JPH0542265B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はリジン含有ジペプチドを結合させたタ
ンパク質又はタンパク質分解物の製造法に関す
る。 トランスグルタミナーゼ（Transglutaminase、
Glitaminyl−peptide：amine γ−
glutamyltrans−ferase；EC2.3.2.13）はCa²⁺依
存性のアシル転移酵素である。アシル供与体は特
異性が高くペプチド鎖中のGln残基のγ−カルボ
キシアミド基であり、アシル受容体はペプチド鎖
中のLys残基のε−アミノ基や種々の一級アミン
である。 本発明は、このトランスグルタミナーゼ反応を
利用して、食品及び飼料蛋白質に各種リジン含有
ジペプチドをイソペプチド結合により導入し、ヒ
ト及び家畜、魚類などの栄養性、および物性の改
良を図ることに関する。 一級アミンの一種である各種アミノ酸のうち、
本酵素の基質となるのはε−アミノ基を有するリ
ジンのみであるが、α−カルボキシル基をエステ
ル化することにより各種アミノ酸のα−アミノ基
がアシル受容体となることは公知である（K.
Ikura et al.、Agric.Biol.Chem.、45、2587
（1981））。しかしながらアミノ酸のエステルおよ
びアミドは一般に天然界には存在しないことか
ら、この方法の食品等への適用は、現在のとこ
ろ、法律的に不可能である。そこで、本発明者ら
は、各種アミノ酸を食品用として使用できるリジ
ルジペプチド（Ｘ−Lys、Lys−Ｘ：Ｘはアミノ
酸）にして、トランスグルタミナーゼ反応によ
り、蛋白質あるいは蛋白質分解物に導入すること
を検討した。その結果、リジルジペプチドは、リ
ジンを反応性担体としてタンパク質に結合するこ
とを発見し本発明を完成した。 即ち、本発明はトランスグルタミナーゼを作用
させてタンパク質又はタンパク質分解物にリジン
含有ペプチドを結合させることを特徴とするタン
パンク素材の製造法に関する。 本発明に例示されるトランスグルタミナーゼは
Connellanらの方法（J.Biol.Chem.、246、1093
（1971））に従つてモルモツトの肝より調製され
る。即ち、モルモツトの肝臓をシヨ糖溶液に分散
させたものを遠心分離し上清液を回収し、これを
ジエチルアミノエチルセルロースカラムにて分画
することによつて、粗製トランスグルタミナーゼ
を得る。これを１％硫酸プロタミンで沈澱させ、
沈澱物を回収する。さらにこの沈澱物を0.2M
Tris−酢酸緩衝液、PH6.0で洗浄後、0.05M 硫
安−５ｍＭ Tris−塩酸緩衝液、PH7.5（２ｍＭエ
チレンジアミン四酢酸（以下EDTAと略す）を
含む）を用いて抽出し、得られた抽出液をカルボ
キシメチルセルロースカラムでプロタミンを除去
し、ロ液に硫安溶液（1M EDTAを含む）を添
加し、遠心分離を行ない、沈澱物を回収する。沈
澱物を10ｍＭ Tris−酢酸緩衝液、PH6.0（１ｍＭ
EDTA、0.16M KClを含む）で溶解し、遠心
分離した上清液を10％アガロース（Bio Gel Ａ
−0.5M）でゲルロ過し、得られた活性画分を限
外ロ過で濃縮し、精製されたトランスグルタミナ
ーゼを得る。この他に牛などの血液、毛のう等か
らも同様にトランスグルタミナーゼを得ることが
できる。 尚、本発明に適用可能なトランスグルタミナー
ゼは、上記のように天然物から抽出分離されたも
のはもちろん、トランスグルタミナーゼを生産す
る微生物を培養して、これらの菌体外、又は菌体
内に蓄積されたものでもよい。また遺伝子工学的
手法や、細胞工学的手法などの生物工的手法を用
いて得られたものでもよい。 本発明で使用されるタンパク質はタンパク質分
解物はグルタミン残基を有するものならば制限は
ない。タンパク質として、例えばカゼインや大豆
タンパク質などの全ての動植物タンパク質、菌体
タンパク質が挙げられる。タンパク質分解物とし
ては上記の全てのタンパク質の分解物を例示する
ことができる。又、グルタミン残基を含むアミノ
酸の合成ポリマーも使用しうる。しかしながら
Lys残基を有するタンパク質に、トランスグルタ
ミナーゼによつて、リジルジペプチドだけを選択
的に導入しようと企図した場合は、予めLys残基
をブロツクした方が好結果を導く。即ち、蛋白質
を無水シトラコン酸でアシル化してから、ジペプ
チドをトランスグルタミナーゼで導入させ、しか
る後に系を酸性（PH３）にすることによつて脱シ
トラコニル化することで目的を達することができ
る。この他に脱保護基を必要としない場合は、無
水酢酸によるアセチル化、無水コハク酸によるサ
クシニル化なども用いることができる。 リジンを含有するジペプチゾは、Ｘ−Lys型で
もLsy−Ｘ型でも導入できる。このペプチドは化
学的合成法でも、あるいは各種プロテアーゼ、ペ
プチダーゼ類の逆反応による酵素的合成法でも容
易に入手できる。 本発明の方法では、無水酢酸でアセチル化した
タンパク質等とLsy−Metなどのリジン含有ジペ
プチドを混合したものに、トランスグルタミナー
ゼを作用させて酵素反応を起させ、タンパク質等
にリジン含有ジペプチドを結合させる。一般にタ
ンパク質１〜５部を水1000部に混合した液に、リ
ジルジペプチド誘導体（ギ酸塩、酢酸塩等）１〜
20部、塩化カルシウム0.6部前後、トランスグル
タミナーゼ0.02〜0.05部を添加する。反応はPH６
〜8.5、好ましくは7.5前後で温度20〜40℃、好ま
しくは37℃前後で行なう。反応時間は１〜10時間
である。反応後、EDTA12部を加え反応を停止
させる。反応終了後、反応液を通常の方法、例え
ば透析処理して目的物を取得する。還元剤、例え
ばシステイン、グルタチオン、メルカプトエタノ
ール、ジチオスレイトールなどとはトランスグル
タミナーゼを活性化しまた安定化する。従つて反
応液に還元剤を添加するのが望ましい。 本発明で得られたリジルジペプチド結合蛋白質
は、例えば栄養の補足強化を目的に使用すること
ができる。大豆タンパクの第一制限アミノ酸はメ
チオニンであるので、Met−Lysの形のジペプチ
ドをトランスグルタミナーゼで導入すれば、タン
パク効率のすぐれたタンパク質素材とすることが
できる。またCys−Lysを導入すれば、タンパク
中にシステイン残基を多く導入することになり、
高度にＳ−Ｓ結合させた組織製のタンパク質を創
出することが可能となる。 更にリジン含有ジペプチドの代わりに適当な構
造をもつたリジン含有オリゴペプチドを用いると
高い基質効率を示すことも予想できる。 次に本発明を実施例によつて説明するが、本発
明はこれらの実施例によつて何ら制限されるもの
ではない。 実施例 １ （タンパク質のアセチル化） 新鮮牛乳からZittle＆Custerの方法（J.Dairy
Sci.、46、1183（1963））により得られたα_S1−カ
ゼイン500mgを50mlの50％飽和酢酸ナトリウム溶
液に分散させ、これに1.5mlの無水酢酸を80μず
つ温度を０℃に調節しながら、注意深く加えた。
反応後、水に対する透析（３℃、24時間）で過剰
の試薬、不純物を除き、凍結乾燥して480mgのア
セチル化α_S1−カゼインが得られた。 （リジルジペプチドの導入） 塩化カルシウム（５ｍＭ）、還元型グルタチオ
ン（10ｍＭ）それに上記アセチル化α_S1−カゼイ
ン（５mg／ml）、Lys−Trpギ酸塩（50ｍＭ）を
0.1M Tris−塩酸緩衝液、PH7.5に溶解し、更に
40μｇ／mlのモルモツト肝トランスグルタミナー
ゼ（Connellanの方法、J.Biol.Chem.、246、1093
（1971）で調製された）を加え、37℃、120分反応
させた。反応は0.4MのEDTA（PH8.0）を0.1ml／
ml加えて停止させた。反応液を水に透析（３℃、
24時間）して、未反応のジペプチド、過剰の試
薬・塩類を除き、凍結乾燥してLys−Trp結合カ
ゼインを得た。アセチル化α_S1−カゼイン５ｇか
ら最終的にLys−Trp結合アセチル化α_S1−カゼイ
ン4.5ｇが得られた。 実施例 ２ 牛乳カゼイン100ｇを10Kgの水に溶解し、PH7.5
にした。これに塩化カルシウム６ｇ、メチオニル
リジン塩酸塩100ｇ、トランスグルタミナーゼ0.3
ｇを加えた。37℃に保ち、ゆるやかに撹拌しなが
ら５時間反応させた。これを限外ロ過で透析した
後、噴霧乾燥して白色のメチオニン、リジン強化
牛乳カゼイン87ｇを得た。メチオニルリジンの導
入量はカゼイン１ｇ当り33.2mgであつた。 実施例 ３ 実施例１と同様の方法で反応させてリジルジペ
プチドのトランスグルタミナーゼ作用による導入
率を検討した。導入量は、アミノ酸分析により求
め、遊離リジンの導入率を100％とする相対導入
率で表わした、その結果は第１表に例示した。

【表】 測定結果は、一般にＸ−Lys型の方が有意に導
入率が高いことがわかつた。但し、Lys−Trpは
Trp−Lysより２倍ほど導入率が高く、ペプチド
の構造の差異及び結合箇所（Lysのε−、α−
NH₂及びアミノ酸Ｘのα−NH₂）の最適配置な
どで導入率が相違することを示している。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ トランスグルタミナーゼを作用させて、タン
   パク質又はタンパク質分解物にリジン含有ジペプ
   チドを結合させることを特徴とするタンパク素材
   の製造法。