JPH0542417B2 - - Google Patents
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- JPH0542417B2 JPH0542417B2 JP57176024A JP17602482A JPH0542417B2 JP H0542417 B2 JPH0542417 B2 JP H0542417B2 JP 57176024 A JP57176024 A JP 57176024A JP 17602482 A JP17602482 A JP 17602482A JP H0542417 B2 JPH0542417 B2 JP H0542417B2
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- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
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- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C35/00—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
- C07C35/48—Halogenated derivatives
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- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F32/00—Homopolymers and copolymers of cyclic compounds having no unsaturated aliphatic radicals in a side chain, and having one or more carbon-to-carbon double bonds in a carbocyclic ring system
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- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は生化学的な方法工程による環式ジヒド
ロキシ化合物の製造、および特定の新規な環式ジ
ヒドロキシ化合物に関する。
ロキシ化合物の製造、および特定の新規な環式ジ
ヒドロキシ化合物に関する。
天然（野生）の状態ではある種の芳香族化合物
を増殖のための炭素源として用いることができる
シユードモナス（Pseudomonas）種、アルカリ
ゲネス（Alkaligenes）種およびベイルジエリン
クキア（Beirjerinckia）種の突然変異株に芳香
族化合物を提供することにより環式ジヒドロキシ
化合物を製造することは、公知である。そのよう
な微生物によつて産生される環式ジヒドロキシ化
合物の濃度は低く、典型的には培養液１当り２
ｇ未満である。さらには、環式ジヒドロキシ化合
物の産生のための酵素を、細胞の使用前に、細胞
を芳香族化合物に接することにより細胞中に誘導
しなければならない。
を増殖のための炭素源として用いることができる
シユードモナス（Pseudomonas）種、アルカリ
ゲネス（Alkaligenes）種およびベイルジエリン
クキア（Beirjerinckia）種の突然変異株に芳香
族化合物を提供することにより環式ジヒドロキシ
化合物を製造することは、公知である。そのよう
な微生物によつて産生される環式ジヒドロキシ化
合物の濃度は低く、典型的には培養液１当り２
ｇ未満である。さらには、環式ジヒドロキシ化合
物の産生のための酵素を、細胞の使用前に、細胞
を芳香族化合物に接することにより細胞中に誘導
しなければならない。
ここに我々は、シユードモナス・プチダ
（putida）のある種の突然変異株の細胞に芳香族
化合物を供給すると、従来達成されたよりも一層
高濃度の環式ヒドロキシ化合物が得られること、
一層広範囲の芳香族化合物類を環式ジヒドロキシ
化合物に転化しうること、を発見した。前述の突
然変異株によつて産生される環式ジヒドロキシ化
合物は、環含有重合体の製造における中間体とし
て有用である（この事項については、出願中の英
国特許出願第8130114号明細書に一層詳しく記載
されている）。
（putida）のある種の突然変異株の細胞に芳香族
化合物を供給すると、従来達成されたよりも一層
高濃度の環式ヒドロキシ化合物が得られること、
一層広範囲の芳香族化合物類を環式ジヒドロキシ
化合物に転化しうること、を発見した。前述の突
然変異株によつて産生される環式ジヒドロキシ化
合物は、環含有重合体の製造における中間体とし
て有用である（この事項については、出願中の英
国特許出願第8130114号明細書に一層詳しく記載
されている）。
本発明に有用な突然変異株を作るための突然変
異に適当なシユードモナス・プチダの代表的な培
養物は、英国スコツトランド、アバーデイーン、
トーリイ、リサーチ、ステーシヨンのザ・ナシヨ
ナル・コレクシヨン・オブ・インダストリアル・
バクテリア（NCIB）に寄託され、NCIB第11680
号およびNCIB第11767号の番号が与えられてい
る。なお、NCIB第11767号はブタペスト条約に
基づく国際寄託番号であり、シユードモナス・プ
チダNCIB第11767号は1982年９月10日に国際寄
託機関であるNCIBに寄託されている。一方、
NCIB第11680号は、NCIBが国際寄託機関として
の地位を取得する前の1981年10月２日に特許手続
のためにNCIBに寄託されたものであつて、本願
出願前容易に入手できたものである。
異に適当なシユードモナス・プチダの代表的な培
養物は、英国スコツトランド、アバーデイーン、
トーリイ、リサーチ、ステーシヨンのザ・ナシヨ
ナル・コレクシヨン・オブ・インダストリアル・
バクテリア（NCIB）に寄託され、NCIB第11680
号およびNCIB第11767号の番号が与えられてい
る。なお、NCIB第11767号はブタペスト条約に
基づく国際寄託番号であり、シユードモナス・プ
チダNCIB第11767号は1982年９月10日に国際寄
託機関であるNCIBに寄託されている。一方、
NCIB第11680号は、NCIBが国際寄託機関として
の地位を取得する前の1981年10月２日に特許手続
のためにNCIBに寄託されたものであつて、本願
出願前容易に入手できたものである。
我々はシユードモナス・プチダNCIB第11680
号およびシードモナス・プチダNCIB第11767号
のそれぞれの第１の突然変異株であつて、もはや
ベンゼンまたはトルエンで増殖することができ
ず、またある種の芳香族化合物から環式ジヒドロ
キシ化合物を産生する突然変異株を調製した。
我々は、またシユードモナス・プチダNCIB第
11767号の第１の突然変異株からさらに別の（第
２）の突然変異株も調製した。かかる第２の突然
変異株は、ある種の芳香族化合物を環式ジヒドロ
キシ化合物へ転化する酵素について構成性である
（これを便宜的に以下では「構成性（突然変異）
株」と称することとする）。構成性株は、微生物
による環式ジヒドロキシ化合物の産生が起こりう
る前に酵素誘導工程を必要としないという利点を
与える。
号およびシードモナス・プチダNCIB第11767号
のそれぞれの第１の突然変異株であつて、もはや
ベンゼンまたはトルエンで増殖することができ
ず、またある種の芳香族化合物から環式ジヒドロ
キシ化合物を産生する突然変異株を調製した。
我々は、またシユードモナス・プチダNCIB第
11767号の第１の突然変異株からさらに別の（第
２）の突然変異株も調製した。かかる第２の突然
変異株は、ある種の芳香族化合物を環式ジヒドロ
キシ化合物へ転化する酵素について構成性である
（これを便宜的に以下では「構成性（突然変異）
株」と称することとする）。構成性株は、微生物
による環式ジヒドロキシ化合物の産生が起こりう
る前に酵素誘導工程を必要としないという利点を
与える。
従つて、本発明は、シードモナス・プチダの突
然変異株の細胞の増殖をほとんどまたは全く支持
しない培地中の適当なシードモナス・プチダ突然
変異株に対して、適当な芳香族または置換芳香族
化合物および適当なエネルギー源を供給すること
からなる１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−
３，５−ジエン環含有化合物の製法を提供する。
然変異株の細胞の増殖をほとんどまたは全く支持
しない培地中の適当なシードモナス・プチダ突然
変異株に対して、適当な芳香族または置換芳香族
化合物および適当なエネルギー源を供給すること
からなる１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−
３，５−ジエン環含有化合物の製法を提供する。
本発明方法に使用される芳香族化合物は単環式
であるのが好ましいが、本発明において複数の環
を有する芳香族化合物、例えばナフタレンおよび
ビフエニルの使用する可能性が排除されるもので
はない。
であるのが好ましいが、本発明において複数の環
を有する芳香族化合物、例えばナフタレンおよび
ビフエニルの使用する可能性が排除されるもので
はない。
本発明方法において置換芳香族化合物を用いる
場合に、そのような化合物は１またはそれ以上の
置換基を有してよく、置換基は１〜４個の炭素原
子を有する１価炭化水素基（例えばメチル、エチ
ル、ビニル基）、および／またはヘテロ原子もし
くは複素基（例：ハロゲン）であつてよい。
場合に、そのような化合物は１またはそれ以上の
置換基を有してよく、置換基は１〜４個の炭素原
子を有する１価炭化水素基（例えばメチル、エチ
ル、ビニル基）、および／またはヘテロ原子もし
くは複素基（例：ハロゲン）であつてよい。
シユードモナス・プチダの前述の第１の突然変
異株（本発明方法に使用でき、芳香族化合物を環
式ジヒドロキシ化合物に変える酵素を誘導できる
突然変異株）は、シユードモナス・プチダNCIB
第11680号または好ましくはシユードモナス・プ
チダNCIB第11767号を、突然変異条件下で処理
することによつて調製できるが、その条件は生育
のために唯一の炭素源としてトルエンまたはベン
ゼンをもはや利用することができず、また炭素源
としてピバリン酸を含む液体培地中でトルエンの
存在下で生育（増殖）するときに265nｍでUV吸
収のピークを有する物質を排泌する突然変異株を
与えるような条件である。前期の突然変異は、化
学的および／または物理的手段により実施するこ
とができる。化学的突然変異は、例えば微生物を
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンで処理することにより実施でき、この処理は
オルストンによつて「J.of Biolog.Chem.」1966、
Vol 241，p3800〜3810に記載されているように
行うことができる。物理的突然変異化は、電磁波
軸射線、例えばUV線照射によつて行うことがで
きる。
異株（本発明方法に使用でき、芳香族化合物を環
式ジヒドロキシ化合物に変える酵素を誘導できる
突然変異株）は、シユードモナス・プチダNCIB
第11680号または好ましくはシユードモナス・プ
チダNCIB第11767号を、突然変異条件下で処理
することによつて調製できるが、その条件は生育
のために唯一の炭素源としてトルエンまたはベン
ゼンをもはや利用することができず、また炭素源
としてピバリン酸を含む液体培地中でトルエンの
存在下で生育（増殖）するときに265nｍでUV吸
収のピークを有する物質を排泌する突然変異株を
与えるような条件である。前期の突然変異は、化
学的および／または物理的手段により実施するこ
とができる。化学的突然変異は、例えば微生物を
Ｎ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンで処理することにより実施でき、この処理は
オルストンによつて「J.of Biolog.Chem.」1966、
Vol 241，p3800〜3810に記載されているように
行うことができる。物理的突然変異化は、電磁波
軸射線、例えばUV線照射によつて行うことがで
きる。
本発明方法に使用できる前述の構成性株は、シ
ユードモナス・プチダNCIB第11767号の第１の
突然変異株を前述のような突然変異条件下で処理
して、芳香族化合物の存在下で生育（増殖）した
後に、芳香族化合物から環式ジヒドロ化合物を産
生しうる能力をもつ株を得ることにより調製でき
る。突然変異処理の結果物から適当な構成性株を
選定することは、突然変異後の細胞を、炭素源と
してピバリン酸（ピバリン酸塩）またはグルコー
スを含む固体寒天培地で増殖させることによつて
促進しうる。その増殖後に、寒天平板上のコロニ
イにカテコールの水溶液を噴霧することにより迅
速に黄／緑に変る細胞コロニイは、カテコールを
２−ヒドロキシムコニン酸セミアルデヒドに変化
させる酵素について構成性である〔ノザキ、「ト
ピツクス・イン・カレント・ケミストリイ（英
文）」1979、Vol.78、p145−186〕。この酵素はシ
ユードモナス・プチダNCIB第11680号およびシ
ユードモナス・プチダNCIB第11767号中でのベ
ンゼンの酸化分解の一工程に触媒作用をなすもの
であり、我々は上記の酵素がその様相から見てベ
ンゼンを環式ジヒドロキシ化合物に転化する酵素
に関連していことを見出した。従つて、カテコー
ルに曝されて黄／緑に変色する細胞は、所望の構
成性株である。
ユードモナス・プチダNCIB第11767号の第１の
突然変異株を前述のような突然変異条件下で処理
して、芳香族化合物の存在下で生育（増殖）した
後に、芳香族化合物から環式ジヒドロ化合物を産
生しうる能力をもつ株を得ることにより調製でき
る。突然変異処理の結果物から適当な構成性株を
選定することは、突然変異後の細胞を、炭素源と
してピバリン酸（ピバリン酸塩）またはグルコー
スを含む固体寒天培地で増殖させることによつて
促進しうる。その増殖後に、寒天平板上のコロニ
イにカテコールの水溶液を噴霧することにより迅
速に黄／緑に変る細胞コロニイは、カテコールを
２−ヒドロキシムコニン酸セミアルデヒドに変化
させる酵素について構成性である〔ノザキ、「ト
ピツクス・イン・カレント・ケミストリイ（英
文）」1979、Vol.78、p145−186〕。この酵素はシ
ユードモナス・プチダNCIB第11680号およびシ
ユードモナス・プチダNCIB第11767号中でのベ
ンゼンの酸化分解の一工程に触媒作用をなすもの
であり、我々は上記の酵素がその様相から見てベ
ンゼンを環式ジヒドロキシ化合物に転化する酵素
に関連していことを見出した。従つて、カテコー
ルに曝されて黄／緑に変色する細胞は、所望の構
成性株である。
構成性株はグルコースおよびカサミノ酸のよう
な炭素源による異化物質抑制（カタボライト・レ
プレツシヨン）を受け易いことがある。そのよう
な異化物質抑制を受けない改善された構成性株
は、構成性株を前述のように処理することによる
突然変異により得ることができる。改善された構
成性株のコロニイを炭素源としてグルコースおよ
びカサミノ酸を含む寒天培地で増殖させることに
より検出できる。すなわちカテコールに曝したと
きに黄／緑に変色するコロニイは、改善された構
成性株を含む。
な炭素源による異化物質抑制（カタボライト・レ
プレツシヨン）を受け易いことがある。そのよう
な異化物質抑制を受けない改善された構成性株
は、構成性株を前述のように処理することによる
突然変異により得ることができる。改善された構
成性株のコロニイを炭素源としてグルコースおよ
びカサミノ酸を含む寒天培地で増殖させることに
より検出できる。すなわちカテコールに曝したと
きに黄／緑に変色するコロニイは、改善された構
成性株を含む。
本発明方法に使用するための突然変異株の細胞
は、連続式、バツチ式（回分式）または供給バツ
チ式で慣用増殖用培地で増殖しうる。
は、連続式、バツチ式（回分式）または供給バツ
チ式で慣用増殖用培地で増殖しうる。
第１の突然変異株を本発明方法において用いる
場合には、芳香族化合物を培養液中に入れてお
き、新しい培地を培養液に供給しながら行う供給
バツチ式によつて増殖させるのが好ましい。
場合には、芳香族化合物を培養液中に入れてお
き、新しい培地を培養液に供給しながら行う供給
バツチ式によつて増殖させるのが好ましい。
本発明に使用するための突然変異株が増殖しう
る増殖用培地は、無機塩類水溶液と適当な炭素源
を含む。炭素源は、例えば酢酸、グルコースまた
はエタノールである。炭素源の濃度は広範囲に変
りうるが、一般的には１〜５％（ｗ／ｖ）であ
る。酸素または酸素含有気体を増殖期間中に存在
させなければならない。増殖期間中の培地の温度
は可成り変動しうるが、通常は25〜35℃の範囲で
ある。培地のPHは、増殖中に5.5〜8.0の範囲、好
ましくは6.5〜7.5に維持する。培養の規模は、可
成り、例えば1.5〜500の範囲で変えうる。
る増殖用培地は、無機塩類水溶液と適当な炭素源
を含む。炭素源は、例えば酢酸、グルコースまた
はエタノールである。炭素源の濃度は広範囲に変
りうるが、一般的には１〜５％（ｗ／ｖ）であ
る。酸素または酸素含有気体を増殖期間中に存在
させなければならない。増殖期間中の培地の温度
は可成り変動しうるが、通常は25〜35℃の範囲で
ある。培地のPHは、増殖中に5.5〜8.0の範囲、好
ましくは6.5〜7.5に維持する。培養の規模は、可
成り、例えば1.5〜500の範囲で変えうる。
増殖期の次に、細胞を本発明方法において用い
る。細胞は例えば遠心分離または凝集法によつて
回収してもよく、あるいは回収せずに本発明方法
に直接使用することもできる。細胞を回収する場
合は、回収細胞を、著しくは細胞の増殖を支持し
ない無機塩類溶液〔例えば燐酸塩緩衝液もしくは
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液〕または慣用増殖用培地から１種またはそれ以
上の必須成分をほとんど除いた培地中に再懸濁す
る。典型的には再懸濁細胞の濃度は１当り１〜
30ｇ（乾燥重量）である。細胞は20〜40℃の温度
に保ち、PHは7.5〜8.5に維持する。酸素または酸
素含有気体は、細胞懸濁液に対して、酸素張力が
飽和の１％以上に保たれるように供給する。適当
なエネルギー源を、好ましくは連続的に、細胞懸
濁液に供給して、エネルギー源の濃度が適当な濃
度、例えば0.05〜0.5％（ｗ／ｖ）に維持される
ようにする。適当なエネルギー源の例としては、
就中、アルコール類（例：エタノール）、カルボ
ン酸類（例：酢酸）および炭水化物類（例：グリ
コース）がある。好ましくは、エネルギー源はエ
タノールまたは酢酸である。
る。細胞は例えば遠心分離または凝集法によつて
回収してもよく、あるいは回収せずに本発明方法
に直接使用することもできる。細胞を回収する場
合は、回収細胞を、著しくは細胞の増殖を支持し
ない無機塩類溶液〔例えば燐酸塩緩衝液もしくは
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝
液〕または慣用増殖用培地から１種またはそれ以
上の必須成分をほとんど除いた培地中に再懸濁す
る。典型的には再懸濁細胞の濃度は１当り１〜
30ｇ（乾燥重量）である。細胞は20〜40℃の温度
に保ち、PHは7.5〜8.5に維持する。酸素または酸
素含有気体は、細胞懸濁液に対して、酸素張力が
飽和の１％以上に保たれるように供給する。適当
なエネルギー源を、好ましくは連続的に、細胞懸
濁液に供給して、エネルギー源の濃度が適当な濃
度、例えば0.05〜0.5％（ｗ／ｖ）に維持される
ようにする。適当なエネルギー源の例としては、
就中、アルコール類（例：エタノール）、カルボ
ン酸類（例：酢酸）および炭水化物類（例：グリ
コース）がある。好ましくは、エネルギー源はエ
タノールまたは酢酸である。
芳香族炭化水素、例えばベンゼン、クロルベン
ゼン、トルエンは、酸素流または酸素含有気体流
中の蒸気として細胞懸濁液へ加えることができる
が、好ましくは、それが液体であるときには、液
体のままで加える。
ゼン、トルエンは、酸素流または酸素含有気体流
中の蒸気として細胞懸濁液へ加えることができる
が、好ましくは、それが液体であるときには、液
体のままで加える。
本発明方法における突然変異株の培養液に対す
る芳香族炭化水素の添加速度（割合）は、典型的
には、乾燥細胞重量１ｇ当り毎時約0.5〜10ｇで
ある。エネルギー源の添加速度は反応工程の期間
中に変りうるが、典型的には乾燥細胞重量１ｇ当
り毎時0.1〜2.0ｇである。細胞懸濁液の生産性か
ら見た寿命は、典型的には５〜50時間である。こ
の期間の後に細胞を遠心分離および／または凝集
によつて除去する。その上澄液に新しい細胞を加
え、工程を繰返すことができる。本発明方法の工
程の終了時に上澄液は典型的には１当り10〜50
ｇのシスー１，２−ジヒドロキシ−シクロヒキサ
−３，５−ジエンまたはその同族体もしくは類似
体（ホモローグもしくはアナローグ）を含む。
る芳香族炭化水素の添加速度（割合）は、典型的
には、乾燥細胞重量１ｇ当り毎時約0.5〜10ｇで
ある。エネルギー源の添加速度は反応工程の期間
中に変りうるが、典型的には乾燥細胞重量１ｇ当
り毎時0.1〜2.0ｇである。細胞懸濁液の生産性か
ら見た寿命は、典型的には５〜50時間である。こ
の期間の後に細胞を遠心分離および／または凝集
によつて除去する。その上澄液に新しい細胞を加
え、工程を繰返すことができる。本発明方法の工
程の終了時に上澄液は典型的には１当り10〜50
ｇのシスー１，２−ジヒドロキシ−シクロヒキサ
−３，５−ジエンまたはその同族体もしくは類似
体（ホモローグもしくはアナローグ）を含む。
本発明方法の環式ジヒドロキシ生成物は、適当
な極性溶剤を用いての溶剤抽出により水性反応混
合物から抽出するのが好ましい。使用しうる極性
溶剤の例としては、就中、酢酸エチル、ジエチル
エーテルおよび塩化メチレンがある。連続抽出法
を用いるのがさらに好ましい。しかし、例えば細
胞の分離後の水性培地を蒸発させ、その残渣を適
当な溶剤（例：メタノール、エタノールまたは塩
化メチレン）に溶解することによる方法の可能性
は本発明から排除されない。
な極性溶剤を用いての溶剤抽出により水性反応混
合物から抽出するのが好ましい。使用しうる極性
溶剤の例としては、就中、酢酸エチル、ジエチル
エーテルおよび塩化メチレンがある。連続抽出法
を用いるのがさらに好ましい。しかし、例えば細
胞の分離後の水性培地を蒸発させ、その残渣を適
当な溶剤（例：メタノール、エタノールまたは塩
化メチレン）に溶解することによる方法の可能性
は本発明から排除されない。
本発明の別の態様によれば、
一般式
（ここにＸおよびＹは、同一であるか相異なつて
いてよく、水素、ハロゲン、アリール（例：フエ
ニル）またはシアノ基を表わすが、ＸおよびＹの
両者が同時に水素であることはない） の化合物も提供される。
いてよく、水素、ハロゲン、アリール（例：フエ
ニル）またはシアノ基を表わすが、ＸおよびＹの
両者が同時に水素であることはない） の化合物も提供される。
好ましくはＹは水素、Ｘは塩素、臭素または弗
素、そして両ヒドロキシ基は相互にシス関係であ
る。
素、そして両ヒドロキシ基は相互にシス関係であ
る。
本発明方法により製造されるジヒドロキシ化合
物は、その誘導体、例えばアセテート、ベンゾエ
ート、ピバレート、カーボネートに変えることが
でき、そしてこのような誘導体はその重合体また
は共重合体に変えることができる。この点につい
ては我々の英国特許出願第8130114号明細書に一
層詳しく記載されている。
物は、その誘導体、例えばアセテート、ベンゾエ
ート、ピバレート、カーボネートに変えることが
でき、そしてこのような誘導体はその重合体また
は共重合体に変えることができる。この点につい
ては我々の英国特許出願第8130114号明細書に一
層詳しく記載されている。
本発明の種々の態様を以下の例示のための実施
例により説明する。
例により説明する。
増殖培地として下記組成のものＡ−Ｇを用い
た。
た。
培地Ａ
濃燐酸（0.7ｇ／）、MgSO4・7H2O（1.6ｇ／
）、K2PO4・3H2O（0.9ｇ／）、硫酸アンモニ
ウム（1.5ｇ／）、硫酸第一鉄（0.025ｇ／）、
CuSO4・5H2O（0.001ｇ／）、MnSO4・4H2O
（0.005ｇ／）、ZnSO4・7H2O（0.005ｇ／）、お
よび炭酸カルシウム（0.065ｇ／）； PHは水酸化ナトリウムで７に調節。
）、K2PO4・3H2O（0.9ｇ／）、硫酸アンモニ
ウム（1.5ｇ／）、硫酸第一鉄（0.025ｇ／）、
CuSO4・5H2O（0.001ｇ／）、MnSO4・4H2O
（0.005ｇ／）、ZnSO4・7H2O（0.005ｇ／）、お
よび炭酸カルシウム（0.065ｇ／）； PHは水酸化ナトリウムで７に調節。
培地Ｂ
培地Ａに１％（ｗ／ｖ）のピバリン酸および
0.5％ｗ／ｖの酢酸を加えたもの。
0.5％ｗ／ｖの酢酸を加えたもの。
培地Ｃ
培地Ａから硫酸アンモニウムを除いたもの。
培地Ｄ
培地Ａに１％（ｗ／ｖ）のピバリン酸を加えた
もの。
もの。
培地Ｅ
濃燐酸（2.2ｇ／）、MgSO4・7H2O（0.8ｇ／
）、K2SO4（0.45ｇ／）、（NH4）2SO4（５ｇ／
）、FeSO4・7H2O（0.04ｇ／）、CuSO4・
5H2O（１mg／）、MnSO4・4H2O（５mg／）、
CaCO3（65mg／）およびグルコース（15ｇ／
）；PHは水酸化ナトリウム溶液で7.5に調節。
）、K2SO4（0.45ｇ／）、（NH4）2SO4（５ｇ／
）、FeSO4・7H2O（0.04ｇ／）、CuSO4・
5H2O（１mg／）、MnSO4・4H2O（５mg／）、
CaCO3（65mg／）およびグルコース（15ｇ／
）；PHは水酸化ナトリウム溶液で7.5に調節。
培地Ｆ
バウシヨツプ・エルスドン培地（Bauschop／
Elsdon）、（「ジヤーナル・オブ・ゼネラル・マイ
クロバイオロジイ」、1960、Vol.23、p457−469
参照）。
Elsdon）、（「ジヤーナル・オブ・ゼネラル・マイ
クロバイオロジイ」、1960、Vol.23、p457−469
参照）。
培地Ｇ
ルリア（Luria）液体培地、J.H.ミラー著「エ
クスペリメンツ・イン・モレキユラー・ジエネテ
イクス」（1972年ニユー・ヨーク；コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリイス発行）参
照。
クスペリメンツ・イン・モレキユラー・ジエネテ
イクス」（1972年ニユー・ヨーク；コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリイス発行）参
照。
本発明に使用するためのシユードモナス・プチダ
（NCIB寄託菌）の突然変異株の調製 シユードモナス・プチダ（NCIB寄託第11680
号）を、炭素源として0.2％（ｗ／ｖ）の酢酸ナ
トリウムを含む無機塩類培地中で対数増殖期の初
期まで増殖させた。細胞を遠心分離で回収し、20
mlの25mMクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液
（PH5.5、１mgのＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン含有）中に、１当り細腕0.2
ｇ（乾燥重量）の濃度で再懸濁させた。懸濁液を
30℃でで40分間温置培養し、次いで細胞を遠心分
離で回収し、25mlのクエン酸塩緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄した。細胞を0.2％（ｗ／ｖ）酢酸ナ
トリウム含有無機塩類培地中で一晩増殖させ、連
続希釈後に0.4mM酢酸ナトリウム無機塩類寒天
平板に接種した。平板（100枚）をペイント缶
（2.5容）中で温置培養した。各ペイント缶はト
ルエン10％ｗ／ｗと水の混合物10mlを入れたバイ
アル（びん）を入れてあつた。30℃で３日の培養
後、30群の見込みのある突然変異株（すなわち
0.5mmより小さい直径のコロニイ）を拾い上げ、
0.2％（ｗ／ｖ）ピバリン酸ナトリウム含有無機
塩類寒天平板上で再び増殖させた。
（NCIB寄託菌）の突然変異株の調製 シユードモナス・プチダ（NCIB寄託第11680
号）を、炭素源として0.2％（ｗ／ｖ）の酢酸ナ
トリウムを含む無機塩類培地中で対数増殖期の初
期まで増殖させた。細胞を遠心分離で回収し、20
mlの25mMクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液
（PH5.5、１mgのＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン含有）中に、１当り細腕0.2
ｇ（乾燥重量）の濃度で再懸濁させた。懸濁液を
30℃でで40分間温置培養し、次いで細胞を遠心分
離で回収し、25mlのクエン酸塩緩衝液（PH5.5）
で３回洗浄した。細胞を0.2％（ｗ／ｖ）酢酸ナ
トリウム含有無機塩類培地中で一晩増殖させ、連
続希釈後に0.4mM酢酸ナトリウム無機塩類寒天
平板に接種した。平板（100枚）をペイント缶
（2.5容）中で温置培養した。各ペイント缶はト
ルエン10％ｗ／ｗと水の混合物10mlを入れたバイ
アル（びん）を入れてあつた。30℃で３日の培養
後、30群の見込みのある突然変異株（すなわち
0.5mmより小さい直径のコロニイ）を拾い上げ、
0.2％（ｗ／ｖ）ピバリン酸ナトリウム含有無機
塩類寒天平板上で再び増殖させた。
各突然変異液は、キブソン、ヘンスリイ、ヨシ
ダおよびマブリイ等によつて「バイオケミストリ
イ」（1970年）、Vol、９、p1626〜1630に記載さ
れた操作によつて、50mlの0.2％（ｗ／ｖ）ピバ
リン酸ナトリウム含有無機塩類溶液を入れた250
mlエルレンマイヤーフラスコ（30℃の水溶中で振
とう）で、トルエンを気相で供給しつつ増殖させ
た。20時間の増殖後に１mlのサンプルを遠心分離
して、その透明な上澄液のUVスペクトルを300
〜220nｍの間で試験した。二つの突然変異株が
265nｍにおいて72および65の最大吸光度をもつ
化合物を含む上澄液を与えた。72の最大吸光度を
有する突然変異株を以下では便宜的に「突然変異
株Ａ」と称する。
ダおよびマブリイ等によつて「バイオケミストリ
イ」（1970年）、Vol、９、p1626〜1630に記載さ
れた操作によつて、50mlの0.2％（ｗ／ｖ）ピバ
リン酸ナトリウム含有無機塩類溶液を入れた250
mlエルレンマイヤーフラスコ（30℃の水溶中で振
とう）で、トルエンを気相で供給しつつ増殖させ
た。20時間の増殖後に１mlのサンプルを遠心分離
して、その透明な上澄液のUVスペクトルを300
〜220nｍの間で試験した。二つの突然変異株が
265nｍにおいて72および65の最大吸光度をもつ
化合物を含む上澄液を与えた。72の最大吸光度を
有する突然変異株を以下では便宜的に「突然変異
株Ａ」と称する。
本発明に使用するためのシユードモナス・プチダ
NCIB寄託第11767号微生物の突然変異株の調製 シユードモナス・プチダNCIB寄託第11767号
を培地Ｇ中で指数増殖期の初期まで増殖させた。
細胞を遠心分離で回収し、20mlの25ｍＭクエン酸
−クエン酸ナトリウム緩衝液〔PH5.5、１mgのＮ
−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン（NTG）含有〕中に１当り細胞0.2ｇ（乾燥
重量）の濃度で再懸濁した。30℃で45分後に細胞
を遠心分離で回収し、培地Ｆで２回洗浄し、次い
で0.3％（ｗ／ｖ）のピバリン酸ナトリウムを含
む培地Ｆ中で30℃において一晩増殖させた。連続
希釈後、0.3ｍＭのピバリン酸ナトリウムを含む
培地Ｆ寒天平板に接種して、１容ペイント缶中
で培養した。ペイント缶中にはバイアル中に入れ
た0.5mlのベンゼンが含まれていた。30℃で３日
後、144群の見込みのある突然変異株（すなわち
0.5mmより小さい直径のコロニイ）を拾い上げ、
0.2％ｗ／ｖピバリン酸ナトリウム含有培地Ｆ寒
天で再び増殖させた。
NCIB寄託第11767号微生物の突然変異株の調製 シユードモナス・プチダNCIB寄託第11767号
を培地Ｇ中で指数増殖期の初期まで増殖させた。
細胞を遠心分離で回収し、20mlの25ｍＭクエン酸
−クエン酸ナトリウム緩衝液〔PH5.5、１mgのＮ
−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン（NTG）含有〕中に１当り細胞0.2ｇ（乾燥
重量）の濃度で再懸濁した。30℃で45分後に細胞
を遠心分離で回収し、培地Ｆで２回洗浄し、次い
で0.3％（ｗ／ｖ）のピバリン酸ナトリウムを含
む培地Ｆ中で30℃において一晩増殖させた。連続
希釈後、0.3ｍＭのピバリン酸ナトリウムを含む
培地Ｆ寒天平板に接種して、１容ペイント缶中
で培養した。ペイント缶中にはバイアル中に入れ
た0.5mlのベンゼンが含まれていた。30℃で３日
後、144群の見込みのある突然変異株（すなわち
0.5mmより小さい直径のコロニイ）を拾い上げ、
0.2％ｗ／ｖピバリン酸ナトリウム含有培地Ｆ寒
天で再び増殖させた。
これらの突然変異株のうちの90を、上記のよう
に260nｍにおいて吸光する化合物をベンゼンか
ら産生するか否かでスクリーニングした。260n
ｍにおいて37の最大吸光度をもつ上澄液を与えた
１つの突然変異株を以下では便宜的に「突然変異
株Ｂ」と称する。
に260nｍにおいて吸光する化合物をベンゼンか
ら産生するか否かでスクリーニングした。260n
ｍにおいて37の最大吸光度をもつ上澄液を与えた
１つの突然変異株を以下では便宜的に「突然変異
株Ｂ」と称する。
突然変異株Ｂからの構成性株の調製
突然変異のために用いた操作は、前記と同じで
あつた。NTGで処理後、洗浄し、希釈した細胞
を培地Ｆ寒天平板（10ｍＭのピバリン酸ナトリウ
ム含有）に接種した。30℃で２日後、コロニイ
0.5Mカテコール水溶液を噴霧した。５分後に
黄／緑に変色したコロニイを選択した。スクリー
ニングした合計1.8×105個のコロニイから35の
黄／緑コロニイを選択した。これらをそれぞれ
を、16mlの培地Ｆ〔0.3％（ｗ／ｖ）のピバリン酸
ナトリウム含有〕中で一晩増殖させた。細胞を回
収し、10mlの25ｍＭ燐酸カリウム緩衝液〔PH7.5、
0.4％（ｖ／ｖ）のエタノール含有〕中に再懸濁
した。これらの培養液を前述のようにそれぞれ
0.5mlのトルエンの存在下に250mlコニカルフラス
コ中で一晩培養した。次いで上澄液を260nｍで
の吸光化合物の有無について試験した。265nｍ
において250の吸光度を与える一つの構成性突然
変異株を選択した。これを以下では便宜的に「突
然変異株Ｃ」と称する。
あつた。NTGで処理後、洗浄し、希釈した細胞
を培地Ｆ寒天平板（10ｍＭのピバリン酸ナトリウ
ム含有）に接種した。30℃で２日後、コロニイ
0.5Mカテコール水溶液を噴霧した。５分後に
黄／緑に変色したコロニイを選択した。スクリー
ニングした合計1.8×105個のコロニイから35の
黄／緑コロニイを選択した。これらをそれぞれ
を、16mlの培地Ｆ〔0.3％（ｗ／ｖ）のピバリン酸
ナトリウム含有〕中で一晩増殖させた。細胞を回
収し、10mlの25ｍＭ燐酸カリウム緩衝液〔PH7.5、
0.4％（ｖ／ｖ）のエタノール含有〕中に再懸濁
した。これらの培養液を前述のようにそれぞれ
0.5mlのトルエンの存在下に250mlコニカルフラス
コ中で一晩培養した。次いで上澄液を260nｍで
の吸光化合物の有無について試験した。265nｍ
において250の吸光度を与える一つの構成性突然
変異株を選択した。これを以下では便宜的に「突
然変異株Ｃ」と称する。
突然変異株Ｃを20mlの培地Ｇ中で30℃において
指数増殖期の初期まで増殖させ、回数後細胞を
0.1MのMgSO4・7H2O溶液40ml中に再懸濁した。
その５mlの部分をガラス製ペトリ皿中で45秒間
1.6μW／cm2×100の線量でUV照射した。次いで細
胞を20mlの培地Ｆ（10ｍＭのピバリン酸ナトリウ
ム含有）中において暗所で増殖させた（複数のロ
ツト）。
指数増殖期の初期まで増殖させ、回数後細胞を
0.1MのMgSO4・7H2O溶液40ml中に再懸濁した。
その５mlの部分をガラス製ペトリ皿中で45秒間
1.6μW／cm2×100の線量でUV照射した。次いで細
胞を20mlの培地Ｆ（10ｍＭのピバリン酸ナトリウ
ム含有）中において暗所で増殖させた（複数のロ
ツト）。
30℃で２日後、それらの培養液を連続希釈し
て、培地Ｆに75ｍＭのグルコースおよび１％
（ｗ／ｖ）のビタミン不含有カサミノ酸（米国ミ
シガン州デトロイトDifco製）を加えたものを接
種し、30℃でさらに２日間培養した。次いでコロ
ニイに対して前記のようにカテコール液を噴霧
し、黄／緑色コロニイを選択した。スクリーニン
グした合計４×104個のコロニイから10個のコロ
ニイを選択し、10mlの培地Ｆに７ｍＭのグルコー
スおよび１％（ｗ／ｖ）のカサミノ酸を加えた培
地中で30℃において一晩増殖させた。細胞を回収
し、前記のようにエタノールを加えた燐酸塩緩衝
液中に再懸濁し、前記のように0.5mlのトルエン
の存在下に70℃で照射した。異化物質抑制により
突然変異株Ｃよりも影響を受けなかつた一つの構
成性突然変異株を選択した。このものは265nｍ
において61.2の吸光度を与えた。この突然変異を
以下では便宜的に「突然変異株Ｄ」と称する。
て、培地Ｆに75ｍＭのグルコースおよび１％
（ｗ／ｖ）のビタミン不含有カサミノ酸（米国ミ
シガン州デトロイトDifco製）を加えたものを接
種し、30℃でさらに２日間培養した。次いでコロ
ニイに対して前記のようにカテコール液を噴霧
し、黄／緑色コロニイを選択した。スクリーニン
グした合計４×104個のコロニイから10個のコロ
ニイを選択し、10mlの培地Ｆに７ｍＭのグルコー
スおよび１％（ｗ／ｖ）のカサミノ酸を加えた培
地中で30℃において一晩増殖させた。細胞を回収
し、前記のようにエタノールを加えた燐酸塩緩衝
液中に再懸濁し、前記のように0.5mlのトルエン
の存在下に70℃で照射した。異化物質抑制により
突然変異株Ｃよりも影響を受けなかつた一つの構
成性突然変異株を選択した。このものは265nｍ
において61.2の吸光度を与えた。この突然変異を
以下では便宜的に「突然変異株Ｄ」と称する。
実施例 １
この実施例は本発明方法によるシス−１，２−
ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの
製造を例示する。
ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの
製造を例示する。
撹拌された培養器中の40の培地Ｂに、突然変
異株Ａを接種して、培地１当り細胞約0.2ｇ
（乾燥重量）の初期細胞密度とした。８時間の増
殖の後、別量の培地Ｂを４時間にわたり２／時
の割合で培養液に添加した。次いでトルエンを
16.5ｇ／時の割合で10.5時間にわたり培養液に添
加した。次いで１当り細胞5.5ｇ（乾燥重量）
の細胞密度において細胞を回収した。
異株Ａを接種して、培地１当り細胞約0.2ｇ
（乾燥重量）の初期細胞密度とした。８時間の増
殖の後、別量の培地Ｂを４時間にわたり２／時
の割合で培養液に添加した。次いでトルエンを
16.5ｇ／時の割合で10.5時間にわたり培養液に添
加した。次いで１当り細胞5.5ｇ（乾燥重量）
の細胞密度において細胞を回収した。
その細胞の一部を５の培地Ｃ中に再懸濁し
て、１当り細胞25ｇ（乾燥重量）の細胞密度と
した。エタノールをその細胞懸濁液に対して６
ｇ／時の割合で連続的に添加した。ベンゼンを20
ｇ／時の割合で空気流中の蒸気の状態で細胞懸濁
液に添加した。温度を30℃に、そしてPHを7.5に
維持した。空気をその撹拌細胞懸濁液に対して
1.5／分の割合で加えた。18時間後、実験を終
了したが、その時の上澄液中のシス−１，２−ジ
ヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの濃
度は13ｇ／であつた。この上澄液を60℃で回転
蒸発法により容積１に濃縮した。蒸気環式ジヒ
ドロキシ化合物を24時間にわたつて500mlの塩化
メチルで連続的に抽出した。この塩化メチル溶液
を30℃で回転蒸発法により濃縮した。この濃縮液
にペンタンを添加して結晶（30ｇ）を得た。この
結晶は融点、nmr.質量スペクトル分析およびUV
分光分析により、シス−１，２−ジヒドロキシ−
シクロヘキサ−３，５−ジエンであることが判明
した。
て、１当り細胞25ｇ（乾燥重量）の細胞密度と
した。エタノールをその細胞懸濁液に対して６
ｇ／時の割合で連続的に添加した。ベンゼンを20
ｇ／時の割合で空気流中の蒸気の状態で細胞懸濁
液に添加した。温度を30℃に、そしてPHを7.5に
維持した。空気をその撹拌細胞懸濁液に対して
1.5／分の割合で加えた。18時間後、実験を終
了したが、その時の上澄液中のシス−１，２−ジ
ヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの濃
度は13ｇ／であつた。この上澄液を60℃で回転
蒸発法により容積１に濃縮した。蒸気環式ジヒ
ドロキシ化合物を24時間にわたつて500mlの塩化
メチルで連続的に抽出した。この塩化メチル溶液
を30℃で回転蒸発法により濃縮した。この濃縮液
にペンタンを添加して結晶（30ｇ）を得た。この
結晶は融点、nmr.質量スペクトル分析およびUV
分光分析により、シス−１，２−ジヒドロキシ−
シクロヘキサ−３，５−ジエンであることが判明
した。
実施例 ２
実施例１の操作を繰返したが、本例では細胞を
培地Ｃ中に再懸濁した後にエタノールを0.3％
ｗ／ｖの濃度までそれに添加し、そしてベンゼン
およびエタノールは別々に添加せずに混合物
（70：30）の形で23ｇ（混合物）／時の割合で添
加した。
培地Ｃ中に再懸濁した後にエタノールを0.3％
ｗ／ｖの濃度までそれに添加し、そしてベンゼン
およびエタノールは別々に添加せずに混合物
（70：30）の形で23ｇ（混合物）／時の割合で添
加した。
実施例 ３
この実施例は本発明方法によるシス−１，２−
ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの
製造を例示する。
ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの
製造を例示する。
１％（ｗ／ｖ）のピバリン酸を炭素源として培
地Ａ中でバツチ培養物の形で突然変異株Ａを増殖
させた。１当り細胞１ｇ（乾燥重量）の細胞密
度の時点において（すなわち、４時間の増殖後）
トルエンを空気流中に混合して培養液に加え（ト
ルエンの添加割合は３ｇ／時）、そして培養をさ
らに16時間継続した。細胞は１当り1.5ｇの乾
燥重量の時点において回収した。
地Ａ中でバツチ培養物の形で突然変異株Ａを増殖
させた。１当り細胞１ｇ（乾燥重量）の細胞密
度の時点において（すなわち、４時間の増殖後）
トルエンを空気流中に混合して培養液に加え（ト
ルエンの添加割合は３ｇ／時）、そして培養をさ
らに16時間継続した。細胞は１当り1.5ｇの乾
燥重量の時点において回収した。
回収細胞を３の培地Ｃに再懸濁して、１当
り細胞10ｇ（乾燥重量）の細胞密度とした。エタ
ノール（15ｇ）をその細胞懸濁液に添加した。ク
ロルベンゼンを空気流（1.2／分）中の蒸気と
してその細胞懸濁液に対し４ｇ／時の割合で添加
した。懸濁液のPHを7.5に、そして温度を30℃に
維持した。24時間後に細胞を除去し、そして反応
混合物を源圧下に60℃で回転蒸発法により約400
mlの容積まで濃縮した。この濃縮液を16時間にわ
たりゲーテル（250ml）で連続的に抽出し、その
エーテル溶液の一部分を過したもの（50ml）か
ら溶剤を蒸発させて粗固形物（1.92ｇ）を得て、
これをトルエン／ペンタンから再結晶して、シス
−１，２−ジヒドロキシ−クロロ−シクロヘキサ
−３，５−ジエンを無色の結晶（1.70ｇ）として
得た。このものは融点95〜96℃であり、29℃にお
ける重水素クロロホルム中でのプロトン磁気共鳴
スペクトル（100Hz）は、δ2.5（2H、単、溶液を
D2Oと共に振とうすると消失）、δ4.2（1H、J1,26.4
Hz、J1,611.4Hz、Ｈ−１）、δ4.5（1H、二重、J2,1
6.4HzＨ−２）、δ5.8〜6.2（3H、多重、Ｈ−４、Ｈ
−５およびＨ−６）において信号を与え、赤外線
スペクトル（KBrデイスク）は3280、1640、
1580、1380、1340、1310、1280、1170、1090、
1040、1000、990、930、880、835、795、670、
590および390cm-1においてそれぞれピークを示し
た。
り細胞10ｇ（乾燥重量）の細胞密度とした。エタ
ノール（15ｇ）をその細胞懸濁液に添加した。ク
ロルベンゼンを空気流（1.2／分）中の蒸気と
してその細胞懸濁液に対し４ｇ／時の割合で添加
した。懸濁液のPHを7.5に、そして温度を30℃に
維持した。24時間後に細胞を除去し、そして反応
混合物を源圧下に60℃で回転蒸発法により約400
mlの容積まで濃縮した。この濃縮液を16時間にわ
たりゲーテル（250ml）で連続的に抽出し、その
エーテル溶液の一部分を過したもの（50ml）か
ら溶剤を蒸発させて粗固形物（1.92ｇ）を得て、
これをトルエン／ペンタンから再結晶して、シス
−１，２−ジヒドロキシ−クロロ−シクロヘキサ
−３，５−ジエンを無色の結晶（1.70ｇ）として
得た。このものは融点95〜96℃であり、29℃にお
ける重水素クロロホルム中でのプロトン磁気共鳴
スペクトル（100Hz）は、δ2.5（2H、単、溶液を
D2Oと共に振とうすると消失）、δ4.2（1H、J1,26.4
Hz、J1,611.4Hz、Ｈ−１）、δ4.5（1H、二重、J2,1
6.4HzＨ−２）、δ5.8〜6.2（3H、多重、Ｈ−４、Ｈ
−５およびＨ−６）において信号を与え、赤外線
スペクトル（KBrデイスク）は3280、1640、
1580、1380、1340、1310、1280、1170、1090、
1040、1000、990、930、880、835、795、670、
590および390cm-1においてそれぞれピークを示し
た。
実施例 ４
この実施例は、本発明方法によるシス−１，２
−ジヒドロキシ−３−メチル−シクロヘキサ−
３，５−ジエンの製造を例示する。
−ジヒドロキシ−３−メチル−シクロヘキサ−
３，５−ジエンの製造を例示する。
実施例３の操作を繰返したが、本例ではクロロ
ベンゼンの代りにトルエンを用いた。
ベンゼンの代りにトルエンを用いた。
培養液中のシス−１，２−ジヒドロキシ−３−
メチル−シクロヘキサ−３，５−ジエンの濃度
は、16ｇ／であつた。これをジエチルエーテル
で連続的に抽出した。抽出エーテル溶液にペンテ
ンを添加して28ｇの結晶を得た。これは融点、
nmr、irおよび質量スペクトル分析によつてシス
−１，２−ジヒドロキシ−３−メチル−シクロヘ
キサ−３，５−ジエンであることが示された。
メチル−シクロヘキサ−３，５−ジエンの濃度
は、16ｇ／であつた。これをジエチルエーテル
で連続的に抽出した。抽出エーテル溶液にペンテ
ンを添加して28ｇの結晶を得た。これは融点、
nmr、irおよび質量スペクトル分析によつてシス
−１，２−ジヒドロキシ−３−メチル−シクロヘ
キサ−３，５−ジエンであることが示された。
実施例 ５
この実施例は本発明方法における構成性酵素の
使用を例示する。
使用を例示する。
突然変異株Ｄを20の培地Ｅに接種して１当
り0.2ｇ（乾燥重量）の初期細胞密度とした。温
度を30℃にPHを7.2に維持した。培養槽は500rpm
で撹拌し、空気を６／分の割合で供給した。16
時間後、細胞４ｇ（乾燥重量）／の細胞密度に
おいて、遠心分離により細胞を回収した。
り0.2ｇ（乾燥重量）の初期細胞密度とした。温
度を30℃にPHを7.2に維持した。培養槽は500rpm
で撹拌し、空気を６／分の割合で供給した。16
時間後、細胞４ｇ（乾燥重量）／の細胞密度に
おいて、遠心分離により細胞を回収した。
回収細胞の一部分を、３の25ｍＭ燐酸カリウ
ム緩衝液（PH7.6、１ｇのFeSO4・7H2Oおよび12
mlのエタノールを含有）中に再懸濁した。その細
胞密度は９ｇ（乾燥重量）／であつた。温度を
30℃に維持し、PHを水酸化ナトリウム溶液で7.6
に維持した。空気・酸素混合物を1.0／分で供
給して、飽和の10％に当る酸素張力を与えた。反
応器は1400rpmで撹拌した。ベンゼンを液状で20
ｇ／時の割合で反応器に添加し、さらに18mlのエ
タノールを３等分量で２時間の間隔で添加した。
７時間後、遠心分離により細胞を除去し、３の
上澄液を得た。この液は１当り29ｇのシス−
１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−
ジエンを含んでいた。
ム緩衝液（PH7.6、１ｇのFeSO4・7H2Oおよび12
mlのエタノールを含有）中に再懸濁した。その細
胞密度は９ｇ（乾燥重量）／であつた。温度を
30℃に維持し、PHを水酸化ナトリウム溶液で7.6
に維持した。空気・酸素混合物を1.0／分で供
給して、飽和の10％に当る酸素張力を与えた。反
応器は1400rpmで撹拌した。ベンゼンを液状で20
ｇ／時の割合で反応器に添加し、さらに18mlのエ
タノールを３等分量で２時間の間隔で添加した。
７時間後、遠心分離により細胞を除去し、３の
上澄液を得た。この液は１当り29ｇのシス−
１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−
ジエンを含んでいた。
実施例 ６
この実施例は本発明方法により高濃度のシス−
１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−
ジエンを製造するための構成性突然変異株の使用
を例示する。
１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−
ジエンを製造するための構成性突然変異株の使用
を例示する。
突然変異株Ｃを培地Ｄ中で30℃６およびPH7.0
において20のバツチ培養物として16時間増殖さ
せた。空気を１／分の割合で供給し、反応混合
物を800rpmで撹拌し、そして温度を30℃に維持
した。ベンゼンを20時間にわたつて20ｇ／時の割
合で空気流中の蒸気の形で添加し、そして合計40
ｇのエタノールを少量づつ添加した。20時間後に
上澄液は24.6ｇ／の濃度で合計123ｇのシス−
１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−
ジエンを含んでいた。
において20のバツチ培養物として16時間増殖さ
せた。空気を１／分の割合で供給し、反応混合
物を800rpmで撹拌し、そして温度を30℃に維持
した。ベンゼンを20時間にわたつて20ｇ／時の割
合で空気流中の蒸気の形で添加し、そして合計40
ｇのエタノールを少量づつ添加した。20時間後に
上澄液は24.6ｇ／の濃度で合計123ｇのシス−
１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−
ジエンを含んでいた。
実施例 ７
突然変異株Ｄを、培地Ｅ中で30℃およびPH7.0
において20のバツチ培養物として16時間増殖さ
せた。回収後、細胞の一部分を、実施例６記載の
培地４中に再懸濁して５ｇ（乾燥重量）／の
細胞密度とした。ベンゼンを液状で12ｇ／時の割
合で、そしてエタノールを連続的に2.5ｇ／時の
割合で懸濁液に添加した。８時間後、細胞を除去
して、15ｇ／の濃度でシス−１，２−ジヒドロ
キシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンを含む上澄
液を得た。その濃度はこの化合物についての既知
の吸光係数に基き得たものである（ナカジマ等、
Chemische Berichte、1959、Vol.92、p163）。
において20のバツチ培養物として16時間増殖さ
せた。回収後、細胞の一部分を、実施例６記載の
培地４中に再懸濁して５ｇ（乾燥重量）／の
細胞密度とした。ベンゼンを液状で12ｇ／時の割
合で、そしてエタノールを連続的に2.5ｇ／時の
割合で懸濁液に添加した。８時間後、細胞を除去
して、15ｇ／の濃度でシス−１，２−ジヒドロ
キシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンを含む上澄
液を得た。その濃度はこの化合物についての既知
の吸光係数に基き得たものである（ナカジマ等、
Chemische Berichte、1959、Vol.92、p163）。
この上澄液に別量の細胞を添加して、１当り
細胞８ｇ（乾燥重量）の細胞密度とし、上記実験
を継続した。それから16時間後、上澄液は１当
り40ｇの濃度でシス−１，２−ジヒドロキシ−シ
クロヘキサ−３，５−ジエンを含んでいた。
細胞８ｇ（乾燥重量）の細胞密度とし、上記実験
を継続した。それから16時間後、上澄液は１当
り40ｇの濃度でシス−１，２−ジヒドロキシ−シ
クロヘキサ−３，５−ジエンを含んでいた。
実施例 ８
実施例６の操作を繰返したが、本例ではベンゼ
ンの代りにナフタレンを用いた。そのナフタレン
は実験の開始時に添加して1.5％（ｗ／ｖ）の濃
度とした。20ｇのシス−１，２−ジヒドコキシ−
１，２−ジヒドロナフタレンが得られた。
ンの代りにナフタレンを用いた。そのナフタレン
は実験の開始時に添加して1.5％（ｗ／ｖ）の濃
度とした。20ｇのシス−１，２−ジヒドコキシ−
１，２−ジヒドロナフタレンが得られた。
実施例 ９〜11
実施例７の操作を繰返したがベンゼンの代り
に、それぞれフルオロベンゼン、ベンジルアルコ
ールおよびビフエニルを別々に用いた。ビフエニ
ルは実験の開始時に添加して２％（ｗ／ｖ）の濃
度とした。
に、それぞれフルオロベンゼン、ベンジルアルコ
ールおよびビフエニルを別々に用いた。ビフエニ
ルは実験の開始時に添加して２％（ｗ／ｖ）の濃
度とした。
それぞれシス−１，２−ジヒドロキシ−３−フ
ルオロシクロヘキサ−３，５−ジエン、シス−
１，２−ジヒドロキシ−３−フエニルシクロヘキ
サ−３，５−ジエンおよびシス−１，２−ジヒド
ロキシ−３−ヒオロキシメチル−シクロヘキサ−
３，５−ジエンが得られた。
ルオロシクロヘキサ−３，５−ジエン、シス−
１，２−ジヒドロキシ−３−フエニルシクロヘキ
サ−３，５−ジエンおよびシス−１，２−ジヒド
ロキシ−３−ヒオロキシメチル−シクロヘキサ−
３，５−ジエンが得られた。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ (1)(a) ベンゼンまたはトルエンから環式ジヒ
ドロキシ化合物を産生するための酵素を含
み、 (b) ベンゼンおよびトルエンのいずれによつて
も増殖することができず、そして (c) ベンゼンまたはトルエンで増殖可能なシユー
ドモナス・プチダ菌株から誘導される、 突然変異株を、適当な炭素源を含む培地中で増
殖させ； (2) 増殖期の後に、その突然変異株の増殖を全く
またはほとんど支持しない培地中の突然変異株
に対して、芳香族化合物及びエネルギー源を供
給し；そして (3) その芳香族化合物を１，２−ジヒドロキシシ
クロヘキサ−３，５−ジエン環からなる化合物
へ転化せしめる、 工程からなる、１，２−ジヒドロキシシクロヘキ
サ−３，５−ジエン環からなる化合物の製法。 ２ シユードモナス・プチダはNCIB国際寄託第
11767号微生物である特許請求の範囲第１項に記
載の方法。 ３ 転化反応に触媒作用を与える酵素は構成性酵
素である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４ 突然変異株は異化物質抑制を受け易くない特
許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５ エネルギー源はエタノール、グルコースまた
は酢酸である特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 ６ 一般式 （ここにＸおよびＹは、同一であるか相異なり、
水素、ハロゲン、アリールまたはシアノ基を表わ
すが、ＸおよびＹの両者が同時に水素であること
はない。） の化合物。 ７ Ｙは水素であり、Ｘが弗素、塩素または臭素
である特許請求の範囲第６項に記載の化合物。 ８ 両OH基は相互にシス関係にある特許請求の
範囲第６項に記載の化合物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8130116 | 1981-10-06 | ||
| GB8130116 | 1981-10-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5871891A JPS5871891A (ja) | 1983-04-28 |
| JPH0542417B2 true JPH0542417B2 (ja) | 1993-06-28 |
Family
ID=10524977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57176024A Granted JPS5871891A (ja) | 1981-10-06 | 1982-10-06 | １，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエン環化合物およびその製法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0076606B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5871891A (ja) |
| AU (2) | AU562987B2 (ja) |
| CA (1) | CA1193991A (ja) |
| DE (1) | DE3268971D1 (ja) |
| DK (1) | DK164071C (ja) |
| ES (1) | ES516275A0 (ja) |
| GR (1) | GR76993B (ja) |
| IE (1) | IE53912B1 (ja) |
| IL (1) | IL67003A (ja) |
| NO (1) | NO160526C (ja) |
| NZ (1) | NZ202075A (ja) |
| ZA (1) | ZA827333B (ja) |
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| GB8614925D0 (en) * | 1986-06-19 | 1986-07-23 | Ici Plc | Cyclic dihydroxy compounds |
| ATE83798T1 (de) * | 1986-07-08 | 1993-01-15 | Shell Int Research | Pseudomonas-putida-staemme und ihre verwendung. |
| US4863861A (en) * | 1986-07-08 | 1989-09-05 | Shell Oil Company | Biochemical process to produce catechol or 1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene compound(s) |
| US4876200A (en) * | 1986-07-08 | 1989-10-24 | Shell Oil Company | New strains of pseudomonas putida |
| GB8616614D0 (en) * | 1986-07-08 | 1986-08-13 | Shell Int Research | Organofluorine compounds |
| ATE85040T1 (de) * | 1986-07-08 | 1993-02-15 | Shell Int Research | Organofluorverbindungen und ihr biochemisches herstellungsverfahren. |
| GB8627711D0 (en) * | 1986-11-20 | 1986-12-17 | Shell Int Research | Microbial preparation of catechols |
| GB8700462D0 (en) * | 1987-01-09 | 1987-02-11 | Shell Int Research | Alkene derivatives |
| JP2562139B2 (ja) * | 1987-03-30 | 1996-12-11 | 新技術事業団 | 微生物の培養法 |
| GB8708517D0 (en) * | 1987-04-09 | 1987-05-13 | Shell Int Research | Preparation of fluorophenols |
| GB8823977D0 (en) * | 1988-10-13 | 1988-11-23 | Ici Plc | Cyclic dihydroxy compounds |
| MX18021A (es) * | 1988-10-18 | 1993-11-01 | Pfizer | Pro-farmacos de la 3-acil-2-oxindol-1-carboxamidasanti-inflamatorias |
| GB8900854D0 (en) * | 1989-01-16 | 1989-03-08 | Ici Plc | Separation of a compound comprising a 1,2-dihydroxy-cyclohexa-3,5-diene ring |
| US4894337A (en) * | 1989-01-17 | 1990-01-16 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Process for the bioproduction of cyclic hydroxides |
| JPH07503234A (ja) * | 1991-10-31 | 1995-04-06 | バイオ−テクニカル・リソーシズ | ベンゾシクロブテンのシス−ジヒドロジオールおよびフェノール誘導体の微生物による生産 |
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| WO1995030764A1 (en) * | 1994-05-10 | 1995-11-16 | Bio-Technical Resources Lp | Formation of and dehydraton of hydroxylated diphenylacetylenes |
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| US5858737A (en) * | 1995-06-20 | 1999-01-12 | Merck & Co., Inc. | Conversion of indene to (1S)-amino-(2R)-indanol free of any stereoisomer, by combination of dioxygenase bioconversion and chemical steps |
| AU1133900A (en) | 1998-10-26 | 2000-07-12 | University Of Iowa Research Foundation, The | Novel naphthalene dioxygenase and methods for their use |
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- 1982-09-23 EP EP82305029A patent/EP0076606B1/en not_active Expired
- 1982-09-28 IE IE2345/82A patent/IE53912B1/en not_active IP Right Cessation
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-
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