JPH0536038B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、新規な生体成分の定量法に関する。 更に詳しくは、本発明は、生体成分、または生
体成分に酵素を作用させて生じた物質に酸化酵素
を作用させ、生成する過酸化水素を測定すること
により行なう生体成分の定量法に於て、４価のチ
タン化合物と、２−（５−ブロモ−２−ピリジル
アゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピル
アミノ）フエノール又は／及びその塩とから成る
試薬（以下、Ti−PAPS試薬と略称する。）を用
いて行なう新規な生体成分の定量法に関する。 生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測
定することは、その変動が疾病と大きく関連して
いるため、疾患の診断、病態の解明、治療経過の
判定を行なう上で、必須なものとなつている。例
えば、血液中のコレステロール、トリグリセライ
ド、グルコース、尿酸、リン脂質、胆汁酸、モノ
アミンオキシダーゼなどを始め、非常に他種類の
微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断
上役立つていることは周知の通りである。 現在、血清成分の測定法としては、それが酵素
以外のものである場合には、目的成分に特異的に
作用する酵素を用い、また、目的成分が酵素の場
合には、その基質となるべき化合物を用いて、
夫々酵素反応を行ない、これによる生成物を測定
して目的成分量を求める、所謂“酵素法”が一般
に広く普及している。なかでも、H₂O₂生成酵素、
例えば、オキシダーゼを働かせて目的成分に相当
するH₂O₂を生成させ、これをペルオキシダーゼ、
及び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発
色系に導き、これを比色定量することにより目的
成分量を求める方法が、被酸化性呈色試薬の開発
と相まつて増加しつつある。例えば、コレステロ
ール−コレステロールオキシダーゼ、トリグリセ
ライド−リポプロテインリパーゼ−グリセロ−ル
オキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼなどの組合せで
発生するH₂O₂を、ペルオノシダーゼ（POD）、
被酸化性呈色試薬を用いて発色系に導き、その呈
色の吸光度を測定することにより目的成分量を求
める方法である。この方法に於て用いられる発色
成分である被酸化性呈色試薬の代表的なものとし
ては、４−アミノアンチピリンと、フエノール系
化合物又はＮ，Ｎ−ジ置換アニリン系化合物とを
組合せた被酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾチ
アゾリノンヒドラゾン（MBTH）とアニリン系
化合物との組合せ試薬、２，2′−アジノビス（３
−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
（ABTS）、トリフエニルメタン系ロイコ色素等
が挙げられるが、これらはいずれもH₂O₂−POD
系による被酸化性呈色試薬からの脱水素反応の結
果、酸化発色するものである。従つて、試料中に
アスコルビン酸の還元性物質が共存する場合に
は、これらの影響を受けて測定値に負の誤差を生
ずることがしばしばあつた。このような還元性物
質の妨害を避ける為の方法として、アスコルビン
酸オキシダーゼを用いる方法（特公昭56−39198
号公報）、ヨウ素酸若しくはその塩を用いる方法、
又は過ヨウ素酸若しくはこれらの塩を用いる方法
（特開昭56−109595号公報、特開昭56−151358号
公報、特開昭56−107161号公報）等がこれまでに
開示され実施されている。しかしながら、これら
の方法はいずれも一長一短があり、必ずしも全て
に満足のいくものではなかつた。 かかる状況に鑑み、本発明者らは、上記した如
き還元性物質の除去方法を講ずる必要のない、即
ち、共存する還元性物質の影響を受け難い生体微
量成分の定量法について鋭意研究の途上、可溶性
の４価のチタン化合物と、４−（２−ピリジルア
ゾ）−レゾルシノール（以下、PARと略称する。）
若しくは１−（２−ピリジルアゾ）−２−ナフトー
ル（以下、PANと略称する。）とから成る試薬を
用いる方法を見出し、先に特許出願している（特
開昭56−45197号公報）。即ち、この方法は酵素反
応により生成する過酸化水素を錯体形成によつて
捕え、この錯体の吸光度を測定することにより、
還元性物質の影響を殆んど受けずに生体成分の定
量を行ない得るものである。しかしながら、この
PARあるいはPANを用いる方法に於いて生成す
る錯体はいずれも分子吸光係数がやや小さく
（Ti−PAR−H₂O₂三元錯体の場合でε＝36000，
Ti−PAN−H₂O₂三元錯体ではε＝12000）、ま
た、極大吸収波長もどちらも500nm前後と必ずし
も充分長波長側にあるとはいえず（Ti−PAR−
H₂O₂三元錯体の場合でλ_nax＝508nm）、400nm前
後に吸収を有する不純物（ビリルビン、ヘモグロ
ビン等）が共存する血清等の生体体液成分の定量
に於ては感度的にも、精度的にも、未だ充分満足
のいくものではなかつた。 今回本発明者らは、より感度が高く、より長波
長側に吸収を有する三元錯体を形成し得る試薬
と、これを用いる生体成分の定量法について更に
研究を重ねた結果、４価のチタン化合物と２−
（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プ
ロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フエノール
又は／及びその塩とから成る試薬を用いることに
より、その目的を達成し得ることを得、本発明に
到達した。 即ち、本発明は、生体成分又は生体成分に酵素
を作用させて生じた物質に特異的に作用する酸化
酵素を作用させ、生成する過酸化水素を測定する
ことにより行なう生体成分の定量法に於て、生成
する過酸化水素に４価のチタン化合物と、２−
（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プ
ロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フエノール
又は／及びその塩とから成る試薬を反応させて色
素を生成させ、該色素を比色測定することを特徴
とする生体成分の定量法である。 本発明に用いるTi−PAPS試薬のPAPSとして
は、下記構造式 で示される、２−（５−ブロモ−２−ピリジルア
ゾ）−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルア
ミノ）フエノール又は／及びそのモノ又はジ，ナ
トリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩が挙げ
られ、夫々、無水物でも水和物でも良い。 本発明に用いる４価のチタン化合物としては、
例えば、四塩化チタン、四臭化チタン、硫酸チタ
ン等の水溶性のチタン化合物が挙げられるが、通
常、四塩化チタンがより好ましく用いられる。 本発明に用いるTi−PAPS試薬は通常、例えば
下記の如く調製される。 調製例 （Ti−PAPS試薬） (1) 試液 四塩化チタン24mlを4N塩酸に溶解し、全量を
500mlとする。次いで、これを水で希釈して四塩
化チタン濃度１×10^-3mo／の溶液とする。 (2) 試液 ２−（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−
（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フ
エノール二ナトリウム二水塩0.0617gを水に溶解
して100mlとし、１×10^-3mo／の濃度する。 (3) Ti−PAPS試薬 試液及び試液を各40mlとり、水を加えて全
量を100mlとすれば、Ti（）４×10^-4Ｍ，２−
（５−ブロモ−２−ピリジルアゾ）−５−（Ｎ−プ
ロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）フエノール
４×10^-4を含むTi−PAPSの塩酸酸性溶液とな
る。 本発明の定量法に於けるTi−PAPS試薬の使用
量は通常、Ti（）４×10^-4Ｍ，PAPS4×10^-4Ｍ
を含む塩酸酸性溶液（PH３↓）として測定系全容
量の1/20〜3/10、好ましくは1/10〜2/10量用いら
れる。 Ti−PAPS試薬を用いる本発明の生体成分の定
量法に於て、至適PHは６〜８であり、PHをその範
囲に保つための緩衝剤としては特に限定されない
が、通常、リン酸緩衝液がより好ましく用いられ
る。 Ti−PAPS試薬を用いる本発明の生体成分の定
量法は、生体成分、又は生体成分に酵素を作用さ
せて生じた物質に酸化酵素を作用させ、それによ
り生成した過酸化水素を定量することにより間接
的にこれを行なうもので、その定量は、過酸化水
素−チタン（）−PAPS三元錯体の呈色を吸光
度を測定することによつてなされるものである。
従つて、測定手段そのものは通常の吸光光度定量
法のそれと同じであり、装置も通常の吸光光度定
量法に於て用いられる測定装置が同様に用いられ
る。 本発明の定量法は、通常、試料に酸化酵素を作
用させて過酸化水素を生成させるステツプと、次
いでこの過酸化水素をTi−PAPS試薬と反応させ
るステツプの２ステツプで行なわれるか、酵素を
多量に用いること等により１ステツプでも効果的
にこれを行なうことが可能である。 本発明の定量法は酸化還元反応に基づく呈色反
応を利用するものではなく、錯体形成反応に基づ
く呈色を測定するものなので、酸化還元反応を利
用する従来の定量法に於けるが如き共存する還元
性物質による影響は殆んど認められない。従つ
て、生体試料中に共存する還元性物質を先に挙げ
た方法等により除去する必要は全くない。以下に
本法によるグルコースの定量に於て、共存物質の
影響について調べた結果を表にして示す。

【表】 註 0.01Mリン酸緩衝液（PH5.6）0.5mlにグルコ
ースオキシダーゼを2U／ml，N_aN₃を３×10^-4
Ｍの濃度になるように溶解し、これに各共存物
質を含むグルコース標準液（最終濃度1.00×
10^-5Ｍとなる量）を加え、37℃で15分間加温し
た。次いで、前記調製剤に従つて調製したTi
−PAPS試薬0.5ml、水0.5ml、0.2Mリン酸緩衝
液（PH7.0）0.5mlを順次加え、37℃で更に10分
間加温した。反応液を室温まで冷却し、539nm
に於ける吸光度を測定した。 表より明らかな如く、本発明の方法に於ては、
共存物質の影響は殆ど受けないことがわかる。 本発明の測定法に於て、Ti−PAPS試薬とH₂
O₂により形成されるTi−PAPS−H₂O₂三元錯体
は、極大吸収波長λ_naxが539nmとTi−PAR−H₂
O₂錯体のそれと比べより長波長側にあるので、
ビリルビン、ヘモグロビン等の共存物質の影響を
より受け難く、また、分子吸光係数εも5.7×10⁴
と大きいので、生体試料中の微量成分の定量によ
り適している。尚、Ti−PAPS−H₂O₂三元錯体
の組成を連続変化法で求めたところ１：１：１で
あつた。 本発明の定量法は、血清、尿等の生体体液中の
微量成分、例えば、尿酸、グルコース、遊離脂肪
酸、コレステロール、コリン等の定量に適してい
るが、これらに限らず、基質に特異的に作用して
過酸化水素を生成させる酸化酵素（オキシダー
ゼ）を使用し、生成する過酸化水素を定量するこ
とにより定量を行なう生体成分の定量には全て使
用し得る。 本発明の測定法は用手法にも、自動分析装置を
使用する方法にも適用し得る。 以上述べた如く、本発明は、アスコルビン酸等
共存する還元性物質の影響を殆んど受けず、高感
度で且つビリルビン、ヘモグロビン等の血清成分
の影響を受け難い、新規で有効な生体微量成分の
定量法を提供するものであり、斯業に貢献すると
ころ甚だ大なるものである。 以下に実施例を示すが、本発明はこれら実施例
によつて限定されるものではない。 実施例１ 血清中のグルコースの定量 (1) 試料の調製 グルコース濃度（×10³Ｍ）が夫々1.25，2.5，
3.75，5.0，7.5，10.0，15.0の標準血清を調製し
た。 (2) Ti−PAPS試薬の調製 前記、調製例（Ti−PAPS試薬）と同様にし
て、Ti（）４×10^-4Ｍ，PAPS4×10^-4Ｍを含む
Ti−PAPSの塩酸酸性溶液を調製した。 (3) 測定操作 0.01Mリン酸緩衝液（PH5.6）0.5mlに、グルコ
ースオキシダーゼを2U／ml，N_aN₃を３×10^-4Ｍ
になるように溶解し、これに上記(1)で調製した標
準血清を各々10μずつ加え、各々37℃で15分間
加温した。次いで、Ti−PAPS試薬0.5ml、水3.5
ml，0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）0.5mlを順次加
え、37℃で更に10分間加温した。反応液を室温迄
冷却し、539nmに於ける吸光度を夫々測定した。
各標準血清のグルコース濃度（最終呈色液中の濃
度）に対してプロツトした吸光度を結ぶ検量線は
第１図に示されるように原点を結ぶ直線となり、
検量線は良好な定量性を示している。 実施例２ 血清中のグルコースの定量（添加回収
率） グルコース濃度72.0〜120mg／dlの血清試料を
使用。これにグルコースを25mg／dl又は50mg／dl
添加し、実施例１と同様の方法で操作して吸光度
を測定し、実施例１で得た検量線からグルコース
濃度を求めてグルコースの添加回収率を算出し
た。結果を表２に示す。

【表】 実施例３ 血清中のグルコースの定量（相関） 〔１〕 本法（Ｙ） 血清試料50検体を用い、実施例１と同様の方法
で操作して吸光度を測定し、実施例１で得た検量
線から夫々グルコース濃度を求めた。 〔２〕 従来法（Ｘ） 〔１〕と同じ検体を用い、市販のグルコース測
定用試薬キツトグルコースＢ−テストワコー（和
光純薬工業（株））を使用して、「グルコースオキ
シダーゼ−ペルオキシダーゼ−４−アミノアンチ
ピリン−フエノール法」によりグルコース濃度を
測定した。 〔〕と〔〕との相関を第２図に示す。 第２図より明らかな如く、本法は従来法と良い
相関を示す。（Ｙ＝0.92X＋4.58，γ＝0.988） 実施例４ 血清中の尿酸の定量 (1) 試料の調製 尿酸濃度（×10³Ｍ）が夫々0.2，0.4，0.6，0.8，
1.0，1.5，2.0，2.5，3.0の標準血清を調製した。 (2) Ti−PAPS試薬の調製 実施例１の(2)と同様にして、Ti（）４×10^-4
Ｍ，PAPS4×10^-4Ｍを含むTi−PAPSの塩酸酸
性溶液を調製した。 (3) 測定操作 0.01Mリン酸緩衝液（PH5.6）0.6mlにウリカー
ゼを100mU／mlになるように溶解し、これに上
記(1)で調製した標準血清を各々50μずつ加え、
各々25℃で15分間加温した。次いでTi−PAPS試
薬0.5ml、水3.5ml、0.2Mリン酸緩衝液（PH7.0）
0.4mlを順次加え、37℃で10分間加温した。反応
液を室温迄冷却し、539nmに於ける吸光度を夫々
測定した。各標準血清の尿酸濃度（最終呈色液中
の濃度）に対してプロツトした吸光度を結ぶ検量
線は第３図に示されるように原点を結ぶ直線とな
り、検量線は良好な定量性を示している。 実施例５ 血清中の尿酸の定量（添加回収率） 血清試料に尿酸5.0mg／dl又は10.0mg／dlを添
加し、実施例４と同様の方法で操作して吸光度を
測定し、実施例４で得た検量線から尿酸濃度を求
めて、尿酸の添加回収率を算出した。結果を表３
に示す。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に於て得られた検量線を示
し、横軸の各グルコース濃度（×10⁵Ｍ）につい
て得られた吸光度（OD）を縦軸に沿つてプロツ
トした点を結んだものである。第２図は、実施例
３に於ける本法で得られたグルコース濃度測定値
と従来法で得られたグルコース濃度測定値との相
関を表わし、横軸Ｘは従来法に於けるグルコース
濃度測定値（mg／dl）を、縦軸Ｙは本法に於ける
グルコース濃度測定値（mg／dl）を表わす。第３
図は、実施例４に於て得られた検量線を示し、横
軸の各尿酸濃度（×10⁵Ｍ）ついて得られた吸光
度（OD）を縦軸に沿つてプロツトした点を結ん
だものである。

【特許請求の範囲】

１ (1) エストロジエンを含有する試料溶液を分
離カラムに導入し、PH4.0〜10.5の溶離液を用
いて該エストロジエンをエストロン、エストラ
ジオールおよびエストリオールの各成分に分離
溶出させる工程、 (2) 該溶出液にニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドが含有されPHが6.5〜11.0に調整された
混合液を固定化酵素17β−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼの充てんしたカラムに導く
工程、および (3) 該固定化酵素カラムから流出する還元型ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドの螢光を測
定する工程、 を包含するエストロジエンの定量法。 ２ 前記溶離液が10〜85重量％の水溶性有機溶媒
を含有する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 前記水溶性有機溶媒がニトリルまたはアルコ
ールである特許請求の範囲第２項に記載の方法。