JPS58501357A - 生物学的液体の酵素分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 分析の感度を増大させる方法 発明の背景 臨床化学検査室における生物学的液体の完全な分析にはその構成成分のすべての 測定を確実にするために、多くのことなる技法を用いる必要がある。それら技法 のいくつか、特に無機および有機物質の分析に用いられる技法は酵素の測定には 適用できない。なぜならば、酵素蛋白は通例その他の蛋白質の全体量のごく小部 分にすぎないからである。したがって、生物学的液体ならびにその他の複合酵素 混合物中の酵素の特異的定量ニークな生化学的性質を測定することにょシ従来は 実施されていた。ある化学的基質がある酵素により変換される時、その触媒的変 換程度を混合物中の酵素量に相関させることが可能である。

化学的ならびに酵素的分析用の診断指示薬群の使用は、臨床分析におけるこれら の構成成分の定量を容易にしてきた。特に、診断指示薬群は、酵素活性の監視に 容易な検出手段を提供するので、酵素分析のだめの基質と共に広く用いられてき た。診断指示薬は、基質に共有結合的に耐着するかあるいは非共有的相互作用に よって基質と複合体を形成するかが可能であり、その両者共に、酵素の作用によ り破壊される。

本発明に特産的に関係している指示薬は、置換されたフェノール発色団のような イオン化型と非イオン化型に容易に転化しうる化合物を含む。これらの置換され たフェノール化合物の例としては、現在アルカリフォスファターゼ活性とアミラ ーゼ活性の測定にそれぞれ用いられているパラ−ニトロフェニル燐酸とパラ−ニ トロフェニル−マルトへシタオシドがある。これら両者の分析において、ニトロ フェノール基は、酵素の加水分解作用によりその各々の基質から開裂して中性ま たはそれに近いＰＨでイオン化型と非イオン化型をもつ指示薬を生成する。フェ ノール基のｐＫａは約７であるから、大部分の酵素分析が行われる中性の−では 、はぼ等部分のイオン化型と非イオン化型が存在する。

しかしながら、指示薬の非イオン化型は約３２０　ｎｍにて最大吸収し、イオン 化型は約１１　Ｑ　Ｑ　ｎｍで最大吸収するので、スペクトルの単一の波長のみ を監視した時には遊離された指示薬のごく一部しか検出されない。

附加的な制限は、この例の非イオン化ニトロフェノール化合物は、スペクトルの 可視波長の範囲内では吸収せず、したがって直接に比色法で検出できないという ことである。

アルカリ　フォスファターゼ分析は、遊離されたフェノールがキノイＶ構造をも つパラ−ニトロフェノキシぜ　イオンへと変２換されるアルカリ性の−ＰＨで実 施される。この反応の進行は、このキノイＶ化合物に関連した黄色の形成にもと づく波長７１０５ｎｍでモニターされる。速度分析においては、アルカリ　フォ スファターゼ酵素によるパラ−ニトロフェノールの加水分解率は反応の最適ＰＨ ですなわちＰＨＩＱ、ろで適切にモニターすることができる。というのは、フェ ノキシＶの大部分は、キノイド型であるから。終点操作において、反応が最大酵 素活性をもつＰＨで前もって決定した時間だけ進行せしめられ、それからＮａＯ Ｈを加えて−を１１．５から１２．０に高めることによシ停止させられる。

−の増加は酵素を不活化しすべてのフェノキシトを着色したキノイド型に変換さ せる。

置換されたフェノール基質を用いるその他の酵素分析の運動論的分析は、一般に アルカリ　フォスファターゼよりも低いＰＨ値で行われる。というのはそれらの 最大酵素活性はおよそ中性の−がごくわずかに中性より高いか低い−で生ずるか らである。これらの運動論的分析において、遊離されたフェノール指示薬のイオ ン化型および非イオン化型が共にほぼ同部分存在し、したがって、分析混合物中 の検出可能な指示薬の量を減少させる。分析者は、最大酵素活性をもつより上の −で分析を実施することによって、運動論的分析での感度を犠牲にするかあるい は、反応をアルカリで終了させることによって終点操作を行うかのいずれかでな ければなら左い。これまで中性のＰＨか中性に近い−で実施される運動論的酵素 分析または化学的分析でイオン化しうる発色団を、殊にニトロフェノールを診断 指示基として用いる分析は、通例約６９０〜Ａ　２Ｑ　ｎｍでモニターされ、し たがって相当多量の診断指示薬が未検出のｉｔでとどまっていた。本発明の改良 試薬ならびに方法は、これらの困難を克服し、化学的・酵素的分析の感度を増大 させる。

発明の要約 本発明に従って、我々は当該試薬が変換しうる化学的物理的状態をもつ診断指示 薬を含む化学的ならびに酵素的分析用の改善された診断試薬を発見し、その改善 は、シフロブキス）　ＩＪンのような水可溶性包接化合物（１ｎｃ１ｕｓｉｏｎ 　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　）の添加により、前記の分析の感度を増加させることから なる。

発明の詳細な説明 ここに記述された発明は、化学的酵素的分析において、シクロデキストリンのよ うな水可溶性包接化合物を使用する。変換しうる化学的・物理的状態をもつ置換 されたフェノールまだはその他の発色団のような診断指示薬を用いて、分析の感 度を実質的に増大させる改善された試薬と方法が開発された。本発明の一つの具 体化例によれば、転化しうる形態の一つをした指示薬が、シクロデキストリンと 望ましくは相互作用して、包接複合物（１ｎｃ１ｕｓｉｏｎ　ｃｏｎｐｌｅｘ　 ）を形成するよりな−試薬に、シクロデキストリンを合体させると、その指示薬 のイオン化程度が変化させられる。このことは一方を犠牲にしてもう一方の変換 可能な形態の検出を実質的に増加させ、酵素活性の最大のＰＨにおいて、より大 きい感度で酵素の運動論的分析を可能にさせることになる。本発明を用いる特産 的な例は、その基質の一部として、ニトロフェノール指示薬を用いる、生物学的 液体中のアミラーゼ、アルファーゲルコシダーゼ、プロテアーゼの運動論的酵素 分析を含む。

本発明の具体化例によれば、シクロデキストリンを試薬へ添加する効果は波長６ ９０から４２Ｑ　ｎｍの間でパラ−ニトロフェノキシＶの吸収を実質的に増加さ せ、同時に波長ろ００から３２０　ｎｍの間で、イオン化されていないパラ−ニ トロフェノールの吸収を減少させることである。シクロデキストリンの添加はパ ラーニトロフェノール＃パラーニトロフェノキシドの平衡のｐＫａを低下させる から、たとえばアミラーゼ試薬のＰＨは、約７．６から約６．６にまで低下させ ることができ、このＰＨ６，６は、基質としてパラ−ニトロフェニル−フルファ ーＤ−マルトヘゾタオシドを用いて、血清および尿中に存在するアミラーゼ活性 を測定するのに最適のＰＨである。このことはアミラーゼ活性の測定感度を著し く増加させる。

パラ−ニトロフェノールとパラーニトロフエノキシドとのアルファーシクロデキ ストリンの生成常数は、種々の技術を用いて測定されている〔Ｇｅ１ｂら、Ａｎ ａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１０３　ｍ　３６２〜３６８ （１９８０））。３０℃において、アルファーシクロデキストリン　パラ−ニト ロフェノール複合体および、アルファーシクロデキストリン　パラ−ニトロフェ ノキシド　イオン複合体に対する生成常数の各々の対数はそれぞれ２．２５１と ３．２０９である。したがって、アルファーシクロデキストリン　パラ−ニトロ フェノキシド　イオン複合体の安定性の方がはるかに高いために次の反応の平衡 はパラ−ニトロフェノキシド　イオンの比率の有意に増加した方へと移行する。

シクロデキストリン ＨＯＮｏ２０”−Ｎｏ２＋Ｈ” （無色）　（黄色キノイ曜へと再編する）そうしてその結果、約５９０〜１１２ ０　ｎｍで吸収が増加する。

本発明の一つの具体化例によれば、シクロデキストリンとニトロフェノールおよ びニトロフェノキシドイオンの間の相互作用が、これらの両化合物の吸収極大に 相当する波長領域で淡色への移行を生ずる。我々は、吸収極大におけるこれらの 淡色移行が基質として置換された指示薬群を用いる酵素分析に有利であることを 発見した。ニトロフェノール基がそこへ耐着する基質およびビリルビンやヘモグ ロビンのような血清中のその他の妨害物質はいくつかの例でニトロフェノキシド 　イオンに対する吸収極太の波長であるろ９８ｎｍ　Ｊで認めうる吸収をもつこ とが知られている。パラー二トロフエル−ト陰イオンの吸収極大が淡色波長へ移 行することは、パラ−ニトロフェノール発色団を含む基質を用いる酵素分析にお いて有利であるだろう。酵素分析において通常に用いられる濃度でこれらの基質 の多くは３９８ｎｍに認めうるほどの吸収をもっている。

４００　ｎｍに認めうる吸収をもつｐ−ニトロフェノール発色団を含む基質を用 いる分析の一例はアルカリ７オスフアターゼ基質、燐酸ｐ−ニトロフェニルであ る。この分析において、ある一定の期間中にｐ−ニトロフェノールへ加水分解さ れた基質の量を定量することによって活性を測定する。この分析で通常用いられ る基質の濃度では、Ａ　［］　［１ｎｍでの吸収は現実的である。この妨害を克 服するために、４０５　ｎｍの波長がｐ−ニトロフェノールの生産率をモニター シ、シタがってアルカリ　フォスファターゼ活性を読みとるのに典型的に用いら れる。シクロデキストリンを分析試薬に合体させると指示薬のフェノキシト型の 吸収極大を約４０５〜１１　Ｑ　７　ｎｍへと移行させるので基質吸収による妨 害を現在なされている吸収測定の感度を犠牲にすることなく実質的に減少させる か除去することかできる。

本発明によれば、シクロデキストリン類はα（１→４）リンクで結合された６個 またはそれ以上の残基を含む大環状非還元性Ｄ−グルコシル　ポリマーに属する 。

シクロデキストリン類は、シクログルカン、シャールデインガー　デキストリン 、又時々、単にデキストリンと呼ばれるがこの後者の名は、他の化合物と混同さ れることがある。現在、二通りの命名法が用いられている。これらのうちの第１ は環状重合体中の残基の数を系列名に対するギリシャ文字の接頭辞をつけること により示している。既知のシクロアミロースのうち最小のものはヘキサマーであ るから、それはアルファという接頭辞をつけられる。環状のヘプタオース、オク タオースなどは、それぞれベータ、ガンマ等デキストリンと呼ばれる。別の命名 法では同族体は重合度に対応するギリシャ接頭辞をもってシクロヘキサアミロー ス、シクロヘプタアミロース、シクロオクタアミロースの名によって示される。

形状ではこれらの分子は円環体に近く溶液中で包接化合物を形成しうる。

本発明の一つの具体化例によれば、一般にシクロデキストリン類は化学的ならび に酵素的分析の感度を高めるのに用いることができる。アルファーおよびベータ ーシクロデキストリンを用いるのが望ましい。我々は、本発明に従ってアルファ ーデキストリンが最ものぞましいことを発見した。感度を増大させるに必要なア ルファーシクロデキストリンの有効濃度は約０．１から約Ｉ　Ｑ　Ｏｗ　／−で ある。

しかしながらシクロデキストリン濃度の有効上限は用いられる緩衝液中での溶解 度により限定され特異的反応条件にしたがって変化しうる。本発明によればシク ロデキストリンの望ましい濃度は約０．１から約１００噌／−である。本発明に よる最も望ましい濃度は約５から約５０η／ｍ！である。

本発明によれば診断指示薬群は基質と共有的に着くかあるいは複合体をつくり、 酵素作用によって遊離されるか変化されるかして、ある変化がおこったことを指 示することのできる化合物である。本発明の一つの具体化例によれば変換しうる 化学的または物理的状態をもつ診断指示薬群が酵素的加水分解により基質から遊 離される。シクロデキストリンを用いる第２の変換可能状態への選択的相互作用 により第１の変換可能状態から第２の変換可能状態への変換は２つ以上の化合物 形態よりもむしろ唯１つの形の検出と分析を可能にする。変換可能な化学的ある いは物理的状態の例は、化学平衡におけるある化合物のイオン化された形とイオ ン化されない形である。本発明によれば選択される指示薬群は、ｐＫａの変化が 検出できる化合物で包接化合物と関連している時に約±０．２５　ｐｘａ単位の 変化を示すものが望ましい。本発明によれば置換されたフェノール化合物とバル ビッール酸とは変換しうる診断指示薬としてより望ましいものである。本発明に しだがう最も望ましい指示薬はパラ−およびメタ−ニトロフェノールのようなニ トロフェノール類で、それらは、眼で見て検出しうるイオン化型と検出しえない イオン化型をもつ発色団の例である。

本発明による、容易に転化しうる状態と適切なｐＫａ特性をもつ診断指示薬群の 例を第１表中に列記しである。

第１表 安息香酸　バルビッール酸 ｍ−ヒＶロキシ安息香酸　フエノバルビタールｐ−ヒドロキシ安息香酸　メフオ バルビタールｍ−メトキシ安息香酸　アモバルビタールｐ−ニトロ安息香酸　シ クロバルピタールｐ−フルオロ安息香酸　ベンドパルビタールＯ−メトキシ安息 香酸　メトバルビタールサリチル酸　パルビタール 桂　皮　酸　Ａ−ビフェニル　カルボキシレート没食子酸　ｍ−メトキシ桂皮酸 ０−ヒドロキシ桂皮酸　ｐ−メトキシ桂皮酸ｍ−ヒレロキシ桂皮酸　、ｍ−二ト ロフェノールｐ−ヒドロキシ桂皮酸　ｐ−ニトロフェノール０−メトキシ桂皮酸 　２−ナフトール 本発明による酵素とその各々の基質の例は以下の第■表に例証されている。

第■表 アルファ　アミラーゼ　”ニトロフェニルオリゴグリコシドアルファおよびベー タグルコシダービ　“ニトロフェニル　グリコシドベーターがラクトシｌ−ゼ　 “ニトロフェニル　ガラクトシドアルファ　マンノシダーゼ　“ニトロフェニル 　マンノシドアルファ　フコシダーゼ　ニトロフェニル　フコシドアシド　フォ スファターゼ　”ニトロフェニル　フォスフェートアルカリ　フォスファターゼ 　−トロフェニル　フォスフニートチパラ−およびメタ−誘導体 本発明による以下の例は、例証するためにのみ記され、その範囲を限定する意図 によるものではない。

第１図は、パラ−およびメタ−ニトロフェノール溶液中に添加されたシクロデキ ストリンの効果を例証し、そこにおいて、０．１０モル燐酸す）ＩＪウム緩衝溶 液中のパラ−ニトロフェノールの吸収スペクトルが、緩衝溶液中アルファー７ク ロデキストリンの添加あるいはそれなしでＰＨ６，８で示されている。緩衝溶液 中にアルファーシクロデキストリンの存在しない場合（点線）パラ−ニトロフェ ノールのイオン化型とイオン化されていない型にそれぞれ相当する約３１８ｎｍ と約６９７ｎｍの吸収はほぼ等しい。アルファーシクロデキストリンを緩衝溶液 中５０〜／−の濃度で添加し、（実線）スペクトルを再実施すると、吸収極大は 約５１８　ｎｍにあったものは実質的に消失し、一方、約ろ９７　ｎｍにあった 吸収極大は有意に増加してより長波長の約４０６　ｎｍへと移行している。類似 の状況がベーターシクロデキストリンの添加もしくは添加なしての同一緩衝溶液 を用いた時も生ずる。

アルファおよびベータ　シクロデキストリンはパラ−ニトロフェノールのイオン 化型および非イオン化型の吸収極太に相当する波長の淡色移行をひきおこす。

これらの淡色移行は第２図に示されており、それは、（１１等量の１．ｃＪｒｒ Ｄｌ／ｌの塩酸で稀釈されたＱ、Ｑ　５　ｍｏｌ／１のＮａ（Ｊ！で最終ＰＨ約 １のものを含む０．１　ｍｏｌ　／　／の燐酸ナトリウム緩衝溶液ＰＨ７，００ 中のパラ−ニトロフェノールと（２）等量の１．［ｌ　ｍｏｌ　／　ｌの水酸化 す）　ＩＪウムで稀釈された０、０５　ｍｏｌ　／　ｌのＮａＣＪＬで最終ＰＨ 約１６のものを含む０．１　ｍｏｌ　／　ｌの燐酸ナトリウム緩衝溶液ＰＨ７， ＯＯ中のパラ−ニトロフェノキシドの吸収スペクトルである。これらのスペクト ルの各々は溶液中にアルファーシクロデキストリンの添加下（実線）および添加 なしく点線）で測定された。吸収スペクトルは、イオン化されていないパラ−ニ トロフェノールの吸収極太が、アルファーシクロデキストリンを溶液に添加した 時に約３１６ｎｍから３２８　ｎｍに移行することを示している。同様の淡色へ の波長移行がアルファーシクロデキストリンの存在下にパラ−ニトロフェノキシ ドでも生じる。この場合、吸収極大は、約６９３　ｎｍから約４０６　ｎｍへと 移行する。

例　３ 感度を増大させるのに必要なアルファーシクロデキス）　ＩＪンの有効濃度は、 約０．１から約１０ＣＩ＋ｇ／−である。第３図は緩衝溶液中のアルファーシク ロデキストリノ濃度の関数としてのパラ−ニトロフェノールのイオン化パーセン トのグラフである。６つのことなるｐＨ値に対するデータは、シクロデキストリ ンの添加による平衡の劇的外移行を示している。

第４図において、感度の増加パーセントを（緩衝溶液中にアルファーシクロデキ ストリノ添加時の４０６ｎｍでの吸収を同じ緩衝溶液中にアルファーシクロデキ ストリンの添加なしでの３９８ｎｍでの吸収で除したものとして定義される）ア ルファーシクロデキストリン／−緩衝溶液の濃度の関数としてプロットした以外 は同じデータのグラフである。３つのことなるｐＨ値に対してデータが与えられ ている。アルファーシクロデキストリン濃度は、緩衝溶液中シクロデキスト１ノ ンの０．１１ｎｇ／−１で有効であることがわかる。最大効果は約５〜２５■／ ７！で通常みられる。これらをこえ５０即／−までの濃度は、有意に感度を増大 させない。

有効濃度は、緩衝溶液中の溶解度の限度までおそらく用いることができるであろ う。

本発明を使用する一例は、組合せ酵素分析における基質、ハラ−ニトロフェニル −アルファークーマルトヘプタオシドを用いるアルファーアミラーゼ活性の分析 において以下のように示される： ＋　ＰＩＰ−α−Ｄ−マルトヘプタオシド　α−”ｒミラ−ゼＰＮＰ−（グルコ ース）、−ｎ＋（グルコース）ｎＰＮＰ−（グ次コース）１−３　α−ｙｐｖｓ −ｙダーゼ　ＰＮＰ士グルコース栂ＰＮＰはパラ−ニトロフェノールであるこの 分析において（アメリカ合衆国特許点１１０２．７４７）パラ−ニトロフェニル −アルファークーマルトヘプタオシドは、アルファーアミラーゼによって、より 短かい鎖のＰＮＰ−グリコシドと寡糖類へと加水分解される。１から６個のグル コース単位を含むより短かい鎖ＰＮＰ−グリコシ「は、それからアルファーグル コシドによって遊離のパラ−ニトロフェノールとグルコースに加水分解される。

アルファーアミラーゼ活性はサンプルを分析試薬に加えた後の時間の関数として ４　Ｑ　（５ｎｍでの吸収の増加を測定することにより、速度あるいは運動論的 操作法を用いて、この分析において測定される。

この分析は２乙００をもつ試薬を用いて以前に開発されていた。しかしながら、 この−は人間の血清に存在するアルファーアミラーゼに対して最適ではなく、１ ／２ｏのサンプル／試薬容量比を用いて期待される正常範囲で充分な感度を与え るＰＨであった。血清中に存在するアルファーアミラーゼに対しては、最大感度 の−は、７．３であり、それはパラ−ニトロフェニル−アルファーＤ−マルトヘ ゾタオシドを基質として用いる時に約６．５である最大アミラーゼ活性に対する ＰＨから有意に相違している。このことは約７．３のＰＨに到達するまでのアミ ラーゼ活性の減少をＰＨ増加に伴うパラ−ニトロフェノールのイオン化の増加が より多く相殺するという事実のせいである。アルファーシクロデキストリンを１ ０ｍｇ／ｒｎｌの濃度で試薬に添加する時、最大感度の−は、７．６から７．０ に変化し、更に約５０％の感度増大が実質的におこる。試薬中のアルファーシク ロデキストリンによる感度の増加と共に、パラ−ニトロフェノール−アルファー Ｄ−マルトヘゾタオシドを基質として用いるおよそ最適のＰＨである約ｐＨ６， ５のアミラーゼ試薬を用いて、人間の血清中に存在するアルファーアミラーゼ活 性を測定することが今や可能である。このＰＨを用いることの附加的な利点は、 カップリング酵素アルファーグルコシド、の活性がより少なく、基質もよシ少な くてすむことである。

試薬中にアルファーシクロデキストリンを用いて検討された酵素分析の別の一例 はアルファーグルコシドである。この分析は基質にパラ−ニトロフェニル−アル ファーＤ−グルコシドを用い、それがアルファーグルコシぷ−ゼにより加水分解 されてグルコースとパラ−ニトロフェノールになる。酵素活性は、サンプルを試 薬へ加えた後に１から５分の間隔で、７１　Ｑ　６ｎｍで許される吸収の変化を 測定するここすしより、運動論的速度分析を用いて測定する。

アルファーアミラーゼ分析試薬は、１３．８０グラムのＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏを 約９０（］−のイオン除去水または蒸溜水と１．４６グラムのＮａＣＪに加える ことによって調製する。塩類が溶解してしまった後に、１ｍｏｌ！／ｌ！のＮａ ＯＨでＰＨを６．５０に調整する。アミラーゼ基質（パラ−ニトロフェニル−ア ルファークーマルトへフタオシド）の２．０グラムをＰＩ−１６，５０の緩衝溶 液に溶解する。

６．０グラムのアルファーシクロデキストリンを加え、完全に溶解するまで混合 する。アルファーシクロデキストリンの最適濃度は第５図に示したように試薬を 最適化させることによって測定できる。最適濃度は重量基準でシフロブキス）　 ＩＪン対基質が約２＝１から約７：１までであることがわかる。２２５．＋］　 Ｑ　Ｏ単位のアルファーグルコシドを加え、溶解するまで静かに混合する（１単 位のアルファーグルコシドとは、基質パラ一二トロンエニルーアルファ−Ｄ−グ ルコシドラ用いて６７°ＣでｐＨ６，８０にて分析した時に、ｉ、ｏの吸収変化 を与える酵素活性量として定義される）。この溶液をイオン除去水まだは蒸溜水 で１．００１Ｊツトルに稀人間の血清および尿中のアミラーゼの分析に以下の操 作法を用いることができる。

１　アミラーゼ試薬１．０−をセルに加え、ろ００あるいは６７°Ｃの反応温度 にあたためる。

２、　サンプル０．０５−をアミラーゼ試薬に加え、混合する。

６、サンプル添加後４−７分間隔でＡ　口６ｎｍで１分あたシの吸収の変化を測 定する。

４．１リツトルのサンプルにつき、１分につき生ずるパラ−ニトロフェノールの ミクロモルとして表わされた酵素活性単位を１分あたりの吸収の変化に係数を乗 じて計算する。

本発明は詳細に記述されてきた。そうして望ましい具体化例がここに例証されて いる。しかしながら、通常の技術をもつ人が本発明の精神と範囲からはなれ彦い で、それに改良変更をある程度加えることは明らかであろう。

−５０ｍｇ／ｍｌ　ａ−シクロデキスト１ルテ奈加−−−−ａ−シクロテ゛キス トリングし：、Ｌ　表　（ｎｍｌ ａ−レクロデキストリン　（ｍａ／ｍｌ）手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称 ＠航９惑Ａｔｈ４人ａうΔ丞 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 ５、補正命令の日付 昭和５８年５月２４日 ６、補正により増加する発明の数 国際調査報告・

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　水可溶性包接化合物を診断試薬に加え、前記の試薬は変換可能な化学的あ るいは物理的状態をもつ指示薬を含有し。 前記の水可溶性包接化合物は、前述の変換可能な状態のうちの一つに対して選択 的親和性を有していること よシなる化学的ならびに酵素的分析の感度の増加方法。 ２、　水可溶性包接化合物がシクロデキストリンである請求の範囲第１項の方法 。 ６、　変換可能な化学的あるいは物理的状態が、前記指示薬のイオン化された型 およびイオン化されない型である請求の範囲第１項の方法。 ４、　水可溶性包接化合物がシフロブキス）　＋Ｊンであシ、変換可能な化学的 あるいは物理的状態が前記の指示薬のイオン化された型およびイオン化されない 型である請求の範囲第１項の方法。 ５、　前記指示薬の変換可能な状態がお互いにことなるスペクトル特性をもつ請 求の範囲第４項の方法。 ６、指示薬の前記の変換可能な状態の一つが可視検出可能であり、もう一つの変 換可能な状態が眼で検出できない請求の範囲第５項の方法。 Ｚ　指示薬が置換されたフェノール、置換されているかあるいは置換されていな いバルビッール化合物。 置換されているかあるいは置換されていない桂皮酸、置換されているかあるいは 置換されていない安息香酸からなる群から選択される請求の範囲第５項の方法。 ８　指示薬が置換されたフェノール化合物である請求の範囲第５項の方法。 ９　置換されたフェノール化合物が、パラ−あるいはメタ−ニトロフェノールで ある請求の範囲第８項の方法。 １０、酵素分析が、生物学的液体中のアミラーゼまたはアルファーゲルコシドー スに対してなされる請求の範囲第６項の方法。 １１、酵素分析が生物学的液体中のアミラーゼまたはアルファーゲルコシドース に対してなされる請求の範囲第７項の方法。 １２、シクロデキストリンがアルファーまたはベーターシクロデキストリンであ る請求の範囲第４．５．６．７．８項の方法。 １６、試薬中のシクロデキストリンの濃度が約０．１から約１００ｍｖ／−であ る請求の範囲第１２項の方法。 １４、シクロデキストリンの濃度が約５から約５０ｍｇ／−である請求の範囲第 １５項の方法。 １５、シクロデキストリンの濃度が約５から約２５１ｎｇ／−である請求の範囲 第１４項の方法。 １６、試薬のＰＨが約６．６である請求の範囲第１０項の、方法。 １Ｚ　シクロデキストリンが約５から約２５■／−の濃度のアルファーシクロデ キストリンであり、指示薬がパラ−あるいはメタ−ニトロフェノールで、試薬の −は約６．６、そして酵素分析°がアミラーゼまたはアルファーゲルコシドース に対してなされる請求の範囲第６項の方法。 １８、酵素分析−がアミラーゼ活性の測定のためになされ、試薬が更にパラ−ニ トロフェニルマルトへブタオシドを基質として含み、又、マルターゼを含む請求 の範囲第６項の方法。 １９　酵素分析が生物学的液体中のプロテアーゼの測定に対してなされる請求の 範囲第５項または第６項の方法。 ２０、水可溶性包接化合物が前記指示薬の前記変換可能な状態の一つに対して選 択的親和性をもっことを改良点とする、 変換可能な化学的または物理的状態をもつ指示薬を前記試薬が有する、化学的お よび酵素的分析用の改良された診断試薬。 ２１、水可溶性包接化合物がシクロデキストリンである請求の範囲第２０項の改 良された試薬。 ２２、変換可能な化学的あるいは物理的状態が前記指示薬のイオン化された型お よびイオン化されない型である請求の範囲第２０項の改良された試薬。 ２６、水可溶性包接化合物がシフロブキス）　ＩＪンであり変換可能な化学的あ るいは物理的状態が前記指示薬のイオン化された型およびイオン化されていない 型である請求の範囲第２０項の改良された試薬。 ２４、前記の指示薬の変換可能な状態がお互いにことなるスペクトル特性をも゛ っ請求の範囲第２３項の改良された試薬。 ２５、指示薬が、置換されたフェノール、置換されたあるいは置換されていない バルビッール化合物、置換されたあるいは置換されていない桂皮酸、置換された あるいは置換されていない安息香酸からなるグループから選択される請求の範囲 第２４項の改良された試薬。 ２６、指示薬がパラ−またはメタ−ニトロフェノールである請求の範囲第２４項 の改良された試薬。 ２Ｚ　シクロデキストリンが約５から約２５ｑ／ｄの濃度でのアルファーシクロ デキストリンであシ、指示薬がパラ−またはメタ−ニトロフェノールであって、 試薬のＰＨが約６．６であシ、そして酵素分析がアミラーゼまたはアルファーゲ ルコシドースに対して々される請求の範囲第２４項の改良された試薬。 ２８、酵素分析が生物学的液体中のアミラーゼまたはアルファーグルコシダース に対してなされる請求の範囲第２６項の改良された試薬。 ２９試薬が更にパラ−ニトロフェニルマルタへツタオシ「を基質として含み、そ してマルターゼを含む請求の範囲第２８項の改良された試薬。 ６０　シクロデキストリンのパラ−ニトロフェニルマルトへシタオシドに対する 重量比が約２から約７である請求の範囲第２９項の改良された試薬。