JPH0542278B2 - - Google Patents
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- JPH0542278B2 JPH0542278B2 JP59093547A JP9354784A JPH0542278B2 JP H0542278 B2 JPH0542278 B2 JP H0542278B2 JP 59093547 A JP59093547 A JP 59093547A JP 9354784 A JP9354784 A JP 9354784A JP H0542278 B2 JPH0542278 B2 JP H0542278B2
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- serum
- che
- pci
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
- C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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- Biophysics (AREA)
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- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般式（）
（式中Ｘはハロゲ原子を表わす）で表わされるコ
リン誘導体を基質として用いることを特徴とする
コリンエステラーゼ活性の測定法に関する。
リン誘導体を基質として用いることを特徴とする
コリンエステラーゼ活性の測定法に関する。
従来合成基質を使用する血清中のコリンエステ
ラーゼ（以下ChEと記す）活性の測定法は種々報
告され、また日常の臨床検査に実用化されている
ものもある。しかしそれらの測定法には種々の欠
点や問題点があり、測定値の不正確さの原因にな
つている。それらの測定法の例をあげると、ガス
分析法、PHメーター法、PH指示薬比色法、チオコ
リン発色法、酵素法、UV法等がある。
ラーゼ（以下ChEと記す）活性の測定法は種々報
告され、また日常の臨床検査に実用化されている
ものもある。しかしそれらの測定法には種々の欠
点や問題点があり、測定値の不正確さの原因にな
つている。それらの測定法の例をあげると、ガス
分析法、PHメーター法、PH指示薬比色法、チオコ
リン発色法、酵素法、UV法等がある。
ガス分析法〔R.Ammon：Pflu¨gers Arch、
Ges Physiol.、233、487（1933）〕は合成基質とし
てアセチルコリンを用い、ChEの酵素作用で生成
した酢酸により炭酸水素ナトリウムから発生する
炭酸ガスを定量する方法であるが、操作が煩雑で
多数の検体を処理することができないなどの欠点
がある。
Ges Physiol.、233、487（1933）〕は合成基質とし
てアセチルコリンを用い、ChEの酵素作用で生成
した酢酸により炭酸水素ナトリウムから発生する
炭酸ガスを定量する方法であるが、操作が煩雑で
多数の検体を処理することができないなどの欠点
がある。
PHメーター法〔H.O.Michel：J.Lab.＆Clin.
Med.、34、1564（1949）〕もガス分析法と同様に
ChEの酵素作用によつて生じた酢酸によるPHの変
化をPHメーターで測定する方法であるが、PHメー
ターの精度、多数の検体を処理することができな
いなど実用上の問題がある。
Med.、34、1564（1949）〕もガス分析法と同様に
ChEの酵素作用によつて生じた酢酸によるPHの変
化をPHメーターで測定する方法であるが、PHメー
ターの精度、多数の検体を処理することができな
いなど実用上の問題がある。
PH指示薬比色法はPHメーター法とは異なり、
ChEにより生じた酢酸によるPHの変化を指示薬の
分子吸光度を測定する方法で、指示薬としてはフ
エノールレツド〔高橋浩、柴田進：医学と生物
学、20、96（1951）〕、ブロムチモールブルー〔H.
G.Biggs、etal：Amer.J.Clin.Path.、30、181
（1958）〕、ｍ−ニトロフエノール〔佐々木匡秀：
臨床病理、12、555（1964）〕などが使われている。
この方法は操作も簡便で多数の検体を処理するこ
ともできるが、反応時間が長く、反応中にもPHが
一定でなく、低値と高値で再現性があまり良くな
いなどの欠点が指摘されている。
ChEにより生じた酢酸によるPHの変化を指示薬の
分子吸光度を測定する方法で、指示薬としてはフ
エノールレツド〔高橋浩、柴田進：医学と生物
学、20、96（1951）〕、ブロムチモールブルー〔H.
G.Biggs、etal：Amer.J.Clin.Path.、30、181
（1958）〕、ｍ−ニトロフエノール〔佐々木匡秀：
臨床病理、12、555（1964）〕などが使われている。
この方法は操作も簡便で多数の検体を処理するこ
ともできるが、反応時間が長く、反応中にもPHが
一定でなく、低値と高値で再現性があまり良くな
いなどの欠点が指摘されている。
上述したアセチルコリンを基質として用いる方
法では、アセチルコリンは非酵素的加水分解を起
しやすく、また基質特異性もあまりないので、基
質そのものにも問題がある。
法では、アセチルコリンは非酵素的加水分解を起
しやすく、また基質特異性もあまりないので、基
質そのものにも問題がある。
チオコリン法〔P.Garry：J.Clin.Chem.、11(2)、
91（1965）〕は基質としてアセチルチオコリン、プ
ロピルチオコリン、ブチルチオコリン等が使用さ
れている。これらの基質はChEの酵素作用でチオ
コリンを生成し、それが５，5′−ジチオビス−２
−ニトロ安息香酸（DTNB）と反応して黄色を
生じる。この黄色の吸光度を比色計で測定する方
法である。この方法は反応性に優れ、感度が高
く、また操作も簡単で多数の検体を処理すること
ができるとともに初速度法もできるなど優れた点
もあるが、呈色が黄色であるため血清中のビリル
ビンの影響を強く受け、またグルタチオンのよう
なチオール基を有する化合物の影響もまぬがれえ
ないし、さらに基質そのものが不安定であること
も問題になつているなどの欠点があり、測定値の
誤差の原因になつている。
91（1965）〕は基質としてアセチルチオコリン、プ
ロピルチオコリン、ブチルチオコリン等が使用さ
れている。これらの基質はChEの酵素作用でチオ
コリンを生成し、それが５，5′−ジチオビス−２
−ニトロ安息香酸（DTNB）と反応して黄色を
生じる。この黄色の吸光度を比色計で測定する方
法である。この方法は反応性に優れ、感度が高
く、また操作も簡単で多数の検体を処理すること
ができるとともに初速度法もできるなど優れた点
もあるが、呈色が黄色であるため血清中のビリル
ビンの影響を強く受け、またグルタチオンのよう
なチオール基を有する化合物の影響もまぬがれえ
ないし、さらに基質そのものが不安定であること
も問題になつているなどの欠点があり、測定値の
誤差の原因になつている。
酵素法はベンゾイルコリン〔岡部紘明他：臨床
病理、25、751（1977）〕とオルソトルオイルコリ
ン〔特開昭54−138533〕などを基質として用い、
ChEの酵素作用で生成したコリンをコリンオキシ
ダーゼによりベタインに変化させ、その時生成す
る過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で４−
アミノアンチピリンをフエノールなどとの酸化的
縮合反応で発色させる方法である。この方法は呈
色が赤色になるので、血清中のビリルビンなどの
干渉を受けず、多数の検体を処理することもでき
るが、発色系の試薬として使用するフエノールや
４−アミノアンチピリンがChEに対して拮抗阻害
があるので、それらの使用量が非常に限定され、
十分な発色が難しい。一般に過酸化水素を経由す
る定量法は血清中のビリルビンやアスコルビン酸
などの還元性物質による影響はまぬがれえない
し、リン脂質の分解などで生じるコリンと影響も
受ける。ベンゾイルコリンを基質として用いた場
合は、非酵素的加水分解性も問題になつているな
ど種々の問題がある。
病理、25、751（1977）〕とオルソトルオイルコリ
ン〔特開昭54−138533〕などを基質として用い、
ChEの酵素作用で生成したコリンをコリンオキシ
ダーゼによりベタインに変化させ、その時生成す
る過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で４−
アミノアンチピリンをフエノールなどとの酸化的
縮合反応で発色させる方法である。この方法は呈
色が赤色になるので、血清中のビリルビンなどの
干渉を受けず、多数の検体を処理することもでき
るが、発色系の試薬として使用するフエノールや
４−アミノアンチピリンがChEに対して拮抗阻害
があるので、それらの使用量が非常に限定され、
十分な発色が難しい。一般に過酸化水素を経由す
る定量法は血清中のビリルビンやアスコルビン酸
などの還元性物質による影響はまぬがれえない
し、リン脂質の分解などで生じるコリンと影響も
受ける。ベンゾイルコリンを基質として用いた場
合は、非酵素的加水分解性も問題になつているな
ど種々の問題がある。
UV法には２種類があり、一つはW.Kalowのベ
ンゾイルコリン〔W.Kalow and K.Genet：
Canad.J.Biochem.＆Phyoiol.、35、339（1957）〕
を基質とする方法であり、もう一つはｐ−ヒドロ
キシコリン〔特開昭57−110198、特開昭58−
129999〕を基質とする方法である。前者はChEの
酵素作用によつて基質が加水分解し、その基質が
減少していく様子を測定波長240nｍで追跡して
いく方法である。この方法の測定原理は直接基質
の減少を測定しているので単純明解であるが、測
定波長が240nｍであるめ血清成分の干渉を受け
やすいし、基質のベンゾイルコリンが基質阻害を
起すため、反応液の基質濃度が限定され、直線性
の範囲が狭く、またベンゾイルコリンの非酵素的
加水分解が起りやすいので、ChEの至適PHで反応
を行つていないなどの問題がある。後者は基質と
してｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを使用し、
ChEの酵素作用によつて生成するｐ−ヒドロキシ
安息香酸を補酵素NADPHの存在下でｐ−ヒド
ロキシ安息香酸水酸化酵素の作用により
NADPHが酸化されNADPに変化する際の吸光
度の減少を波長340nｍで測定追跡する方法であ
る。この方法はほぼ至適PHで反応が行えるし、過
酸化水素−発色系における欠点、すなわちビリル
ビンやアスコルビン酸などの還元性物質による影
響やリン脂質の分解で生じるコリンの干渉を除く
ことができ、チオコリン法の欠点もなく、さらに
多数の検体処理が可能な自動分析装置に適した優
れたChE活性測定法である。しかしながら、使用
する補酵素NADPHは高価な試薬であり、安定
性も悪いので一定の品質に維持および管理するの
が難しいし、また酵素してｐ−ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素やプロトカテキユ酸−３，４−ジオ
キシゲナーゼなどを使用し、測定原理としては前
者に比較して大分複雑であり、測定値の誤差要因
が多い。またChE活性の測定法としては異型コリ
ンエステラーゼの活性測定も重要である。しか
し、この後者の方法はフツ化ナトリウムの影響を
強く受けるため異型コリンエステラーゼの活性測
定には問題がある。
ンゾイルコリン〔W.Kalow and K.Genet：
Canad.J.Biochem.＆Phyoiol.、35、339（1957）〕
を基質とする方法であり、もう一つはｐ−ヒドロ
キシコリン〔特開昭57−110198、特開昭58−
129999〕を基質とする方法である。前者はChEの
酵素作用によつて基質が加水分解し、その基質が
減少していく様子を測定波長240nｍで追跡して
いく方法である。この方法の測定原理は直接基質
の減少を測定しているので単純明解であるが、測
定波長が240nｍであるめ血清成分の干渉を受け
やすいし、基質のベンゾイルコリンが基質阻害を
起すため、反応液の基質濃度が限定され、直線性
の範囲が狭く、またベンゾイルコリンの非酵素的
加水分解が起りやすいので、ChEの至適PHで反応
を行つていないなどの問題がある。後者は基質と
してｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを使用し、
ChEの酵素作用によつて生成するｐ−ヒドロキシ
安息香酸を補酵素NADPHの存在下でｐ−ヒド
ロキシ安息香酸水酸化酵素の作用により
NADPHが酸化されNADPに変化する際の吸光
度の減少を波長340nｍで測定追跡する方法であ
る。この方法はほぼ至適PHで反応が行えるし、過
酸化水素−発色系における欠点、すなわちビリル
ビンやアスコルビン酸などの還元性物質による影
響やリン脂質の分解で生じるコリンの干渉を除く
ことができ、チオコリン法の欠点もなく、さらに
多数の検体処理が可能な自動分析装置に適した優
れたChE活性測定法である。しかしながら、使用
する補酵素NADPHは高価な試薬であり、安定
性も悪いので一定の品質に維持および管理するの
が難しいし、また酵素してｐ−ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素やプロトカテキユ酸−３，４−ジオ
キシゲナーゼなどを使用し、測定原理としては前
者に比較して大分複雑であり、測定値の誤差要因
が多い。またChE活性の測定法としては異型コリ
ンエステラーゼの活性測定も重要である。しか
し、この後者の方法はフツ化ナトリウムの影響を
強く受けるため異型コリンエステラーゼの活性測
定には問題がある。
以上に述べたごとく、従来のChEの酵素活性測
定法には種々の問題があり、測定値の誤差の原因
になつている。我々は従来法の欠点を解決すべく
鋭意研究し、一般式（）で表わされる化合物の
１種であるプロトカテキユイルコリンアイオダイ
ド（以下PCIと記す）を基質として用いる血清
ChE活性を測定する新規な方法を発生するに至つ
た。
定法には種々の問題があり、測定値の誤差の原因
になつている。我々は従来法の欠点を解決すべく
鋭意研究し、一般式（）で表わされる化合物の
１種であるプロトカテキユイルコリンアイオダイ
ド（以下PCIと記す）を基質として用いる血清
ChE活性を測定する新規な方法を発生するに至つ
た。
第２図にPCIとプロトカテキユ酸のUVスペク
トルを示した。PCIがChEの作用で加水分解する
とコリンとプロトカテキユ酸を生成する。コリン
は波長300nｍ以上ではUV吸収はない。プロトカ
テキユ酸は波長340nｍ以上ではUV吸収はほとん
どしない。したがつて、PCIをChE活性を測定す
る基質として使用し、測定波長340から360nｍで
反応を追跡すれば、基質PCIの減少を正確に追う
ことができる。前述のW.KalowのUV法では測定
波長240nであるので初期吸収において血液成分
の干渉を大きく受けるが、本発明の測定波長340
から360nｍではあまり受けないので、至適な測
定条件の設定が容易である。この基質PCIは非酵
素的加水分解に対して非常に安定である。たとえ
ばPHが8.5の50ｍＭバルビタール緩衝液中37℃の
条件下で90分間ではほとんど加水分解は起きなか
つた（第６図参照）。この結果は測定中非酵素的
加水分解は無視できることを示している。PHを一
定に保持するための緩衝剤として、バルビタール
酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、グリシン、グリ
シルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノメ
タンなどが使用できる。上記以外の緩衝剤でもPH
を7.5〜10.0の間において緩衝能を維持できるも
のであれば用いることが可能である。
トルを示した。PCIがChEの作用で加水分解する
とコリンとプロトカテキユ酸を生成する。コリン
は波長300nｍ以上ではUV吸収はない。プロトカ
テキユ酸は波長340nｍ以上ではUV吸収はほとん
どしない。したがつて、PCIをChE活性を測定す
る基質として使用し、測定波長340から360nｍで
反応を追跡すれば、基質PCIの減少を正確に追う
ことができる。前述のW.KalowのUV法では測定
波長240nであるので初期吸収において血液成分
の干渉を大きく受けるが、本発明の測定波長340
から360nｍではあまり受けないので、至適な測
定条件の設定が容易である。この基質PCIは非酵
素的加水分解に対して非常に安定である。たとえ
ばPHが8.5の50ｍＭバルビタール緩衝液中37℃の
条件下で90分間ではほとんど加水分解は起きなか
つた（第６図参照）。この結果は測定中非酵素的
加水分解は無視できることを示している。PHを一
定に保持するための緩衝剤として、バルビタール
酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、グリシン、グリ
シルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノメ
タンなどが使用できる。上記以外の緩衝剤でもPH
を7.5〜10.0の間において緩衝能を維持できるも
のであれば用いることが可能である。
ChEに対するPCIのKm値はベンゾイルコリン
と同程度で50ｍＭトリス・マレイン酸緩衝液（PH
8.2）では2.6×10-5mol／、50ｍＭバルビター
ル緩衝液（PH8.5）では5.88×10- 5mol／であ
る。PCIのKm値が十分小さいので、本発明の測
定法の反応系では十分な基質濃度で反応を行うこ
とができ、経時的直線範囲が広くなり、高単位の
活性まで十分測定が可能である。
と同程度で50ｍＭトリス・マレイン酸緩衝液（PH
8.2）では2.6×10-5mol／、50ｍＭバルビター
ル緩衝液（PH8.5）では5.88×10- 5mol／であ
る。PCIのKm値が十分小さいので、本発明の測
定法の反応系では十分な基質濃度で反応を行うこ
とができ、経時的直線範囲が広くなり、高単位の
活性まで十分測定が可能である。
PCIを基質として用いた場合、50ｍＭバルビタ
ール緩衝液ではChEの至適PHは8.5〜8.6であつた
（第５図参照）。前述のごとくPCIはPH8.5で非酵素
的加水分解安定性があるので、本発明の測定法は
ChEの至適のPHで反応を行うことができる。
ール緩衝液ではChEの至適PHは8.5〜8.6であつた
（第５図参照）。前述のごとくPCIはPH8.5で非酵素
的加水分解安定性があるので、本発明の測定法は
ChEの至適のPHで反応を行うことができる。
検体中の共存物質が測定値に影響する場合、測
定値の誤差原因になることは前述の通りである。
本発明の方法は測定原理的にみても共存物質の影
響を受け難い。共存物質たとえば、アスコルビン
酸20mg／dl、尿酸20mg／dl、グルコース500mg／
dl、ヘモグロビン200mg／dl、アルブミン５ｇ／
dl、ビリルビン20mg／dl、グルタチオン（還元
型）50mg／dlまでは添加試験では問題はなかつた
（第７図〜第１３図参照）。抗凝固剤EDTE・
2Na、クエン酸塩、ヘパリン、蓚酸塩、二重シユ
ウ酸等の添加試験でも問題はなかつた（第１４図
参照）。本発明は共存物質の影響を非常に受け難
い方法であり、測定値の誤差原因が大幅に解消さ
れた。
定値の誤差原因になることは前述の通りである。
本発明の方法は測定原理的にみても共存物質の影
響を受け難い。共存物質たとえば、アスコルビン
酸20mg／dl、尿酸20mg／dl、グルコース500mg／
dl、ヘモグロビン200mg／dl、アルブミン５ｇ／
dl、ビリルビン20mg／dl、グルタチオン（還元
型）50mg／dlまでは添加試験では問題はなかつた
（第７図〜第１３図参照）。抗凝固剤EDTE・
2Na、クエン酸塩、ヘパリン、蓚酸塩、二重シユ
ウ酸等の添加試験でも問題はなかつた（第１４図
参照）。本発明は共存物質の影響を非常に受け難
い方法であり、測定値の誤差原因が大幅に解消さ
れた。
コリンエステラーゼには血清中に存在するプソ
イドコリンエステラーゼと赤血球中に存在するツ
ルーコリンエステラーゼの二重が知られている。
通常臨床検査で測定されているのは血清中のプソ
イドコリンエステラーゼであるが、血清中にツル
ーコリンエステラーゼが混入している場合がある
ので、検査目的としてはプソイドコリンエステラ
ーゼのみと選択的反応する基質が望ましい。本発
明の方法に用いるPCIはプソイドコリンエステラ
ーゼとは良く反応するが、ツルーコリンエステー
ゼとはほとんど反応しない非常に特異性の高い基
質である。
イドコリンエステラーゼと赤血球中に存在するツ
ルーコリンエステラーゼの二重が知られている。
通常臨床検査で測定されているのは血清中のプソ
イドコリンエステラーゼであるが、血清中にツル
ーコリンエステラーゼが混入している場合がある
ので、検査目的としてはプソイドコリンエステラ
ーゼのみと選択的反応する基質が望ましい。本発
明の方法に用いるPCIはプソイドコリンエステラ
ーゼとは良く反応するが、ツルーコリンエステー
ゼとはほとんど反応しない非常に特異性の高い基
質である。
外科および精神科領域で麻酔剤とプソイドコリ
ンエステラーゼの関係で異常プソイドコリンエス
テラーゼ検査が重要である。本発明の測定方法は
反応機構的に単純明解なので異常プソイドコリン
エステラーゼ検査法として非常に適している。
ンエステラーゼの関係で異常プソイドコリンエス
テラーゼ検査が重要である。本発明の測定方法は
反応機構的に単純明解なので異常プソイドコリン
エステラーゼ検査法として非常に適している。
本発明のChE活性測定方法は上記のごとく種々
の点で従来法の問題点が解決されている。本発明
の利点を記すと次のごとくである。
の点で従来法の問題点が解決されている。本発明
の利点を記すと次のごとくである。
(1) 測定系の反応機構が単純明解で、測定値の誤
差原因が非常に少い。
差原因が非常に少い。
(2) 基質に用いるPCIが非酵素的加水分解や酸化
に対して安定なので、測定値の再現性が非常に
良い。
に対して安定なので、測定値の再現性が非常に
良い。
(3) PCIはプソイドコリンエステラーゼに対し
て、基質特異性が高い。
て、基質特異性が高い。
(4) 基質PCI以外に酸化還元系の酵素や補酵素、
呈色系の試薬など用いないので安価である。
呈色系の試薬など用いないので安価である。
(5) 前記のごとく、ビリルビン、アスコルビン
酸、グルタチオン等の検体成分や抗凝固剤の影
響をほとんど受けない。
酸、グルタチオン等の検体成分や抗凝固剤の影
響をほとんど受けない。
(6) 検体ごとに検体ブランクをたてる必要がない
ので簡易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処
理することが可能である。
ので簡易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処
理することが可能である。
(7) 異常プソイドコリンエステラーゼ検査が可能
である。
である。
(8) PCIが安定なので、至適PH（8.5〜8.6）での
反応が可能である。
反応が可能である。
(9) 高単位まで測定可能である。
以上のごとく、本発明のChE活性測定方法は従
来法の有する欠点を解決し、多くの利点や特徴を
有し、正確かつ簡便にChE活性を測定でき、日常
の臨床検査のChE活性測定に充分貢献できるもの
である。
来法の有する欠点を解決し、多くの利点や特徴を
有し、正確かつ簡便にChE活性を測定でき、日常
の臨床検査のChE活性測定に充分貢献できるもの
である。
以下に参考例および実施例によりさらに詳細に
説明するが、本発明はこれによつて限定されるも
のではない。
説明するが、本発明はこれによつて限定されるも
のではない。
参考例 １
プロトカテキユイルコリンアイオダイドの合成
法 プロトカテキユ酸10ｇを2.73N NaOH71mlに
溶解し、０〜５℃に氷冷し、激しく撹拌しながら
カルボベンゾキシクロライド22mlを滴下した。PH
を９〜10に保つように2.73N NaOHも同時に滴
下した。約１時間でPHは一定になり、次いで室温
で３時間撹拌下反応させ、反応終了後冷5N HCl
でPHを２に調整し、酢酸エチル200ml、次いで100
mlで抽出し、酢酸エチル相を合せ、食塩水で洗浄
後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥後、溶媒を減
圧留去し、油状物25ｇを得た。これを酢酸エチ
ル／ｎ−ヘキサンより再結晶し、０，0′−ジカル
ボベンゾキシプロトカテキユ酸9.2ｇを得た。こ
の４ｇを防湿下エーテル50mlに懸濁し、五塩化リ
ン２ｇを粉末で加え、室温で撹拌下５時間反応さ
せた。反応終了後溶媒を減圧留去し、油状物4.5
ｇを得た。これをベンゼン20mlに溶解した液をジ
メチルアミノエタノール２mlをベンゼン30mlに溶
解した液に５〜10℃に冷却しながら滴下した。滴
下後室温で一晩撹拌し、反応させた後、水次いで
飽和食塩水で洗浄し、ベンゼン相を無水硫酸マグ
ネシウム上で乾燥後溶媒を減圧留去し、4.9ｇの
油状物を得た。これをエタノール260mlに溶解し、
パラジウム−黒２ｇを加え接触還元を５時間行
い、触媒を濾別してエタノールを減圧留去し、油
状物３ｇを得た。これをアセトン90mlに溶解し、
ヨウ化メチル２ｇの酢酸エチル溶液を加え室温で
一晩放置すると結晶が析出した。この結晶を濾取
し、アセトンで良く洗浄後五酸化リン上で一晩減
圧乾燥し、本発明の新規化合物プロトカテキユイ
ルコリンアイオダイド2.5ｇを得た。融点205〜
209℃ この結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフイー
（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）で単
一のスポツト（Rf＝0.31）を与えた。
法 プロトカテキユ酸10ｇを2.73N NaOH71mlに
溶解し、０〜５℃に氷冷し、激しく撹拌しながら
カルボベンゾキシクロライド22mlを滴下した。PH
を９〜10に保つように2.73N NaOHも同時に滴
下した。約１時間でPHは一定になり、次いで室温
で３時間撹拌下反応させ、反応終了後冷5N HCl
でPHを２に調整し、酢酸エチル200ml、次いで100
mlで抽出し、酢酸エチル相を合せ、食塩水で洗浄
後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥後、溶媒を減
圧留去し、油状物25ｇを得た。これを酢酸エチ
ル／ｎ−ヘキサンより再結晶し、０，0′−ジカル
ボベンゾキシプロトカテキユ酸9.2ｇを得た。こ
の４ｇを防湿下エーテル50mlに懸濁し、五塩化リ
ン２ｇを粉末で加え、室温で撹拌下５時間反応さ
せた。反応終了後溶媒を減圧留去し、油状物4.5
ｇを得た。これをベンゼン20mlに溶解した液をジ
メチルアミノエタノール２mlをベンゼン30mlに溶
解した液に５〜10℃に冷却しながら滴下した。滴
下後室温で一晩撹拌し、反応させた後、水次いで
飽和食塩水で洗浄し、ベンゼン相を無水硫酸マグ
ネシウム上で乾燥後溶媒を減圧留去し、4.9ｇの
油状物を得た。これをエタノール260mlに溶解し、
パラジウム−黒２ｇを加え接触還元を５時間行
い、触媒を濾別してエタノールを減圧留去し、油
状物３ｇを得た。これをアセトン90mlに溶解し、
ヨウ化メチル２ｇの酢酸エチル溶液を加え室温で
一晩放置すると結晶が析出した。この結晶を濾取
し、アセトンで良く洗浄後五酸化リン上で一晩減
圧乾燥し、本発明の新規化合物プロトカテキユイ
ルコリンアイオダイド2.5ｇを得た。融点205〜
209℃ この結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフイー
（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）で単
一のスポツト（Rf＝0.31）を与えた。
元素分析値：C12H18NO4I（M.W.367.166）として
実測値（％） Ｃ：39.34 Ｈ：5.07 Ｎ：3.90
計算値（％） Ｃ：39.25 Ｈ：4.94 Ｎ：3.81
IRスペクトルおよびUVスペクトルをそれぞれ
第１図および第２図に示した。
第１図および第２図に示した。
実施例 １
血清ChE活性測定方法
(1) 50ｍＭバルビタール緩衝液（PH8.5、25℃）
(2) 検体
(3) 6.3ｍＭ基質（PCI）液
(1)の緩衝液2.0mlに検体0.1mlを加え、２〜10分
間程度37℃で予加温し、それに(3)の基質液0.1ml
を加え、すばやく撹拌してから、分光器で測定す
る。基質の340nｍにおける吸光度を経時的に測
定追跡する。第３図は血清および希釈血清におけ
るタイムコースを各２度測定した結果である。バ
ルビタール緩衝液のPHは25℃で調整した。血清は
コンセーラ（日水製薬社製）を使用し、血清希
釈は0.877％食塩水で行つた。第３図からわかる
ように、各血清において８分までは直線性を示し
た。第４図に血清希釈濃度と△O.D.との関係を
示した。この結果は原点を通過するきれいな直線
を示した。この事実はChE活性と△O.D.とが比例
関係にあることをあらわすとともに、この新規な
ChE活性測定方法の実用性および有用性を示して
いる。
間程度37℃で予加温し、それに(3)の基質液0.1ml
を加え、すばやく撹拌してから、分光器で測定す
る。基質の340nｍにおける吸光度を経時的に測
定追跡する。第３図は血清および希釈血清におけ
るタイムコースを各２度測定した結果である。バ
ルビタール緩衝液のPHは25℃で調整した。血清は
コンセーラ（日水製薬社製）を使用し、血清希
釈は0.877％食塩水で行つた。第３図からわかる
ように、各血清において８分までは直線性を示し
た。第４図に血清希釈濃度と△O.D.との関係を
示した。この結果は原点を通過するきれいな直線
を示した。この事実はChE活性と△O.D.とが比例
関係にあることをあらわすとともに、この新規な
ChE活性測定方法の実用性および有用性を示して
いる。
実施例 ２
実施例１の(1)の緩衝液のPHを7.4から9.2まで変
化させ、この方法におけるChEの至適PHを求め
た。緩衝液のPH以外は全て実施例１に従つた。そ
の結果を第５図に示した。この条件下では至適PH
は8.5から8.6であつた。
化させ、この方法におけるChEの至適PHを求め
た。緩衝液のPH以外は全て実施例１に従つた。そ
の結果を第５図に示した。この条件下では至適PH
は8.5から8.6であつた。
実施例 ３
実施例１の(1)の緩衝液2.0mlに(3)の基質液0.1ml
を加え、37℃の保温セルに入れ、波長340nｍに
おける吸光度の変化を経時的に追跡し、基質の非
酵素的加水分解安定性を調べた。その結果は第６
図に示したごとく、90分まではほとんど安定であ
つた。基質PCIは至適PH8.5において安定であるの
で、検体ごとの試薬ブランクを測定する必要はな
い。
を加え、37℃の保温セルに入れ、波長340nｍに
おける吸光度の変化を経時的に追跡し、基質の非
酵素的加水分解安定性を調べた。その結果は第６
図に示したごとく、90分まではほとんど安定であ
つた。基質PCIは至適PH8.5において安定であるの
で、検体ごとの試薬ブランクを測定する必要はな
い。
実施例 ４
実施例１の測定法に従い、反応系での下記の添
加物の影響を調べた。
加物の影響を調べた。
添加物 添加量
(1) アスコルビン酸 ０〜20mg／dl
(2) グルコース ０〜500mg／dl
(3) 尿 酸 ０〜20mg／dl
(4) ヘモグロビン ０〜500mg／dl
(5) アルブミン ０〜５ｇ／dl
(6) ビリルビン ０〜20mg／dl
(7) グルタチオン ０〜50mg／dl
(8) 抗凝固剤
二重蓚酸 200mg／dl
蓚酸ソーダ 200mg／dl
ヘパリン ２mg／dl
クエン酸ソーダ 500mg／dl
EDTA・2Na 200mg／dl
NaF 500mg／dl
測定結果は相対活性（％）で第７図から第１４
図に示した。ヘモグロビンは300mg／dlの添加で
相対活性が97.3％であつたので、この程度までは
測定可能である。NaFはプソイドコリンエステ
ラーゼの阻害剤であるので、NaFの存在下では
一般にChE活性の測定はいかなる方法でも正しい
測定値を与えない。従つて、第１４図のNaFの
結果よりプソイドコリンエステラーゼ活性を測定
する場合には、抗凝固剤としてNaFは使用する
ことができない。
図に示した。ヘモグロビンは300mg／dlの添加で
相対活性が97.3％であつたので、この程度までは
測定可能である。NaFはプソイドコリンエステ
ラーゼの阻害剤であるので、NaFの存在下では
一般にChE活性の測定はいかなる方法でも正しい
測定値を与えない。従つて、第１４図のNaFの
結果よりプソイドコリンエステラーゼ活性を測定
する場合には、抗凝固剤としてNaFは使用する
ことができない。
実施例 ５
血清ChE阻害活性の測定法
(1) 50ｍＭバルビタール緩衝液（PH8.5、25℃）
(2) 検体
(3) 6.3ｍＭ基質（PCI）液
(4) 6.3ｍＭ基質（PCI）液と0.44ｍＭジブカイン
液 (5) 6.3ｍＭ基質（PCI）液と220ｍＭ NaF液 (1)、(2)および(3)は実施例１と同一のものであ
る。(4)および(5)は基質て阻害剤の各指定してある
濃度の混合液である。測定方法は実施例１の方法
と同じである。すなわち(3)の液のかわりに(4)また
は(5)の液を加え、反応を測定波長340nｍで追跡
した。結果はジブカイン添加では80％、NaF添
加では57.9％阻害された。
液 (5) 6.3ｍＭ基質（PCI）液と220ｍＭ NaF液 (1)、(2)および(3)は実施例１と同一のものであ
る。(4)および(5)は基質て阻害剤の各指定してある
濃度の混合液である。測定方法は実施例１の方法
と同じである。すなわち(3)の液のかわりに(4)また
は(5)の液を加え、反応を測定波長340nｍで追跡
した。結果はジブカイン添加では80％、NaF添
加では57.9％阻害された。
実施例 ６
血清ChE活性測定法
(1) 250ｍＭ基質（PCI）液 2.0ml
〔50ｍＭトリス−マレイン酸緩衝液（PH8.2、
25℃）に溶解〕 (2) 血清または希釈血清 (i) 血清：コンセーラ 0.1ml (ii) 血清：コンセーラ 0.2ml (iii) 血清：プレチパスＥ 0.1ml (1)の2.0mlを２〜10分間37℃で予加温し、それ
に(2)の血清又は希釈血清を0.1mlまたは0.2ml加
え、すばやく撹拌してから分光器の37℃に保温さ
れたセルに入れ、測定波長340nｍで吸光度の減
少を測定追跡する。(1)の緩衝液のPH調整は25℃で
行つた。血清はコンセーラ（日水製薬社製）と
プレチパスＥ（ベーリンガー・マンハイム社製）
を使用し、血清希釈は0.877％食塩水で行つた。
25℃）に溶解〕 (2) 血清または希釈血清 (i) 血清：コンセーラ 0.1ml (ii) 血清：コンセーラ 0.2ml (iii) 血清：プレチパスＥ 0.1ml (1)の2.0mlを２〜10分間37℃で予加温し、それ
に(2)の血清又は希釈血清を0.1mlまたは0.2ml加
え、すばやく撹拌してから分光器の37℃に保温さ
れたセルに入れ、測定波長340nｍで吸光度の減
少を測定追跡する。(1)の緩衝液のPH調整は25℃で
行つた。血清はコンセーラ（日水製薬社製）と
プレチパスＥ（ベーリンガー・マンハイム社製）
を使用し、血清希釈は0.877％食塩水で行つた。
ChE活性値は下記の式により計算される。
IU／＝△OD(1)×全反応液量／分子吸光係数(2)×血清
量×1000 (1) △ODは測定波長340nｍにおける１分間当り
の吸光度の変化量。
量×1000 (1) △ODは測定波長340nｍにおける１分間当り
の吸光度の変化量。
(2) 波長340nｍにおける分子吸光度係数は2960
である。
である。
第１５図に示した如く、３種共に、血清希釈と
酵素活性は非常に良く原点を通過する直線適な比
例関係にあつた。
酵素活性は非常に良く原点を通過する直線適な比
例関係にあつた。
第１図はプロトカテキユイルコリンアイオダイ
ドのIRスペクトルを示す。第２図は(a)プロトカ
テキユイルコリンアイオダイド（濃度100μM）
および(b)プロトカテキユ酸（濃度100μM）のUV
スペクトル〔50ｍＭバルビタール緩衝液（PH8.5）
中〕を示す。第３図は希釈血清によるタイムコー
スを示す。第４図は血清希釈と△O.D.との関係
を示す。第５図はChEの至適PHを示す。第６図は
基質の非酵素的加水分解安定性を示す。第７図〜
第１４図は添加物の影響を示す。第１５図は３種
の血清についての血清希釈と酵素活性との関係を
示す。
ドのIRスペクトルを示す。第２図は(a)プロトカ
テキユイルコリンアイオダイド（濃度100μM）
および(b)プロトカテキユ酸（濃度100μM）のUV
スペクトル〔50ｍＭバルビタール緩衝液（PH8.5）
中〕を示す。第３図は希釈血清によるタイムコー
スを示す。第４図は血清希釈と△O.D.との関係
を示す。第５図はChEの至適PHを示す。第６図は
基質の非酵素的加水分解安定性を示す。第７図〜
第１４図は添加物の影響を示す。第１５図は３種
の血清についての血清希釈と酵素活性との関係を
示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式（） （式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる
コリン誘導体を基質として使用し、この基質のコ
リンエステラーゼによる分解によつて生じる吸光
度変化を340〜360nｍの測定波長で直接測定する
ことを特徴とするコリンエステラーゼ活性の測定
法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59093547A JPS60238000A (ja) | 1984-05-10 | 1984-05-10 | 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| US06/731,069 US4717659A (en) | 1984-05-10 | 1985-05-06 | Novel method for determining cholinesterase activity |
| EP85105635A EP0160980B1 (en) | 1984-05-10 | 1985-05-08 | Novel method for determining cholinesterase activity |
| DE8585105635T DE3584385D1 (de) | 1984-05-10 | 1985-05-08 | Verfahren zur aktivitaetsbestimmung von cholinesterase. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59093547A JPS60238000A (ja) | 1984-05-10 | 1984-05-10 | 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60238000A JPS60238000A (ja) | 1985-11-26 |
| JPH0542278B2 true JPH0542278B2 (ja) | 1993-06-28 |
Family
ID=14085284
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59093547A Granted JPS60238000A (ja) | 1984-05-10 | 1984-05-10 | 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4717659A (ja) |
| EP (1) | EP0160980B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60238000A (ja) |
| DE (1) | DE3584385D1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0650997B2 (ja) * | 1986-04-15 | 1994-07-06 | 日東紡績株式会社 | コリンエステラ−ゼ活性の新規測定方法 |
| CA2095495C (en) * | 1992-06-01 | 2002-06-04 | Stephen Carl Hasselberg | Assay for serum cholinesterase |
| US6764831B2 (en) | 1998-11-23 | 2004-07-20 | Proteome Sciences, Inc. | Methods and compositions for pain management |
| RU2157850C1 (ru) * | 1999-05-21 | 2000-10-20 | Военный университет радиационной, химической и биологической защиты | Способ определения соединений антихолинэстеразного действия в воде и водных экстрактах |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5854800B2 (ja) * | 1978-04-17 | 1983-12-06 | 協和醗酵工業株式会社 | コリン誘導体を用いるコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| DE2914721A1 (de) * | 1978-04-17 | 1979-10-18 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Verfahren zur bestimmung der cholinesterase-aktivitaet sowie fuer dieses verfahren verwendbare cholin-derivate |
| JPS5721352A (en) * | 1980-07-11 | 1982-02-04 | Shinotesuto Kenkyusho:Kk | Novel substance for measuring cholineesterase activity and method thereof |
| JPS5935599B2 (ja) * | 1980-12-25 | 1984-08-29 | 株式会社 シノテスト研究所 | コリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| JPS603838B2 (ja) * | 1981-04-08 | 1985-01-30 | 富士レビオ株式会社 | コリンエステラ−ゼの活性測定法 |
| DE3265517D1 (en) * | 1981-03-04 | 1985-09-26 | Fujirebio Kk | Method for determining the activity of cholinesterase and diagnostic solution for use therein |
| JPS57144999A (en) * | 1981-03-04 | 1982-09-07 | Fujirebio Inc | Measurement of activity of cholinesterase |
| JPS603839B2 (ja) * | 1981-04-08 | 1985-01-30 | 富士レビオ株式会社 | コリンエステラ−ゼの活性測定法 |
| JPS60197643A (ja) * | 1984-03-21 | 1985-10-07 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規コリン誘導体 |
-
1984
- 1984-05-10 JP JP59093547A patent/JPS60238000A/ja active Granted
-
1985
- 1985-05-06 US US06/731,069 patent/US4717659A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-08 EP EP85105635A patent/EP0160980B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-08 DE DE8585105635T patent/DE3584385D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3584385D1 (de) | 1991-11-21 |
| EP0160980B1 (en) | 1991-10-16 |
| JPS60238000A (ja) | 1985-11-26 |
| EP0160980A2 (en) | 1985-11-13 |
| EP0160980A3 (en) | 1987-10-07 |
| US4717659A (en) | 1988-01-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |