレングリコール系アルキ
ルエーテル型の非イオン性界面活性剤（商品名、Ｔｒｉ
ｔｏｎ■Ｘ−１００）ｔ−含むｐＨ８の溶液を通過させ
ウロキナーゼを溶出した０溶出液よシ界面活性剤を除去
し、６０，０００国際国際年ダ蛋白の精製ウロキナーゼ
ｔ−８４％の回収率で得た。　　□実施例３ 実施例２の粗ウロキナーゼ溶液１００ｄＫｌＯＭｆｔの
塩化カリウムを溶解し、ＰＨを６．８に調整した。８０
ｍ（カラム体積）のアミノオクチルセファローズをカラ
ムに充填し、０．０５Ｍのリン酸塩溶液に２．０Ｍ量の
塩化カリウムを溶解し、ｐＨを６．８に調整した溶液を
通過させ平衡化した０これに先に調製したつ四キナーゼ
溶液を通過させウロキナーゼ金吸着させたのち、平衡化
溶液で洗浄した。その後、ｚ％　（ｗ／ｖ）のポリオキ
シエチレン系エーテル型の非イオン性界面活鴫剤（、分
子量ユ０００瞥、１０，０００）を含むＰＨ９の溶液を
通過させ、ウロキナーゼを溶出した０溶出液よシ界面活
性剤を除去し、比活性７２，０００国際年位／ａｇ蛋白
の精製ウロキナーゼを９１−の回収率で得た。

特許出願人　株式会社ミドリ十字

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 式 ％式％）： （式中、Ｘは水酸基、メチル基、水酸基で置換されてい
   てもよいフェニル基またはアミノ基を、ｎは５〜ｌＯの
   整数を示す）で表わされる基をリガンドとして有する水
   不溶性の担体につ四キナーゼを吸着させること′ｌｋ％
   黴とするつ四キナーゼの精製法。