JPH0722702B2 - 化学生成物 - Google Patents

化学生成物

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JPH0722702B2
JPH0722702B2 JP2509704A JP50970490A JPH0722702B2 JP H0722702 B2 JPH0722702 B2 JP H0722702B2 JP 2509704 A JP2509704 A JP 2509704A JP 50970490 A JP50970490 A JP 50970490A JP H0722702 B2 JPH0722702 B2 JP H0722702B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血漿濃縮物からの血液凝固因子分離用の改良さ
れた媒体並びにこれらの媒体を用いた分離及び単離方法
に関する。
血液凝固因子VIII（以下因子VIIIと略記）は血液のタン
パク質成分であって、その不存在又は不足は血友病にな
る。それは血友病患者への投与用に工業的規模で多数の
国において献血血漿から得られている。因子VIIIは非常
に低い濃度で血漿中に存在しており、現プロセスでは因
子VIIIの比活性が他の血漿タンパク質と比較して有意に
増加した精製因子VIII含有産物を生成しようと試みてい
る。一般に因子VIIIは複合体の形で単離され、その複合
体はフォンビルブラント因子（vWF）と共に形成され
る。
用いられてきた１つの因子VIII精製方法は因子VIIIに親
和性を有する分離媒体への吸着及びそれからの溶出であ
る。その場合に他のタンパク質に対する媒体の親和性は
因子VIIIに関する場合と通常異なり、一部の分離は特に
クロマトグラフィー技術を用いて行ってもよい。
分離媒体は因子VIIIの吸着にある程度の選択性を示すば
かりでなく、多量の因子VIIIが単位容量当たりの分離媒
体で吸着されかつ高回収率で溶出されうることがこのよ
うな分離技術では重要である。これまで、因子VIII用の
このような分離媒体は因子VIIIに親和性を有する官能
基、特にアミノアルキル基をもつアガロースのような不
活性物質、例えばセファロース（Sepharose）から構成
されていた。このタイプの典型的物質はオーステンDEG
（Austen DEG）（1979:Br.J.Haematol.43,669−674）；
オーステンDEG及びSmith JK（1982:Thromb.Haemostas.4
8,46−48）並びに米国特許第4,508,709号明細書で記載
されている。
特に、ニールG.G.らは1985年７月にサンジエゴのポスタ
ー発表で記載したが、因子VIII用の特定な分離媒体は特
定のポリアミン類を含めた広範囲のアミン類に結合され
たセファロースであった（Neal GG,Smith JK及びHersee
D,1985,Thromb.Haemostas.54,78,Conference Abstrac
t）。ポリアミン類は単純なモノアミン類よりも良い因
子VIII吸着性を示すが、但しアルキレンジアミン類はジ
エチレントリアミン又はジ（ｎ−プロピレン）トリアミ
ンのようなジアルキレントリアミン類よりも良い結果を
示した。
更に我々の研究では、高級ポリアミン基がニールらによ
り記載されたアミン基よりも因子VIIIの単離に関して良
い結果を示すことができ、しかもメチレン基の数と比較
してプロトン化アミノ基の数の多いことが因子VIIIに関
する選択性を決定する上で重要であることを示した。我
々はこの関係から、式H2N（CH2）2NH（CH2）3NH2（Ｎ−
（２−アミノエチル）−1,3−プロパンジアミン）を有
するポリアミンがH2N（CH2）2NH（CH2）2NH2（ジエチレ
ントリアミン）又はH2N（CH2）3NH（CH2）3NH2（ジ（ｎ
−プロピレン）トリアミン）のいずれかよりも良い結果
を示し、トリエチレンテトラアミン（TETA）のような４
以上の窒素原子を有するポリアミン類がもっと良い結果
を示すことをみつけた。ジエチレントリアミンの場合に
おいて各窒素の近接は大体のpHレベル、例えばpH5.5で
３つすべての全プロトン化を妨げるが、一方化合物 H2N（CH2）2NH（CH2）3NH2を与えるもう１つのメチレン
基の導入はpH5.5で全てプロトン化させる。
したがって本発明によれば、我々は多数のポリアミン基
を有する非水溶性マトリックスからなるタンパク質分離
用の分離媒体を提供するが、上記ポリアミン基は少なく
とも３つの塩基性窒素原子を有しており、上記塩基性窒
素原子は少なくとも２つの介在炭素原子の鎖で互いに分
離され、各ポリアミン基に全部で３つの窒素原子がある
場合には全部で５つのかかる介在炭素原子が存在する。
ポリアミン基は少なくとも４つの窒素原子を含むことが
好ましい。
ポリアミン基は各々直鎖状又は分岐鎖状でもあるいは単
環式又は多環式の基であってもよい。窒素原子は、ポリ
ビニルアミン類又はポリアリルアミン類の場合のように
炭素原子の連続鎖に結合されたアミノ基で供与されても
又はトリエチレンテトラアミン及びポリエチレンイミン
のようなポリアルキレンポリアミン基の場合のように炭
素鎖を遮断していてもよい。このような基の合成は環構
造を生じる傾向を若干示すが、少なくとも一部のポリア
ミン基は単環式でもよく、その場合に全部もしくは一部
のポリアルキレンポリアミン基は２以上の窒素を含む単
環を形成するか又は炭素原子もしくは炭素及び窒素原子
を介在させることで結合されたいくつかのこのような環
が存在している。
マトリックスに結合されたポリアルキレンポリアミン基
は同一でも又は異なっていてもよい。
窒素原子対の間に介在する炭素原子（即ち、炭素原子の
鎖が側鎖又は置換基を除いて窒素原子を直接結合してい
る）は一般に直鎖又は分岐鎖アルキレン又はシクロアル
キレン基の部分からなっても又はそれを形成していても
よい。アルキレン基が好ましい。窒素原子対の間に介在
する炭素原子の数は３以下であることが好ましい。ポリ
アルキレンポリアミン基が２つの窒素原子を含む環式基
を有する場合、例えば下記基のように２組の介在炭素原
子が存在することは明らかであろう： ポリアルキレンポリアミン基は分岐鎖であってもよく、
即ち直鎖ポリアルキレンポリアミンは自ら分岐して直鎖
中の炭素又は窒素原子いずれかに結合されたアミノ、ア
ルキル、アミノアルキル又はポリアルキレンポリアミン
側基を有していてもよい。
ポリアミン基中の炭素原子はヒドロキシ又はオキソ基の
ような他の非酸性置換基を有していてもよい。窒素原子
は一級、二級、三級又は四級アミン基の中に含まれる。
このため例えば、二級、三級又は四級アミン基における
窒素原子は他の窒素原子に結合された介在炭素原子に加
えて例えば炭素原子１〜３を含むアルキル置換基を有し
ていてもよい。しかしながら、少なくとも１つの末端一
級アミン基が存在することが好ましく、一般に窒素原子
は少なくとも１つの水素原子を有することが好ましい。
最も好ましいポリアミン基はアルキレン基中に炭素原子
２〜５、更に好ましくは炭素原子２又は３を有する直鎖
ポリアルキレンポリアミン基である。特に良い結果はエ
チレン及びｎ−プロピレン基が交互になったポリアミン
基を用いて得られるが、これは良好なプロトン化と良好
な窒素−炭素比とを組合せたからである。このようなポ
リアミン基は下記式で表される： −NH−［（CH）2NH（CH2）3NH］ｍ−（CH2）2NH2 上記においてｍは整数である。
非水溶性マトリックスは通常有機マトリックス、例えば
臭化シアン、エピクロロヒドリン、カルボニルジイミダ
ゾール又は1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル
のようなカップリング剤を用いて所要ポリアミン基を結
合させるために用いられるヒドロキシ等の官能基を有し
たアガロースのようなポリマー物質である。このためか
かるカップリング剤はポリアミン基の開始部分を形成す
る結合基を与える。これは炭素原子１〜10を有するアル
キレン基であることが好ましいが、酸素原子で介在され
ていても、ヒドロキシ又はオキソ基のような置換基を有
していてもよい。カルボニルジイミダゾールとカップリ
ングさせることで形成されるカルバメート基のカルボニ
ル結合基はオキソ置換基を有するメチレン基と考えるこ
とができる。
本発明による媒体用として特に好ましいポリアミン基に
は以下がある： 上記においてＬは前記のような結合基である。
好ましいポリアミン基は上記（Ｂ）及び（Ｇ）である。
ポリアミン基を有するマトリックスはポリマー親水性物
質であることが好ましいが、これはアガロース、セルロ
ース又はデキストラン（架橋していてもよい）のような
天然源であってもあるいはポリアクリルアミド又はオリ
ゴエチレングリコール、グリシジルメタクリレート及び
ペンタエリトロール−ジメタクリレートのコポリマーの
ような合成ポリマーであってもよい。マトリックスは大
孔質シリカのような無機物質でもよい。マトリックスは
水性ゲルの形であることが好ましい。好ましいマトリッ
クス物質としてはセファロース、セファデックス（Seph
adex）、セファクリル（Sphacryl）、フラクトゲル（Fr
actogel）及びトリスアクリル（Trisacryl）の市販名を
有する物質がある。
本発明の分離媒体は適切なポリアミンを非水溶性マトリ
ックスにカップリングさせて製造されることが有利であ
る。上記のように、カップリングは好ましくは炭素原子
１〜10を有する二官能性分子、例えばエピクロロヒドリ
ン（Ｌ＝−CH2CH（OH）−CH2−）、カルボニルジイミダ
ゾール（Ｌ＝−CO−）又は1,4−ブタンジオールジグリ
シジルエーテル （Ｌ＝−CH2CH（OH）CH2−Ｏ−（CH2）４−Ｏ−CH2CH
（OH）CH2−） であるカップリング剤を用いて通常行われる。このよう
な試薬はマトリックス上のヒドロキシ、アミノ又はスル
フヒドリル基にカップリングさせる。
マトリックス上におけるリガンドの担持量は通常10〜9
0、好ましくは20〜60μmol/mlゲルの範囲である。
本発明の分離媒体を製造する上で用いられる多数のポリ
アミン類は市販されている。一般に、それらはエチレン
ジアミンのような市販短鎖ポリアミン類とエチレン又は
プロピレンジブロミドのような二官能性アルカン類との
反応により合成される。このような反応が混合物、例え
ば環状生成物を生じる場合、このような副生成物は分別
化により除去しても又は多くの単純に混合物中に残し
て、混合ポリアミン基を有する本発明の生成物を得るた
め活性化マトリックスと反応させてもよい。
前記のように、我々の研究では、因子VIIIの比活性増加
に関する良い結果のために、固定化ポリアミンがpH5.5
（因子VIIIの精製及びタンパク質沈降の回避のために最
適のpH）で高比率のプロトン化対非プロトン化窒素原子
及び高比率の窒素対炭素原子を有するべきであることを
示した。
我々がこれまで研究してきたポリアミン類に関して、我
々は下記式のように定義される実験関数Ｑを導くことが
できた： Ｑ＝1.0n1N＊＋0.3n2N−0.3n3C 上記においてn1N＊はプロトン化窒素の数であり、n2Nは
pH5.5における非プロトン化窒素の数であり（実験的に
測定されたpKa値から評価:Critical Stability Constan
ts,Volume2:Amines by Smith,R.M.及びMartell,A.E.,Pl
enum Press,New York and London,1975）、n3Cは介在炭
素原子の総数である。
表１における基の選択性は、Ｑの計算値が汚染タンパク
質の相対的非存在率に関する溶出因子VIII分画の純度と
定性的意味で相関しているらしいことから、Ｑと関連し
ているようである。下記表４は汚染タンパク質からの因
子VIII活性の分離に関する評点及びＱ値について掲載し
ている。一般に、計算されたＱが少なくとも1.5である
リガンドを用いることが好ましい。
更に、因子VIIIに対するリガンドのクロマトグラフィー
性質は例えばCu2+等との遷移金属結合又はＮ−アルキル
化等の化学反応によりそれらの化学構造を変えることで
変化させてもよい。このため、例えば、アルキル化は分
離媒体上に担持されるリガンドのアルキル化剤、例えば
ヨウ化メチルのようなアルキルハライドとの反応により
行うことができる。
本発明のもう１面によれば、我々は本発明による分離媒
体上に因子VIII含有物質を担持させ、しかる後洗浄し、
電解質濃度を増加させながら溶出させることからなる、
因子VIIIを少なくとも部分的に精製する方法を提供す
る。
本発明による分離媒体は本質的にクロマトグラフィー技
術を用いてカラムで通常用いられる。このため、媒体は
通常カラムに充填され、pH範囲5.0〜8.0、最も好ましく
はpH5.0〜6.0、最適にはpH5.5において適切な緩衝液で
平衡化される。有用な緩衝液はpHが水酸化ナトリウムで
5.5に調整された酢酸緩衝液、例えば100mM酢酸である。
例えば100mMで塩酸リジン、例えば10％v/vでグリセロー
ルのようなポリアルコール及び例えば10mMでカルシウム
イオンが緩衝液中に通常含有される。他の有用な緩衝液
はビス−トリス緩衝液、例えばpH6.0〜6.5の100mMビス
−トリス及びトリス緩衝液、例えばpH7〜８の100mMトリ
スである。緩衝液はリガンドに応じて1.0M以内で塩化ナ
トリウムを含有していてもよい。
次いで分離用の因子VIII含有物質はカラムに充填される
が、固体である場合それは通常適切な緩衝液、好ましく
はカラムを平衡化するために用いられる緩衝液に溶解さ
れる。一方、分離媒体はバッチ式でしばらく緩衝液平衡
化因子VIII含有物質と混ぜ、遠心により集め、カラムに
注ぎ、しかる後クロマトグラフィー溶出させてもよい。
この技術は特に因子VIII含有物質が血漿のように低い効
力である場合に有用である。因子VIII含有物質が血漿で
ある場合、それは例えばセファデックスG25のようなセ
ファデックスを用いて適切な緩衝液、例えば塩化ナトリ
ウムと緩衝液交換してよい。それは吸着剤、例えばDEAE
−セファデックスとの処理である汚染タンパク質、例え
ばプロトロンビンを除去するため前処理してもよい。
充填の後に、望ましくはカラムを平衡化するために用い
られた緩衝液で洗浄する。
カラムの展開は平衡化に用いられた種類の緩衝液中で電
解質の濃度を増加させた溶液により行われる。電解質は
慣用的に塩化ナトリウムであるが、但し他の塩、例えば
塩化カルシウムと共に塩化アンモニウム、硫酸ナトリウ
ム、硫酸アンモニウム、クエン酸三ナトリウムも使用可
能である。濃度勾配又は濃度の段階的増加のいずれかが
用いられる。電解質濃度の段階的増加が用いられる場
合、低濃度の電解質が因子VIII以外の結合タンパク質を
除去するため最初に用いられ、しかる後高濃度で因子VI
IIを除去するために用いられる。因子VIII溶出用に加え
られる電解質の濃度は例えばリガンドに応じて塩化ナト
リウム0.2〜4.0Mの範囲である。濃度勾配を増加させる
ことによる溶出は２段階以上で行ってもよい。
分離用の因子VIII含有溶液には、例えば全血漿、プロト
ロンビンを除去するため前処理された血漿、寒冷沈降
物、中間純度濃縮物（IPC）、高純度濃縮物（HPC）又は
ほとんどのフィブリノーゲン、フィブロネクチン及びビ
タミンＫ依存性凝固因子を除去するため前処理された寒
冷沈降物の溶液がある。これらの溶液はウイルス不活性
化のために溶媒−界面活性剤系、例えばリン酸トリ−ｎ
−ブチル及びツィーン（Tween）80で処理してもよく、
我々はこれらの物質が因子VIIIの吸着及び溶出に影響を
与えないことを発見した。
因子VIIIは通常フォンビルブラント因子（vWF）と共に
このような出発物質中に存在しており、この形で但し通
常因子VIII対vWFの比率を増加させて分離される。因子V
IIIを汚染するフィブリノーゲン及びフィブロネクチン
の量はこの方法で約50倍に減少せしめられる。因子VIII
の純度はこの方法で少なくとも50倍まで増加せしめられ
る。
下記例及び製造は実施及び添付図面により示されている
が、その場合に図１は様々なリガンドからの因子VIIIの
溶出に要するNaCl濃度及びＱ値の相互関係について示
し、各ポイントによる数値は表４で番号化されたリガン
ドに関する。
物質 化学物質 ポリアミン化合物は通常アルドリッチ（Aldrich）から
入手し、一方ペンタエチレンヘキサミンはフカル（Fluk
a）製であった。ポリアミンＣ及びＧ（表１）はVan Alp
hen,J.（Recueil des Travaux Chimiques des Pays−Ba
s,55,835（1936）及び同ジャーナル,56,343（1937））
に従い合成し、ポリビニルアミンは通常市販される試薬
を用いてDawson,D.J.,Gless,R.D.及びWingaard,R.E.
（J.Am.Chem.Soc.98,5996−6000（1976））に従い合成
した。カップリング剤はシグマ（Sigma）（1,4−ブタン
ジオールジグリシジルエーテル及びカルボニルジイミダ
ゾール）及びBDH（エピクロロヒドリン）から入手し
た。
支持体 セファロース、セファデックス及びセファクリルはファ
ルマシア（Pharmacia）から入手した。トリスアクリル
はIBF−LKBから入手した。フラクトゲルはBDHから入手
した。
一般的カップリング操作 カルボニルジイミダゾール（CDI） ゲルは濃度を増加させながら適切な溶媒、例えばアセト
ンで及び最後に生溶媒での連続洗浄により非水性環境に
移してもよい。
少量、例えば3.5g/100mlゲルのカルボニルジイミダゾー
ルを室温で15分間ゲルと反応させる。次いで活性化され
たゲルをアセトンのような多量の溶媒で迅速に洗浄し、
しかる後環境温度で約17時間ポリアミン化合物の水溶液
と反応させる。この溶液の濃度は約10％v/vであること
が好ましく、pHは９〜11に調整する。次いでカップリン
グされたゲルを水、希酢酸及び最後に水で徹底洗浄す
る。
ポリアミンが結合されている支持体がセファクリルＳ−
500であった場合には、活性化、洗浄及びカップリング
ステップはすべて溶媒として乾燥アセトンを用いて行っ
た。更に、カップリングステップは４℃で行った。エピ
クロロヒドリン（ECH） 洗浄された吸引乾燥ゲル100gに水素化ホウ素ナトリウム
200mg及び2M水酸化ナトリウム溶液50mlを加える。エピ
クロロヒドリン６×5mlずつ及び水酸化ナトリウム溶液
６×10mlずつを２時間かけて加え、その際にゲルを室温
で撹拌する。混合物を更に15時間撹拌し、しかる後ゲル
を水で徹底洗浄する。
次いで活性化されたゲルを2M炭酸ナトリウム溶液に溶解
されpH約11に調整されたポリアミン化合物約10％及び水
素化ホウ素ナトリウム0.1％含有の等容量の溶液に加
え、混合物を60℃で約20時間撹拌する。ゲルを水、水性
酢酸及び最後に水で徹底洗浄する。
ポリアミンが結合されている支持体がフラクトゲルTSK
HW−55であった場合には、下記方法を用いた。洗浄さ
れた吸引乾燥ゲル100gを約40℃の温度で２時間にわたり
9M水酸化ナトリウム溶液60ml、水80ml及びECH60mlと混
ぜる。ゲルを濾取し、水洗し、しかる後60℃で３時間に
わたりポリアミンの10％水溶液100mlと混ぜる。ゲルを
水、しかる後水性酢酸及び最後に水で徹底洗浄する。
1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテル（BDE） 1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテルを用いるカ
ップリングはエピクロロヒドリンに関して記載された場
合と本質的に同一であるが、但し活性ステップにおいて
吸引乾燥ゲルを等容量の0.6M NaOH溶液及び等容量の1,
4−ブタンジオールジグリシジルエーテルと１ステップ
で混ぜる。
リガンド（Ｃ）及び（Ｇ）の合成（表１） 構造H2N（CH2）2NH（CH2）3NH（CH2）2NH2（Ｃ）及びH2
N（CH2）2NH（CH2）3NH（CH2）2NH（CH2）3NH（CH2）2N
H2（Ｇ）を有するこれらのリガンドはVan Alphen,J.のR
ecueil des Travaux Chimiques des Pays−Bas,55,835
（1936）及び同著者の同ジャーナル,56,343（1937）に
従い合成した。実験の詳細は簡単には下記のとおりであ
る:1,2−ジアミノエタン（45ml、0.67mol）及び無水エ
タノール（40ml）を250ml丸底フラスコにいれ、それに
水冷コンデンサー及び1,3−ジブロモプロパン（12.5m
l、0.124mol）含有均圧化滴下漏斗を装備した。フラス
コの内容物を磁気撹拌し、1,3−ジブロモプロパンを穏
やかな還流を維持するように滴下した。添加終了後、混
合物を還流下で１時間加熱した。撹拌を続け、水酸化カ
リウム35gを加え、混合物を再度還流下で30分間加熱し
た。固体KBrを濾取し、エタノール及び1,2−ジアミノエ
タンを留去した。残渣を冷却して固体物及び黄色液体を
得たが、その液体はデカントした。液体を減圧（約18mm
Hg）蒸留により分別化した。沸点範囲164−166℃及び約
208℃（18mmHg）を有する２分画を集めた。第一分画は
第二の約２倍容量であり、双方とも淡黄色であった。第
一分画の沸点は常圧で280−290℃の範囲内であったが、
これはそれが化合物（Ｃ）であることを同定する。Van
Alphenの研究から判断して、高沸点側の分画は化合物
（Ｇ）であろう。タール様残渣は減圧蒸留後にフラスコ
内に残留した。
アッセイ 1.因子VIIIアッセイは２段階凝固アッセイに関する標準
的方法又はProwse,C.et al,Vox Sang.50,21−25（198
6）の方法に従うコーテスト（Coatest）因子VIIIアッセ
イキット（Kabi）の使用のいずれかにより行った。
2.全タンパク質はブラッドフォードアッセイ（Bradfor
d,M.M.,Anal.Biochem.,72,248−254（1976））を用いて
測定した。
3.ゲル上に固定されたリガンド濃度は一級アミン基を検
出するためピクリルスルホン酸を用いて測定した。湿潤
静置ゲル0.50mlを室温で約１時間にわたり飽和水性テト
ラホウ酸ナトリウム中ピクリルスルホン酸の2.5mg/ml溶
液9.5mlと混ぜた。ゲルを遠心で集め、ペレットを上澄
が無色になるまで数回洗浄した。ペレットの溶解は5M
HCl 9.5mlの添加及び75℃加熱により行った。サンプル
5M HClで更に希釈し（20又は40倍のいずれか）、OD349
値を測定した。ε−アミノカプロン酸の40mM溶液を標準
として用いた。この溶液0.5mlをピクリルスルホン酸溶
液9.5mlと反応させた。この溶液0.5mlをサンプルの場合
のように5M HCl 9.5mlで処理し、OD349値を読取り、
必要であれば5M HClで溶液を２倍希釈した。ピクリル
スルホン酸試薬ブランクも調製し、OD349値をサンプル
ではなく標準に関する場合から差し引いた。
熱5M HClに不溶性である３種のゲル、即ちTETA−セフ
ァクリルＳ−500、TETA−フラクトゲルTSK HW−55及び
TETA−トリスアクリルGF2000に関して、リガンド濃度を
酸／塩基滴定により測定した。
4.特定のタンパク質（フィブリノーゲン、フィブロネク
チン及びvWF）をLaurell,C−Ｂ（1972）Scand.J.Clin.l
nvest.,29,Suppl.,124,21−37の方法により分析した。
緩衝液 緩衝液A:0.1M酢酸、0.1MリジンHCl、 10％（v/v）グリセロール、 10mMCaCl2、pH5.50 緩衝液B:0.1M酢酸、0.1MリジンHCl、 pH5.50 緩衝液C:0.2M酢酸、1mMイミダゾール、 pH5.50 緩衝液D:緩衝液Ａと同様だが、但しpH5.0 緩衝液E:0.1Mビス−トリス、 0.1MリジンHCl、 10％（v/v）グリセロール、 10mMCaCl2、pH6.0 緩衝液F:緩衝液Ｅと同様だが、但しpH6.5 緩衝液G:0.1Mトリス、0.1MリジンHCl、 10％（v/v）グリセロール、 10mMCaCl2、pH7.0 緩衝液H:緩衝液Ｇと同様だが、但しpH7.9 すべての緩衝液は更に保存剤として0.02％アジ化ナトリ
ウムを含有していた。
因子VIII含有溶液の調製方法 “寒冷沈降物”は解凍物の温度が０〜２℃に保たれるよ
うに新鮮凍結血漿を解凍することで形成した。寒冷沈降
物を遠心により解凍懸濁物から集め、24ml緩衝液/kg血
漿を用いてpH7.0の20mMトリス緩衝液に溶解した。この
溶液は“寒冷溶液”と呼ばれ、更に溶液を10℃に冷却し
て遠心により生じた沈降物を除去することにより精製し
た。上澄をpH7.0に調整し、5mlゲル/kg原血漿の割合で
アルヒドロゲル（Alhydrogel）〔デンマークのスーパー
ホス（Superfos）製の2.0％Al（OH）３〕で処理した。
アルヒドロゲルを遠心除去し、上澄を膜濾過により滅菌
し、ガラスバイアルに分配し、凍結乾燥した。この調製
物は“中間純度因子VIII濃縮物”（IPC）と呼ばれ、原
容量に再調製した場合におよそ下記の組成を有する： 因子VIII:5.6iu/ml 全タンパク質:21mg/ml vWF:12.5u/ml フィブリノーゲン:19mg/ml フィブロネクチン:4.3mg/ml 代わりに、寒冷溶液中の因子VIIIをpH6.4〜6.6及び温度
25〜30℃で0.6〜0.9mg/mlの最終濃度までのヘパリンナ
トリウムUSPの添加と沈降フィブリノーゲン及びフィブ
ロネクチンの遠心除去により精製した。この因子VIIIに
富む上澄は“ヘパリン上澄”と呼ばれ、およそ下記の組
成を有する： 因子VIII:7.2iu/ml 全タンパク質:12.2mg/ml vWF:33u/ml フィブリノーゲン:4.5mg/ml フィブロネクチン:1.9mg/ml 代わりに、寒冷溶液中の因子VIIIを前記のようなヘパリ
ンナトリウムの添加しかる後濃度２〜12％v/vでアルヒ
ドロゲルの添加により精製した。フィブリノーゲン、フ
ィブロネクチン及びアルヒドロゲルの重沈降物を遠心除
去した。得られた因子VIIIに富む上澄は“ヘパリン／ア
ルヒドロゲル上澄”と呼ばれ、ヘパリン上澄の場合と同
様の組成を有するが、但しビタミンＫ依存性凝固因子
（例えば、因子II、IX及びＸ）は欠乏していた。
ヘパリン上澄中の因子VIIIをpH7.0及び30℃で各々1.48M
及び2.36Mの最終濃度までのグリシン及びNaClの添加と
遠心による因子VIIIに富む沈降物の回収によって更に精
製した。沈降物を原血漿容量の約1/520で0.10M塩化ナト
リウム、0.01Mトリス、0.01Mクエン酸ナトリウム、1.2m
M塩化カルシウム、1.5％（w/w）スクロース、pH6.9緩衝
液に再溶解し、しかる後ゲル濾過媒体セファデックスＧ
−25を用いて同緩衝液で脱塩した。
因子VIII溶液を膜濾過により滅菌し、無菌ガラスバイア
ルに分配し、凍結乾燥し、80℃で72時間加熱してウイル
スを不活性化した。この調製物は“高純度濃縮物”（HP
C）と呼ばれ、原容量に再調製した場合におよそ下記の
組成を有する： 因子VIII:23.5iu/ml 全タンパク質:6.0mg/ml vWF:62.3u/ml フィブリノーゲン:4.6mg/ml フィブロネクチン:0.31mg/ml カラムクロマトグラフィー すべてのクロマトグラフィーは室温及びカラムサイズに
適した流速で行った。溶出液中における全タンパク質は
LKBユビコード（LKB Uvicord）を用いて280nmでモニタ
ーした。高純度濃縮因子VIIIサンプルを室温37℃で適切
な充填緩衝液に溶解し、不溶性物質をカラム充填前に遠
心で除去した。充填後、カラムをOD280がベースライン
近くになるまで充填緩衝液で洗浄した。次いでタンパク
質を塩濃度のステップ又は勾配増加のいずれかにより溶
出させた。勾配は蠕動ポンプ〔ギルソン（Gilson）〕の
３チャンネルを用いて形成させた。次いで溶出因子VIII
活性の位置を測定し、OD280トレース上にプロットし
た。分画中の塩化ナトリウム濃度は導電率計及び適切な
検量曲線を用いて決定した。溶出を段階的に行った場合
には、低濃度側は約５％以上の充填因子VIII活性を除去
せずに結合タンパク位置を溶出させるために最初に用
い、しかる後高濃度側を因子VIIIを除去するために用い
た。適切な電解質濃度は各マトリックス毎に決定した。
例１ 分離媒体の合成 前記カップリング方法、リガンド及び支持体を用いて、
下記分離媒体を合成した。
ポリアミンリガンドＡ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリアミンリガンドＢ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリアミンリガンドＣ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリアミンリガンドＤ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリアミンリガンドＥ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリアミンリガンドＦ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリアミンリガンドＧ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリアミンリガンドＨ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリアミンリガンドＩ−セファロース4B−ECHカップリ
ング ポリエチレンイミン−セファロース6B−ECHカップリン
グ ポリアリルアミン−セファロース4B−ECHカップリング ポリビニルアミン−セファロース4B−ECHカップリング TETA−トリスアクリルGF2000−CDIカップリング TETA−セファデックスG25−ECHカップリング TETA−セファクリルＳ−500−CDIカップリング TETA−フラクトゲルTSK HW5−ECHカップリング TETA−セファロース6B−ECHカップリング Ｎ−メチル化TETA−セファロース4B−ECHカップリング TETA−セファロース4B−BDEカップリング TETA−セファロースCL−6B−CDIカップリング 例２ ECHカップリングされたTETA−セファロース4B、HPCの精
製 TETA−セファロース4B（ECHカップリング、27μmol/ml
リガンド濃度）の10mlカラム（1.6×5.0cm）を緩衝液Ａ
約50mlで充填かつ平衡化した。
緩衝液A20mlに溶解された２バイアルの高純度濃縮物の
サンプル（バッチ8Y2278）をカラムを流速60ml/hrで充
填した。次いでカラムを緩衝液Ａ（50ml）、緩衝液Ａ＋
0.25M NaCl（100ml）及び最後に緩衝液Ａ＋1.0M NaCl
（40ml）で連続的に洗浄かつ溶出した。10ml分画を集
め、塩濃度の変化に従いプールした。因子VIII活性及び
全タンパク質量を出発物質及びプールされた分画におい
て測定した。結果は表２で示されている。
例３ ECHカップリングされたTETA−セファロース4B、ヘパリ
ン上澄の精製 TETA−セファロース4B（33μmol/ml、ECHカップリン
グ）の1.0mlカラム（0.7×2.6cm）を緩衝液Ａで平衡化
した。
ヘパリン上澄（８倍容量）をグリセロール（１倍容
量）、pH5.5の1MリジンHCl/1M酢酸（１倍容量及び1M塩
化カルシウム（0.1倍容量）の混合物の添加によりクロ
マトグラフィー用に調製した。因子VIII約100iu含有サ
ンプルをカラムに流速10ml/hrで充填した。次いでカラ
ムを緩衝液Ａ（10ml）、緩衝液Ａ＋0.20M NaCl（10m
l）及び最後に緩衝液Ａ＋1.0M NaCl（5ml）で連続的に
洗浄した。
分画プールを例２のように処理し、因子VIII活性、全タ
ンパク質、vWH、フィブロネクチン及びフィブリノーゲ
ンに関して試験した。結果は表３で示されている。
例４ ８種のポリアミンリガンドにECHカップリングされたセ
ファロース4B、HPCの精製 一連の８種の異なるポリアミンリガンド（表１）がECH
カップリングにより結合されたセファロース4Bゲルを下
記方法で因子VIII精製に関して試験した。10mlカラム
（1.6×5.0cm）を緩衝液Ｂで充填し、平衡化させた。サ
ンプルは高純度濃縮物、バッチ8Y2278であり、緩衝液B1
0ml中１バイアル濃縮物の溶解により調製した。カラム
を流速60ml/hrで充填し、しかる後溶出液のOD280がベー
スラインに近づくまで緩衝液Ｂで洗浄した。次いで結合
タンパク質の溶出を緩衝液Ｂ中で通常全容量130mlの直
線塩化ナトリウム勾配により行った。
勾配はすべてのケースで0.0〜1.0Mであったが、但し化
合物Ｇの場合にはカラムを最初0.50M NaCl（40ml）で
洗浄してから0.50〜1.5M勾配（130ml）を用い、化合物
Ｈの場合には0.0〜1.3M勾配（130ml）を用いた。
勾配は蠕動ポンプ（ギルソン）の３チャンネルを用いて
形成し、10ml分画を集めた。溶出因子VIII活性及び塩化
ナトリウム濃度（導電率計及び適切な検量曲線を用いて
決定）をOD280トレース上に分画数値に対してプロット
した。結果は表４で示されているが、その場合に“相対
的能力”と記載された欄は溶出タンパク質のピークから
の溶出因子VIII活性のピークの分離の目視評価に関す
る。
これらの結果から、計算Ｑ値とリガンドの能力との間に
良好な関係が存在することがわかる。因子VIIIピークが
図１で示されたように溶出された塩化ナトリウムの濃度
とＱ値との間にも直線的関係が存在する。
例５ 小さな方のポリアミンに関する場合と同様の方法を用い
て、セファロースゲルを３種のポリマーアミノ化合物：
ポリエチレンイミン（PEI）、ポリビニルアミン及びポ
リアリルアミンを用いて製造した。これらのマトリック
スは例２及び４の一般的方法を用いて因子VIII精製に関
し試験した。
（ｉ）ECHカップリングされたPEI−セファロース6B、HP
Cの精製 PEI−セファロース6B（ECHカップリング）2.0mlのカラ
ム（1.6×1.0cm）を緩衝液Ａ＋0.5M NaClで平衡化させ
た。２バイアルの高純度濃縮物（バッチ8Y2278）を同緩
衝液20mlに溶解し、そのカラムに流速18ml/hrで充填し
た。カラムを短い（28ml）0.5〜0.7M NaCl勾配しかる
後0.7〜2.0M NaCl勾配（25ml）で連続的に溶出させ
た。結果は表５で示されている。
（ii）ECHカップリングされたポリアリルアミン−セフ
ァロース4B、HPCの精製 このゲルを例５（ｉ）の方法と同様にして試験した。緩
衝液Ａ＋0.90M NaClを用いてサンプルを調製しかつカ
ラムを平衡化し、サンプルの充填後にカラムを充填緩衝
液で洗浄し、しかる後結合タンパク質を0.9〜2.3M NaC
l勾配で溶出させた。充填された因子VIIIの６％が吸着
されず、82％が約50倍の精製度で溶出液中に回収され
た。
（iii）ECHカップリングされたポリビニルアミン−セフ
ァロース4B、HPCの精製 このゲルを例５（ii）の方法と同様にして試験したが、
但し初期NaCl濃度は1.0Mであり、1.0〜3.5M NaCl勾配
を溶出に用いた。因子VIIIの11％は未結合のままであ
り、66％が更に約50倍の精製度で溶出液中に回収され
た。
例６ 様々な支持体にカップリングされたTETA TETAはセファロース以外の支持体に結合させてもよく、
そのマトリックスは因子VIII精製に用いることができ
る。
（ｉ）CDIカップリングされたTETA−トリスアクリルGF2
000、HPCの精製 例２を繰り返したが、但し支持体としてトリスアクリル
GF2000を用い、それにTETAがCDI法により57μmol/mlの
レベルで結合された。充填された因子VIIIの53％が80倍
の比活性増加で溶出した。
（ii）ECHカップリングされたTETA−セファデックスG2
5、HPCの精製 例２を繰り返したが、但し支持体としてセファデックス
G25を用い、それにTETAがECH法により89μmol/mlのレベ
ルで結合された。カラムを緩衝液Ｂで平衡化させ、緩衝
液B10mlに溶解された高純度濃縮物１バイアルのサンプ
ルを充填した。カラムを充填緩衝液で洗浄し、緩衝液＋
0.30M NaClで溶出させた。適用された因子VIIIの47％
が約50倍の比活性増加で回収された。
（iii）CDIカップリングされたTETA−セファクリルＳ−
500、HPCの精製 CDI法を用いて製造されかつ28μmol/mlの置換レベルを
有するTETA−セファクリルＳ−500の2.0ml（1.0×2.5c
m）カラムを緩衝液Ａで平衡化させた。高純度濃縮物１
バイアルを例２で記載されたように調製、充填かつ溶出
させたが、但し0.30M NaClを洗浄緩衝液に用いた。充
填因子VIII活性の99％が少なくとも50倍の比活性増加で
溶出液中に回収された。
（iv）ECHカップリングされたTETA−フラクトゲルTSK
HW−55、ヘパリン上澄の精製 ECH法を用いて製造されかつ57μmol/mlの置換レベルを
有するTETA−フラクトゲルTSK HW−55の2.0ml（1.0×
2.5cm）カラムを緩衝液Ａで平衡化させた。因子VIII166
iu含有ヘパリン上澄のサンプルを例３の方法に従い調製
し、カラムに充填した。非吸着タンパク質は緩衝液Ａを
用いて除去し、洗浄を緩衝液Ａ＋0.25M NaClを用いて
行い、緩衝液Ａ＋1.0M NaClを用いて因子VIIIを溶出さ
せた。充填因子VIII活性の70％が115倍の精製度で溶出
液中に回収された。
例７ 異なる出発物質からの因子VIIIの精製 前例で記載された場合以外の因子VIII出発物質も用いる
ことができる。
（ｉ）ECHカップリングされたTETA−セファロース4Bで
精製されたIPC 中間純度濃縮物１バイアルを緩衝液B30mlに溶解し、例
２で記載されたようにクロマトグラフィーに付したが、
但し緩衝液Ｂを緩衝液Ａの代わりに用い、0.30M NaCl
を低塩洗浄に用いた。結果は表６で示されている。
（ii）TETA−セファロース6Bで精製された血漿 血漿20mlをセファデックスＧ−25のカラム （2.0×18.0cm）を用いてpH7.4の水中75mMNaClと緩衝液
交換した。プールされた溶出液（32ml）を1.0M酢酸、1.
0MリジンMCl、pH5.50（4.0ml）、グリセロール（4.0m
l）及び1M CaCl2（0.4ml）と同時に混ぜた。混合物のp
HはpH5.0の1.0M酢酸を用いて5.50に調整した。TETA−セ
ファロース6B（ECHカップリング、リガンド濃度48μmol
/ml）のサンプルを各々５倍容量の0.1M NaOH、水、0.1
M HCl及び緩衝液Ａで洗浄した。ゲル1.0gを調整された
血漿39mlと１時間混ぜ、しかる後遠心（150g、15分間）
により集め、カラムに注いだ。カラムを緩衝液Ａ（6m
l）で洗浄し、しかる後緩衝液Ａ＋1.0M NaCl（10ml）
で溶出させた。結果は表７で示されている。
（iii）TETA−セファロース6Bで精製されたプロトロン
ピン欠乏血漿 DEAEセファデックスＡ−50 1.5gのサンプルを75mMNaCl
100mlで前膨潤させた。この懸濁液1.66mlを新鮮解凍
血漿50mlと２時間混ぜた。DEAE−セファデックスを遠心
により除去し、上澄22mlを等容量の水で希釈した。その
pHを5.5に調整した後、血漿調製物を例７（ii）で記載
されたようにTETA−セファロース6B1.0gに吸着させて、
クロマトグラフィーに付したが、但しカラムを溶出前に
緩衝液Ａ中0.2M NaClで更に洗浄した。調整された血漿
中で因子VIII活性の75％が比活性2.4iu/mgで溶出液中に
回収された。プロトロンビンの測定では、98.5％がDEAE
−セファデックスによる血漿の処理で除去され、原血漿
プロトロンビンの0.4％のみがTETA−セファロースから
溶出液中に回収されたことを示した。
（iv）TETA−セファロース4Bで精製されたヘパリン／ア
ルヒドロゲル上澄 ヘパリン／アルヒドロゲル上澄のサンプルを室温で一夜
0.3％リン酸トリ−ｎ−ブチル（TNBP）及び１％ツィー
ン80で処理し、しかる後サンプルを例３で記載されたよ
うにクロマトグラフィー用に調製した。次いでこの溶液
23mlを緩衝液Ａで平衡化されたTETA−セファロース4B
（ECHカップリング、32μmol/mlTETA）1.0mlのカラムに
充填した。カラムを例２で記載されたように展開した
が、但し低塩洗液0.20M NaClを含有していた。結果は
表８で示されている。
例８及び９ 化合物２のようなポリアミンリガンド（TETA）の因子VI
IIに対するクロマトグラフィー性質を変えることは遷移
金属結合及び化学反応により可能である。
例８ ECHカップリングされCuIIで担持されたTETA−セファロ
ース4B、IPCの精製 TETA−セファロース4Bのサンプルを常法で但し緩衝液で
はなく水を用いてカラム（10ml）に充填し、しかる後水
中CuCl2の10mg/ml溶液の通過によりCuIIイオンで担持さ
せた。CuIIイオンによるマトリックスの飽和は、マトリ
ックスがブリリアントブルーになるため容易に観察でき
た。カラムを水、1.0M NaCl含有pH7.0の100mMイミダゾ
ール緩衝液及び最後に緩衝液Ｃで洗浄した。中間純度濃
縮物のサンプルを緩衝液Ｃで調製し、カラムに充填し
た。カラムを緩衝液で洗浄し、結合タンパク質を0.0〜
1.0M NaCl勾配で溶出させた。ピーク因子VIII活性は0.
38M NaClの濃度で溶出し、全体回収率は61％であっ
た。
例９ ECHカップリングされたＮ−メチル化TETA−セファロー
ス4B、HPCの精製 カップリング剤としてECHを用い前記のように製造され
たTETA−セファロース4Bのサンプルは、すべての窒素を
完全にメチル化して下記リガンド構造： を与えることが予想される条件下でヨウ化メチルと反応
させた。ゲル20mlをメタノールの環境下に移し、同溶媒
80mlに懸濁した。ヨウ化メチル4.0ml及び炭酸水素カリ
ウム4.0gを加え、混合物を40℃で３日間撹拌した。ゲル
を水性環境に戻し、（ａ）CuIIイオンと結合する及び
（ｂ）ピクリルスルホン酸と反応するその能力に関して
試験したが、双方とも陰性であることが判明した。
改良ゲルのカラムは高純度濃縮物のサンプルを緩衝液Ｂ
にいれ、カラムを更に緩衝液Ｂ、緩衝液Ｂ＋0.1M NaCl
及び最後に緩衝液Ｂ＋0.2M NaClで洗浄することにより
試験した。充填された活性の46％が適切な条件下におい
て未改良TETAで得られた場合と同様の純度で0.2M NaCl
分画中に回収された。
例10 リガンド（TETA）及びゲル間にスペーサーを含んだマト
リックスの使用 TETA−セファロース4Bは前記のようにカップリング剤と
して1,4−ブタンジオールジグリシジルエーテルを用い
て製造した。カップリングされたTETAの量は18.0μmol/
mlであった。ゲルは例４の方法を用いて因子VIII精製に
関して試験した。結果は、ECHがゲルの製造でカップリ
ング剤として用いられた場合よりも因子VIII及び全タン
パク質の双方が強固に結合していないことを示した。ピ
ーク因子VIIは165mMNaClで溶出し、全体回収率は89％で
あった。
例11 クロマトグラフィーに関するpHのバリエーション 異なるpH5.0〜7.9の緩衝液をクロマトグラフィーに用い
た。CDI法を用いて製造されかつ39μmol/mlの置換レベ
ルを有するTETA−セファロースCL−6Bの2.0ml（1.0×2.
5cm）カラムを具体的実験のため適切な緩衝液で充填か
つ平衡化した。１バイアルの高純度濃縮物（バッチ8Y34
92）を適切な緩衝液10mlで再調製し、カラムに流速24ml
/hrで充填した。未結合タンパク質を更に充填緩衝液で
除去し、0.25M NaCl洗浄を行い、しかる後1.0M NaCl
で溶出させた。未結合のまま残留した充填因子VIIIの率
及び1.0M NaCl溶出液中に回収された率は表９で示され
ている。試験されたpHの中では、pH5.5が1.0M NaCl溶
出液中における因子VIIIの回収率及びその未結合残留に
よる損失の最少化にとり最適である。
例12 溶出用にNaCl以外の塩の使用 いくつかの実験を例６（iii）で記載されたように行っ
た。0.30M NaCl洗浄後、結合因子VIIIは緩衝液Ａを用
いて回収し、特定の塩について試験した。因子VIIIの回
収率は表10で示されている。
このようにNaCl以外の塩も因子VIIIの溶出に用いてよい
が、溶出液中で達成される回収率は塩の同一性に依存し
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−136518（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−157000（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−26227（ＪＰ，Ａ)

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】多数のポリアミン基を有する非水溶性マト
    リックスからなるタンパク質分離用の分離媒体であっ
    て、 上記ポリアミン基が少なくとも３つの塩基性窒素原子を
    有し、上記塩基性窒素原子が少なくとも２つの介在炭素
    原子の鎖で互いに分離され、各ポリアミン基に全部で３
    つの窒素原子がある場合には全部で５つのかかる介在炭
    素原子が存在することを特徴とする分離媒体。
  2. 【請求項２】マトリックスが有機マトリックスである、
    請求項１に記載の分離媒体。
  3. 【請求項３】各ポリアミン基が少なくとも４つの窒素原
    子を有する、請求項１又は２に記載の分離媒体。
  4. 【請求項４】各ポリアミンが直鎖、分岐鎖、単環式又は
    多環式ポリアミン基である、請求項１、２又は３に記載
    の分離媒体。
  5. 【請求項５】マトリックスに結合されたポリアミン基が
    異なる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分離媒
    体。
  6. 【請求項６】窒素原子対間の介在炭素原子がアルキレン
    又はシクロアルキレン基を形成している、請求項１〜５
    のいずれか一項に記載の分離媒体。
  7. 【請求項７】ポリアミン基がアルキレン基中に炭素原子
    ２又は３を有する直鎖ポリアルキレンポリアミン基であ
    る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離媒体。
  8. 【請求項８】ポリアミン基がトリエチレンテトラアミン
    である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の分離媒
    体。
  9. 【請求項９】非水溶性マトリックスが親水性ポリマー物
    質である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離媒
    体。
  10. 【請求項１０】マトリックス物質がアガロース、セルロ
    ース、デキストラン、大孔質シリカ又はポリアクリルア
    ミドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の分離
    媒体。
  11. 【請求項１１】ポリアミンが炭素原子１〜10を有する二
    官能性カップリング試薬を用いてマトリックスにカップ
    リングされる、請求項１〜10のいずれか一項に記載の分
    離媒体。
  12. 【請求項１２】カップリング試薬がエピクロロヒドリ
    ン、カルボニルジイミダゾール又は1,4−ブタンジオー
    ルジグリシジルエーテルである、請求項11に記載の分離
    媒体。
  13. 【請求項１３】エピクロロヒドリンを介してトリエチレ
    ンテトラアミンにカップリングされたアガロースゲルで
    ある、請求項１に記載の分離媒体。
  14. 【請求項１４】請求項１に記載された分離媒体上に因子
    VIII含有サンプルを担持させ、洗浄し、因子VIIIに富む
    分画を溶出させることからなる、少なくとも部分的な因
    子VIII精製方法。
  15. 【請求項１５】因子VIII含有物質が全血漿、寒冷沈降物
    又は部分的精製因子VIIIである、請求項14に記載の方
    法。
  16. 【請求項１６】カラムクロマトグラフィーにより実施さ
    れる、請求項14又は15に記載の方法。
  17. 【請求項１７】因子VIII含有物質がpH5.0〜8.0の充填緩
    衝液存在下で分離媒体上に担持される、請求項14、15又
    は16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】pHが5.5である、請求項17に記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】充填緩衝液が0.2Mのイオン強度である、
    請求項17又は18に記載の方法。
  20. 【請求項２０】溶出が電解質の濃度を増加させながら行
    われる、請求項14〜19のいずれか一項に記載の方法。
  21. 【請求項２１】電解質濃度が0.2〜4.0Mである、請求項2
    0に記載の方法。
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU646889B2 (en) * 1990-10-10 1994-03-10 Brigham Young University Polytetraalkylammonium and polytrialkylamine containing ligands bonded to inorganic supports and processes of using the same for removing and concentrating desired ions from solution
DE4204694C3 (de) * 1992-02-01 1995-10-12 Octapharma Ag Verfahren zur Gewinnung von hochreinem, virusinaktiviertem Faktor VIII mittels Anionenaustauscher-Chromatographie
AUPM632894A0 (en) * 1994-06-21 1994-07-14 Alldredge, Robert Louis Immobilised branched polyalkyleneimines
DE59703340D1 (de) * 1996-08-17 2001-05-17 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Quantifizierung von Glykosaminoglykanen in Antithrombin III-haltigen Lösungen
EP1820516B1 (en) * 1999-02-22 2013-07-24 University of Connecticut Novel albumin-free factor VIII formulations
ATE346856T1 (de) * 2000-02-08 2006-12-15 Upfront Chromatography As Neue harze und ihre verwendung zur rückgewinnung von proteinen oder peptiden
DE10011481A1 (de) * 2000-03-09 2001-10-18 Fresenius Hemocare Gmbh Adsorbens zum Absenken der Konzentration von Fibrinogen und/oder Fibrin, Verwendung des Adsorbens zur Herstellung eines Adsorbers und Adsorber mit dem Adsorbens
FR2811985A1 (fr) * 2000-07-19 2002-01-25 Univ Bretagne Occidentale Procede de synthese de la n1, n3-bis(2-aminoethyl)propane- 1,3-diamine, intermediaires de synthese, produits ainsi obtenus et leur application a la synthese de cyclam
GB0028414D0 (en) * 2000-11-22 2001-01-03 Univ Leeds Flush preservation solution
CA2517149A1 (en) * 2003-03-07 2004-09-16 University College Cork - National University Of Ireland, Cork A process for the synthesis of a chromatographic phase
US7479222B2 (en) 2004-02-05 2009-01-20 Millipore Corporation Porous adsorptive or chromatographic media
US9433922B2 (en) 2007-08-14 2016-09-06 Emd Millipore Corporation Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same
DE202008017854U1 (de) 2007-08-14 2010-08-19 Millipore Corp., Billerica Mittel zur Ionenaustausch-Membranchromatographie auf der Basis von primären polymerischen Aminen, Sorptionsvorrichtung mit diesem Mittel, Chromatographieverfahren und Reinigungsverfahren unter dessen Verwendung
US20090130738A1 (en) * 2007-11-19 2009-05-21 Mikhail Kozlov Media for membrane ion exchange chromatography
WO2009145722A1 (en) * 2008-05-30 2009-12-03 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Separation method utilizing polyallylamine ligands
EP2385825B1 (en) 2008-11-07 2018-10-10 University of Connecticut Factor viii formulations
CN102655876B (zh) 2009-11-03 2015-07-15 基立福疗法公司 α-1蛋白酶抑制剂组合物、方法和试剂盒
BR112012012460B1 (pt) 2009-11-24 2020-06-23 Grifols Therapeutics Inc. Método de liofilização de uma composição
EP2652491B1 (en) 2010-12-15 2017-11-29 Baxalta GmbH Eluate collection using conductivity gradient
EP2925432A4 (en) * 2012-11-29 2016-08-31 Affigel Ab SUPER-HYDROXYLATED ADSORBENTS AND USES THEREOF
US11059856B2 (en) 2016-09-15 2021-07-13 Klawego Gmbh & Co. Kg Use of a polymeric mesh for the purification of macromolecules
US20210039070A1 (en) 2018-03-15 2021-02-11 Klawego Gmbh & Co. Kg Composite materials for the depletion of contaminants from solutions
KR20210074346A (ko) 2018-10-19 2021-06-21 클라우스 고트샬 오염물질 제거를 위한 여과재, 재료 및 방법
CN110824101B (zh) * 2019-11-14 2022-05-13 兰州蓝星纤维有限公司 一种测定碳纤维表面官能团的方法
AU2025214240A1 (en) 2024-02-02 2026-08-06 Piac Gmbh Materials, processes, and methods for the adsorption of harmful compounds

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2247943A1 (de) * 1971-10-01 1973-04-26 Orion Yhtymae Oy Verfahren zum vernetzen von agarose oder agar
ES471858A1 (es) * 1977-07-25 1979-02-01 Monsanto Co Un metodo para separar el factor especifico de coagulacion de la sangre de una mezcla con otras proteinas de la sangre en un medio fluido
US4471112A (en) * 1982-06-28 1984-09-11 Monsanto Company Heparin polyelectrolyte polymer complex
US4397841A (en) * 1982-06-28 1983-08-09 Monsanto Company Production of blood coagulation factor VIII:C
FR2543448A1 (fr) * 1983-04-01 1984-10-05 Rhone Poulenc Spec Chim Procede de fractionnement du plasma
US4508709A (en) * 1983-12-05 1985-04-02 Armour Pharmaceutical Company Process for purifying factor VIII:C
NL8701915A (nl) * 1987-08-14 1989-03-01 Waander Riethorst Adsorbensmateriaal en toepassing daarvan voor het isoleren van stollingsfaktoren.

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CA2057926A1 (en) 1990-12-09
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ATE88375T1 (de) 1993-05-15
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ES2054361T3 (es) 1994-08-01
CA2057926C (en) 1998-04-28
DK0476038T3 (da) 1993-05-17
US5304638A (en) 1994-04-19
AU644801B2 (en) 1993-12-23
DE69001436D1 (de) 1993-05-27
WO1990014886A1 (en) 1990-12-13
GB8913183D0 (en) 1989-07-26

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