JPS5871891A - １，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエン環化合物およびその製法 - Google Patents
１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエン環化合物およびその製法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生化学的な方法工程による環式ジヒドロキシ化
合物の製造、および特定の新規な環式ジヒｒロキシ化合
物に関する。
合物の製造、および特定の新規な環式ジヒｒロキシ化合
物に関する。
天然（野生）の状態ではある種の芳香族化合物を増殖の
ための炭素源として用い本ことができる（Ｂθｉｒｊθ
ｒｉｎｃｋｉａ）種の突然変異株に芳香族化合物を供給
することにより環式ジヒドロキシ化合物を製造すること
は、公知である。そのような微生物によって産生される
環式ジヒドロキシ化合物の濃度は低く、典型的には培養
液１Ｊ当り２９未満である。さらには、環式ジヒドロキ
シ化合物の産生のための酵素を、細胞の使用前に、細胞
を芳香族化合物に接することにより細胞中に誘導しなけ
ればならない。
ための炭素源として用い本ことができる（Ｂθｉｒｊθ
ｒｉｎｃｋｉａ）種の突然変異株に芳香族化合物を供給
することにより環式ジヒドロキシ化合物を製造すること
は、公知である。そのような微生物によって産生される
環式ジヒドロキシ化合物の濃度は低く、典型的には培養
液１Ｊ当り２９未満である。さらには、環式ジヒドロキ
シ化合物の産生のための酵素を、細胞の使用前に、細胞
を芳香族化合物に接することにより細胞中に誘導しなけ
ればならない。
ここに我々は、シュー９モ ス・プ
（ｐｕｔｉｄａ ）のある種の突然変異株の細胞に芳香
族化合物を供給すると、従来達成されたよりも一層高濃
度の環式＝）門ドロキシ化合物が得られること、一層広
範囲の芳香族化合物類を環式ジヒドロキシ化合物に転化
しうろこと、を発見した。前述の突然変異株によって産
生される環式ジヒドロキシ化合物は、環含有重合体の製
造における中間体として有用である（この事項について
は、出願中の英国特許出願第８１３０１１４号明細書に
一層詳しく記載されている）。
族化合物を供給すると、従来達成されたよりも一層高濃
度の環式＝）門ドロキシ化合物が得られること、一層広
範囲の芳香族化合物類を環式ジヒドロキシ化合物に転化
しうろこと、を発見した。前述の突然変異株によって産
生される環式ジヒドロキシ化合物は、環含有重合体の製
造における中間体として有用である（この事項について
は、出願中の英国特許出願第８１３０１１４号明細書に
一層詳しく記載されている）。
本発明に有用な突然変異株を作るための突然変異に適当
なシュードモナス・プチダの代表的な培養物は、英国ス
コツトランド、アバーディーン。
なシュードモナス・プチダの代表的な培養物は、英国ス
コツトランド、アバーディーン。
トーリイ・リサーチ・ステーションのザ・ナショナル・
コレクション・オノ・インダストリアル・バクテリア（
ＮＧＩＢ）に寄託され、ＮＧＩＢ第１１６８０号および
ＮＣＩＢ第１１７６７号の番号が与えられている。
コレクション・オノ・インダストリアル・バクテリア（
ＮＧＩＢ）に寄託され、ＮＧＩＢ第１１６８０号および
ＮＣＩＢ第１１７６７号の番号が与えられている。
我々はシュードモナス・プチダＮＣＩＢ第１１６８０号
およびシードモナス・プチダＮ０ＩＢ第１１７６７号の
それぞれの第１の突然変異株であって、もはや−？／ゼ
ンまたはトルエンで増殖することができず、またある種
の芳香族化合物から環式ジヒドロキシ化合物を産生ずる
突然変異株を調製した。我々は、またシュート９モナス
・プチダＮＣＩＢ第１１７６７号の第１の突然変異株か
らさらに別の（第２）の突然変異株も調製した。かかる
第２の突然変異株は、ある種の芳香族化合物を環式ジヒ
ドロキシ化合物へ転化する酵素について構成性である（
これを便宜的に以下では「構成性（突然変異）株」と称
することとする）。構成性株は、微生物による環式ジヒ
ト９０キシ化合物の産生が起こりうる前に酵素誘導工程
を必要としないという利点を与える。
およびシードモナス・プチダＮ０ＩＢ第１１７６７号の
それぞれの第１の突然変異株であって、もはや−？／ゼ
ンまたはトルエンで増殖することができず、またある種
の芳香族化合物から環式ジヒドロキシ化合物を産生ずる
突然変異株を調製した。我々は、またシュート９モナス
・プチダＮＣＩＢ第１１７６７号の第１の突然変異株か
らさらに別の（第２）の突然変異株も調製した。かかる
第２の突然変異株は、ある種の芳香族化合物を環式ジヒ
ドロキシ化合物へ転化する酵素について構成性である（
これを便宜的に以下では「構成性（突然変異）株」と称
することとする）。構成性株は、微生物による環式ジヒ
ト９０キシ化合物の産生が起こりうる前に酵素誘導工程
を必要としないという利点を与える。
従って、本発明は、シードモナス・プチダの突然変異株
の細胞の増殖をほとんどまたは全く支持しない培地中の
適当なシート０モナス・プチダ突然変異株に対して、適
当な芳香族または置換芳香族化合物および適当なエネル
ギー源を供給することからなる１、２−ジヒドロキシ−
シクロヘキサ−３゜５−ジエン環含有化合物の製法を提
供する。
の細胞の増殖をほとんどまたは全く支持しない培地中の
適当なシート０モナス・プチダ突然変異株に対して、適
当な芳香族または置換芳香族化合物および適当なエネル
ギー源を供給することからなる１、２−ジヒドロキシ−
シクロヘキサ−３゜５−ジエン環含有化合物の製法を提
供する。
本発明方法に使用される芳香族化合物は単環式であるの
が好ましいが１本発明において複数の環を有する芳香族
化合物、例えばす７タレンおよびビフェニルの使用する
可能性が排除されるものではない。
が好ましいが１本発明において複数の環を有する芳香族
化合物、例えばす７タレンおよびビフェニルの使用する
可能性が排除されるものではない。
本発明方法において置換芳香族化合物を用いる場合に、
そのような化合物は１またはそれ以上の置換基を有して
よく、置換基は１〜４個の炭素原子を有する１価炭化水
素基（例えばメチル、エチル、ビニル基）、および／ま
たはへテロ原子もしくは複素基（例゛：ハロゲン）であ
ってよい。
そのような化合物は１またはそれ以上の置換基を有して
よく、置換基は１〜４個の炭素原子を有する１価炭化水
素基（例えばメチル、エチル、ビニル基）、および／ま
たはへテロ原子もしくは複素基（例゛：ハロゲン）であ
ってよい。
シュードモナス・プチダの前述の第１の突然変異株（本
発明方法に使用でき、芳香族化合物を環式ジヒドロキシ
化合物に変える酵素な誘導できる突然変異株）は、シュ
ードモナス・プチダＮＣＩＢ第１１６８０号または好ま
しくはシュードモナス・プチダＮＣＩＢ第１１７６７号
を、突然変異条件下で処理することによって調製できる
が、その条件は生育のために唯一の炭素源としてトルエ
ンまたはベンゼンをもはや利用することができず、また
炭素源としてピノ七リン酸を含む液体培地中でトルエン
の存在下で生育（増殖）するときに２６５ｎｍでＵＶ吸
収のピークを有する物質を排泌する突然変異株を与える
ような条件である。前記の突然変異は、化学的および／
または物理的手段により実施することができる。化学的
突然変異は、例えば微生物をＮ−メチル−Ｎ′−二）ｏ
−Ｎ−ニトロン、グアニジンで処理することにより実施
でき、この処理はオルストンによって「Ｊ、ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇ。
発明方法に使用でき、芳香族化合物を環式ジヒドロキシ
化合物に変える酵素な誘導できる突然変異株）は、シュ
ードモナス・プチダＮＣＩＢ第１１６８０号または好ま
しくはシュードモナス・プチダＮＣＩＢ第１１７６７号
を、突然変異条件下で処理することによって調製できる
が、その条件は生育のために唯一の炭素源としてトルエ
ンまたはベンゼンをもはや利用することができず、また
炭素源としてピノ七リン酸を含む液体培地中でトルエン
の存在下で生育（増殖）するときに２６５ｎｍでＵＶ吸
収のピークを有する物質を排泌する突然変異株を与える
ような条件である。前記の突然変異は、化学的および／
または物理的手段により実施することができる。化学的
突然変異は、例えば微生物をＮ−メチル−Ｎ′−二）ｏ
−Ｎ−ニトロン、グアニジンで処理することにより実施
でき、この処理はオルストンによって「Ｊ、ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇ。
Ｃｈｅｍ、Ｊ １９６６、Ｖｏｌ ２４１−ｐ３８００
〜３８１０に記載されているように行うことができる。
〜３８１０に記載されているように行うことができる。
物理的突然変異化は、電磁波軸封線、例えばＵＶ線照射
によって行うことができる。
によって行うことができる。
本発明方法に使用できる前述の構成性様は、とニードモ
ナス・プチダＮＣＩＢ第１１７６７号の第１の突然変異
株を前述のような突然変異条件下で処理して、芳香族化
合物の不在下で生育（増殖）した後に、芳香族化合物か
ら環式ジヒビロ化合物を産生しうる能力をもつ株を得る
ことにより調製できる。突然変異処理の結果物から適当
な構成性様を選定することは、突然変異後の細胞を、炭
素源としてピバリン酸（ピバリン酸塩）またはグルコー
スを含む固体寒天培地で増殖させることによって促進し
うる。その増殖後に、寒天平板上のコロニイにカテコー
ルの水溶液を噴霧することにより迅速に黄／緑に変る細
胞コロニイは、カテコールを２−ヒドロキシムコニン酸
セミアルデヒドに変化させる酵素について構成性である
〔ノブキ、「トピックス・イン・カレント・ケξストリ
イ（英文）Ｊ １９７９． Ｖｏｗ、７ＥＬ ｐ１４５
１８６ ）。
ナス・プチダＮＣＩＢ第１１７６７号の第１の突然変異
株を前述のような突然変異条件下で処理して、芳香族化
合物の不在下で生育（増殖）した後に、芳香族化合物か
ら環式ジヒビロ化合物を産生しうる能力をもつ株を得る
ことにより調製できる。突然変異処理の結果物から適当
な構成性様を選定することは、突然変異後の細胞を、炭
素源としてピバリン酸（ピバリン酸塩）またはグルコー
スを含む固体寒天培地で増殖させることによって促進し
うる。その増殖後に、寒天平板上のコロニイにカテコー
ルの水溶液を噴霧することにより迅速に黄／緑に変る細
胞コロニイは、カテコールを２−ヒドロキシムコニン酸
セミアルデヒドに変化させる酵素について構成性である
〔ノブキ、「トピックス・イン・カレント・ケξストリ
イ（英文）Ｊ １９７９． Ｖｏｗ、７ＥＬ ｐ１４５
１８６ ）。
この酵素はシュー−トモナス・プチダＮＣＩＢ第１１６
８０号およびシュードモ力源ニーｍＮＣＩＢ第１１７６
７号中でのベンゼンの酸化分解の一工程に触媒作用をな
すものであり、我々は上記の酵素がその様相から見てベ
ンゼンを環式ジヒドロキシ化合物に転化する酵素に関連
していることを見出した。従って、カテコールに曝され
て黄／緑に変色する細胞は、所望の構成性様である。
８０号およびシュードモ力源ニーｍＮＣＩＢ第１１７６
７号中でのベンゼンの酸化分解の一工程に触媒作用をな
すものであり、我々は上記の酵素がその様相から見てベ
ンゼンを環式ジヒドロキシ化合物に転化する酵素に関連
していることを見出した。従って、カテコールに曝され
て黄／緑に変色する細胞は、所望の構成性様である。
構成性様はグルコースおよびカサミノ酸のような炭素源
による異化物質抑制（カタボライト・レゾレツション）
を受は易いことがある。そ゛のような異化物質抑制を受
けない改善された構成性様は、構成性様を前述のように
処理することによる突然変異により得ることができる。
による異化物質抑制（カタボライト・レゾレツション）
を受は易いことがある。そ゛のような異化物質抑制を受
けない改善された構成性様は、構成性様を前述のように
処理することによる突然変異により得ることができる。
改善された構成性様のコロニイを炭素源としてグルコー
スおよびカサミノ酸を含む寒天培地で増殖させることに
より検出できる。すなわちカテコールに曝したときに黄
／緑に変色するコロニイは、改善された構成性様を含む
。
スおよびカサミノ酸を含む寒天培地で増殖させることに
より検出できる。すなわちカテコールに曝したときに黄
／緑に変色するコロニイは、改善された構成性様を含む
。
本発明方法に使用するための突然変異株の細胞は、連続
式、バッチ式（回分式）または供給バッチ式で慣用増殖
用培地で増殖しうる。
式、バッチ式（回分式）または供給バッチ式で慣用増殖
用培地で増殖しうる。
第１の突然変異株を本発明方法において用いる場合には
、芳香族化合物を培養液中に入れておき、新しい培地を
培養液に供給しながら行う供給、ｅツテ式によって増殖
させるのが好ましい。
、芳香族化合物を培養液中に入れておき、新しい培地を
培養液に供給しながら行う供給、ｅツテ式によって増殖
させるのが好ましい。
本発明に使用するための突然変異株が増殖し５る増殖用
培地は、無機塩類水溶液と適当な炭素源を含む。炭素源
は、例えば酢酸、グルコースまたはエタノールである。
培地は、無機塩類水溶液と適当な炭素源を含む。炭素源
は、例えば酢酸、グルコースまたはエタノールである。
炭素源の濃度は広範囲に変りうるが、一般的には１〜５
％（ｗ／ｖ ）である。
％（ｗ／ｖ ）である。
酸素または酸素含有気体を増殖期間中に存在させなけれ
ばならない。増殖期間中の培地の温度は可成り変動しう
るが、通常は２５〜６５Ｃの範囲である。培地のｐＨは
、増殖中に５．５〜８．０の範囲、好ましくは６．５〜
ｚ５に維持する。培養の規模は、可成り、例えば１．５
〜５００ｊの範囲で変えうる。
ばならない。増殖期間中の培地の温度は可成り変動しう
るが、通常は２５〜６５Ｃの範囲である。培地のｐＨは
、増殖中に５．５〜８．０の範囲、好ましくは６．５〜
ｚ５に維持する。培養の規模は、可成り、例えば１．５
〜５００ｊの範囲で変えうる。
増殖期の次に、細胞を本発明方法において用いる。細胞
は例えば遠心分離または凝集法によって回収してもよく
、あるいは回収せずに本発明方法に直接使用するととも
できる。細胞を回収する場合は、回収細胞を、著しくは
細胞の増殖を支持しない無機塩類溶液〔例えば燐酸−緩
衝液もしくはトリス（ヒｙロキシメチル）アミノメタン
緩衝液〕または慣用増殖用培地から１種またはそれ以上
の必須成分をほとんど除いた培地中に再懸濁する。
は例えば遠心分離または凝集法によって回収してもよく
、あるいは回収せずに本発明方法に直接使用するととも
できる。細胞を回収する場合は、回収細胞を、著しくは
細胞の増殖を支持しない無機塩類溶液〔例えば燐酸−緩
衝液もしくはトリス（ヒｙロキシメチル）アミノメタン
緩衝液〕または慣用増殖用培地から１種またはそれ以上
の必須成分をほとんど除いた培地中に再懸濁する。
典型的には再懸濁細胞の＃度は１１当９１〜３０１１（
乾燥重量）である。細胞は２０〜４０Ｃの温度に保ち、
ｐＨは７５〜８．５に維持する。酸素または酸素含有気
体は、細胞懸濁液に対して、酸素張力が飽和の１係以上
に保たれるように供給する。
乾燥重量）である。細胞は２０〜４０Ｃの温度に保ち、
ｐＨは７５〜８．５に維持する。酸素または酸素含有気
体は、細胞懸濁液に対して、酸素張力が飽和の１係以上
に保たれるように供給する。
適当なエネルギー源を、好ましくは連続的に、細胞懸濁
液に供給して、エネルギー源の濃度が適当な濃度、例え
ば０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ ）に維持されるように
する。適当なエネルギー源の例としては、就中、アルコ
ール類（例：エタノール）、カルボン酸類（例：酢酸）
および炭水化物類（例：グリコース）がある。好ましく
は、エネルギー源はエタノールまたは酢酸である。
液に供給して、エネルギー源の濃度が適当な濃度、例え
ば０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ ）に維持されるように
する。適当なエネルギー源の例としては、就中、アルコ
ール類（例：エタノール）、カルボン酸類（例：酢酸）
および炭水化物類（例：グリコース）がある。好ましく
は、エネルギー源はエタノールまたは酢酸である。
芳香族炭化水素、例えばインゼン、クロル（ンゼ／、ト
ルエンは、酸素流または酸素含有気体流中の蒸気として
細胞懸濁液へ加えることができるが、好ましくは、それ
が液体であるときには、液体のままで加える。
ルエンは、酸素流または酸素含有気体流中の蒸気として
細胞懸濁液へ加えることができるが、好ましくは、それ
が液体であるときには、液体のままで加える。
本発明方法における突然変異株の培養液に対する芳香族
炭化水素の添加速度（割合）は、典型的には、乾燥細胞
重量１ｇ当り毎時的０．５〜１０Ｉである。エネルギー
源の添加速度は反応工程の期間中に変りうるが、典型的
には乾燥細胞重量１１当り毎時０．１〜２．０Ｉｉであ
る。細胞懸濁液の生産性から見た寿命は、典型的には５
〜５０時間である。この期間の後に細胞を遠心分離およ
び／または凝集によって除去する。その上澄液に新しい
細胞を加え、工程を繰返すことができる。本発明方法の
工程の終了時に上澄液は典型的には１ｊ尚り１０〜５０
ＩＩのシス−１，２−ジヒｒロキシーシクロヘキサ−３
，５−ジエンまたはその同族体もしくは類似体（ホモロ
ーブもしくはアナローブ）を含む。
炭化水素の添加速度（割合）は、典型的には、乾燥細胞
重量１ｇ当り毎時的０．５〜１０Ｉである。エネルギー
源の添加速度は反応工程の期間中に変りうるが、典型的
には乾燥細胞重量１１当り毎時０．１〜２．０Ｉｉであ
る。細胞懸濁液の生産性から見た寿命は、典型的には５
〜５０時間である。この期間の後に細胞を遠心分離およ
び／または凝集によって除去する。その上澄液に新しい
細胞を加え、工程を繰返すことができる。本発明方法の
工程の終了時に上澄液は典型的には１ｊ尚り１０〜５０
ＩＩのシス−１，２−ジヒｒロキシーシクロヘキサ−３
，５−ジエンまたはその同族体もしくは類似体（ホモロ
ーブもしくはアナローブ）を含む。
本発明方法の環式ジヒドロキシ化合物は、適当な極性溶
剤を用いての溶剤抽出により水性反応混合物から抽出す
るのが好ましい。使用し５る極性溶剤の例としては、就
中、酢酸エチル、ジエチルエーテルおよび塩化メチレン
がある。連続抽出法を用いるのかさらに好ましい。しか
し、例えば細胞の分離後の水性培地を蒸発させ、その残
渣を適当な溶剤（例：メタノール、エタノールまたは塩
化メチレン）に溶解することによる方法の可能性は本発
明から排除されない。
剤を用いての溶剤抽出により水性反応混合物から抽出す
るのが好ましい。使用し５る極性溶剤の例としては、就
中、酢酸エチル、ジエチルエーテルおよび塩化メチレン
がある。連続抽出法を用いるのかさらに好ましい。しか
し、例えば細胞の分離後の水性培地を蒸発させ、その残
渣を適当な溶剤（例：メタノール、エタノールまたは塩
化メチレン）に溶解することによる方法の可能性は本発
明から排除されない。
本発明の別の態様によれば、
（ここにＸおよびＹは、同一であるか相異なっていてよ
く、水素、ハロゲン、アリール（例：フェニル）または
シアノ基を表わすが、ＸおよびＹの両者が同時に水素で
あることはない） の化合物も提供される。
く、水素、ハロゲン、アリール（例：フェニル）または
シアノ基を表わすが、ＸおよびＹの両者が同時に水素で
あることはない） の化合物も提供される。
好ましくはＹは水素、Ｘは塩素、臭素または弗素、そし
て両ヒビロキシ基は相互にシス関係である。
て両ヒビロキシ基は相互にシス関係である。
本発明方法により製造されるジヒドロキシ化合物は、そ
の誘導体、例えばアセテート、ベンゾエート、ピノ２レ
ート、カーボネートに変えることができ、そしてこのよ
うな誘導体はその重合体または共重合体に変えることが
できる。この点については我々の英国特許出願第８１３
０１１４号明細書に一層詳しく記載されている。
の誘導体、例えばアセテート、ベンゾエート、ピノ２レ
ート、カーボネートに変えることができ、そしてこのよ
うな誘導体はその重合体または共重合体に変えることが
できる。この点については我々の英国特許出願第８１３
０１１４号明細書に一層詳しく記載されている。
本発明の種々の態様を以下の例示のための実施例により
説明する。
説明する。
増殖培地として下記組成のものＡ−Ｇを用いた。
培地Ａ
−燐酸（０，７１９／ｊ）、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０（１
６ｙ／Ｉ ）、Ｋ、ＰＯ４・３Ｈ２０（０，９１１／Ｉ
）、硫酸アンモニウムＣ’Ｌ５ｆｌ／ｌ）、硫酸第一
鉄（α０２５．ＳＩ／ｊ）、Ｃｕ５Ｏ，”５Ｈ２０（０
，００１１／ｌ ）、Ｍｎ８０４−４）Ｉ、０（α００
５１／ｌ ）、Ｚｎ５Ｏ，−７Ｈ２０（（ＬＯ０５＃／
ｊ）、および炭酸カルシウム（０，０６５１／Ｉ） ；
ｐＨは水酸化ナトリ′ウムで７に調節。
６ｙ／Ｉ ）、Ｋ、ＰＯ４・３Ｈ２０（０，９１１／Ｉ
）、硫酸アンモニウムＣ’Ｌ５ｆｌ／ｌ）、硫酸第一
鉄（α０２５．ＳＩ／ｊ）、Ｃｕ５Ｏ，”５Ｈ２０（０
，００１１／ｌ ）、Ｍｎ８０４−４）Ｉ、０（α００
５１／ｌ ）、Ｚｎ５Ｏ，−７Ｈ２０（（ＬＯ０５＃／
ｊ）、および炭酸カルシウム（０，０６５１／Ｉ） ；
ｐＨは水酸化ナトリ′ウムで７に調節。
檀１Ｊ
培地ＡＫ１％（Ｗ／Ｖ ）のピバリン酸および０．５９
６ｖ／ｖの酢酸を加えたもの。
６ｖ／ｖの酢酸を加えたもの。
檀屋夕
培地Ａから硫酸アンモニウムを除いたもの。
前層ｐ
培地Ａに１％（Ｗ／Ｙ）のピバリン酸を加えたもの。
種部Ｊ
濃燐酸（２，２１１／Ｉ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ，Ｏ（α
８ＪＦ／ｊ）、Ｋ、５ｏ４（ＣＬ ４５１１／ｌ ）、
（ＮＨ４）、５０４（５１１／Ｉ ）、ＦｅＳＯ４”７
Ｈ，Ｏ（ｏ、 ０４１１／ｌ ）、Ｏｕｓｏ ａ ・５
Ｈ２０（１”Ｐ／Ｉ ）、Ｍ ｎ ＳＯ４・４Ｈｚ ０
Ｃ５ｙｖ／Ｉ）、ＣａＧｏ ｓ （６５”ｌ／’ ）お
よびダルコース（１５１１１０； ｐＨは水酸化ナト
リウム溶液で７５に調節。
８ＪＦ／ｊ）、Ｋ、５ｏ４（ＣＬ ４５１１／ｌ ）、
（ＮＨ４）、５０４（５１１／Ｉ ）、ＦｅＳＯ４”７
Ｈ，Ｏ（ｏ、 ０４１１／ｌ ）、Ｏｕｓｏ ａ ・５
Ｈ２０（１”Ｐ／Ｉ ）、Ｍ ｎ ＳＯ４・４Ｈｚ ０
Ｃ５ｙｖ／Ｉ）、ＣａＧｏ ｓ （６５”ｌ／’ ）お
よびダルコース（１５１１１０； ｐＨは水酸化ナト
リウム溶液で７５に調節。
培地Ｆ
バクショップ・エルストン培ｊｔｈ （Ｂａｕａｃｈｏ
′Ｑ／Ｅｉａａｏｎ） 、（ｒジャーナル・オノ・ゼネ
ラル・マイクロノＺイオロジイ」、１９６０．Ｙｏｌ、
２３゜ｐ４５７−４６９参照）。
′Ｑ／Ｅｉａａｏｎ） 、（ｒジャーナル・オノ・ゼネ
ラル・マイクロノＺイオロジイ」、１９６０．Ｙｏｌ、
２３゜ｐ４５７−４６９参照）。
培地Ｇ
ルリ７ （Ｌｕｒｉａ）液体培地、Ｊ、Ｈ，ミラー著「
エクス堅すメンツ・イン・モレキュラー・ジエネテイク
スＪ（１９７２年ニュー・ヨーク、コールｒ・スプリン
グ・）翫−ノー・ラボラトリイス発行）参照。
エクス堅すメンツ・イン・モレキュラー・ジエネテイク
スＪ（１９７２年ニュー・ヨーク、コールｒ・スプリン
グ・）翫−ノー・ラボラトリイス発行）参照。
シュードモナス・プチダ（ＮＧＩＢ寄託第１１６８０号
）を、炭素源としてα２％（Ｗ／Ｖ）の酢酸ナトリウム
を含む無機塩類培地中で対数増殖期の初期まで増殖させ
た。細胞を遠心分離で回収し、２０−の２５ｍＭクエン
酸−クエン酸ナトリウム緩衝１１（ｐＨ５，５，１ダの
Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二）ｏソグアニジン含
有）中に、１１１り細胞０．２ｊｌ（乾燥重量）の濃度
で再懸濁させた。懸濁液を３０Ｃで４０分間温装培養し
、次いで細胞を遠心分離で回収し、２５ｍｊのクエン酸
塩緩衝液（ｐＨ５，５＞ テ３ ［１洗浄Ｌり。１１８
胞ｉｋ Ｑ、 ２ ％（ｖ／ｖ）酢酸ナトリウム含有無
機塩類培地中で一晩増殖させ、連続稀釈後に０．４ｍＭ
酢酸酢酸ナトリウム塩類寒天平板に接種した。平板（１
００枚）をペイント缶（２，５７容）中で装置培養した
。各ペイント缶にはトルエン１０％ｖ／ｖと水の混合物
１〇−を入れたバイアル（びん）を入れてあった。
）を、炭素源としてα２％（Ｗ／Ｖ）の酢酸ナトリウム
を含む無機塩類培地中で対数増殖期の初期まで増殖させ
た。細胞を遠心分離で回収し、２０−の２５ｍＭクエン
酸−クエン酸ナトリウム緩衝１１（ｐＨ５，５，１ダの
Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二）ｏソグアニジン含
有）中に、１１１り細胞０．２ｊｌ（乾燥重量）の濃度
で再懸濁させた。懸濁液を３０Ｃで４０分間温装培養し
、次いで細胞を遠心分離で回収し、２５ｍｊのクエン酸
塩緩衝液（ｐＨ５，５＞ テ３ ［１洗浄Ｌり。１１８
胞ｉｋ Ｑ、 ２ ％（ｖ／ｖ）酢酸ナトリウム含有無
機塩類培地中で一晩増殖させ、連続稀釈後に０．４ｍＭ
酢酸酢酸ナトリウム塩類寒天平板に接種した。平板（１
００枚）をペイント缶（２，５７容）中で装置培養した
。各ペイント缶にはトルエン１０％ｖ／ｖと水の混合物
１〇−を入れたバイアル（びん）を入れてあった。
３０Ｃで３日の培養後、３０群の見込みのある突然変異
株（すなわち０．５ｍｇより小さい直径のコル二イ）を
拾い上げ、α２％（ｖ／Ｖ）ピノ（リン酸ナトリウム含
有無機塩類寒天平板上で再び増殖させた。
株（すなわち０．５ｍｇより小さい直径のコル二イ）を
拾い上げ、α２％（ｖ／Ｖ）ピノ（リン酸ナトリウム含
有無機塩類寒天平板上で再び増殖させた。
各突然変異株は、キプノン、ヘンスリイ、旨シダおよび
マプリイ等によって「バイオケζストリイＪ （１９７
０年）、Ｖｏｌ−９＊ ｉ） １６２６〜１６６６に記
載された操作によって、５ＱｉｌのＣ１，２（ｌＡｖ／
ｆ）ピパリン酸ナトリウム含有無機塩類溶液を入れた２
５０１１１エルレンマイヤーフラスコ（３０Ｃの水浴中
で振とう）で、トルエンを気相で供給しつつ増殖させた
。２０時間の増殖後に１ｄのサンプルを遠心分離して、
その透明な上澄液のＵＶスはクトルを３００〜２２０
ｎｍの間で試験した。二つの突然変異株が２６５ ｎｕ
において７２および６５の最大吸光度をもつ化合物を含
む上澄液を与えた。７２の最大吸光度を有する突然変異
株を以下では便宜的に「突然変異株Ａ」と称する。
マプリイ等によって「バイオケζストリイＪ （１９７
０年）、Ｖｏｌ−９＊ ｉ） １６２６〜１６６６に記
載された操作によって、５ＱｉｌのＣ１，２（ｌＡｖ／
ｆ）ピパリン酸ナトリウム含有無機塩類溶液を入れた２
５０１１１エルレンマイヤーフラスコ（３０Ｃの水浴中
で振とう）で、トルエンを気相で供給しつつ増殖させた
。２０時間の増殖後に１ｄのサンプルを遠心分離して、
その透明な上澄液のＵＶスはクトルを３００〜２２０
ｎｍの間で試験した。二つの突然変異株が２６５ ｎｕ
において７２および６５の最大吸光度をもつ化合物を含
む上澄液を与えた。７２の最大吸光度を有する突然変異
株を以下では便宜的に「突然変異株Ａ」と称する。
シュードモナス・プチダＮＧＩ陣託ｔＩＬ１１７６７号
を培地Ｇ中で指数増殖期の初期まで増殖させた。
を培地Ｇ中で指数増殖期の初期まで増殖させた。
細胞を遠心分離で回収し、２０１１１１の２５ｍＭクエ
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５，１ｉｙ
のＮ−）チルーＮ／−ニトローＮ−ニトロソグアニジン
（Ｎ’ｒＧ ）含有〕中に１１轟り細胞０．２Ｎ（乾燥
重量）の濃度で再懸濁した。３０ｒで４５分後に細胞を
遠心分離で回収し、培地Ｆで２回洗浄し、次いで０．３
Ｔｏ （ｖｒ／ｖ ）のピバリン酸ナトリウムを含む
培地Ｆ中で３ＤＣにおいて一晩増殖させた。連続稀釈後
、０．３ｍＭのピノ（リン酸ナトリウムを含む培地Ｆ寒
天平板に接種して、１ｊ容イイント缶中で培養した。Ｒ
インド缶中にはバイアル中に入れた０、５−のに／イン
が含まれていた。
ン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５，１ｉｙ
のＮ−）チルーＮ／−ニトローＮ−ニトロソグアニジン
（Ｎ’ｒＧ ）含有〕中に１１轟り細胞０．２Ｎ（乾燥
重量）の濃度で再懸濁した。３０ｒで４５分後に細胞を
遠心分離で回収し、培地Ｆで２回洗浄し、次いで０．３
Ｔｏ （ｖｒ／ｖ ）のピバリン酸ナトリウムを含む
培地Ｆ中で３ＤＣにおいて一晩増殖させた。連続稀釈後
、０．３ｍＭのピノ（リン酸ナトリウムを含む培地Ｆ寒
天平板に接種して、１ｊ容イイント缶中で培養した。Ｒ
インド缶中にはバイアル中に入れた０、５−のに／イン
が含まれていた。
３０Ｃで６日後、１４４群の見込みのある突然変異株（
すなわち０．５ ｗｔより小さい直径のコロニイ）
′を拾い上げ、０．２％’Ｗ／Ｖ ピノリン酸ナ
トリウム含有培地？寒天で再び増殖させた。
すなわち０．５ ｗｔより小さい直径のコロニイ）
′を拾い上げ、０．２％’Ｗ／Ｖ ピノリン酸ナ
トリウム含有培地？寒天で再び増殖させた。
これらの突然変異株のうちの９０を、上記のように２６
０ ｎｍにおいて吸光する化合物をベンゼンから産生ず
るか否かでスクリーニングした。
０ ｎｍにおいて吸光する化合物をベンゼンから産生ず
るか否かでスクリーニングした。
２６０ ｎｍにおいて３７の最大吸光度をもつ上澄液を
与えた１つの突然変異株を以下では便宜的Ｋ「突然変異
株Ｂ」と称する。
与えた１つの突然変異株を以下では便宜的Ｋ「突然変異
株Ｂ」と称する。
突然変異株Ｂからの構成性株の調製
突然変異のために用いた操作は、前記と同じであった。
ＮＴＧで処理後、洗浄し、稀釈した細胞を培地Ｆ寒天平
板（１０ｍＭのピパリン酸ナトリウム含有→に接種した
。３ｏｃで２日後、コロニイＫ Ｏ，５Ｍカテコール水
溶液を噴霧した。５分後に黄／緑に変色したコロニイを
選択した。スクリー二ン〆した合計ｔ８Ｘ１０’個のコ
ｎニイから３５の黄／緑コロニイを選択した。これらの
それぞれを、１６１１７の培地Ｆ’（０，５％（ｗ／ｖ
）のピパリン酸す）ＩＪウム含有〕中で一晩増殖させた
。細胞を回収し、１０ゴの２５ｍＭ燐酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，５，０，４％（ｖ／Ｖ）のエタノール含有〕
中に再懸濁した。これらの培養液を前述のようにそれぞ
れ０．５ Ｍｌのトルエンの存在下に２５０Ｍ１コニカ
ルフラスコ中で一晩培養した。次いで上置液を２６０
ｎｍでの吸光化合物の有無について試験した一２６５ｎ
ｍにおいて２５０の吸光度を与える一つの構成性突然変
異株を選択した。これを以下では便宜的に「突然変異株
Ｃ」と称する。
板（１０ｍＭのピパリン酸ナトリウム含有→に接種した
。３ｏｃで２日後、コロニイＫ Ｏ，５Ｍカテコール水
溶液を噴霧した。５分後に黄／緑に変色したコロニイを
選択した。スクリー二ン〆した合計ｔ８Ｘ１０’個のコ
ｎニイから３５の黄／緑コロニイを選択した。これらの
それぞれを、１６１１７の培地Ｆ’（０，５％（ｗ／ｖ
）のピパリン酸す）ＩＪウム含有〕中で一晩増殖させた
。細胞を回収し、１０ゴの２５ｍＭ燐酸カリウム緩衝液
（ｐＨ７，５，０，４％（ｖ／Ｖ）のエタノール含有〕
中に再懸濁した。これらの培養液を前述のようにそれぞ
れ０．５ Ｍｌのトルエンの存在下に２５０Ｍ１コニカ
ルフラスコ中で一晩培養した。次いで上置液を２６０
ｎｍでの吸光化合物の有無について試験した一２６５ｎ
ｍにおいて２５０の吸光度を与える一つの構成性突然変
異株を選択した。これを以下では便宜的に「突然変異株
Ｃ」と称する。
突然変異株Ｃを２０１１１の培地Ｇ中で３ＤＣ’におい
て指数増殖期の初期まで増殖させ、回収後細胞を０．１
ＭのＭｇ５Ｏ，・７Ｈ１０溶液４Ｑｍ中に再懸濁した。
て指数増殖期の初期まで増殖させ、回収後細胞を０．１
ＭのＭｇ５Ｏ，・７Ｈ１０溶液４Ｑｍ中に再懸濁した。
その５ｔ／の部分をガラスｊＩｌイトリ皿中で４５秒間
１６μＷ〆一”Ｘ１００の線量でＵＶ照射した。次いで
細胞を２０−の培地Ｆ（１０ｍＭのピパリン酸ナトリウ
ム含有）中において暗所で増殖させた（複数のロット）
。
１６μＷ〆一”Ｘ１００の線量でＵＶ照射した。次いで
細胞を２０−の培地Ｆ（１０ｍＭのピパリン酸ナトリウ
ム含有）中において暗所で増殖させた（複数のロット）
。
３０Ｃで２日後、それらの培養液を連続稀釈して、培地
Ｆに７５ｍＭのグルコースおよび１ｑｂ（ｖ／Ｖ）のビ
タミン不含有カサミノ酸（米国ミシガン州デトロイ）
Ｄｉｆｃｏ Ｉ！ ）を加えたものを接種し、３０Ｃで
さらに２日間培養した。次いでコロニイに対して前記の
ようにカテコール液を噴霧し、黄／緑色コロニイを選択
した。スクリーニングした合計４ Ｘ １０’個のコロ
ニイから１０値のコシニイを選択し、１０−の培地２に
７ｍＭのグルコースおよび１％（Ｗ／Ｖ）のカサミノ酸
な加えた培地中で５０Ｃにおいて一晩増殖させた。細胞
を回収し、前記のようにエタノールを加えた燐酸塩緩衝
液中に再懸濁し、前記のようＫＯ，５−のトルエンの存
在下に７Ｏｒで照射した。異化物質抑制により突然変異
株Ｃよりも影響を受けなかった一つの構成性突然変異株
を選択した。このものは２６５ｎｍ ｉｃおいて６’Ｌ
２の吸光度を与えた。この突然変異株を以下では便宜的
に「突然変異株Ｄ」と称する。
Ｆに７５ｍＭのグルコースおよび１ｑｂ（ｖ／Ｖ）のビ
タミン不含有カサミノ酸（米国ミシガン州デトロイ）
Ｄｉｆｃｏ Ｉ！ ）を加えたものを接種し、３０Ｃで
さらに２日間培養した。次いでコロニイに対して前記の
ようにカテコール液を噴霧し、黄／緑色コロニイを選択
した。スクリーニングした合計４ Ｘ １０’個のコロ
ニイから１０値のコシニイを選択し、１０−の培地２に
７ｍＭのグルコースおよび１％（Ｗ／Ｖ）のカサミノ酸
な加えた培地中で５０Ｃにおいて一晩増殖させた。細胞
を回収し、前記のようにエタノールを加えた燐酸塩緩衝
液中に再懸濁し、前記のようＫＯ，５−のトルエンの存
在下に７Ｏｒで照射した。異化物質抑制により突然変異
株Ｃよりも影響を受けなかった一つの構成性突然変異株
を選択した。このものは２６５ｎｍ ｉｃおいて６’Ｌ
２の吸光度を与えた。この突然変異株を以下では便宜的
に「突然変異株Ｄ」と称する。
実施例 １
この実施例は本発明方法によるシス−１，２−ジヒドロ
キシ−シクロヘキサ−６，５−ジエンの製造を例示する
。
キシ−シクロヘキサ−６，５−ジエンの製造を例示する
。
攪拌された培養器中の４０１の培地Ｂに、突然変異株Ａ
を接種して、培地１ノ当り細胞的０．２１（乾燥重量）
の初期細Ｉ＠密度とした。８時間の増殖の後、別置の培
地Ｂを４時間にわたり２１７時の割合で培養液に添加し
た。次いでトルエンを１６．５ｔ／時の割合で１Ｑ、５
時間にわたり培養液に添加した。次いで１ｊ当り細胞５
．５．９（乾燥重量）の細胞密度において細胞を回収し
た。
を接種して、培地１ノ当り細胞的０．２１（乾燥重量）
の初期細Ｉ＠密度とした。８時間の増殖の後、別置の培
地Ｂを４時間にわたり２１７時の割合で培養液に添加し
た。次いでトルエンを１６．５ｔ／時の割合で１Ｑ、５
時間にわたり培養液に添加した。次いで１ｊ当り細胞５
．５．９（乾燥重量）の細胞密度において細胞を回収し
た。
その細胞の一部を５１の培地Ｃ中に再懸濁して、１１当
り細胞２５１９（乾燥重量）の細胞密度とした。エタノ
ールをその細胞懸濁液に対して６１１／時の割合で連続
的に添加した。ベンゼンを２０ｇ／時の割合で空気流中
の蒸気の状態で細胞懸濁液に添加した。温度を３００に
、そしてｐＨを７．５ Ｋ維持した。空気をその攪拌細
胞懸濁液に対して１５１／分の割合で加えた。１８時間
後、実験を終了したが、その時の上澄液中のシス−１，
２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの濃
度は１５ｆｉ／ｌであった。この上澄液を６ｏｃで回転
蒸発法により容積１１に濃縮した。上記環式ジヒト９０
キシ化合物を２４時間にわたって５００１Ｌｌの塩化メ
チルで連続的に抽出した。この塩化メチル溶液を３００
で回転蒸発法により濃縮した。この濃縮液にペンタンを
添加して結晶（５０１１＞を得た。この結晶は融点、ｎ
ｍｒ、 質量スイクトル分析およびＵＶ分光分析により
、シス−１，２−ジヒドロキシーシクロヘキ？−３，５
−：）エンであることが判明した。
り細胞２５１９（乾燥重量）の細胞密度とした。エタノ
ールをその細胞懸濁液に対して６１１／時の割合で連続
的に添加した。ベンゼンを２０ｇ／時の割合で空気流中
の蒸気の状態で細胞懸濁液に添加した。温度を３００に
、そしてｐＨを７．５ Ｋ維持した。空気をその攪拌細
胞懸濁液に対して１５１／分の割合で加えた。１８時間
後、実験を終了したが、その時の上澄液中のシス−１，
２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエンの濃
度は１５ｆｉ／ｌであった。この上澄液を６ｏｃで回転
蒸発法により容積１１に濃縮した。上記環式ジヒト９０
キシ化合物を２４時間にわたって５００１Ｌｌの塩化メ
チルで連続的に抽出した。この塩化メチル溶液を３００
で回転蒸発法により濃縮した。この濃縮液にペンタンを
添加して結晶（５０１１＞を得た。この結晶は融点、ｎ
ｍｒ、 質量スイクトル分析およびＵＶ分光分析により
、シス−１，２−ジヒドロキシーシクロヘキ？−３，５
−：）エンであることが判明した。
実施例 ２
実施例１の操作を繰返したが、本例では細胞を培地Ｃ中
に再懸濁した後にエタノールを０．３％ｖ／ｖの濃度ま
でそれに添加し、そしてインゼンおよびエタノールは別
々に添加せずに混合−（７０：３０）の形で２３９（混
合物）７時の割合で添加した。
に再懸濁した後にエタノールを０．３％ｖ／ｖの濃度ま
でそれに添加し、そしてインゼンおよびエタノールは別
々に添加せずに混合−（７０：３０）の形で２３９（混
合物）７時の割合で添加した。
実施例 ３
この実施例は本発明方法によるシス−１，２−ジヒト０
ロキシー３−クロルーシクロヘキサ−３，５−ジエンの
製造を例示する。
ロキシー３−クロルーシクロヘキサ−３，５−ジエンの
製造を例示する。
１ｑｂ（Ｗ／Ｖ）のピパリン酸を辰素源として培地Ａ中
でノζツチ培養物の形で突然変異採入を増殖させた。１
ノ当り細胞ＩＪＦ（乾燥重量）のｍｗ密度の時点におい
て（すなわち、４時間の増殖後）トルエンを空気流中に
混合して培養液に加え（トルエンの添加割合は３１／時
）、そし【培養をさらに１６時間継続した。細胞は１ノ
尚りｔ５，９の乾燥重量の時点において回収した。
でノζツチ培養物の形で突然変異採入を増殖させた。１
ノ当り細胞ＩＪＦ（乾燥重量）のｍｗ密度の時点におい
て（すなわち、４時間の増殖後）トルエンを空気流中に
混合して培養液に加え（トルエンの添加割合は３１／時
）、そし【培養をさらに１６時間継続した。細胞は１ノ
尚りｔ５，９の乾燥重量の時点において回収した。
回収細胞を３！の培地Ｃに再懸濁して、１ノ当り細胞１
０１９’（乾燥重量）の細胞密度とした。エタノール（
１５ｊ’）をその細胞懸濁液に添加した。
０１９’（乾燥重量）の細胞密度とした。エタノール（
１５ｊ’）をその細胞懸濁液に添加した。
クロルベンゼンを空気流（１，２７／分）中の蒸気とし
てその細胞懸濁液に対し４１７時の割合で添加した。Ｓ
濁液のｐＨを７５に、そして温度を３０ＣＫ維持した。
てその細胞懸濁液に対し４１７時の割合で添加した。Ｓ
濁液のｐＨを７５に、そして温度を３０ＣＫ維持した。
２４時間後に細胞を除去し、そして反応混合物を減圧下
に６ｏｃで回転蒸発法により約４ＱＯ＋ｊの容積まで濃
縮した。この濃縮液を１６時間にわたりエーテル（２５
０ｍ）で連続的に抽出し、そのエーテル溶液の一部分な
ｆ過したもの（５０ｉ１）から溶剤を蒸発させて粗固形
物（ｔ９２１Ｉ）を得て、これをトルエン／はンタンカ
ラ再結晶して、シス−１，２−ジヒｒロキシークロロー
シクロヘキサ−３，５−ジエンを無色の結晶（１，７０
，９）として得た。このものは融点９５〜９６Ｃであり
、２９Ｃにおける重水素クロ關ホルム中でのプロトン磁
気典鳴スイクトル（１００Ｈｚ）は、８２．５ｃ２Ｈ，
単、溶液なり、Ｏと共に振とうすると消失）、δ４．２
（Ｉ Ｈｅ Ｊｌ、２ ＜５，４Ｈｚ。
に６ｏｃで回転蒸発法により約４ＱＯ＋ｊの容積まで濃
縮した。この濃縮液を１６時間にわたりエーテル（２５
０ｍ）で連続的に抽出し、そのエーテル溶液の一部分な
ｆ過したもの（５０ｉ１）から溶剤を蒸発させて粗固形
物（ｔ９２１Ｉ）を得て、これをトルエン／はンタンカ
ラ再結晶して、シス−１，２−ジヒｒロキシークロロー
シクロヘキサ−３，５−ジエンを無色の結晶（１，７０
，９）として得た。このものは融点９５〜９６Ｃであり
、２９Ｃにおける重水素クロ關ホルム中でのプロトン磁
気典鳴スイクトル（１００Ｈｚ）は、８２．５ｃ２Ｈ，
単、溶液なり、Ｏと共に振とうすると消失）、δ４．２
（Ｉ Ｈｅ Ｊｌ、２ ＜５，４Ｈｚ。
Ｊｌ、、１１４Ｈｚ、Ｈ−１）、Ｊ４．５（ＩＨ，二重
＠ Ｊ２，１５４ＨｚＨ−２）、δ５．８〜６．２ （
３Ｈ、多重、 Ｈ−４゜Ｈ−５およびＨ−６）において
信号を与え、赤外線スペクトル（ＫＢｒ ディスク）は
３２８０．１６４０゜１５８０．１３８０．１３４０，
１３１０，１２８０．１１７０゜１０９０、１０４０．
１０００．９９０．９３０．８８０．８３５゜７９５．
６７０．５９０および３９０ｍ−”においてそれぞれピ
ークを示した。
＠ Ｊ２，１５４ＨｚＨ−２）、δ５．８〜６．２ （
３Ｈ、多重、 Ｈ−４゜Ｈ−５およびＨ−６）において
信号を与え、赤外線スペクトル（ＫＢｒ ディスク）は
３２８０．１６４０゜１５８０．１３８０．１３４０，
１３１０，１２８０．１１７０゜１０９０、１０４０．
１０００．９９０．９３０．８８０．８３５゜７９５．
６７０．５９０および３９０ｍ−”においてそれぞれピ
ークを示した。
実施例 ４
この実施例は、本発明方法によるシス−１，２−ジヒド
ロキシ−６−メチル−シクロへキサ−３，５−ジエンの
製造を例示する。
ロキシ−６−メチル−シクロへキサ−３，５−ジエンの
製造を例示する。
実施例３の操作を繰返したが、本例ではクロロベンゼン
の代りにトルエンを用いた。
の代りにトルエンを用いた。
培養液中のシス−１，２−ジヒト０ロキシー６−メチル
ーシクμヘキサ−３，５−ジエンの製置は、１６１１／
ｌ であった。これをジエチルエーテルで連続的に抽出
した。抽出エーテル溶液にはンテンを添加して２８Ｉｉ
の結晶を得た。これは融点、ｎｍｒ、ｉｒおよび質量ス
イクトル分析によってシス−１，２−ジヒドロキシ−３
−メチル−シクロへキサ−３，５−ジエンであることが
示された。
ーシクμヘキサ−３，５−ジエンの製置は、１６１１／
ｌ であった。これをジエチルエーテルで連続的に抽出
した。抽出エーテル溶液にはンテンを添加して２８Ｉｉ
の結晶を得た。これは融点、ｎｍｒ、ｉｒおよび質量ス
イクトル分析によってシス−１，２−ジヒドロキシ−３
−メチル−シクロへキサ−３，５−ジエンであることが
示された。
実施例 ５
この実施例は本発明方法における構成性酵素の使用を例
示する。
示する。
突然変異株りを２０１の培地ＥＫ接種して１ノ当り０．
２．９（乾燥重量）の初期細胞密度とした。
２．９（乾燥重量）の初期細胞密度とした。
温度を３０ｒＫｐＨを７２に維持した。培養槽は５００
ｒｐｍで攪拌し、空気を６１７分の割合で供給した。
ｒｐｍで攪拌し、空気を６１７分の割合で供給した。
１６時間後、細胞４ｇ（乾燥重量）／Ｊの細胞密度にお
いて、遠心分離により細胞を回収した。 − 回収細胞の一部分を、３Ｉの２５ｍＭ燐酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７，６，１１）Ｆｅ８０４−７Ｈ，Ｏオよび１
２＋１１７のエタノールを含有）中に再懸濁した。
いて、遠心分離により細胞を回収した。 − 回収細胞の一部分を、３Ｉの２５ｍＭ燐酸カリウム緩衝
液（ｐＨ７，６，１１）Ｆｅ８０４−７Ｈ，Ｏオよび１
２＋１１７のエタノールを含有）中に再懸濁した。
その細胞密度は９Ｉ（乾燥重量）／ｌであった。
温度を３０Ｃに維持し、ｐＨを水酸化ナトリウム溶液で
７６に維持した。空気・酸素混合物を１゜７７分で供給
して、飽和の１０％に当る酸素張力を与えた。反応器は
１４００ ｒｐｍで攪拌した。ベンゼンを液状で２０／
ｌ時の割合で反応器に添加し、さらに１８ｍ１のエタノ
ールを３等分量で２時間の間隔で添加した。７時間後、
遠心分離により細胞を除去し、３ｊの上澄液を得た。こ
の液は１１当り２９１のシス−１，２−：）ヒ”ト０ロ
キシーシクロヘキサー３，５−ジエンを含んでいた。
７６に維持した。空気・酸素混合物を１゜７７分で供給
して、飽和の１０％に当る酸素張力を与えた。反応器は
１４００ ｒｐｍで攪拌した。ベンゼンを液状で２０／
ｌ時の割合で反応器に添加し、さらに１８ｍ１のエタノ
ールを３等分量で２時間の間隔で添加した。７時間後、
遠心分離により細胞を除去し、３ｊの上澄液を得た。こ
の液は１１当り２９１のシス−１，２−：）ヒ”ト０ロ
キシーシクロヘキサー３，５−ジエンを含んでいた。
実施例 に
の実施例は本発明方法により高濃度のシス−１、２−−
、’ヒドロキシーシクロヘキｔ−３．ｓ−：）エンな製
造するための構成性突然変異株の使用を例示する。
、’ヒドロキシーシクロヘキｔ−３．ｓ−：）エンな製
造するための構成性突然変異株の使用を例示する。
突然変異株Ｃを培地り中で３０ＵおよびｐＨ７，０にお
いて２０ｊのノでツチ培養物として１６時間増殖させた
。空気を１１Ｉ分の割合で供給し、反応混合物を８０
Ｏｒｐｍで攪拌し、そして温度を６０Ｃに維持した。ベ
ンゼンを２０時間にわたって２０１１Ｉ時の割合で空気
流中の蒸気の形で添加し、そして合計４０ｇのエタノー
ルを少量づつ添加した。２０時間後に上澄液は２４．６
．９／ｊの濃度で合ｔｔ１２３Ｎのシス−１，２−−、
ｊヒト９０キシーシク田ヘキサ−Ｓ、Ｓ−：）エンな含
んでいた。
いて２０ｊのノでツチ培養物として１６時間増殖させた
。空気を１１Ｉ分の割合で供給し、反応混合物を８０
Ｏｒｐｍで攪拌し、そして温度を６０Ｃに維持した。ベ
ンゼンを２０時間にわたって２０１１Ｉ時の割合で空気
流中の蒸気の形で添加し、そして合計４０ｇのエタノー
ルを少量づつ添加した。２０時間後に上澄液は２４．６
．９／ｊの濃度で合ｔｔ１２３Ｎのシス−１，２−−、
ｊヒト９０キシーシク田ヘキサ−Ｓ、Ｓ−：）エンな含
んでいた。
実施例 ７
突然変異株りを、培地Ｅ中で３０ＣおよびｐＨ７Ｏにお
いて２０１のパッチ培養物として１６時間増殖させた。
いて２０１のパッチ培養物として１６時間増殖させた。
回収後、細胞の一部分を、実施例６記載の培地４ｊ中に
再懸濁して５９（乾燥重量）／ｌの細胞密度とした。ベ
ンゼンを液状で１１１Ｉ時の割合で、そしてエタノール
を連続的に２．５ｙ／時の割合で懸濁液に添加した。８
時間後、細胞を除去して、１５１／ｌの濃度でシス−１
，２−ジヒｒロキシーシクロヘキサ−３，５−Ｊ）′エ
ンな含む上澄液を得た。その濃度はこの化合物について
の既知の吸光係数に基き得たものである（ナカジマ等、
Ｃｈｅｍｉｇｃｈｅ Ｂｅｒｉｃｈｔｅ、 １９５９．
ＶＯＩ 、 ９２ ＦｐＬ６３）。
再懸濁して５９（乾燥重量）／ｌの細胞密度とした。ベ
ンゼンを液状で１１１Ｉ時の割合で、そしてエタノール
を連続的に２．５ｙ／時の割合で懸濁液に添加した。８
時間後、細胞を除去して、１５１／ｌの濃度でシス−１
，２−ジヒｒロキシーシクロヘキサ−３，５−Ｊ）′エ
ンな含む上澄液を得た。その濃度はこの化合物について
の既知の吸光係数に基き得たものである（ナカジマ等、
Ｃｈｅｍｉｇｃｈｅ Ｂｅｒｉｃｈｔｅ、 １９５９．
ＶＯＩ 、 ９２ ＦｐＬ６３）。
この上澄液に別置の細胞を添加して、１ｊ当り細胞８Ｎ
（乾燥重量）の細胞密度とし、上記実験を継続した。そ
れから１６時間後、上澄液は１ｊ当り４０Ｉの濃度でシ
ス−１，２−ジヒドロキシ−７りｐヘキサ−３，５−−
、＄エンを含んでいた。
（乾燥重量）の細胞密度とし、上記実験を継続した。そ
れから１６時間後、上澄液は１ｊ当り４０Ｉの濃度でシ
ス−１，２−ジヒドロキシ−７りｐヘキサ−３，５−−
、＄エンを含んでいた。
実施例 ８
実施例６の操作を繰返したが、本例ではベンゼンの代り
にナフタレンを用いた。そのナフタレンは実験の開始時
に添加して１５ ％ （Ｗ／ｖ）の濃度とした。２０Ｉ
のシス−１，２−ジヒドロキシ−１゜２−ジヒドロナフ
タレンが得られた。
にナフタレンを用いた。そのナフタレンは実験の開始時
に添加して１５ ％ （Ｗ／ｖ）の濃度とした。２０Ｉ
のシス−１，２−ジヒドロキシ−１゜２−ジヒドロナフ
タレンが得られた。
実施例 ９〜１１
実施例７の操作を繰返したがベンゼンの代りに、ソレソ
れフルオロベンゼン、インジルアルコールおよびビフェ
ニルを別々に用いた。ビフェニルは実験の開始時に添加
して２％（ｖ／ｖ ）の濃度とした。
れフルオロベンゼン、インジルアルコールおよびビフェ
ニルを別々に用いた。ビフェニルは実験の開始時に添加
して２％（ｖ／ｖ ）の濃度とした。
ツレツレシス−１，２−ジヒドロキシ−３−フルオロシ
クロヘキサ−ｓ、ｓ−：）エン、シス−１，２−ジヒド
ロキシ−３−フェニルシクロヘキサ−６，５−ジエンお
よびシスーｔ、２−ジヒ）″′ｐキシー６−ヒドｐキシ
メチル−シクロヘキサ−６，５−ジエンが得られた。
クロヘキサ−ｓ、ｓ−：）エン、シス−１，２−ジヒド
ロキシ−３−フェニルシクロヘキサ−６，５−ジエンお
よびシスーｔ、２−ジヒ）″′ｐキシー６−ヒドｐキシ
メチル−シクロヘキサ−６，５−ジエンが得られた。
特許出願人 インシリアル・ケミカル・ 。
インダストリーズ・ピーエルゾー
Claims (9)
- （１） シュードモナス・プ ダの突然変異株の細胞
の増殖をほとんどまたは全く支持しない培地中の上記突
然変異株に対して、芳香族化合物およびエネルギー源を
供給することからなる１、２−ジヒドロキシ−シクロヘ
キサ−３，５−ジエン環よりなる化合物の製法。 - （２） シシドモナス・プチダはＮＧＩＢ寄託第１１
７６７号微生物である特許請求の範囲第１項に記載の方
法。 - （３） 転化反応に触媒作用を与える酵素は構成性酵
素である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （４）突然変異株は異化物質抑制を受は易くない特許請
求の範囲第３項に記載の方法。 - （５） ｆｆ４ルキ−源ハエタノール、タルコースま
たは酢酸である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 - （６）一般式 ％式％ （ここにＸおよびＹは、同一であるか相異なり、水素、
ハロゲン、アリールまたはシアノ基を表わすが、Ｘおよ
びＹの両者が同時に水素であることはない。） の化合物。 - （７）Ｙは水素であり、Ｘが弗素、塩素または臭素であ
る特許請求の範囲第６項に記載の化合物。 - （８） 両ＯＨ基は相互にシス関係にある特許請求の
範囲第６項に記載の化合物。 - （９）生物学的に純粋なシュードモナス・プチダＮＣＩ
Ｂ寄託第１１７６７号微生物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8130116 | 1981-10-06 | ||
| GB8130116 | 1981-10-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5871891A true JPS5871891A (ja) | 1983-04-28 |
| JPH0542417B2 JPH0542417B2 (ja) | 1993-06-28 |
Family
ID=10524977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57176024A Granted JPS5871891A (ja) | 1981-10-06 | 1982-10-06 | １，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエン環化合物およびその製法 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4508822A (ja) |
| EP (1) | EP0076606B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5871891A (ja) |
| AU (2) | AU562987B2 (ja) |
| CA (1) | CA1193991A (ja) |
| DE (1) | DE3268971D1 (ja) |
| DK (1) | DK164071C (ja) |
| ES (1) | ES8400143A1 (ja) |
| GR (1) | GR76993B (ja) |
| IE (1) | IE53912B1 (ja) |
| IL (1) | IL67003A (ja) |
| NO (1) | NO160526C (ja) |
| NZ (1) | NZ202075A (ja) |
| ZA (1) | ZA827333B (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63240778A (ja) * | 1987-03-30 | 1988-10-06 | Res Dev Corp Of Japan | 微生物の培養法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8408953D0 (en) * | 1984-04-06 | 1984-05-16 | Ici Plc | Polymer coatings |
| GB8614925D0 (en) * | 1986-06-19 | 1986-07-23 | Ici Plc | Cyclic dihydroxy compounds |
| ATE83798T1 (de) * | 1986-07-08 | 1993-01-15 | Shell Int Research | Pseudomonas-putida-staemme und ihre verwendung. |
| US4876200A (en) * | 1986-07-08 | 1989-10-24 | Shell Oil Company | New strains of pseudomonas putida |
| US4863861A (en) * | 1986-07-08 | 1989-09-05 | Shell Oil Company | Biochemical process to produce catechol or 1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene compound(s) |
| GB8616614D0 (en) * | 1986-07-08 | 1986-08-13 | Shell Int Research | Organofluorine compounds |
| ATE85040T1 (de) * | 1986-07-08 | 1993-02-15 | Shell Int Research | Organofluorverbindungen und ihr biochemisches herstellungsverfahren. |
| GB8627711D0 (en) * | 1986-11-20 | 1986-12-17 | Shell Int Research | Microbial preparation of catechols |
| GB8700462D0 (en) * | 1987-01-09 | 1987-02-11 | Shell Int Research | Alkene derivatives |
| GB8708517D0 (en) * | 1987-04-09 | 1987-05-13 | Shell Int Research | Preparation of fluorophenols |
| GB8823977D0 (en) * | 1988-10-13 | 1988-11-23 | Ici Plc | Cyclic dihydroxy compounds |
| US5118703A (en) * | 1988-10-18 | 1992-06-02 | Pfizer Inc. | Prodrugs of antiinflammatory 3-acyl-2-oxindole-1-carboxamides |
| GB8900854D0 (en) * | 1989-01-16 | 1989-03-08 | Ici Plc | Separation of a compound comprising a 1,2-dihydroxy-cyclohexa-3,5-diene ring |
| US4894337A (en) * | 1989-01-17 | 1990-01-16 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Process for the bioproduction of cyclic hydroxides |
| WO1993009240A1 (en) * | 1991-10-31 | 1993-05-13 | Bio-Technical Resources | Microbial production of cis-dihydrodiol and phenol derivatives of benzocyclobutene |
| JPH07503234A (ja) * | 1991-10-31 | 1995-04-06 | バイオ−テクニカル・リソーシズ | ベンゾシクロブテンのシス−ジヒドロジオールおよびフェノール誘導体の微生物による生産 |
| US5420361A (en) * | 1992-02-05 | 1995-05-30 | Bio-Technical Resources | Formulation of and dehydration of hydroxylated diphenyl acetylenes |
| WO1995030764A1 (en) * | 1994-05-10 | 1995-11-16 | Bio-Technical Resources Lp | Formation of and dehydraton of hydroxylated diphenylacetylenes |
| US5551560A (en) * | 1994-06-30 | 1996-09-03 | Alpha Enterprises, Inc. | Container for compact disc and jewel box |
| US5824540A (en) * | 1995-06-20 | 1998-10-20 | Merck & Co., Inc. | Pseudomonas putida strain with dioxygenase activity |
| US5858737A (en) * | 1995-06-20 | 1999-01-12 | Merck & Co., Inc. | Conversion of indene to (1S)-amino-(2R)-indanol free of any stereoisomer, by combination of dioxygenase bioconversion and chemical steps |
| AU1133900A (en) | 1998-10-26 | 2000-07-12 | University Of Iowa Research Foundation, The | Novel naphthalene dioxygenase and methods for their use |
| US7407195B2 (en) * | 2004-04-14 | 2008-08-05 | William Berson | Label for receiving indicia having variable spectral emissivity values |
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|---|---|---|---|---|
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| US4259444A (en) * | 1972-06-07 | 1981-03-31 | General Electric Company | Microorganisms having multiple compatible degradative energy-generating plasmids and preparation thereof |
-
1982
- 1982-09-23 DE DE8282305029T patent/DE3268971D1/de not_active Expired
- 1982-09-23 EP EP82305029A patent/EP0076606B1/en not_active Expired
- 1982-09-28 IE IE2345/82A patent/IE53912B1/en not_active IP Right Cessation
- 1982-10-04 GR GR69428A patent/GR76993B/el unknown
- 1982-10-04 NZ NZ202075A patent/NZ202075A/en unknown
- 1982-10-04 NO NO823326A patent/NO160526C/no not_active IP Right Cessation
- 1982-10-05 AU AU89131/82A patent/AU562987B2/en not_active Ceased
- 1982-10-06 JP JP57176024A patent/JPS5871891A/ja active Granted
- 1982-10-06 ES ES516275A patent/ES8400143A1/es not_active Expired
- 1982-10-06 CA CA000412926A patent/CA1193991A/en not_active Expired
- 1982-10-06 ZA ZA827333A patent/ZA827333B/xx unknown
- 1982-10-06 US US06/433,093 patent/US4508822A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-10-06 DK DK443282A patent/DK164071C/da not_active IP Right Cessation
- 1982-10-17 IL IL67003A patent/IL67003A/xx not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-12-31 US US06/687,935 patent/US5036009A/en not_active Expired - Fee Related
-
1986
- 1986-10-16 AU AU64110/86A patent/AU591936B2/en not_active Ceased
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