JPH0542273B2

JPH0542273B2 -

Info

Publication number: JPH0542273B2
Application number: JP19246785A
Authority: JP
Inventors: Shinichi Tejima; Juzo Hayashi; Minoru Ando
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1985-08-30
Filing date: 1985-08-30
Publication date: 1993-06-28
Also published as: JPS6252000A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬に関するものである。体液中
のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活
性の測定は、腎移植後の拒絶反応の早期診断、急
性腎不全、糸球体腎炎等の各種腎疾患の診断及び
経過観察、薬物の腎毒性等に有用な情報を与える
ものとして臨床的意義が高い。

（従来の技術）従来、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ
ーゼ（以下NAGと称する）活性は、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサンの還元末端にｐ−ニトロフエ
ノールを結合させた基質を用いてNAGを作用さ
せ、遊離してくるｐ−ニトロフエノールをアルカ
リ性下で比色する方法が一般的である（Metods
Engymol.、28、702（1972））。

ところがこ方法では目的とする酸素NAGの至
適PH（PH４〜5.5）と発色用であるｐ−ニトロフ
エノールの発色PH（PH９以上）とが異なる為に
NAG活性を測定する為には酵素反応と発色反応
を別々に行なう必要があり、その為に試薬数及び
操作ステツプが多く必要となり、酵素活性を求め
る場合に一番適当であるといわれている速度分析
（レートアツセイ）法が出来ない欠点がある。

その他、Ｎ−アセチルグルコサミンにフエノー
ルを結合させた基質を用いる方法（特開発54−
60997号）、Ｎ−アセチルグルコサミンにｍ−クレ
ゾールスルホフタレインを結合させた基質を用い
る方法（Clin.Chem.29、1713（1983））も上記ｐ
−ニトロフエノールを用いる場合と同様の欠点が
ある。

（発明の解決しようとする問題点）本発明の目的は定量性に優れたNAGのレート
アツセイが可能となるNAG活性測定試薬を提供
することである。

（問題点を解決する為の手段）本発明者らは、上記目的を達成するために種々
鋭意検討したところ、一般式〔〕で示される基
質を用いることにより体液中のNAG活性を短時
間に正確簡単にレートアツセイ出来ることを見い
出し本発明に到達した。

すなわち本発明は基質として下記一般式〔〕
で示される化合物を含有することを特徴とするβ
−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性測
定試薬である。

（式中、Ａは還元性末端でβ−結合しているＮ−
アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクト
サミン残基である。Ｘはニトロ基を示す。R₁〜
R₄のうち、少なくとも１つはハロゲン原子を示
し、かつR₁〜R₄のうち、少なくとも１つはスル
ホン酸基又はカルボン酸基又はこれらのアルカリ
金属塩基を示し、他の基は水素原子を示す。）本発明に用いる基質としては一般式〔〕で示
される化合物、すなわちＮ−アセチルグルコサミ
ン又はＮ−アセチルガラクトサミンがその還元性
末端で置換芳香族基とβ−結合したものである。
置換芳香族基とは解裂したアグリコンとして基質
とは異なつたスペクトル吸収を示す置換芳香族基
である。解裂したアグリコンとは具体的には次の
一般式（Ｘ、R₁〜R₄は前記のものと同じ）で示される
フエノール誘導体である。

例えば２，４−ジクロロ−３−ヒドロキシ−６
−ニトロンベンゼンスルホン酸、２−クロロ−３
−ヒドロキシ−６−ニトロベンゼンスルホン酸、
２−ニトロ−４−クロロ−５−ヒドロキシベンゼ
ンスルホン酸、２，４，５−トリクロロ−３−ヒ
ドロキシ−６−ニトロベンゼンスルホン酸、２，
４−ジブロモ−３−ヒドロキシ−６−ニトロベン
ゼンスルホン酸、２−ブロモ−３−ヒドロキシ−
６−ニトロベンゼンスルホン酸、２−ニトロ−４
−ブロモ−５−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、
２，４，５−トリブロモ−３−ヒドロキシ−６−
ニトロベンゼンスルホン酸、２，４−ジヨード−
３−ヒドロキシ−６−ニトロベンゼンスルホン
酸、２−ヨード−３−ヒドロキシ−６−ニトロベ
ンゼンスルホン酸、２−ニトロ−４−ヨード−５
−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、２，４，５−
トリヨード−３−ヒドロキシ−６−ニトロベンゼ
ンスルホン酸、２−ヒドロキシ−３−クロロ−５
−ニトロベンゼンスルホン酸、３，４−ジクロロ
−２−ヒドロキシ−５−ニトロベンゼンスルホン
酸、３，４，６−トリクロロ−２−ヒドロキシ−
５−ニトロベンゼンスルホン酸、２−ヒドロキシ
−３−ブロモ−５−ニトロベンゼンスルホン酸、
３，４−ジブロモ−２−ヒドロキシ−５−ニトロ
ベンゼンスルホン酸、３，４，６−トリブロモ−
２−ヒドロキシ−５−ニトロベンゼンスルホン
酸、２−ヒドロキシ−３−ヨード−５−ニトロベ
ンゼンスルホン酸、３，４−ジヨード−２−ヒド
ロキシ−５−ニトロベンゼンスルホン酸、３，
４，６−トリヨード−２−ヒドロキシ−５−ニト
ロベンゼンスルホン酸、２，４−ジクロロ−３−
ヒドロキシ−６−ニトロベンゼンカルボン酸、２
−クロロ−３−ヒドロキシ−６−ニトロベンゼン
カルボン酸、２−ニトロ−４−クロロ−５−ヒド
ロキシベンゼンカルボン酸、２，４，５−トリク
ロロ−３−ヒドロキシ−６−ニトロベンゼンカル
ボン酸、２，４−ジブロモ−３−ヒドロキシ−６
−ニトロベンゼンカルボン酸、２−ブロモ−３−
ヒドロキシ−６−ニトロベンゼンカルボン酸、２
−ニトロ−４−ブロモ−５−ヒドロキシベンゼン
カルボン酸、２，４，５−トリブロモ−３−ヒド
ロキシ−６−ニトロベンゼンカルボン酸、２，４
−ジヨード−３−ヒドロキシ−６−ニトロベンゼ
ンカルボン酸、２−ヨード−３−ヒドロキシ−６
−ニトロベンゼンカルボン酸、２−ニトロ−４−
ヨード−５−ヒドロキシベンゼンカルボン酸、
２，４，５−トリヨード−３−ヒドロキシ−６−
ニトロベンゼンカボン酸、２−ヒドロキシ−３−
クロロ−５−ニトロベンゼンカルボン酸、３，４
−ジクロロ−２−ヒドロキシ−５−ニトロベンゼ
ンカルボン酸、３，４，６−トリクロロ−２−ヒ
ドロキシ−５−ニトベンゼンカルボン酸、２−ヒ
ドロキシ−３−ブロモ−５−ニトロベンゼンカル
ボン酸、３，４−ジブロモ−２−ヒドロキシ−５
−ニトロベンゼンカルボン酸、３，４，６−トリ
ブロモ−２−ヒドロキシ−５−ニトロベンゼンカ
ルボン酸、３，４−ジブロモ−２−ヒドロキシ−
５−ニトロベンゼンカルボン酸、３，４，６−ト
リブロモ−２−ヒドロキシ−５−ニトロベンゼン
カルボン酸、２−ヒドロキシ３−ヨード−５−ニ
トロベンゼンカルボン酸、３，４−ジヨード−２
−ヒドロキシ−５−ニトロベンゼンカルボン酸、
３，４，６−トリヨード−２−ヒドロキシ−５−
ニトロベンゼンカルボン酸またはそれらのベンゼ
ンカルボン酸とこれらのNa塩またはＫ塩等があ
げられる。

これら基質の合成方法はＮ−アセチルヘキソサ
ミンをアセチル化し、このアセチル化されたＮ−
アセチルヘキソサミンと置換芳香族化合物、アグ
リコンを結合させた後、脱アセチルすることによ
り合成するか（実験化学講座第24巻第304頁、
1958年）、又はアセチル化されたＮ−アセチルヘ
キソサミンをハロゲン化し、次いでそのハロゲン
化物と置換芳香族化合物、アグリコンをエーテル
結合させたあと、脱アセチルすることにより合成
することが出来る（Methods in Carbohydrate
Chemistry 、第334頁）。

基質の置換芳香族基においてR₁〜R₄がハロゲ
ン原子のみで置換されている場合には、水に対す
る溶解性が悪く、基質必要量の溶解が不可能であ
る。

本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬は、ハロゲン置換のニトロフ
エノールに−SO₃H、−COOH、−SO₃Na、−
COONa、−SO₃K、−COOK等を置換し、水溶性
に優れた基質を使用する。

試薬のPHは体液中のNAGの至適PHであるPH4.0
〜5.5を保つ緩衝液であれば、いかなるものでも
良い。例えばクエン酸緩衝液やその他有機酸緩衝
液、例えば酢酸、コハク酸、フタル酸等の緩衝液
があげられる。

基質濃度としては特に制限がないが、好ましく
は最大のNAGの酵素活性を示す濃度が適当であ
る。例えば１ｍＭ以上である。

本発明の試薬は必要により界面活性剤、防腐
剤、塩化ナトリウム、シクロデキストリン、安定
化剤等を含有してもよい。

本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬を用いて、NAG活性を測定
する方法としては、試料を該試薬と反応させて生
成するアグリコン、フエノール誘導体の吸光度変
化を直接分光光度計を用いて比色定量する方法で
ある。

（発明の効果）本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬において、一般式〔〕で示
される化合物を基質として用いることにより、体
液中のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダー
ゼ活性を短時間に正確、かつ簡単にレートアツセ
イすることができる。基質に結合したフエノール
誘導体がハロゲン原子、ニトロ基の他に、スルホ
ン酸基又はカルボン酸基あるいはこれらのアルカ
リ金属塩基を有することにより、基質自体の水溶
性が向上する。

（実施例）以下、本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１被検液中のNAG活性量を下記試薬を用いて下
記方法により測定した。

１試薬２−クロロ−４−ニトロ−６−スルホフエニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
２ｍＭ塩化ナトリウム 200ｍＭクエン酸緩衝液 0.05M PH４、５２測定方法 NAG含有被検液50μに上記試薬２ｍを
加えて37℃で反応させ、その吸光度を波長
400nｍで測定して発色速度を求めた。

反応曲線を第１図に示す。検量線を第２図に
示す。第１図および第２図から明らかなよう
に、水溶性基質を用いた本発明の試薬では、短
時間に正確かつ簡単にレートアツセイすること
ができる。

実施例２被液中のNAG活性量を下記試薬を用いて実施
例１と同じ方法により測定した。

１試薬２，６−ジクロロ−４−ニトロ−５−スルホ
フエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミ
ニド２ｍＭ塩化ナトリウム 200ｍＭクエン酸緩衝液 0.05M PH４、５反応曲線を第３図に示す。検量線を第４図に示
す。第３図および第４図から明らかなように、水
溶性基質を用いた本発明の試薬では、短時間に正
確かつ簡単にレートアツセイすることができる。

実施例３被検液中のNAG活性量を下記試薬を用いて実
施例１と同じ方法により測定した。

１試薬２−ブロモ−４−ニトロ−６−スルホフエニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド
２ｍＭ塩化ナトリウム 200ｍＭクエン酸緩衝液 0.05M PH４、５反応曲線を第５図に示す。検量線を第６図に示
す。第５図および第６図から明らかなように、水
溶性基質を用いた本発明の試薬では、短時間に正
確かつ簡単にレートアツセイすることができる。

実施例４被検液中のNAG活性量を下記試薬を用いて実
施例１と同じ方法により測定した。

１試薬２，６−ジブロモ−４−ニトロ−５−スルホフ
エニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド２ｍＭ塩化ナトリウム 200ｍＭクエン酸緩衝液 0.05M PH４、５反応曲線を第７図に示す。検量線を第８図に示
す。第７図および第８図から明らかなように、水
溶性基質を用いた本発明の試薬では、短時間に正
確かつ簡単にレートアツセイすることができる。

実施例５被検液中のNAG活性量を下記試薬を用いて実
施例１と同じ方法により測定した。

１試薬２，３，６−トリクロロ−４−ニトロ−５−
スルホフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル
コサミニド２ｍＭ塩化ナトリウム 200ｍＭクエン酸緩衝液 0.05M PH４、５反応曲線を第９図に示す。検量線を第１０図に
示す。第９図および第１０図から明らかなよう
に、水溶性基質を用いた本発明の試薬では、短時
間に正確かつ簡単にレートアツセイすることがで
きる。

実施例６被検液中のNAG活性量を下記試薬を用いて実
施例１と同じ方法により測定した。

１試薬２，３，６−トリブロモ−４−ニトロ−５−ス
ルホフエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコ
サミド２ｍＭ塩化ナトリウム 200ｍＭクエン酸緩衝液 0.05M PH４、５反応曲線を第１１図に示す。検量線を第１２図
に示す。第１１図および第１２図から明らかなよ
うに、水溶性基質を用いた本発明の試薬では、短
時間に正確かつ簡単にレートアツセイすることが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図、第３図、第５図、第７図、第９図およ
び第１１図は本発明実施例の反応曲線を示す。第
２図、第４図、第６図、第８図、第１０図および
第１２図は本発明実施例の検量線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１基質として下記一般式〔〕で示される化合
物を含有することを特徴とするβ−Ｎ−アセチル
−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性測定試薬。（式中、Ａは還元性末端でβ−結合しているＮ−
アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクト
サミン残基である。Ｘはニトロ基を示す。R₁〜
R₄のうち、少なくとも１つはハロゲン原子を示
し、かつR₁〜R₄のうち、少なくとも１つはスル
ホン酸基又はカルボン酸基又はこれらのアルカリ
金属塩基を示し、他の基は水素原子を示す。）