JPH0542413B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインタ−ロイキン−２蛋白質を
含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用
組成物に関する。 インタ−ロイキン−２〔以下IL−２と略称す
る。なおIL−２は、Ｔ細胞増殖因子（TCGF）と
も呼ばれる。〕は、レクチンやアロ抗原等で刺激
されたＴ細胞によつて産生されるリンホカインで
ある〔サイエンス、第193巻、1007頁（1976年）；
イムノロジカル・レビユー、第51巻、257頁
（1980年）〕。IL−２は、Ｔ細胞をインビトロでそ
の機能を保持したまま増殖させ長期間の継代維持
を可能にするほかに、今までに胸腺細胞のマイト
−ジエン反応を促進したり（コステイミユレータ
ー）、ヌードマウス脾細胞のＴ細胞依存性抗原に
対する抗体産生能を回復させたり（Ｔ細胞リプレ
−シングフアクター）キラー細胞の分化増殖を促
進する（キラーヘルパーフアクター）活性を有す
ると報告されている〔ザ・ジヤーナル・オブ・イ
ムノロジー、第123巻、2928頁（1979年）、イムノ
ロジカル・レビユー、第51巻、257頁（1980年）〕。 IL−２を利用して、これまでにキラーＴ細胞
やヘルパーＴ細胞、さらにはナチユラルキラー細
胞などのクローンが多数得られている〔たとえ
ば、ネイチヤー、第268巻、154頁（1977年）；
ザ・ジヤーナル・オブ・イムノロジー、第130巻、
981頁（1983年）〕。このようなＴ細胞やナチユラ
ルキラー細胞のクローン化という直接的用途のほ
かに、IL−２を用いてある特殊な抗原、たとえ
ば腫瘍抗原を認識し破壊する抗原特異的なキラー
Ｔ細胞をインビトロで選択的に増殖させることが
できる。このようにして増殖させた腫瘍特異的キ
ラーＴ細胞を動物に移入して腫瘍の増殖を抑制阻
止することが可能である〔ザ・ジヤーナル・オ
ブ・イムノロジー、第125巻、1904頁（1980年）〕。
また、IL−２がインターフエロンγの産生を誘
導すること（ザ・ジヤーナル・オブ・イムノロジ
ー、第130巻、1784頁（1983年）〕や、ナチユラル
キラー細胞を活性化すること〔ザ・ジヤーナル・
オブ・イムノロジー、第130巻、1970頁（1983
年）〕が知られている。 これらの実験事実はIL−２が抗腫瘍剤として
用いられる可能性を示すものである。IL−２は
また、胸腺機能を欠如しているヌードマウスのヘ
ルパーＴ細胞機能を回復させること（ヨーロピア
ン・ジヤーナル・オブ・イムノロジー、第10巻、
719頁（1980年）〕や、同種細胞に対するキラーＴ
細胞の誘導を回復させること〔ネイチヤー、第
284巻、278頁（1980年）〕が知られており、免疫
機能低下疾患への応用も期待できる。 しかしながら、ヒトIL−２は量産が困難であ
るために、現時点では臨床への応用が不可能であ
り、純度の高いヒトIL−２を容易により安価に
大量生産できる技術の開発が望まれている。 Taniguchiらは、ヒトＴ白血病細胞株Jurkatの
IL−2mRNAを素材にヒトIL−２遺伝子をクロー
ニングし、それから推定されるヒトIL−２蛋白
質のアミノ酸配列を報告した〔ネイチヤー、第
302頁、305頁（1983年）〕。その後、Devosらは、
ヒト脾臓細胞由来のIL−２遺伝子をクローニン
グして、大腸菌で発現したことを報告している
〔ザ・ヌクレイツク・アシツド・リサーチ、第11
巻、4307頁（1983年）〕。しかし、これまでは
TCGF活性を有することによりIL−２様物質の存
在が推定されていたのみで、現実にヒトIL−２
をコードするDNAを含有する形質転換体の産生
するヒトIL−２蛋白質を精製取得したとの報告
はない。 本発明者らは、遺伝子操作技術を利用してヒト
IL−２遺伝子をクローニングし、得られた組換
えDNA分子を宿主に移入してヒトIL−２遺伝子
を発現させ、目的とするIL−２蛋白質を得るこ
とのできる技術の開発研究を行つた結果、実質的
に純粋な非グリコシル化ヒトIL−２蛋白質の製
造法に確立し、本発明を完成した。 すなわち、本発明は、大腸菌形質転換体の培養
により得られ、ヒト末梢血リンパ球を５×10⁶
個／mlとなるように10％FCS添加RPMI1640培地
に浮遊しコンカナバリン−A40μｇ／mlおよび12
−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−アセテ
ート15nｇ／mlを添加して37℃で５％CO₂の存在
下に48時間培養した培養液の上清をIU／mlと定
める方法により測定された比活性が10⁴U／mg以
上であり、エンドトキシンの含有量が1ppm以下
であり、発熱物質試験の方法に従つてウサギに体
重１Kgあたり200Uを投与し発熱物質を含まない
と判定され、かつ実質的に純粋な非グリコシル化
ヒトインターロイキン−２蛋白質と、製剤学的に
許容される担体、賦形剤または（および）希釈剤
とを含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治
療用組成物を提供するものである。 本発明で用いられるヒトIL−２をコードする
DNAは、例えば第２図中コドン１〜１３３で示
される塩基配列のDNA（）があげられる。この
DNA（）は、その5′末端にATGまたは第２図
中コドンＳ１〜Ｓ２０で示されるシグナルコドン
を有していてもよく、3′末端にTAA，TGAまた
はTAGを有することが好ましく、とりわけTGA
が好ましい。 DNA（）はプロモーターの下流に連結されて
いることが好ましく、これらプロモーターとして
トリプトフアン（trp）プロモーター、レツクＡ
（recA）プロモーター、APLプロモーターなどが
挙げられ、とりわけtrpプロモーターが好適であ
る。 本発明においては、例えばコンカナバリンＡな
どで刺激されたヒト末梢白血球の培養液からヒト
IL−２をコードするmRNAを分離し、逆転写酵
素などを用いて単鎖のcDNAを合成した後、二重
鎖DNAを合成する。ついで、プラスミドに導入
して、例えば大腸菌や枯草菌などを形質転換さ
せ、これによりcDNA含有プラスミドを単離する
ことによりヒトIL−２をコードする二重鎖DNA
を製造することができる。 本発明で用いられるヒトIL−２をコードする
mRNAはHinumaらの方法〔バイオケミカル・
アンド・バイオフイジイカル・リサーチ・コミユ
ニケイシヨンズ、第109巻、363頁（1982年）〕に
よつて得ることができる。得られたヒトIL−
2mRNAを鋳型として、逆転写酵素を用い自体公
知の方法でcDNA鎖を合成し、cDNAを二本鎖
DNAへ交換する〔Maniatis、T.ら、セル、第８
巻、163頁（1976年）；Land、H.ら、ヌクレイツ
ク・アシツド・リサーチ、第９巻、2251頁（1981
年）〕。このDNAを、例えばdG−dCホモポリマ
ー結合法〔Nelson、T.S.，メソツズ・イン・エ
ンジモロジー、第68巻、41頁（1979年）〕により
たとえばプラスミドpBR322のPst Ｉ 制限エン
ドヌクレアーゼ切断部位に組み込ませる。さら
に、例えばヒトIL−２の一部のアミノ酸配列に
対応する塩基配列をもつオリゴヌクレオタイドを
化学合成した後、³²Pでラベルしてプロープとなし
自体公知の方法でコロニーハイブイダイゼイシヨ
ン法〔Grunstein、M.、Hogness、D.S.、プロシ
ーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデ
ミ・オブ・サイエンス・USA，第72巻、3961頁
（1975年）〕；Alwine、J.C.ら、メソツズ・イン・
エンジモロジー、第68巻、220頁（1979年）〕によ
り、テトラサイクリン耐性あるいはアンピシリン
感受性のトランスフオーマントの中から求めるク
ローンを選出する。上記ハイブリツダイゼイシヨ
ン法で陽性を示したクローンのDNAの塩基配列
をMaxam−Gilbert法〔Maxam、A.M.ら、プロ
シーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス・USA、第74巻、560頁
（1977年）〕あるいはフアージM13を用いたジヌク
レオチド合成鎖停止の方法〔Messing、J.ら、ヌ
クレイツク・アシツド・リサーチ、第９巻、309
頁（1981年）〕により決定し、ヒトIL−２遺伝子
の存在を確認する。次に、得られたクローンから
ヒトIL−２遺伝子の全部あるいは一部を切り出
し、プラスミド中の適当なプロモーター、SD（シ
ヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列の下流に
つないで適当な宿主に導入することができる。 プロモーターとしてはtrpプロモーターなどが、
宿主としては大腸菌（294株、DH1株など）など
が有利に用いられる。 なお大腸菌294株〔Beckmanら、プロシーデイ
ングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス・USA.第73巻、4174頁（1976
年）〕およびDH1株〔Selson、M.E.ら、ネイチヤ
ー、第217巻、1110頁（1968年）〕はいずれも公知
の菌株である。 DNAによる宿主の形質転換は公知の方法
〔Cohen、S.N.ら、プロシーデイングス・オブ・
ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・USA、第69巻、2110頁（1972年）〕により実
施することができる。このようにして得られた宿
主はそれ自体公知の培地、例えばグルコース、カ
ザミノ酸を含むM9培地〔Miller，J.，エクスペ
リメンツ・モレキユラー・ジエネテツクス、431
頁−433頁（コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、ニユー・ヨーク、1972年）〕中で
培養される。trpプロモーターを使用する場合は、
それを効率よく働かせるために、例えば３−β−
インドリルアクリル酸のような薬剤を加えること
ができる。培養は通常15〜43℃で３〜24時間行な
い必要に応じて通気あるいは撹拌することもでき
る。 かくして生成されるヒトIL−２の測定にはIL
−２依存性細胞株を用いることができるが、ヒト
IL−２はヒト以外にラツトおよびマウスなどの
IL−２依存性細胞の増殖をも促進することが知
られている〔イムノロジカル・レビユー、第51
巻、257頁（1980年）〕ので、IL−２依存性ヒト
細胞株のみならずラツトまたはマウスのIL−２
依存性細胞株を用いることもできる〔ジヤーナ
ル・オブ・イムノロジー、第130巻、981頁および
988頁（1983年）〕。 特にマウスのIL−２依存性細胞株は、長期間
安定に継代維持され得るので再現性の高い測定結
果が得られる。 本発明のヒトIL−２を培養菌体から抽出する
に際しては、培養後、公知の方法で菌体を集め、
菌体を塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む
緩衝液に懸濁し、冷所で撹拌したのち、遠心分離
によりIL−２を含む上澄液を得る方法、あるい
は緩衝液に懸濁し、超音波処理、リゾチームおよ
び（または）凍結融解によつて菌体を破壊したの
ち、遠心分離によりIL−２を含む上澄液を得る
方法などが適宜用い得る。 上記上澄液からIL−２を分離、精製するには、
自体公知の分離、精製法を適切に組み合わせて行
うことができる。これらの公知の分離、精製法と
しては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用す
る方法、透析法、限外過法、ゲル過法および
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの
主として分子量の差を利用する方法、イオン交換
クロマトグラフイーなどの荷電の差を利用する方
法、アフイニテイークロマトグラフイーなどの特
異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマ
トグラフイーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方
法などが挙げられる。特に、ヒトIL−２蛋白質
は高い疎水性を有しているので、疎水性カラムク
ロマトグラフイーとりわけ逆相系カラムを用いる
高速液体クロマトグラフイーは該蛋白質の精製に
極めて有効である。 したがつて、本発明の精製工程においては、逆
相高速液体クロマトグラフイーを用いる工程が採
用される。 例えば、ヒトIL−２をコードする遺伝子を含
有する大腸菌を培養して得られる菌体を塩酸グア
ニジン（好ましくは2M〜8Mの濃度で用いる）な
どの蛋白質変性剤に懸濁させ、撹拌後遠心分離に
より上澄液を集める。上澄液をそのままあるいは
限外過装置などにより濃縮して透析し、生じた
沈澱を遠心分離により除き、得られる上澄液を、
たとえばジエチルアミノエチルセルロースや
〔DE52セルロース（ワツトマン社製、アメリカ）
カラムなど〕を用いて陰イオン交換クロマトグラ
フイー言を行い活性両分を集める。 次いで、活性画分を限外過装置を用いて濃縮
したあと、たとえばＮ，N′−メチレンビスアク
リルアミド架橋アリルデキストランたとえばセフ
アクリルＳ−200（フアルマシア社製、スエーデ
ン）カラム等を用いるゲル過を行う。活性画分
を集め、ついで前記した高速液体クロマトグラフ
イーを行う。このような方法により、本発明の非
グリコシル化ヒトIL−２を取得することができ
る。 なお、ここで高速液体クロマトグラフイーに用
いる逆相系カラムとしては、例えばアルキル化
（C₁〜₁₈程度）ケイ素のものが挙げられる。溶出
溶媒としては、C_1〜6の低級アルカノール（エタノ
ール、プロパノールなど）やアセトニトリルが有
利に使用でき、PH1.5〜４のものが好ましい。溶
出速度は0.1〜100ml／minが好ましい。 ここで得られるヒトIL−２蛋白質溶液は必要
によりこれを凍結乾燥により粉末とすることがで
きる。凍結乾燥に際しては、ソルビトール、マン
ニトール、デキストロース、マルトース、グリセ
ロール、ヒト血清アルブミン（HSA）などの安
定剤を加えることができる。 本発明で得られるヒトIL−２蛋白質はIL−２
依存性マウス細胞を用いて放射性チミジンの取込
みを指標とするIL−２活性測定において、１×
10⁴U／mg以上の比活性を示すものである。本発
明によれば、２×10⁴U／mg以上、３×10⁴U／mg
にも達する比活性を示す高純度の非グリコシル比
ヒトIL−２蛋白質を得ることができる。 なお、ここでIL−２の活性としての単位(U)の
算出方法は以下のようにして行つた。 すなわち、IL−２濃度に依存して増殖するマ
ウス細胞株を浮遊した培地にIL−２を含む検体
を加えて培養し、該細胞株の増殖をトリチウムチ
ミジンの取込を指標として求めた。目的とする検
体中のユニツト(U)算出のためには、常に標準IL
−２（1U／ml）を並べてアツセイを実施して、そ
の比率からユニツトを算出した。 具体的には、ヒトIL−２を含有するコンデイ
シヨンドメジウムを含む20％FCS加RPMI1640培
地中で、37℃で５％CO₂の存在下に継代維持され
たIL−２依存性マウス細胞株（NKC3）、
Hinumaら、バイオケミカル・バイオフイジカ
ル・リサーチ・コミユニケイシヨンズ、第109巻、
363頁（1982頁）〕を無血清RPMI 1640培地を用
いて２回洗浄し、20％FCS 加 RPMI 1640培
地に６×10⁵個／mlになるように再浮遊する。 IL−２を含む資料50μを96穴平底マイクロタ
イタープレート（ヌンク社、デンマーク）の第１
列目の穴に入れ、50μずつの20％FCS 加
RPMI 1640培地を用いて第12列目まで順次２倍
段階希釈系列を作成後、上記NKC3細胞浮遊液を
50μずつ各穴に分注し、37℃で５％CO₂の存在
下に24時間培養する。培養20時間目に、各穴に
1μCiずつトリチウムチミジン（アマルシヤム社、
イギリス）を添加してさらに４時間培養を継続
後、セルハーベスター（フロー社、アメリカ）を
使用して細胞をガラスフイルター上に回収し、液
体シンチレーシヨンカウンターを用いてトリチウ
ムチミジンの取込を測定する。測定に際しては標
準IL−２標品について資料と同一の操作を行い、
トリチウムチミジンの取込を測定する。 ユニツト(U)の計算はジヤーナル・オブ・イムノ
ロジー、第120巻、2027頁（1978年）に準じてプ
ロビツト変換法により行う。すなわち、標準IL
−２標品（ヒト末梢血リンパ球を５×10⁶個／ml
となるように10％FCS加RPMI1640培地に浮遊
し、コンカナバリン−Ａ 40μｇおよび12−Ｏ−
テトラデカノイルホルボール−13−アセテート
15nｇ／mlを添加して、37℃で５％CO₂の存在下
に48時間培養した培養液の遠心上清を1U／mlと
定める）の希釈系列のうち最大値の取込を100％
として、各希釈段階の取込値の割合（％）を計算
する。得られた数値を正規確率紙にプロツトし、
50％の取込を示す希釈倍数を作図から求める。同
様にしてIL−２を含む各資料についても50％の
取込を示す希釈倍数を求める。 資料のIL−２濃度（Ｕ／ml）は次式に従つて
計算される： 資料が50％取込を示す希釈倍数／標準IL−２標品が50％
の取込を示す希釈倍数 なお、本定量法によつて求めたヒト末梢血から
得られた天然のIL−２の比活性は、20000〜
70000U／mgであり、本発明の非グリコシル化ヒ
トIL−２蛋白質とほぼ同等の比活性を示した。 本発明の非グリコシル化ヒトIL−２蛋白質は、
好ましくは第３図に示すアミノ酸配列〔該図中、
ＸはMetまたは水素を示す〕からなるポリベプチ
ド（）を含有するものである。 本発明により製造されるヒトIL−２蛋白質は
下記の性状を有する。 (1) SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均
一であり、本法による分子量測定値は15000±
1000ダルトンである。 (2) アミノ末端アミノ酸としてアラニンまたはメ
チオニンを有する。 (3) カルボキシ末端アミノ酸としてスレオニンを
有する。 (4) 正常なＴ細胞やナチユラルキラー細胞をその
機能を保持させたまま増殖させる活性を有す
る。 本発明により製造されるヒトIL−２蛋白質は、
リムラス試験〔ヘモスターシス、第７巻、183頁
（1978年）〕陰性であり、來雑蛋白質、発熱物質が
きわめて少ないので注射剤原体等として安全に使
用される。 すなわち、本発明の組成物に含有されるヒト
IL−２蛋白質は、エンドトキシンの含有量が
1ppm以下であり、発熱物質試験の方法に従つて
ウサギに体重１Kgあたり200Uを投与し発熱物質
を含まないと判定される。 該発熱物質試験としては、たとえば、生物学的
製剤基準、厚生省薬務局監修、社団法人細菌製剤
協会発行、1985年第223〜224頁に記載された方法
が挙げられる。 本発明により得られる非グリコシル化ヒトIL
−２蛋白質は、低毒性で、正常なＴ細胞やナチユ
ラルキラー細胞をその機能を保持させたまま増殖
させる活性を有する。したがつて、本発明のIL
−２蛋白質は、Ｔ細胞やナチユラルキラー細胞を
インビトロで長期にわたり増殖、継代したりクロ
ーン化するのに使用できる。なお、この性質を利
用してヒトIL−２の活性を測定することができ
る。 さらに、本発明のヒトIL−２蛋白質は、たと
えば腫瘍抗原を認識し、破壊する抗原特異的なキ
ラーＴ細胞や抗原感作の経験の有無と無関係に腫
瘍を殺す能力をもつところのナチユラルキラー細
胞をインビトロで選択的に増殖させることがで
き、またこのキラーＴ細胞を生体へ移入する際
に、本発明のヒトIL−２を同時に接種すること
により、その抗腫瘍効果を増大させることから、
温血動物（例、マウス、ラツト、ウサギ、犬、ネ
コ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ウシ、人など）の腫瘍
の予防、治療や免疫機能低下疾患の治療のために
用いることができる。 本発明のヒトIL−２蛋白質は高純度に精製さ
れているので抗原性がなく低毒性である。 本発明のヒトIL−２蛋白質を腫瘍の予防、治
療剤として用いるには、当該蛋白質の自体公知の
担体として混合稀釈して、たとえば注射剤、カプ
セル剤などとして非経口的にまたは経口的に投与
することができる。さらに、前述したようにイン
ビトロで増殖させたキラーＴ細胞やナチユラルキ
ラー細胞と共にまたは単独で使用することができ
る。 本発明のヒトIL−２蛋白質は、公知の天然か
ら分離されたヒトIL−２と実質的に同じ生物活
性を有するのでこれと同様に使用することがで
き、細胞のIL−２受容体との解離定数がきわめ
て小さいことから、極く小量の投与で良い。 Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用す
るためには、本発明のヒトIL−２を約0.01〜１ユ
ニツト／ml、好ましくは約0.1〜0.5ユニツト／ml
の濃度で培地に添加して用いることができる。 Ｔ細胞をインビトロで増殖させる目的に使用す
る具体例としては、たとえば、20％ウシ胎児血清
を含むRPMI 1640培地にヒト末梢血より分離し
たＴ細胞（１×10⁶個／ml）およびＸ線（1500ラ
ツド）照射したＢ細胞トランスフオーマント（１
×10⁶個／ml）を加えて37℃、５％CO₂存在下で
３日間リンパ球混合培養を行なつて得られるアロ
抗原感作Ｔ細胞を含む細胞浮遊液に本発明のIL
−２蛋白質を0.1〜0.5ユニツト／mlの濃度で約一
週間ごとに培地交換しながら約１か月間培養を続
ける方法などが挙げられる。 下記実施例に開示している形質転換体、大腸菌
E.coli.DH １／pTF4は財団法人発酵研究所
（Institute For Fermentation、Osaka）にIFO
−14299として寄託されており、また本形質転換
体は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究
所（FRI）に受託番号FERM Ｐ−7578として寄
託され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に
切換えられて、受託番号FERM BP−628として
同研究所（FRI）に保管されている。 なお、本願明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−
IUB Commission on Biochemical
Nomenclatureによる略号あるいは当該分野にお
ける慣用略号に基づくものであり、その例を第１
表に挙げる。また、アミノ酸に関し光学異性体が
ありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を示
すものとする。 第１表 DNA：デオキシリボ核酸 cDNA：相補的デオキシリボ核酸 Ａ：アデニン Ｔ：チミン Ｇ：グアニン Ｃ：シトシン RNA：リボ核酸 mRNA：伝令リボ核酸 dATP：デオキシアデノシン三リン酸 dTTP：デオキシチミジン三リン酸 dGTP：デオキシグアノシン三リン酸 dCTP：デオキシシチジン三リン酸 ATP：アデノシン三リン酸 EDTA：エチレンジアミン四酢酸 SDS：ドデシル硫酸ナトリウム Gly：グリシン Ala：アラニン Val：バリン Leu：ロイシン Ile：イソロイシン Ser：セリン Thr：スレオニン Cys：システイン 1/2Gys：ハーフシスチン Met：メチオニン Glu：グルタミン酸 Asp：アスパラギン酸 Lys：リジン Arg：アルギニン His：ヒスチジン Phe：フエエールアラニン Tyr：チロシン Trp：トリプトフアン Pro：プロリン Asn：アスパラギン Gle：グルタミン 実施例 １ (i) ヒトIL−２をコードするmRNAの分離 ヒト末梢血より調製したリンパ球を12−Ｏ−
テトラデカノイルホルボール−13−アセテート
（TPA）（15nｇ／ml）とコンカナバリンＡ（40μ
ｇ／ml）を含むRPMI 1640培地（10％の牛胎
児血清を含む）中、37℃で培養し、IL−２を
誘導させた。24時間後、この誘導した１×10¹⁰
個のヒトリンパ球を5Mグアニジンチオシアネ
ート、５％メルカプトエタノール、50mM
Tris・HCl PH 7.6、10ｍＭ EDTA 溶液
中でテフロンホモゲナイザーによつて破壊変性
した後Ｎ−ラウロイリルザルコシン酸ナトリウ
ムを４％になるように加え、均質化した混合物
を5.7M塩化セシウム溶液（5.7M塩化セシウ
ム、0.1M EDTA）６ml上に重層し、ベツクマ
ンSW28のローターを用いて15℃で24000rpm48
時間遠心処理を行い、RNA沈澱を得た。この
RNA沈澱を0.25％Ｎ−ラウロイルザルコシン
酸ナトリウム溶液にとかした後、エタノールで
沈澱させ、10mgのRNAを得た。このRNAを高
塩溶液〔0.5M NaCl，10ｍＭ Tris・HCl
PH7.6、１ｍＭ EDTA、0.3％ SDS〕中でオ
リゴ（dT）セルロースカラムに吸着させ、ポ
リ(A)を含むmRNAを低塩溶液（10ｍＭ Tris
−HCl・PH7.6、１ｍＭ EDTA、0.3％SDS）
で溶出させることにより、ポリ(A)を含む
mRNA300μｇを分取した。 このmRNAを更にエタノールで沈澱させ、
0.2mlの溶液（10ｍＭ Tris・HCl PH7.6、２
ｍＭ EDTA，0.3％ SDS）に溶かし、65℃
で２分間処理して10〜35％シヨ糖密度勾配遠心
処理（ペツクマンSW28のローターを用いて20
℃、25000rpmで21時間遠心分離）することに
より分画して22分画を得た。この各分画につき
RNAの一部ずつを、アフリカツメガエルの卵
母細胞に注入し、合成される蛋白質中のIL−
２活性を測定し、分画11〜15（沈降定数8S〜
15S）にIL−２の活性を検出した。この分画の
IL−２ mRNAは約25μｇであつた。 (ii) 単鎖DNAの合成 上記で得たmRNAおよび逆転写酵素を用い、
100μの反応液（5μｇのmRNA、50μｇオリ
ゴ（dT）、100ユニツトの逆転写酵素、１ｍＭ
ずつのdATP.dCTP、dGTPおよびdTTP、８
ｍＭ MgCl₂、50ｍＭ KCl、10ｍＭジチオス
レイトール、50ｍＭ Tris−HCl PH8.3）中
で42℃、１時間インキユベートした後に、フエ
ノールで除蛋白し、0.1NのNaOHで70℃、20
分処理してRNAを分解除去した。 (iii) 二重鎖DNAの合成 ここで合成された単鎖の相補DNAを50μ
の反応液（mRNAとオリゴdTを含まない以外
は上記と同じ反応液）中で42℃２時間反応させ
ることにより二重鎖DNA合成した。 (iv) dCテイルの付加 この二重鎖DNAにヌクレアーゼS1を50μ
の反応液（二重鎖DNA0.1M酢酸ナトリウムPH
4.5、0.25M NaCl、1.5ｍＭ ZnSO₄、60ユニ
ツトのS1ネクレアーゼ）中で室温30分間作用
させ、フエノールで除蛋白し、エタノールで
DNAを沈澱させた後、これにターミナルトラ
ンスフエラーゼを50μの反応液（二重鎖
DNA、0.14Mカコジル酸カリ、0.3M Tris（塩
基）PH7.6、２ｍＭジチオスレイトール、１ｍ
Ｍ CoCl₂、0.15ｍＭ dCTP，30ユニツトタ
ーミナルトランスフエラーゼ）中で３分間37℃
で作用させ二重鎖DNAの３両端に約15個のデ
オキシシチジン鎖を伸長させた。これらの一連
の反応で約300nｇのデオキシシチジン鎖をも
つた二重鎖DNAを得た。 (v) 大腸菌プラスミドの開裂ならびにdGテイル
の付加 一方、10μｇの大腸菌プラスミド
pBR322DNAに制限酵素PatIを50μの反応液
（10μｇ DNA、50ｍＭ NaCl、6mｍ
Trie・HCl・PH7.4、６ｍＭ MgCl₂、6mｍ
２−メルカプトエタノール、100μｇ／ml牛血
清アルブミン、20ユニツトのPstI）中で３時間
37℃で作用させてpBR322 DNA中に１ケ所存
在するPstI認識部位を切断し、フエノールで除
蛋白した後、ターミナルトランスフエラーゼを
50μの反応液（DNA 10μｇ、0.14Mカコジル
酸カリ、0.3M Tris・塩基 PH7.6、２ｍＭ
ジチオスレイトール、１ｍＭ CoCl₂、0.15ｍ
Ｍ GTP、30ユニツトターミナルトランスフ
エラーゼ）中で３分間37℃で作用させ上記プラ
スミドpBR322DNAの3′両端に約17個のデオキ
シグアニン鎖を延長させた。 (vi) cDNAの会合ならびに大腸菌の形質変換 このようにして得られた合成二重鎖
DNA0.1μｇと上記プラスミドpBR322、0.5μｇ
を0.1M NaCl、50ｍＭ Tris・HCl PH7.6、
1mMEDTAよりなる溶液中で65℃２分間、45
℃２時間加熱しその後除冷して会合させEnaa
らの方法〔J.Mol、Biol.、96、495（1975）〕に
従つて大腸菌MM294を形質転換させた。 (vii) cDNA含有プラスミドの単離 このようにして約20000個のテトラサイクリ
ン耐性株が単離され、これら各々のDNAをニ
トロセルロースフイルターの上に固定した。次
いでTaniguchiらの報告〔Nature、302、305
（1983）〕したIL−２のアミノ酸配列をもとに
してアミノ酸No.74〜78（Lys⁷⁴−His−Leu−Gln
−Cys）およびアミノ酸No.122〜126（Thr¹²²Phe
−Met−Cys−Glu）に対応する塩基配列（⁵
′AAA CAT CTT CAG TGT³′および⁵′ACA
TTC ATC TGT GAA³′）にそれぞれ相補す
るオリゴヌクレオチドをトリエステル法
〔Crsa、R.らProc、Natl.Acad.Sci.USA、75、
5765（1978）〕により化学合成した。 このオリゴヌクレオチドに対してT4ポリヌ
クレチドカイネースを用いて50μの反応液
（オリゴヌクレチオド0.20μｇ、50ｍＭ Tris・
HCl PH8.0、10ｍＭ MgCl₂、10ｍＭメルカ
プトエタノール、50μCiγ−³²PATP、３ユニツ
トT4ポリヌクレオチドカイネース）中で１時
間37℃で反応させ、5′末端を³²Pで標識した。
この標識されたオリゴヌクレチオドをプローブ
としてLawnらの方法〔Nucleic Acids Rec.、
９、6403（1981）〕に従つて上記のニトロセルロ
ースフイルター上に固定したDNAに会合させ、
オートラジオグラフイーによつて上記二種類の
オリゴヌクレオチドプローブに反応する菌株を
４個単離した。これらの菌株の各々の菌体から
プラスミドDNAをアルカリ法〔Birncoim H.
C.＆Doly、J.Nucleic Acids Res.、Ｉ、1513
（1979）〕によつて単離した。次にプラスミド
DNAの挿入部を制限酵素PstIにより切り出し、
分離したプラスミドのうちでその挿入部の長さ
の最も長い断片を含むものをえらび、このプラ
スミドをpILOT 135−８と名づけた。このプ
ラスミドの制限酵素地図を第１図に示す。 次にこのpILOT−135−８プラスミドに挿入
されたcDNAの配列の一次構造（塩基配列）を
ジデオキシヌクレオチド法とMaxam−Gilbert
法によつて決定した。その一次構造は第２図に
示した。この塩基配列により規定されるペプチ
ドはその合成開始信号（No.64〜66のATG）か
ら始まつて153個のアミノ酸から成る。この中
Ｎ末端から20個のアミノ酸はシグナルペプチド
と考えられる。上記の一次構造から、このプラ
スミドはヒトIL−２蛋白質をコードする塩基
配列を全部持つていることが判明した。この事
実によつてプラスミドに組み込まれた遺伝子を
他の発現用プラスミドに組み込むことにより
IL−２蛋白質の任意のポリペプチドを生産す
ることができる。 実施例 ２ 実施例１で得たプラスミドpILOT 135−８を
制限酵素HgiA1で切断し、1294bpのIL−２遺伝
子を含むDNA断片を得た。このDNA断片を
T4DNAポリメラーゼで処理した後、アラニンの
コドンGCAとメチオニンのコドンATGを有する
Cla Ｉのリンカー、CGATA ATG GCAを結合
させ、ClaI、PstI処理した後、ptrp771のClaI、
Pst Ｉ siteに組み込み、得られた発現用プラス
ミドをpTF4と命名した（第４図）。 実施例 ３ 実施例２で得たプラスミドpTF4を用いて
Cohenらの方法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA、69、
2110（1972）〕に準じて大腸菌DH1を形質転換さ
せ、当該プラスミドを含む形質転換体
（Escherichia coli DH １／pTF4）を得た。 実施例 ４ 実施例３で得たE.coli DH1／pTF4を250ml容
三角フラスコ内のバクト・トリプトン（デイフ
コ・ラボラトリーズ・アメリカ）１％、バクト・
イーストエキス（デイフコ・ラボラトリーズ・ア
メリカ）0.5％、食塩0.5％およびテトラサイクリ
ン7μｇ／mlを含む液体培地（PH7.0）50mlに接種
して37℃で１晩回転振盪培養した。この培養液を
カザミノ酸0.5％、グルコース0.5％およびテチラ
サイクリン7μｇ／mlを含むM9培地2.5の入つた
５容ジヤーフアーメンターに移し37℃で４時
間、ついで３−β−インドリルアクリル酸（25μ
ｇ／ml）を添加して、さらに４時間通気撹拌培養
して培養液2.5を得た。この培養液を遠心分離
し、菌体を集め、−80℃で凍結して保存した。 実施例 ５ 実施例４で得た凍結保存菌体12.1ｇを7M塩酸
グアニジン、0.1M Tris・HClを含む抽出液（PH
7.0）100mlに均一に懸濁し、４℃で１時間撹拌し
た。この溶菌液を28000×ｇで20分間遠心分離し
て上清93mlを得た。 実施例 ６ 実施例５で得た上清を0.01M Tris・HCl緩衝
液（PH8.5）に対して透析後19000×ｇで10分間遠
心分離して透析上清94mlを得た。この透析上清を
0.01M Tris−HCl緩衝液（PH8.5）で平衡化した
DE52（DEAE−セルロース、ワツトマン社製、イ
ギリス）カラム（50ml容）に通して蛋白を吸着さ
せ、NaCl濃度直線勾配（０〜0.15M NaCl、１
）を作成してＩ−２を溶出させた。活性画分53
mlをYM−５メンブラン（アミコン社製、アメリ
カ）を用いて4.8mlに濃縮し、0.1M Tris・HCl
（PH8.0）−1M NaCl緩衝液で平衡化したセフアク
リルＳ−200（フアルマシア社製、スエーデン）カ
ラム（500ml容）を用いてゲル過を行つた。活
性画分28mlをYM−５メンブランで2.5mlに濃縮
した。得られた濃縮液をウルトラポアRPSC（ア
ルテツクス社製、アメリカ）カラムに吸着させ、
トリフルオロ酢酸−アセトニトリル系を溶出溶媒
とする高速液体クロマトグラフイーを行つた。 カラム、ウルトラポアRPSC（4.6×75mm）；カラ
ム温度、30℃；溶出溶媒Ａ、0.1％トリフルオロ
酢酸−99.9％水；溶出溶媒Ｂ、0.1％トリフルオ
ロ酢酸−99.9％アセトニトリル；溶出プログラ
ム、０分（68％Ａ＋32％Ｂ）−25分（55％Ａ＋45
％Ｂ）−35分（45％Ａ＋55％Ｂ）−45分（30％Ａ＋
70％Ｂ）−48分（100％Ｂ）；溶出速度、0.8ml／
min；検出波長、230nｍ。本条件下で保持時間約
39分の活性画分を集め、非グリコシル化ヒトIL
−２蛋白質0.53mg〔比活性、30000U／mg、出発
材料からの活性回収率、30.6％；蛋白質の純度、
99％（デンシトメトリーによる）〕を含む溶液10
mlを得た。 上記溶液を凍結乾燥に付し、白色粉末を得た。
本粉末の比活性は26000U／mgであつた。 実施例 ７ 実施例６で得たヒトIL−２蛋白質について以
下の諸性質を調べた。 (1) 単一性： ラエムリの方法〔Nature、227、680（1970）〕
に準じてSDS−ポリアクリルアミドスラブゲル
電気泳動を行つたあとクマジ−プリリアントブ
ルーで染色した結果、該ヒトIL−２蛋白質は
単一のバンドを示した（第５図参照）。バンド
の位置は還元条件下でも非還元条件下でも変ら
なかつた。 (2) 分子量： 該フトIL−２蛋白質の分子量は、SDS−ポ
リアリクルアミドスラブゲル電気泳動から約
15000ダルトンと算出された（第５図参照）。 上記(1)項および(2)項の結果から、実施例６で
得たヒトIL−２蛋白質はオリゴマーを実質的
に含んでいないことが明らかである。 (3) アミノ酸組成： 該ヒトIL−２蛋白質20μｇをガラス製加水分
解用試験管にとり、４％チオグリコール酸を含
む定沸点塩酸を加えて、減圧下に封管したの
ち、110℃で24、48、72時間加水分解した。加
水分解後、開管し、減圧下に塩酸を除去し、残
渣を0.01N塩酸に溶解して日立製835型アミノ
酸分析計によりアミノ酸分析を実施した。シス
チンおよびシステインはハースの方法
〔Methods in Enzymol、11、197（1967）〕に従
い、該ヒトIL−２蛋白質を過ギ酸酸化したの
ち、減圧下、定沸点塩酸中で24時間加水分解し
て、アミノ酸分析計によりシステイン酸として
定量した。アミノ酸分析値は、24、48および72
時間の加水分解で得られた値を平均して求め
た。但し、セリンおよびスレオニンの値は加水
分解時間を０時間に外挿して求めた。その結果
を第２表に示す。 第２表アミノ酸 モル％ Asp／Asn 8.8 Thr 9.3 Ser 5.7 Glu／Gln 13.7 Pro 3.4 Gly 1.7 Ala 3.8 1/2Cys 2.3 Val 3.1 Met 3.7 Ile 6.3 Leu 16.3 Tyr 2.3 Phe 4.5 Lys 8.3 His 2.5 Arg 3.1 Trp 1.1 (4) Ｎ末端アミノ酸配列： 該ヒトIL−２蛋白質34μｇに気相プロテイン
シ−クエネーター（アプライド・バイオシステ
ムズ社製470A型、アメリカ）を用いる自動エ
ドマン分解法を適用して、Ｎ末端アミノ酸配列
を分析した。フエニルチオビダントインアミノ
酸（PTH−アミノ酸）はミクロパツクSP−０
DSカラム（バリアン社製、アメリカ）を用
いる高速液体クロマトグラフイーにより固定し
た。各ステツプで検出されたPTH−アミノ酸
を第３表に示す。 第３表ステツプ 検出されたPTH−アミノ酸 １ Als Met ２ Pro Ala ３ Thr Pro ４ Ser Thr ５ Ser ６ Ser ７ Thr ８ Lys ９ Lys 10 Thr 11 Gln 12 Leu 13 Gln 14 Leu 15 Glu 16 Ｙ 17 Leu 18 Leu 19 Leu 20 Asp 表中Ｙについては未決定である。 (5) Ｃ末端アミノ酸： 該ヒトIL−２蛋白質30μｇをガラス製ヒドラ
ジン分解用試験管にとり、無水ヒドラジン0.05
mlを加えて減圧下に封管したのに、100℃で６
時間加熱した。得られたヒドラジン分解物を凍
結乾燥したのち、蒸留水に溶解した。この溶液
にベンズアルデヒドを添加し、室温で１時間撹
拌し、遠心分解を行なつたのち、上清を得た。
この上清を凍結乾燥し、日立製835型アミノ酸
分析計によりアミノ酸分析を実施した。その結
果、スレオニンのみが検出された。 (6) トリプシン消化ペプチドマツプ： 該IL−２標品15μｇをTPCK（Ｌ−１−トシ
ルアミド−２−フエニルエチルクロルメチルケ
トン）トリプシン（ワシントン社製、アメリ
カ）0.4μｇと0.02M炭酸水素ナトリウム120μ
中、37℃、18時間反応させた。反応液に２−メ
ルカプトエタノール5μを添加してさらに37
℃で２時間反応したのち、反応液に１％トリフ
ルオロ酢酸75μを加え反応を停止させた。得
られた反応液を下記の条件下での高速液体クロ
マトグラフイーにより分析して、第６図に示す
マツプを得た。 カラム：ウルトラスフエアーオクチル（5μｍ、
4.6×250mm：アルテツクス社製、アメリカ）。 カラム温度：30℃ 移動相：Ａ液、0.02％トリフルオロ酢酸−99.98
％水 Ｂ液、0.02％トリフルオロ酢酸−99.98％ア
セトニトリル ０分（95％Ａ液＋５％Ｂ液）−40分（30％Ａ
液＋70％Ｂ液）。 溶出速度：1.0ml／分。 検出法：フロレスカミン（ロツシユ社製、アメ
リカ）を用いる蛍光法〔Analytical
Biochem.、67、438（1975）〕。 (7) IL−２依存性細胞株に対する活性： Biochem.Biophye.Res.Commun.、109、363
（1982）に記載の方法に準じて、本発明の非グ
リコシル化ヒトIL−２蛋白質の活性を測定し
た結果、該IL−２蛋白質はIL−２依存性マウ
ス細胞株（NKC3、第７図参照）およびヒト細
胞株（第８図参照）のいずれに対してもトリチ
ウムチミジンの取込を促進させる活性を有して
いた。 また、該IL−２蛋白質を0.5U／mlになるよ
うに20％FCS加RPMI−1640培地中に溶解した
ものに、NKC3株を２×10⁵個／mlになるよう
に浮遊してリンブロマルチデイツシユ（フロー
社、アメリカ）内で37℃、５％CO₂存在下に継
代培養した。培養２〜３日毎に生細胞数を計測
して、新たに新鮮な上記培養液に再浮遊するこ
とを繰り返した結果、第９図に示すように該
IL−２蛋白質はNKC3株の増殖を長期にわたつ
て維持し得る活性を有していた。 実施例 ８ 注射用製剤： 実施例６で得られた非グリコシル化ヒトIL−
２蛋白質含有溶液を、0.025M酢酸アンモニウム
緩衝液（PH5.0）で平衡化したCMトヨパール（東
洋曹達社）カラムに無菌条件下で吸着させ、
0.15MのNaClを含む上記緩衝液で溶出させる。
溶出液に0.15M NaClを適宜加えて希釈し、
NSAを0.5％になるように添加してメンブランフ
イルター（口経0.22μｍ）を用いて過後、得ら
れた液を無菌的に１mlずつバイアル瓶に分注し
て凍結乾燥し、注射用ヒトIL−２を調製する。
本注射用製剤は、用時注射用蒸留水１mlに溶解す
る。 実施例 １ 実施例６で得たヒトIL−２蛋白質につき、そ
のチオール基の定量とチオール基の位置決定を行
つた。 (1) まず、チオール基の定量については、
DTNB法によるEllmanの方法〔アルカイブ
ズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイ
オフイジクス（Archives of Biochemistry
and Biophysics）第32巻70頁（1959年）〕に従
つて行なつた。すなわち、実施例６で得たヒト
IL−２蛋白質0.4mg（26.7nmol）を含む6M塩酸
グアニジン−10ｍＭエチレンジアミンテトラ酢
酸・２ナトリウム−75ｍＭトリス塩酸緩衝液
（PH8.3）1.98mlに10ｍMDTNB［５，5′−ジチ
オビス（２−ニトロ安息香酸）］メタノール溶
液0.02mlを添加し、室温で30分間反応を行わせ
た。定量は反応液の黄色の呈色を412nｍの吸
光度で測定し、標準物質として既知濃度のシス
テイン塩酸塩を用いることにより行つた。その
結果、ヒトIL−２蛋白質１モルあたり0.85モル
のチオール基が検出され、従つて、ヒトIL7−
蛋白質が有するシステイン３残基のうち、遊離
のチオール基を有するのは１残基のみで、他の
２残基は互いにジスルフイド結合を形成してい
ることが判明した。 (2) 次にチオール基の位置決定をEgorovらによ
つて報告された方法［プロシーデイングス・オ
ブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイ
エンシズ・USA、第72巻第3029−3033頁
（1975年）］に基づいて行つた。すなわち、実施
例６で得たヒトIL−２蛋白質6.3mgを含む6M塩
酸グアニジン−0.1M塩化ナトリウム−25ｍＭ
酢酸アンモニウム緩衝液（PH5.0）３mlを同緩
衝液で平衡化されたチオプロピルセフアロース
6B（フアルマシア社、スウエーデン）カラム
（1.0cmφ×5.1cm、４ml）に流速５ml／ｈで負
荷したのち、上記緩衝液10ml、0.1M塩化ナト
リウム−25ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（PH
5.0）10mlおよび0.2M酢酸（PH3.0）10mlを用い
てカラムの洗浄を行つた。 次にこのチオプロピルセフアロース6Bゲル
４mlをカラムから取り出し、0.2M酢酸（PH
3.0）６mlを添加し、ペプシン（シグマ社、
USA）0.1mgを用いて37℃、15時間攪拌しなが
ら、加水分解反応を行わせた。反応後、再びこ
のゲルをカラムに詰め、0.2M酢酸（PH3.0）10
mlおよび25ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（PH
4.5）10mlで洗浄したのち、20ｍM2−メルカプ
トメタノール−25ｍＭ酢酸アンモニウム（PH
4.5）30mlを用いてゲル中の未反応基を２−チ
オピリドンとして溶出した。ひき続いて、25ｍ
Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（PH4.5）10mlおよ
び25ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（PH8.0）10
mlでカラムを洗浄したのち、20ｍM2−メルカ
プトエタノール−25ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝
液（PH8.0）を用いて流速５ml／ｈで溶出を行
い、遊離のチオール基を有するヒトIL−２蛋
白質由来のペプチドフラグメントを含む画分10
mlを取得した。さらに、この画分をサーバント
を用いて濃縮乾固したのち、0.1％トリフルオ
ロ酢酸溶液0.5mlに溶解させ、下記の条件で逆
相高速液体クロマトグラフイーを行つた。 カラム：ヌクレオシル5C18（0.8cmφ×30cm、ナー
ゲル社、西ドイツ） カラム温度：30℃ 溶出溶媒Ａ：0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％水 溶出溶媒Ｂ：0.1％トリフルオロ酢酸−99.9％ア
セトニトリル 溶出プログラム：０分（95％Ａ＋５％Ｂ）−60分
（70％Ａ＋30％Ｂ）−75分（50％Ａ＋50％Ｂ）−
85分（40％Ａ＋60％Ｂ）−95分（25％Ａ＋75％
Ｂ）−98分（15％Ａ＋85％Ｂ） 溶出速度：３ml／min 検出波長：230nｍ その結果、第１０図に示すように４つのピーク
が検出されたので、これらを、分取後、サーバン
トで濃縮乾固し、それぞれについてアミノ酸組成
分析を行つた。結果を第４表に示す。 【表】 上記の結果からピーク１はCys125−Ser130、
ピーク２はCys125−Thr131、ピーク３はCys125
−Ilel129、ピーク４はCys125−Thy131と容易に
同定され、４つのピークすべてがCys125を含む
フラグメントであることがわかつた。また、チオ
プロピルセフアロースカラムクロマトグラフイ
ー、プロテアーゼ反応、逆相高速液体クロマトグ
ラフイーの全過程を通じての回収率は32.6％であ
つた。 従つて、実施例６で得た精製ヒトIL−２蛋白
質は、ヒトIL−２蛋白質が有するシステイン３
残基のうち、遊離のチオール基を有するのは
Cys125であり、Cys58とCys105とがジスルフイ
ド結合を形成しており、チオール基の結合様式の
異なるアイソマーは含まれていないことが判明し
た。 実験例 ２ 実施例６で得たヒトIL−２蛋白質につき、そ
のエンドキシンの定量を行つた。定量法は、岩永
らの方法［ヘモスターシス（Haemostasis）第７
巻183−188頁（1978年）］に従つて行つた。 (1) まず、エシエリヒア・コリ0111−B4から得
られた標準エンドトキシン（エンドトキシン検
出試薬プレゲル（帝国臓器製薬製）に添付した
もの）の10^-2nｇ／ml、10^-1nｇ／ml、３×
10^-1nｇ／ml、1nｇ／mlおよび3nｇ／mlの濃度
の水溶液を調製した。 LAL（Limulus Amebocyte Lysate、カブト
ガニ血球抽出成分、帝国臓器製薬製）25μ、
合成基質 Boc−Leu−Gly−Arg−pNA（生化
学工業製、Boc：ブトキシカルボニル、
pNA：パラニトロアニド）（1.6mg／ml）25μ
および上記標準エンドトキシンの水溶液50μ
を混合し、37℃60分反応させた後、12.5％酢酸
を添加し、405nｍの吸光度をそれぞれ２回測
定し、次の結果を得た。 【表】 上記の結果をプロツトし第１１図を作成し
た。 (2) 次に、実施例６で得たヒトIL−２蛋白質を、
1.10mg／ml、1.16mg／mlとなるようにそれぞれ
水に溶解し、水溶液とした。これらを、上記(1)
項と同様の反応に付し、405nｍの吸光度を測
定した。得られた吸光度から、第１１図に基づ
いて、該水溶液のエンドトキシン濃度を計算
し、これにより、実施例６で得たヒトIL−２
蛋白質の１mgタンパクあたりのエンドトキシン
量を算出した。結果を次の第６表に示す。 【表】 実験例 ３ (1) 粗抽出液の製造 (i) 発現のプラスミドの構築 上述の実施例１(vii)で得られたヒトIL−２
遺伝子を有するプラスミドpILOT 135−８
を制限酵素HgiAIで切断した。得られた
1294bpDNA断片をT4DNAポリメラーゼで
平滑末端とし、T4DNAリガーゼを用いて、
Eco RIリンカー
dTGCCABGAATTCATGGCAを結合させ
た。得られたDNAをEcoR Ｉで消化し、翻
訳開始コドンATGおよびヒトIL−２遺伝子
を有するDNA断片を得た。 このDNA断片を、あらかじめEcoR Ｉ−
Pst1部位を消化したptrp781［ヌクレイツク・
アシズ・リサーチ、第11巻、3077頁（1983）］
にT4DNAリガーゼを用いて挿入した。かく
して得られた発現用プラスミドpTFIはtrpプ
ロモーターの下流に翻訳開始コドンとヒト
IL−２遺伝子を有する。 プラスミドpTFIを制限酵素Stulで切断し、
BamHIリンカーと結合させた。このプラス
ミドDNAを制限酵素BamHIおよびEcoRIで
処理し、ついでEcoRI−BamHI部位にλPL
プロモーターを有するプラスミドpTB281に
挿入した。かくして得た発現用プラスミドを
pTB285と命名した。 (ii) 形質転換体の製造 上記で得たプラスミドpTB285でエシエリ
ヒアコリN4830をコーエンらの方法［プロシ
ージングス・オブ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Pro.Natl.Acad.Sci
USA）、第69巻、2110頁（1972）］に従い形
質転換体エシエリヒアコリN4830／pTB285
を得た。 (iii) 形質転換体の培養、抽出 前記で得た形質転換し、上記プラスミドを
含有する形質転換体エシエリヒアコリ
N4830／pTB285を、実施例４と同様の方法
で培養した。このようにして得られた大腸菌
形質転換体（８ｇ）を、20nM トリス−塩
酸（PH7.5、30ｍMNaClを含む。）で洗浄し、
同じ組成の緩衝液（40ml）に懸濁し、これを
ソニツク処理（０℃、２分間）に付した。さ
らに、分解物をリゾチーム（1μｇ／ml）消
化（０℃、20分）し、ついで凍結融解を３回
行ない、全体を遠心分離（28000×ｇ、30分）
した。このようにして得られた２つの粗抽出
液をロツト01およびロツト02と称する。 (2) 形質転換体の培養、抽出および精製 上記で得られた形質転換体エシエリヒアコリ
N4830／pTB285を、実施例４と同様の方法で
培養し、実施例５および６の方法と同様の方法
で抽出および精製を行なつた。このようにして
得られたリコンビナントヒトインターロイキン
−２（以下、rIL−２と略称することもある。）
の２つの精製品を、ロツト51およびロツト52と
称する。 (3) IL−２活性 前記(iii)および(iv)で得られた粗抽出液および精
製品の蛋白濃度およびIL−２活性を測定した。
ユニツトは、前記方法と同様の方法で測定し
た。結果を第７表に示す。 【表】 実験例 ４ (1) rIL−２製剤中のエンドトキシン含量の測定 (イ) 材料： rIL−２製品（粗抽出液ロツト01および02
ならびに精製品ロツト51および52）を使用し
た。 (ロ) 方法および結果： 上記製品中のエンドトキシンの定量を、
T.サカタらの方法〔Journal of Parenteral
Science and Technology、39、197（1985）〕
に従つて実施した。まずエシエリヒア・コリ
055：B5由来の標準エンドトキシンControl
7D4089〔デイフコ・ラボラトリーズ〕を水に
溶解し、エンドトキシン濃度3.1×10^-3nｇ／
ml、、6.3×10^-3nｇ／ml、1.25×10^-2nｇ／ml、
2.5×10^-2nｇ／mlおよび5.0×10^-2nｇ／mlの
水溶液を調製した。トキシノメーターET−
201を用いてのアツセイを、10mm径ガラス管
中の100μのLAL
〔Limulusamebocytelysate（カブトガニアメ
ーバ様細胞溶解産物）、カブトガニ
（Limulus polyphemus）血液細胞抽出物；
アソシエーツ・オブ・ケイプコツド、インコ
ーポレイテツド〕溶液100μに試験液100μ
を加えることによつて、行つた。ヴオルテ
ツクスミキサーで数秒間反応液を混合したの
ち、試験管をトキシノメーターET−201の光
学ユニツトに挿入し、濁度測定を開始した。
各試料の反応時間を個々に、ゲル化が確認さ
れるまで計測した。結果を次の第８表に示
す。 【表】 上記の結果をプロツトして、エンドトキシ
ンの用量依存性標準曲線としてグラフＡを得
た。 logC＝−3.07×logT(G)＋2.389 γ＝−0.997 トキシノメーターET−201は、LAL／エ
ンドトキシン溶液のゲル化時の濁度変化を波
長660nｍで測定し、試料のゲル化時間を自
動的に記録する。この装置は、連続的に変化
する光量の初期光量に対する比Ｒ(t)を同時に
64アンプルまで12秒ごとに測定する。試料を
37±0.5℃の一定温度で静置状態でインキユ
ベートするとき、試料の振動からくる妨害な
しに、ゲル化を客観的に検出できる。Ｒ(t)の
５％低下を得るのに必要な反応時間として定
義されるゲル化時間Ｔ(G)は、表示装置に表示
され、印字されるか、外部コンピユーターに
送られて、エンドトキシン濃度の計算に使わ
れる。 つぎに、rIL−２製品を水に溶解し、水溶
液とした。これらの溶液を上記と同じ操作に
付し、ゲル化時間を測定した。こうして得ら
れたゲル化時間をグラフＡに示した曲線と比
較して、該水溶液中のエンドトキシン濃度を
算出し、rIL−２蛋白質１mg当りのエンドト
キシン量に換算した。こうして得られた結果
を下記の第９表に示す。 【表】 (ハ) エンドトキシン含量 上記(ロ)の第９表から有らかなように、精製
品のエンドトキシン含量は極めて少量で
0.017および0.014nｇ／mg蛋白である。これ
に対し、粗抽出液のエンドトキシン含量は、
２×10³および2.9×10³nｇ／mg淡白で、精製
品のそれの約1.6×10⁵倍である。 粗抽出液は、試料中に大量のエンドトキシ
ンを有するので、粗抽出物は臨床用に使用す
ることができない。 一方、精製品のエンドトキシン含量は極め
て少量であるので、精製品はそのままで臨床
に用いることができる。 (2) rIL−２製品中の発熱物質の測定 (イ) 材料： rIL−２製品（粗抽出物ロツト01および02
ならびに精製品ロツト51および52）を使用し
た。ウサギは市川屋（東京）から購入した。 (ロ) 方法および結果： 発熱物質試験は「生物学的製剤基準、厚生
省薬務局監修、社団法人細菌製剤協会発行、
1985年」223〜224ページに記載の方法に従つ
て実施した。結果を次の第10表に示す。 【表】 【表】 緩衝液は、発熱物質を含まないものを使用
した。
(ハ) 結論 生物学的製剤基準の発熱試験法の判定基準
に従えば、精製品は、発熱物質を含んでいな
い。しかし、粗抽出物は、ひとへの臨床量投
与条件下で発熱性であることが明らかであ
る。 さらに詳しくは、本実験は、予定臨床用量
１×10³U／人（20U／Kg体重；ヒトの平均
体重を50Kgとした）に基き、粗抽出液および
精製品とも、その10倍量の200U／Kgを投与
して発熱性試験を行つた。しかし、用量決定
実験で、粗抽出液を投与したウサギは、体温
上昇のため死に至つた。それゆえ、粗抽出液
群では、用量を20U／Kgに低減した。 上記第10表に示されているように、精製品
の発熱性は検出されなかつたが、粗抽出液で
は、精製品よりも少量のrIL−２の投与によ
つても、発熱性が検出された。 それゆえ、粗抽出液は、その発熱性のた
め、臨床に用いることはできない。 一方、精製品は、発熱性を有しないため
に、臨床に用いることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は実施例１(vii)で得たプラス
ミドpILOT135−８の制限酵素地図（ はシグ
ナルペプチドをコードする部分を、 はIL−
２をコードする部分を表わす）および一次構造
（塩基配列）をそれぞれ示し、第３図は本発明の
非グリコキシル化ヒトIL−２蛋白質のアミノ酸
配列（図中Ｘは、Metまたは水素を表わす）を示
す。第４図は実施例２における発現用プラスミド
pTF4構築図を示す。第５図は実施例７(1)、(2)の
SDS−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動の
結果を、第６図は実施例７(6)のトリプシン消化ペ
プチドマツプを、第７図および第８図は実施例７
(7)のNKC3細胞株およびヒト細胞株のトリチウム
チミジンの取込に及ぼす本発明のヒトIL−２蛋
白質の影響を示す。第９図は実施例７(7)のNKC3
細胞株に対する長期継代培養の結果を示す。第１
０図は、実験例１で得られた逆相高速液体クロマ
トグラフイーの結果を示す。第１１図は、実験例
２における標準エンドトキシンの濃度と405nｍ
の吸光度との関係を示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 大腸菌形質転換体の培養により得られ、ヒト
   末梢血リンパ球を５×10⁶個／mlとなるように10
   ％FCS添加RPMI1640培地に浮遊しコンカナバリ
   ン−A40μｇ／mlおよび12−Ｏ−テトラデカノイ
   ルホルボール−13−アセテート15nｇ／mlを添加
   して37℃で５％CO₂の存在下に48時間培養した培
   養液の上清をIU／mlと定める方法により測定さ
   れた比活性が10⁴U／mg以上であり、エンドトキ
   シンの含有量が1ppm以下であり、発熱物質試験
   の方法に従つてウサギに体重１Kgあたり200Uを
   投与し発熱物質を含まないと判定され、かつ実質
   的に純粋な非グリコシル化ヒトインターロイキシ
   −２蛋白質と、製剤学的に許容される担体、賦形
   剤または（および）希釈剤とを含有する抗腫瘍用
   または免疫機能低下疾患治療用組成物。