JPH0573398B2 - - Google Patents
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- JPH0573398B2 JPH0573398B2 JP60017452A JP1745285A JPH0573398B2 JP H0573398 B2 JPH0573398 B2 JP H0573398B2 JP 60017452 A JP60017452 A JP 60017452A JP 1745285 A JP1745285 A JP 1745285A JP H0573398 B2 JPH0573398 B2 JP H0573398B2
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明はβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定用試薬に関するものである。体液
中のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ
活性の測定は、腎移植後の拒絶反応の早期診断、
急性腎不全、糸球体腎炎等の各種腎疾患の診断及
び経過観察、薬物の腎毒性等に有用な情報を与え
るものとして臨床的意義が高い。 （従来の技術） 従来、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ
ーゼ（以下NAGと略する）活性は、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミンの還元末端にｐ−ニトロフ
エノールを結合させた基質を用いてNAGを作用
させ、遊離してくるｐ−ニトロフエノールをアル
カリ性下で比色する方法が一般的である
（Methods Engymol.、28、702（1972））。 ところがこの方法では目的とする酵素NAGの
至適PH（PH４〜5.5）と発色用であるｐ−ニトロ
フエノールの発色PH（PH９以上）とが異なる為に
NAG活性を測定する為には酵素反応と発色反応
を別々に行なう必要があり、その為に試薬数及び
操作ステツプが多く必要となり、酵素活性を求め
る場合に一番適当であるといわれている速度分析
（レートアツセイ）法が出来ない欠点がある。 その他、Ｎ−アセチルグルコサミンにフエノー
ルを結合させた基質を用いる方法（特開昭54−
60997号）、Ｎ−アセチルグルコサミンにｍ−クレ
ゾールスルホフタレインを結合させた基質を用い
る方法（Clin.Chem.29、1713（1983））も上記ｐ
−ニトロフエノールを用いる場合と同様の欠点が
ある。 （発明の解決しようとする問題点） 本発明の目的は定量性に優れたNAGのレート
アツセイが可能となるNAG活性測定試薬を提供
することである。 （問題点を解決する為の手段） 本発明者らは、上記目的を達成するために種々
鋭意検討したところ、一般色〔〕で示される基
質を用いることにより体液中のNAG活性を短時
間に正確簡単にレートアツセイ出来ることを見い
出し本発明に到達した。 すなわち本発明は基質として下記一般式〔〕
で示される化合物を含有することを特徴とするβ
−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性測
定試薬である。
ダーゼ活性測定用試薬に関するものである。体液
中のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ
活性の測定は、腎移植後の拒絶反応の早期診断、
急性腎不全、糸球体腎炎等の各種腎疾患の診断及
び経過観察、薬物の腎毒性等に有用な情報を与え
るものとして臨床的意義が高い。 （従来の技術） 従来、β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ
ーゼ（以下NAGと略する）活性は、Ｎ−アセチ
ル−Ｄ−グルコサミンの還元末端にｐ−ニトロフ
エノールを結合させた基質を用いてNAGを作用
させ、遊離してくるｐ−ニトロフエノールをアル
カリ性下で比色する方法が一般的である
（Methods Engymol.、28、702（1972））。 ところがこの方法では目的とする酵素NAGの
至適PH（PH４〜5.5）と発色用であるｐ−ニトロ
フエノールの発色PH（PH９以上）とが異なる為に
NAG活性を測定する為には酵素反応と発色反応
を別々に行なう必要があり、その為に試薬数及び
操作ステツプが多く必要となり、酵素活性を求め
る場合に一番適当であるといわれている速度分析
（レートアツセイ）法が出来ない欠点がある。 その他、Ｎ−アセチルグルコサミンにフエノー
ルを結合させた基質を用いる方法（特開昭54−
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ゾールスルホフタレインを結合させた基質を用い
る方法（Clin.Chem.29、1713（1983））も上記ｐ
−ニトロフエノールを用いる場合と同様の欠点が
ある。 （発明の解決しようとする問題点） 本発明の目的は定量性に優れたNAGのレート
アツセイが可能となるNAG活性測定試薬を提供
することである。 （問題点を解決する為の手段） 本発明者らは、上記目的を達成するために種々
鋭意検討したところ、一般色〔〕で示される基
質を用いることにより体液中のNAG活性を短時
間に正確簡単にレートアツセイ出来ることを見い
出し本発明に到達した。 すなわち本発明は基質として下記一般式〔〕
で示される化合物を含有することを特徴とするβ
−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ活性測
定試薬である。
【化】
〔式中、ＡはＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−
アセチルガラクトサミン残基であつて、その還元
性末端が置換芳香族基（解裂したアグリコンとし
て基質とは異なつたスペクトル吸収を示す基）と
β−結合されている。置換芳香族基中のＸはニト
ロ基または水素原子を示す。Ｘが水素原子の場合
はR1〜R4のいずれかの置換基の２個以上がニト
ロ基であり、他の基は水素原子又はハロゲン原子
である。Ｘがニトロ基の場合はR1および／また
はR4はハロゲン原子またはニトロ基を示し、残
りのR1〜R4は水素原子、ハロゲン原子またはニ
トロ基のいずれかを示す。） 本発明に用いる基質としては一般式〔〕で示
される化合物、すなわちＮ−アセチルグルコサミ
ン又はＮ−アセチルガラクトサミンとその還元性
末端で置換芳香族基とβ−結合したものである。
置換芳香族基とは解裂したアグリコンとしては基
質とは異なつたスペクトル吸収を示す置換芳香族
基であればいかなるものでも良いが、具体的には
アセチルガラクトサミン残基であつて、その還元
性末端が置換芳香族基（解裂したアグリコンとし
て基質とは異なつたスペクトル吸収を示す基）と
β−結合されている。置換芳香族基中のＸはニト
ロ基または水素原子を示す。Ｘが水素原子の場合
はR1〜R4のいずれかの置換基の２個以上がニト
ロ基であり、他の基は水素原子又はハロゲン原子
である。Ｘがニトロ基の場合はR1および／また
はR4はハロゲン原子またはニトロ基を示し、残
りのR1〜R4は水素原子、ハロゲン原子またはニ
トロ基のいずれかを示す。） 本発明に用いる基質としては一般式〔〕で示
される化合物、すなわちＮ−アセチルグルコサミ
ン又はＮ−アセチルガラクトサミンとその還元性
末端で置換芳香族基とβ−結合したものである。
置換芳香族基とは解裂したアグリコンとしては基
質とは異なつたスペクトル吸収を示す置換芳香族
基であればいかなるものでも良いが、具体的には
【化】
（Ｘ、R1〜R4は前記のものと同じ）で示される。
その置換芳香族基はフエノールの形で示せば、
例えば２，６−ジクロロ−４−ニトロフエノー
ル、２，６−ジブロモ−４−ニトロフエノール、
２，３，６−トリクロロ−４−ニトロフエノー
ル、２，３，６−トリブロモ−４−ニトロフエノ
ール、２，３，５，６−テトラブロモ−４−ニト
ロフエノール、２，３，５，６−テトラクロロ−
４−ニトロフエノール、２，４−ジニトロフエノ
ール、２，５−ジニトロフエノール、２−クロロ
−４−ニトロフエノール、２−ブロモ−４−ニト
ロフエノール等があげられる。 これら基質の合成方法はＮ−アセチルヘキソサ
ミンをアセチル化し、このアセチル化されたＮ−
アセチルヘキソサミンと置換芳香族基、アグリコ
ンを結合させた後、脱アセチルすることにより合
成するか（実験化学講座第24巻第304頁、1958
年）、又はアセチル化されたＮ−アセチルヘキソ
サミンをハロゲン化し、次いでそのハロゲン化物
と置換芳香族基、アグリコンをエーテル結合させ
たあと、脱アセチルすることにより合成すること
が出来る（Methods in Carbohydr ate
Chemistry 、第334頁）。 基質の置換芳香族基においてR1又はR4がハロ
ゲン原子である場合には、基質の溶解性の点から
見て、シクロデキストリンが必要である。 本発明に用いるシクロデキストリンとしては
α、β、γの重合度のものが知られているが、上
記基質〔〕の溶解性又は呈色のPH安定性に効果
があるものであればいかなるものでも良い。好ま
しくはα及びβ−シクロデキストリンが良い。 本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬は上記基質、シクロデキスト
リン、及び必要により塩化ナトリウムを含有す
る。 該試薬のPHは体液中のNAGの至適PHであるPH
4.0〜5.5を保つ緩衝液であれば、いかなるもので
も良い。例えばクエン酸緩衝液やその他有機酸緩
衝液、例えば酢酸、コハク酸、フタル酸等の緩衝
液があげられる。 基質濃度としては特に制限がないが、好ましく
は最大のNAGの酵素活性を示す濃度が適当であ
る。例えば１ｍＭ以上である。次にシクロデキス
トリン濃度としては基質の溶解性又は呈色のPH安
定性に有効である濃度であれば特に制限はないが
好ましくは0.1％以上が適当である。 塩化ナトリウム濃度としてはNAGの活性化に
有効な濃度であれば特に制限はないが、好ましく
は１〜1000ｍＭが適当である。更に必要があれば
界面活性剤、防腐剤等を加えてもよい。 本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬を用いて、NAG活性を測定
する方法としては、試薬を該試薬と反応させて生
成するアグリコンの吸光度の高化を直性分光光度
計を用いて比色定量する方法である。 （発明の効果） 本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬において、一般式〔〕で示
される化合物を基質として用いることにより、体
液中のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダー
ゼ活性を短時間に正確、かつ簡単にレートアツセ
イすることができる。 （実施例） 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 実施例 １ 被検液中のNAG活性量を下記試薬を用いて下
記方法により測定した。 １ 試薬 ２−クロロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセチ
ルβ−Ｄ−グルコサミニド １ｍＭ 塩化ナトリウム 200ｍＭ α−シクロデキストリン １％ 0.05Mクエン酸緩衝液（PH4.5）で全量 10ml ２ 測定方法 NAG含有被検液50μに上記試薬２mlを加
えて37℃で反応させ、その吸光度を波長400n
ｍで測定して発色速度を求めた。 反応曲線を第１図に示す。検量波を第２図に示
す。 第１図および第２図から明らかなように、本発
明の試薬を用いると、短時間に正確かつ簡単にレ
ートアツセイすることができる。 比較例 １ １ 試薬 ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グ
ルコサミニド １ｍＭ 塩化ナトリウム 200ｍＭ α−シクロデキストリン １％ 0.05Mクエン酸緩衝液（PH4.5）で全量 10ml ２ 測定方法 実施例１と同じ方法を実施した。 反応曲線を第３図に示す。また検量線を第４図
に示す。第３図および第４図から明らかなように
ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グル
コサミニドを基質とした試薬を用いると、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼの至適PHである
４〜5.5付近ではｐ−ニトロフエノールが解離し
ないため、レートアツセイができないことが判明
した。 実施例 ２ １ 試薬 ２，６−ジクロロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−
アセチルβ−Ｄ−グルコサミニド １ｍＭ 塩化ナトリウム 200ｍＭ α−シクロデキストリン １％ 0.05Mクエン酸緩衝液（PH4.5）で全量 10ml ２ 測定方法 実施例１と同じ。 反応曲線を第５図に示す。また検量線を第６図
に示す。第５図および第６図から明らかなよう
に、本発明の試薬を用いると、短時間に正確かつ
簡単にレートアツセイすることができる。
例えば２，６−ジクロロ−４−ニトロフエノー
ル、２，６−ジブロモ−４−ニトロフエノール、
２，３，６−トリクロロ−４−ニトロフエノー
ル、２，３，６−トリブロモ−４−ニトロフエノ
ール、２，３，５，６−テトラブロモ−４−ニト
ロフエノール、２，３，５，６−テトラクロロ−
４−ニトロフエノール、２，４−ジニトロフエノ
ール、２，５−ジニトロフエノール、２−クロロ
−４−ニトロフエノール、２−ブロモ−４−ニト
ロフエノール等があげられる。 これら基質の合成方法はＮ−アセチルヘキソサ
ミンをアセチル化し、このアセチル化されたＮ−
アセチルヘキソサミンと置換芳香族基、アグリコ
ンを結合させた後、脱アセチルすることにより合
成するか（実験化学講座第24巻第304頁、1958
年）、又はアセチル化されたＮ−アセチルヘキソ
サミンをハロゲン化し、次いでそのハロゲン化物
と置換芳香族基、アグリコンをエーテル結合させ
たあと、脱アセチルすることにより合成すること
が出来る（Methods in Carbohydr ate
Chemistry 、第334頁）。 基質の置換芳香族基においてR1又はR4がハロ
ゲン原子である場合には、基質の溶解性の点から
見て、シクロデキストリンが必要である。 本発明に用いるシクロデキストリンとしては
α、β、γの重合度のものが知られているが、上
記基質〔〕の溶解性又は呈色のPH安定性に効果
があるものであればいかなるものでも良い。好ま
しくはα及びβ−シクロデキストリンが良い。 本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬は上記基質、シクロデキスト
リン、及び必要により塩化ナトリウムを含有す
る。 該試薬のPHは体液中のNAGの至適PHであるPH
4.0〜5.5を保つ緩衝液であれば、いかなるもので
も良い。例えばクエン酸緩衝液やその他有機酸緩
衝液、例えば酢酸、コハク酸、フタル酸等の緩衝
液があげられる。 基質濃度としては特に制限がないが、好ましく
は最大のNAGの酵素活性を示す濃度が適当であ
る。例えば１ｍＭ以上である。次にシクロデキス
トリン濃度としては基質の溶解性又は呈色のPH安
定性に有効である濃度であれば特に制限はないが
好ましくは0.1％以上が適当である。 塩化ナトリウム濃度としてはNAGの活性化に
有効な濃度であれば特に制限はないが、好ましく
は１〜1000ｍＭが適当である。更に必要があれば
界面活性剤、防腐剤等を加えてもよい。 本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬を用いて、NAG活性を測定
する方法としては、試薬を該試薬と反応させて生
成するアグリコンの吸光度の高化を直性分光光度
計を用いて比色定量する方法である。 （発明の効果） 本発明のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニ
ダーゼ活性測定試薬において、一般式〔〕で示
される化合物を基質として用いることにより、体
液中のβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダー
ゼ活性を短時間に正確、かつ簡単にレートアツセ
イすることができる。 （実施例） 以下、本発明を実施例により詳細に説明する。 実施例 １ 被検液中のNAG活性量を下記試薬を用いて下
記方法により測定した。 １ 試薬 ２−クロロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−アセチ
ルβ−Ｄ−グルコサミニド １ｍＭ 塩化ナトリウム 200ｍＭ α−シクロデキストリン １％ 0.05Mクエン酸緩衝液（PH4.5）で全量 10ml ２ 測定方法 NAG含有被検液50μに上記試薬２mlを加
えて37℃で反応させ、その吸光度を波長400n
ｍで測定して発色速度を求めた。 反応曲線を第１図に示す。検量波を第２図に示
す。 第１図および第２図から明らかなように、本発
明の試薬を用いると、短時間に正確かつ簡単にレ
ートアツセイすることができる。 比較例 １ １ 試薬 ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グ
ルコサミニド １ｍＭ 塩化ナトリウム 200ｍＭ α−シクロデキストリン １％ 0.05Mクエン酸緩衝液（PH4.5）で全量 10ml ２ 測定方法 実施例１と同じ方法を実施した。 反応曲線を第３図に示す。また検量線を第４図
に示す。第３図および第４図から明らかなように
ｐ−ニトロフエニル−Ｎ−アセチルβ−Ｄ−グル
コサミニドを基質とした試薬を用いると、Ｎ−ア
セチル−Ｄ−ヘキソサミニダーゼの至適PHである
４〜5.5付近ではｐ−ニトロフエノールが解離し
ないため、レートアツセイができないことが判明
した。 実施例 ２ １ 試薬 ２，６−ジクロロ−４−ニトロフエニル−Ｎ−
アセチルβ−Ｄ−グルコサミニド １ｍＭ 塩化ナトリウム 200ｍＭ α−シクロデキストリン １％ 0.05Mクエン酸緩衝液（PH4.5）で全量 10ml ２ 測定方法 実施例１と同じ。 反応曲線を第５図に示す。また検量線を第６図
に示す。第５図および第６図から明らかなよう
に、本発明の試薬を用いると、短時間に正確かつ
簡単にレートアツセイすることができる。
第１図は本発明実施例１の反応曲線を示す。第
２図は本発明実施例１の検量線を示す。第３図は
本発明比較例１の反応曲線を示す。第４図は本発
明比較例１の検量線を示す。第５図は本発明実施
例２の反応曲線を示す。第６図は本発明実施例２
の検量線を示す。
２図は本発明実施例１の検量線を示す。第３図は
本発明比較例１の反応曲線を示す。第４図は本発
明比較例１の検量線を示す。第５図は本発明実施
例２の反応曲線を示す。第６図は本発明実施例２
の検量線を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 基質として下記一般式〔〕で示される化合
物およびシクロデキストリンを含有することを特
徴とするβ−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ
ーゼ活性測定試薬。 【化】 〔式中、ＡはＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−
アセチルガラクトサミン残基であつて、その還元
性末端が置換芳香族基（解裂したアグリコンとし
て基質とは異なつたスペクトル吸収を示す基）と
β−結合されている。置換芳香族基中のＸはニト
ロ基または水素原子を示す。Ｘが水素原子の場合
はR1〜R4のいずれかの置換基の２個以上がニト
ロ基であり、他の基は水素原子又はハロゲン原子
である。Ｘがニトロ基の場合はR1および／また
はR4はハロゲン原子またはニトロ基を示し、残
りのR1〜R4は水素原子、ハロゲン原子またはニ
トロ基のいずれかを示す。〕
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1745285A JPS61177999A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1745285A JPS61177999A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61177999A JPS61177999A (ja) | 1986-08-09 |
| JPH0573398B2 true JPH0573398B2 (ja) | 1993-10-14 |
Family
ID=11944412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1745285A Granted JPS61177999A (ja) | 1985-01-30 | 1985-01-30 | β−Ｎ−アセチル−Ｄ−ヘキソサミニダ−ゼ活性測定試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61177999A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69023710T2 (de) * | 1989-02-23 | 1996-04-18 | Iatron Lab | Verfahren zur bestimmung von enzymatischer wirksamkeit. |
-
1985
- 1985-01-30 JP JP1745285A patent/JPS61177999A/ja active Granted
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BIOCHEMICAL PLEPARATIONS=1963 * |
| METHODS ENZYMOL=1972 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61177999A (ja) | 1986-08-09 |
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