JPH0543347B2 - - Google Patents
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- JPH0543347B2 JPH0543347B2 JP83502817A JP50281783A JPH0543347B2 JP H0543347 B2 JPH0543347 B2 JP H0543347B2 JP 83502817 A JP83502817 A JP 83502817A JP 50281783 A JP50281783 A JP 50281783A JP H0543347 B2 JPH0543347 B2 JP H0543347B2
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Description
請求の範囲
１ インターフエロン又はその生物学的に活性な
断片を喫煙可能なタバコ製品に加えることを含ん
で成る該製品に薬剤付与する方法。 ２ インターフエロンが安定化されている請求の
範囲第１項記載の方法。 ３ 前記インターフエロンを担体に付加すること
によつて安定化を行う請求の範囲第２項記載の方
法。 ４ 前記担体が血清アルブミンである請求の範囲
第３項記載の方法。 ５ 担体がチトクロームＣである請求の範囲第３
項記載の方法。 ６ 前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第１
項記載の方法。 ７ 前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第１
項記載の方法。 ８ 前記製品がパイプタバコである請求の範囲第
１項記載の方法。 ９ ヒトの体中でインターフエロンの産生を誘発
する物質を喫煙可能なタバコ製品に加えることを
含んで成る該製品に薬剤を付加する方法。 １０ 前記物質が二重鎖RNA、ピランコポリマ
ー、ポリアニオン、及びリンホカインから成る群
から選ばれる請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第
９項記載の方法。 １２ 前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第
９項記載の方法。 １３ 前記製品がパイプタバコである請求の範囲
第９項記載の方法。 １４ 外部的に適用されたインターフエロンを含
有する喫煙可能なタバコ製品。 １５ 前記インターフエロンが安定化されている
請求の範囲第１４項記載の製品。 １６ 前記インターフエロンを担体に付加するこ
とにより安定化を行う請求の範囲第１５項記載の
製品。 １７ 前記担体が血清アルブミンである請求の範
囲第１６項記載の製品。 １８ 前記担体がチトクロームＣである請求の範
囲第１６項記載の製品。 １９ ヒトの体内でインターフエロンの生産を誘
導する外部から適用された物質を含んで成る喫煙
可能なタバコ製品。 ２０ 前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第
１９項記載の製品。 ２１ 前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第
２０項記載の製品。 ２２ 前記製品がパイプタバコである請求の範囲
第１９項記載の製品。 ２３ 前記物質が二重鎖RNA、ピランコポリマ
ー、ポリアニオン及びリンホカインから成る群か
ら選ばれる請求の範囲第１９項記載の製品。 明細書 幾つかの特許が、一般的に（A.B.Kleinの米国
特許第977635号；J.L.Jordan等の米国特許第
1974242号；S.S.Fredericksonの米国特許第
2418296号；P.Speiser等の米国特許第4021364
号）、ビタミンによる（A.Viscardi等の米国特許
第2198188号；G.Fachini等の米国特許第2890973
号；B.Stoneの米国特許第3244180号：J.
Waterbury等の米国特許第3339558号；M.J.
Waterbury等の米国特許第3667478号）、電荷によ
る（R.Roystenの米国特許第3240212号）タバコ
への薬剤付与を試みている。これらの薬剤付与
は、それ自体の有利性、又は喫煙者により吸引さ
れる煙の毒作用、例えば生長の抑制、呼吸困難、
枯草熱、癌、気腫及び心臓疾患を中和しもしくは
軽減することを目的としている。これらの特許
は、思うに、タバコの喫煙によつて消耗される生
物学的化合物の保存修復のための手段、又は喫煙
の疑わしい悪い効果に対向するための手段を提供
するが、これらは薬剤の別々の投与によりもたら
される効果よりさらに効果的な薬剤付与を目的と
していない。今や、これらの得られる結果を考慮
して、発明者は、たばこの煙と相乗的に作用する
薬物を使用することにより実質上さらに良好な結
果が得られるものと予想する。この発明は、タバ
コを天然薬物であるインターフエロンと組合わせ
ることによる相乗作用に関し、インターフエロン
の活性は喫煙の条件により強調され、そして喫煙
によつて撹乱される細胞を標的にする。この発明
はさらに、インターフエロンを安定化し、その生
物学的活性を、タバコ製造、貯蔵及び使用の通常
の条件を通じて保持することができる新規な方法
を提供する。 インターフエロンはまず有効な抗ウイルス剤と
して特徴付けられ（Isaacs及びLindenmann、
Proceedings Royal Society London、シリーズ
B.Vol147、258−276頁、1957）、そして以来抗生
長（抗癌）活性を有することが見出された
（Paucker等、Virology、Vol17、324−334頁、
1962）（Gresser編、InterferonVol.2、13〜46頁、
1981においてTaylor−Papadimitriouにより総説
されている）。インターフエロンはさらに腫瘍免
疫系を活性化する（Trinachieri等、Journal of
Experimental Medicine、Vol147、1299−1305
頁、1978）。発明者はまず、インターフエロンが
適当な濃度において実際にある種の悪性細胞を、
「分化」と称する過程又は細胞成熟を通して正常
細胞に変えることができることを推定した
（Carter等、1980年７月に提出された特許明細書
POICA29545；Gillespie及びCarter、Texas
Reports in Biology and Medicine、41：37−
42、1981−82）。Gillespie及びCarterにより行わ
れた（前記）実験的証明は、腫瘍細胞が成熟又は
正常な発達過程を通じて正常になるように方向付
けられる時間にわたつて、その腫瘍細胞がインタ
ーフエロンに暴露されれば、インターフエロンは
癌をその初期の段階において除去することができ
るとする発明者の推論を支持する。 この発明はたしかに、悪性細胞の最初の小さい
巣が発生する身体の部位に反復的且つ効果的にイ
ンターフエロンを供給する有効な方法が工夫され
れば、腫瘍細胞がヒトの体内に発生する際にそれ
らの細胞は除去されるであろうことを予想させ
る。このような腫瘍の巣がもしチエツクされずに
放置されれば、通常それらの局所的拘束を越えて
拡散し、最終的には兆候ある病気と死をもたらす
であろう。さらに、発明者は、肺癌を有する個体
は、体中でのインターフエロンの不適当な関与か
ら生ずると考えられる免疫監視系の不全を有する
という証明を得た（Strayer、Carter等、印刷中、
1982）。 従つてこの発明は、インターフエロンと、イン
ターフエロンによりその不利益な効果が防止され
る物質であつてその製造、貯蔵又は使用がインタ
ーフエロンの生物学的活性と適合しない物質とを
組合わされることを目的とするインターフエロン
の安定化に関する。発明者が記載するインターフ
エロンの安定化のための２つの方法は新規であ
り、そして自明でない。 重要な例として、この発明は、インターフエロ
ンと、集合的にタバコと称する喫煙物との組合わ
せを目的とするインターフエロン蛋白質の安定化
に関する。この組合わせは相乗的である。これ
は、インターフエロンの効果がタバコの煙によつ
て加温された細胞において高められるために相乗
的である。すなわちHron及びBergにより発見さ
れた低温効果である（Nature274：508−510、
1978）。この研究において、２〜３℃という小さ
い環境温度の上昇が、白血病細胞の生育を阻害す
る低投与量のインターフエロンの効果を約800％
増大せしめることを示した。さらに最近において
は、Delbruck等（Biomedicine33：239−241、
1980）は、骨肉腫細胞を殺すインターフエロンの
効果が、37℃から39℃への２℃の温度上昇により
100位上昇することを示した。タバコから出る煙
の温度は40〜50℃である（Repart of Surgeon
General、Department of Health、Education
and Welfare、1979、14頁、36）から、口腔、咽
喉、及びおそらく肺の細胞表面が実質上上昇し、
そしてこれらの細胞に運ばれるインターフエロン
の効果を強化するであろう。さらに、疎水性安定
化インターフエロンは、煙の成分、例えば３，４
−ベンゾピレンのごとき疎水性発癌物質及びこの
発癌物質を担持する粒子と結合し、そして従つて
インターフエロンが特異的に煙の発癌物質により
撹乱された細胞、すなわち潜在的癌細胞に集中す
る。さらに、Horoszewic等により示されたよう
に（Science206：1091−1093、1979）、インター
フエロンは腫瘍細胞、例えば前の喫煙により生じ
た細胞と選択的に相互作用するから相乗的であ
る。最後に、インターフエロンが喫煙と同時にそ
して局所的に適用されるから相乗性が強化され
る。喫煙者によつて摂取されるインターフエロン
量は、喫煙されたタバコの数、すなわち発癌物質
への露出に直接関連する。さらに、インターフエ
ロンが喫煙物の構成部分であるから、喫煙者が喫
煙前にインターフエロンの補給を失念することが
ない。従つて、引続いて又は同時に適用されたイ
ンターフエロンが喫煙によつて生じた癌に対して
有効である可能性は明らかであるが、本発明者が
発見したインターフエロンとタバコとの相乗作用
は明らかではなく、そしてタバコと組合わせるた
めのインターフエロンの安定化のために適する手
段は自明ではない。 タバコの煙をふくむ空気中環境汚染物は、肺癌
及びおそらく他の癌の機会を増加するであろう
が、潜在期間が長く、そのため早い段階におい
て、生じた癌を効果的に阻止し、そして根絶する
ことは不可能であつた。多くのヒトの癌は、この
疾患に対する身体的物質（先天的又は後天的）を
有する固体が環境的引金と称する第２の事実に反
復して暴露された結果である（U.S.Depertment
of Research、1971−1981、における総説、1981
を参照のこと）。この発明は、肺癌の発生に関す
る上記の両条件を正しくする方法すなわち、(1)外
来性インターフエロンを身体組織に与えて体自体
によるインターフエロンの産生の不足（先天的又
は後天的）を補足し（これによつて癌に対する免
疫不全を回復せしめ）、そしてさらに(2)毒性発癌
物質の癌促進効果（これはある場合には身体的防
御系を圧倒する）を攻撃し、そして最終的には、
投与されたインターフエロンの追加の局在効果、
すなわち悪性細胞を「分化」の過程を通じて直接
正常化することにより除去する方法を含む。 この発明の目的は、多くの有用な効果を有する
天然物質を身体の特定の部分に移行せしめること
を促進するために規則的喫煙の利益を得ることで
ある。 タバコ製品へのインターフエロンの導入は、イ
ンターフエロンを病気に冒された口腔、肺及び鼻
に移行せしめる新規な方法を提供し、この方法は
種々のインターフエロン効果、例えばインターフ
エロンによりもたらされる種々の防御効果を発生
せしめ、この防御効果は、可能性ある発癌物質を
含む種々の空中環境汚染物に長期間暴露された場
合に生ずる癌細胞を包括的に除去するものであ
る。この結果、この発明は、種々の癌、特に肺、
咽喉及び口腔中に生ずる癌の発生率を低下せしめ
るはずである。この発明はさらに、他の疾患、例
えば外来性粒状物の慢性的吸入により生ずる疾患
（気腫及び慢性気管支炎に関連する）、及び空気伝
染性のヒト−ウイルスにより生ずる疾患（肺炎、
インフルエンザ症候群、感冒等の種々の感染性疾
患に関する）に対する身体の全体的耐性の増加に
関しても試験した。試験管内試験におけるこれら
の結果（例を参照のこと）は、個体によるこの発
明の規則的な実行（すなわち種々のタイプのイン
ターフエロンを含浸せしめたタバコの喫煙）が、
多くの有利な身体的効果、例えば癌の率の低下、
気腫／慢性気管支炎の率の低下、並びにウイルス
性及び感染性疾患の減少に伴う一般的に良好な健
康状態をもたらすことを示した。あるタイプの血
管系疾患に対する感受性の低下は、ヘビースモー
カーにおいて増加するが、インターフエロンが血
管壁の閉塞（閉鎖）に寄与するある種の因子に拮
抗する場合にも生ずるであろう。 この多数の有利な効果を達成するために、すべ
てのタイプのインターフエロン及びすべてのタイ
プのインターフエロン誘発物質（体内でインター
フエロンの産生を開始させる物質）とタバコとを
組合わせる方法が提供される。この方法は、癌及
び他の危険な疾患の発生率を低下せしめることに
より、ヒトにとつて明らかに有用であり、これら
の疾患の危険な効果は、傷つきやすいそして／又
は早期に病気にかかつた細胞と物理的に並行して
反復して投与されたインターフエロンにより中和
される。この方法はさらに、ヒトの体の入口にお
いて高濃度のインターフエロンの局在した効果に
より対抗を受けるあらゆる種類の他の発癌物にも
適用できよう。 しかしながら、天然のヒト−インターフエロン
は蛋白質の１群であり、そして蛋白質の生物学的
活性は、ある条件〔例えば、熱的変化、酸／アル
カリ環境、撹流、及び／又は剪断効果（渦流）
等〕のもとではしばしば感受性である（破壊され
る）。インターフエロンの生物学的活性の感受性
を低下せしめるために、発明者はさらに、新しい
クラスのインターフエロンを導入した。このイン
ターフエロンは天然又は合成インターフエロンの
断片であり（成分又は特定のアミノ酸配列）、広
範囲の種類の異る環境条件のもとで所望の生物学
的活性を保持する点において分子の安定性をもた
らすものである。この断片は典型的には、インタ
ーフエロンの正常な分子の長さの約10〜15％であ
ればよく、通常の約162の構成アミノ酸ではなく
むしろせいぜい25〜45アミノ酸である。完全な長
さのヒト−インターフエロンからのこれらの必須
アミノ酸断片（配列）の決定は、脊椎動物の進化
の過程で保存された種々のインターフエロンの領
域の発明者等による新規な解析（コンピユーター
により促進される）により可能にされた。好まし
い物理−化学的性質に加えて、インターフエロン
断片又は配列はさらにコスト／効果の観点から有
用であり、サイズが小さいことにより、全インタ
ーフエロン分子のコストの小部分により、そして
多様な製造方法、例えば組換DNA技法、固相合
成等により大規模生産が可能になる。 しかしながら、発明者は、インターフエロンの
安定なそして生物活性を有する断片の製造及び試
験は、この発明を実施する場合に満足できない遅
延をもたらすことを認識する。従つて、発明者
は、分子がとりうる異る状態の数を限定すること
により天然インターフエロンを安定化させるため
の簡単で経済的な手段を発明した。発明者は、イ
ンターフエロンと他の基剤、通常は蛋白質との間
の弱い疎水性相互作用を生起させることにより、
このことを達成した。 発明者は、紙巻タバコを含むタバコ製品とイン
ターフエロンとを組合わせる。発明者は、高温、
破壊的化学物質及び長期間の貯蔵に直面した場合
に生物学的活性を保持するために、「インターフ
エロンの断片」を用いることにより、そしてイン
ターフエロンとある種の担体を組合わせることに
よりインターフエロンを安定化するための必要か
つ新規な手段を記載する。 安定化されたインターフエロンの幾つかは煙の
粒子と結合し、これによつて病気にかかつた細胞
に集中し、インターフエロンを別々に例えばアト
マイザーを用いて導入したのでは不可能なインタ
ーフエロンとタバコの煙との間の相乗作用が得ら
れる。 従来技術の簡単な記載 Carter W.A.、1979、Life Sciences25：717−
728；Carter W.A.等、1980、Program Grant
Proposal POICA 29545 the National Cancer
Institute；Carter W.A.及びHoroszewicz J.S.、
1980、Pharmacology and Therapeutics ８：
359−377；Isaacs及びLindenmann、
Proceedings Royal Society London、シリーズ
Ｂ Vol147、258−267頁（1957）；Paucker等、
Virology Vol17、324−334頁（1962）；Taylor
Papadimitriou、「Interferon」（Gresser編）、
Vol2、13−46頁（1981）；Derynk等、Nature、
Vol285、542−547頁（1980）；Goeddel等、
Nature、Vol290、20−26頁（1980）；Shepard
等、Nature、Vol294、563−565頁（1981）。 発明の要約 生物学的活性及び強化された安定性を有するイ
ンターフエロンの断片の製造及び精製方法及び組
成物が提供される。インターフエロンの断片又は
全インターフエロン（又はインターフエロン誘発
物質）とタバコとを組合わせて、タバコの煙に暴
露された細胞に対する強化されたインターフエロ
ン効果を得る方法及び組成物が提供される。多く
の好ましい、そして有利な結果が得られる。 (1) インターフエロン及び喫煙は、癌細胞の発
生、呼吸器ウイルスの感染等に対して監視する
ために相乗的に作用する。このような好ましい
医療的効果の発生におけるインターフエロンの
生物学的効果は、タバコの煙中の上昇した温度
により増強される（Horon及びBergにより発
見された高温効果、Nature274：508−510、
1978）。 (2) インターフエロンが無毒と推定される薬剤
（揮発性物質又は粒状物）と同時に標的ヒト細
胞に移送され、細胞が悪性化し続けるのではな
くむしろ正常化することを促進するため、喫煙
者に対する発癌効果は種々のヒト組織の入口部
分において克服される。 (3) 肺微小環境において非毒性外来性粒状物を清
掃し、飲み込み、そしてさもなければ破壊し、
これによつて慢性気管支炎、気腫等の衰弱及び
疾患の発生を防止することにより肺を正常に保
つ細胞（マクロフアージ）の効果を増加せしめ
るこの発明の証明された可能性により、外来性
粒状物（分子状炭素等）の気管支破壊効果が最
小となり又は除去される。 (4) 低いインターフエロンレベルによる肺におけ
る局所的な免疫不全はこの発明により直接修正
され、そしてさらに、肺を通過し、蓄積された
インターフエロンに一時的に暴露されることに
より能力が増大した免疫細胞（体の全免疫系の
一部分を構成する）は次に体の他の部分に循環
することが合理的に信じられる。こうして、イ
ンターフエロンは局所的に投与されても増加し
た、そして最終的に体の種々の他の部分に拡散
される有利な効果（全身的効果と称する）を有
するであろう。このような効果は、病理的過程
により動脈及び静脈を閉塞する全体的過程にお
ける成分である血小板生長因子の不活性化のご
とき他の好ましい全身的効果有することができ
る。 (5) ヒトの全呼吸器（鼻、口、咽頭、気管、肺
等）にわたるウイルスへの暴露は非常に高い組
織の抵抗に合うであろう。インターフエロンの
抗ウイルス作用は種々の体の領域に拡散するか
らである。この発明が規則的に実行される場合
はいつでも、呼吸組織上の生物活性を失つたイ
ンターフエロンは常に新鮮で活性なインターフ
エロン分子により置き換えられるであろう。 発明者は、インターフエロンとタバコを含むタ
バコ製品を組合わせる。発明者は、高温、破壊的
化学物質及び長期間の貯蔵に直面して、インター
フエロンの断片を使用することにより、そしてイ
ンターフエンロンとある種の担体を組合わせるこ
とによりインターフエロンを安定化する必要且つ
新規な手段を記載する。安定化されたインターフ
エロンの幾らかが煙粒子と結合し、そしてそれに
より病気にかかつた細胞に集中し、インターフエ
ロンを例えばアトマイザーにより導入することに
よつては不可能なインターフエロンとタバコの煙
との相乗作用が得られる。 発明者は、ある大きな人口群が、癌、及び種々
のウイルスに関する病気を含む他の危険な病気に
対して通常より大きな危険を有することを見出し
た。癌に対する増加した素質を生じさせる遺伝的
欠陥のためにこれらの群の危険がより大きいので
ある。これらの欠陥は、前記の人口群が空気中発
癌物質又はウイルスに環境的に暴露された場合に
特に拡大される。この発明は、インターフエロン
及びその断片並びにインターフエロン誘発物質に
より体の免疫監視系を強化することによりこれら
の欠陥の修正をもたらす。癌又はウイルスに増加
した危険（一般より大きな）を有する個体におい
て、免疫監視細胞はしばしば不十分である。発明
者は、このような細胞が肺組織を正常に一時的に
通過する間における、このような細胞のインター
フエロン（タバコ製品の使用によりすでに与えら
れそして蓄積している）に対する短時間の暴露
が、不十分な細胞活性を修正し、そして活性な癌
防止機能を回復するのに十分であることを見出し
た。 具体的な態様の記載 この発明は、生物活性を保持しながら高い安定
性を得るためにインターフエロン分子の一部分を
除去し又は変形する新規な実行を採用する。この
発明の方法は、タバコの煙により影響を受けた組
織において生ずる癌細胞の連続的分子的監視及び
除去を行うためにインターフエロンとタバコを組
合わせることによる相乗的組合わせを提供する。
「たばこ」は葉まきたばこ、パイプたばこ等を含
むすべての喫煙物を意味する。「インターフエロ
ン」及び「インターフエロンの断片」なる語は、
互換的に使用され、天然インターフエロン、並び
にペプチド部分及び炭水化物部分の変形を伴うす
べての変形物を含み、ヒトの細胞のみならず、細
菌、酵母、モンキー細胞等を含むヒト以外の細胞
において生産されたものも含む。さらに、この発
明は、例えば天然インターフエロン又はその誘導
体を疎水性担体に結合することにより、これらの
分子がとりうる異る状態の数を限定することによ
り、これらを安定化せしめる方法を記載する。 この発明の方法は次の段階に分けられよう。 インターフエロン領域の認識。 選択された領域を有するインターフエロン断
片の調製。 担体によるインターフエロンの安定化。 インターフエロン断片及び全インターフエロ
ン分子とタバコとの組合わせ。 インターフエロン誘発物質／活性化物質とタ
バコとの組合わせ。 インターフエロン領域の認識 インターフエロンをコードする遺伝子はクロ
ーン化されている（例えば、Derynk等、
Nature、Vol285、542−547頁、1980）。これ
らの遺伝子は配列決定され（Goeddel等、
Nature、Vol290、20−26頁、1980；Derynk
等、Nature、Vol285、542−547頁、1980）、
そして種々のインターフエロンの９個の一次構
造か決定された。コンピユータープログラムを
用いて、本発明者はインターフエロン系の幾つ
かの生物学的性質に必要な領域を決定した
（Gillespie及びCarter、Handbook of
Experimental Pharmacology of Interferon、
Volume71、Berlin；Spring−Vealag、pp45
−63、1984）。 抗ウイルス反応を生じさせるインターフエロ
ンの先祖アミノ酸配列は配列25−40及び115−
141を含む（第１図）。すべてのインターフエロ
ンは抗ウイルス反応及び抗新生物反応の両方を
生じさせるから、この領域の位置は、インター
フエロンの１つの種から他の種にわたるこの領
域の一次アミノ酸配列の保存性を基礎にして推
定され、この保存がmRNA（メツセンジヤー
RNA）又は蛋白質の形態の保存によつて説明
されない場に特にそうである。生物学的反応領
域は外界に露出されており（第２図及び
Gillespie及びCarter、1982）そして他の細胞
成分との相互作用を促進するであろう。
Streuli等（Proceedings National Academy
of Sciense、U.S.A.、Vol78、2848−2852頁、
1981）は、ある範囲の宿主細胞において生物学
的活性を生じさせるためにはインターフエロン
分子の両端が必要であると提案した。 特定の細胞受容器に結合するために必須であ
ると決定されたインターフエロン領域はアミノ
酸115−141を含有する（Gillespie及びCarter、
1982）。この領域の位置は、部分的に決定され、
又はコレラトキシンのＢサブユニツト（Lai、
Journal Biol.Chem.Vol252、7249−7256頁、
1977）、すなわち受容器と結合するためにイン
ターフエロンと競争する物質との相同性によつ
て促進される。 タバコに生物学的監視を与えるために少なく
とも２つのインターフエロン断片が有用であ
る。１つの断片は生物学的反応領域それ自体か
らなり、純粋であり又は感受性細胞への移入を
促進する他の部分と結合している。第２の断片
は、受容器結合領域に隣接する生物学的反応領
域から成る。完全ポリペプチド及び補欠分子
族、それへの付加又はそれからの欠失、又はこ
の両者、又はこの変形を含む他のインターフエ
ロン断片もま、有用であろう。 さらに、この発明は任意の天然の又は合成的
に（細菌又は酵母）調製された全インターフエ
ロン分子〔一般にα（白血球型）、β（線維芽細
胞型）又はγ（免疫型）インターフエロンと称
する〕を用いて実施することができる。インタ
ーフエロン断片の利点には、安定性、タバコか
ら肺への移入の容易さ（分子量が小さいため）、
より良好な組織への透過性及び低い抗原性が含
まれる。 選択領域を有するインターフエロン断片の調
製 インターフエロンの断片は幾つかの方法で調
製することができる。例示により１つの適当な
方法を次に記載する。他の方法、例えば天然イ
ンターフエロンの化学的変形又はクローニング
された（合成）完全インターフエロンの化学的
変形、インターフエロン誘導体、等も容易に明
らかであり、そしてこの発明の範囲である。 クローニングされたインターフエロン遺伝子
は、特定の制限エンドヌクレアーゼを用いて特
定の場所で切断することができる（第３図）。
得られたインターフエロン遺伝子断片はインタ
ーフエロンポリペプチドの断片をコードしてお
り、これをRNAポリメラーゼプロモーター、
リボゾーム結合部位、開始コドン及び他の必要
なシグナルを含有する発現ベクターと融合せし
めることができる。この組換DNAは、インタ
ーフエロンの断片を合成するために適当な宿主
細胞に導入することができる。 ポリＡ・dTに連結されそしてpBR322中でク
ローニングされたヒト−インターフエロン−β
の遺伝子5μｇを、37℃にて２時間、20ｍＭの
トリス、PH7.4、10ｍＭのMgCl2、50ｍＭの
（NH4）2SO4及び100mg／mlのウシ血清アルビミ
ン中50ユニツトのEndoR・P1と共にインキユ
ベートすることによりインターフエロン遺伝子
を塩基203−206の単鎖を残して切断した（第３
図）。DNAを酢酸カルシウムにおいて0.3Mと
し、そしてエタノールから沈澱せしめた。
DNAを、100mlの50ｍＭ燐酸カリウム、PH7.4、
6.7ｍＭのMgCl2、１ｍＭのメルカプトエタノ
ール、35ｍＭのデオキシアデノシン及びデオキ
シシチジン、並びにエセリヒア・コリDNAポ
リメラーゼのクレノウ断片25ユニツト、に溶解
した。DNAを酢酸カリウムについて0.3ｍＭと
し、そしてエタノールから沈澱せしめた。沈澱
を100mlの30ｍＭ酢酸ナトリウム、PH4.6、50ｍ
ＭのNaCl、１ｍＭのZnSO4、５％のグリセリ
ン及び25ユニツトのS1ヌクレアーゼ、に溶解
し、そして37℃にて１時間インキユベートし
た。これにより平滑末端を有する、ヌクレオチ
ド204までの完全なインターフエロン遺伝子断
片が生成し、第１は、45位のロイシンをコード
するコドンに存在した（第１及び３図）。酢酸
ナトリウムを0.3Mになるように加え、そして
DNAをエタノールから沈澱せしめた。 別に、ポリdA・dTに連結されそして
pBR322中でクローニングされたヒト−インタ
ーフエロン−βの遺伝子５ｇを、37℃にて２時
間、10ｍＭのトリス、PH7.9、６ｍＭのKCl、
10ｍＭのMgCl2、１ｍＭのジチオスレイトール
及び100mg／mlのウシ血清アルブミン中50ユニ
ツトのEndo Ｒ Mboと共にインキユベート
した。DNAをエタノールから沈澱せしめ、そ
して上記のようにしてS1ヌクレアーゼにより
処理した。インターフエロン遺伝子のヌクレオ
チド401−688を含有する288塩基対の平滑末端
断片を、３％アガロースによる電気泳動により
精製した。この断片のアリコート25mgを、Pst1
処理し、DNAポリメラーゼ処理しそしてS1ヌ
クレアーゼ処理したDNA5μｇと共に導入し
た。 ２つのDNA断片から成る沈澱を、10ユニツ
トの殺菌性アルカリホスフアターゼを含有する
PH8.0の10ｍＭトリス10mlに溶解し、そして37
℃にて２時間インキユベートした。次に溶液
を、2.3Mの酢酸ナトリウムにより100mlに稀釈
し、65℃にて30分間保持し、CHCl3にて抽出
し、次にエタノールから沈澱せしめた。沈澱
を、10mlの70ｍＭトリス、PH7.5、100mlの
KCl、10ｍＭのMgCl2、５ｍＭのジチオスレイ
トール、300ｍＭのリボアデノシントリホスフ
エート、１ユニツトのポリヌクレオチドキナー
ゼ及び10ユニツトのT4DNAリガーゼに溶解
し、そして37℃にて２時間インキユベートし
た。 こうして得られたDNAは、アミノ酸46−111
が欠失したインターフエロンポリペプチドをコ
ードする、ヌクレオチド205−400を欠失したイ
ンターフエロン遺伝子を含有していた。 次の例において、この物質を「インターフエ
ロン断片ポリペプチド」と称する。 この組換インターフエロン断片は、常用の技
法を用いて、細菌又は哺乳動物細胞中で発現せ
しめるために適する多くのベクターに挿入する
ことができる。インターフエロン又はインター
フエロン断片は、標準的方法により精製するこ
とができる。但し、この発明は、有害な物質が
存在しない限り１％未満のインターフエロンを
用いて実施することができる。例えば、インタ
ーフエロンを含有する溶液中の蛋白質は、エチ
レン又はポリエチレングリコールの非存在下で
シバクロームブルー（Cibachrom blue）セフ
アロースに結合する。カラムを、インターフエ
ロン以外の蛋白質のほとんどを除去する種々の
溶液で洗浄し、そしてインターフエロンを、エ
チレンもしくはポリエチレングリコール、又は
他の適当な溶離剤を含有する溶液により溶出す
る（Carter等、Pharmacology and
Therapeutics、Vol8、359−377頁、1980）。所
望により、結合及び溶出のための常用の条件を
用いて、インターフエロン含有溶剤を抗−イン
ターフエロン抗体を含有するカラム基剤に通す
ことにより、シバクロームブルー画分又は他の
材料の精製をさらに行うことができる。 上記の組換DNAは、同じ酵素の幾つか又は
すべてを異る条件下で又は異る順序で使用し
て、あるいは上記の酵素又はインターフエロン
遺伝子の変形を用いて調製することができる。
他の適当な組換DNAは他の酵素及び他の方法
を使用して形成することができる。最後に、イ
ンターフエロンの断片を得るために組換DNA
を使用することは、インターフエロンの断片を
生成せしめるための方法の単なる例示である。
他の手段、例えば固相合成、無傷の材料、又は
細菌及び酵母中で調製された遺伝的にクローニ
ングされたインターフエロンの蛋白質分解的切
断を、同様に用いることができる。 担体によるインターフエロンの安定化 インターフエロンは、他の蛋白質と同様に、
比較的不安定な化学物質である。水溶液中の溶
解性及び生物活性は、種々の線状に配列したア
ミノ酸の非常に特異的な三次元配置に依存する
（第１図参照）。具体的には、細胞への結合及び
複雑な生物反応の惹起のために機能するインタ
ーフエロン分子の領域は適切に露出されそして
整列されていなければならない。しかしなが
ら、他の非機能的方向の多くの配列も可能であ
り、自由に形成され得る。これらの異る状態は
熱、ある種の外来性化学物質及び長期に及び貯
蔵により助長される。 異る不活性状態の形成を防止するための１つ
の解決方法は、IFN活性を示すが限定された数
の異る状態を有する分子、すなわち．に記載
したインターフエロン断片を形成することであ
る。本発明者によつて開発された他の解決方法
は、インターフエロンを担体分子又は構造上に
固定化することにより異る状態の形成を制限す
ることである。 活性酵素はしばしば、細胞膜、核酸、蛋白質
等に結合した複合構造の部分として見出され、
そして酵素は通常、複合した状態においてより
安定である。このような方法の実施可能性を評
価するため、本発明者は、効果的な安定剤であ
ると考えられる種々のリガンドを含有する幾つ
かのカラム基剤を形成した（第２図、Carter
等、1980、Pharmac.Ther.8：359−377）。ア
ルブミンを結合せしめることによりカラムを特
徴付けた。１ml中に11500ユニツト及び0.99mg
の蛋白質を含有する100mlの透析してないイン
ターフエロン標品を、ペリスタルポンプを用い
て、60ml／cm2／時の流速でカラムに適用した。
アルブミンカラムを、0.15MのNaClを含有す
る0.02Mの燐酸ナトリウム（PH7.4）を用いて
平衡化した。カラムからの溶出液を流れ分割装
置により１：９の比率で分割した。溶出液の10
％の部分を、0.02Mの燐酸ナトリウム及び
0.15MのNaClを含有する血清アルブミンの１
％溶液１ml中に集め、そしてインターフエロン
活性の測定に使用した。溶出液の90％部分は蛋
白質濃度を測定するのに使用した。画分全体
に、適用した蛋白質の約98％が含まれており、
そして適用したインターフエロン活性の１％未
満が含まれていた。50（ｖ／ｖ）％のエチレン
グリコール及び50％の0.04M燐酸塩（PH7.4）
及び0.30MのNaClを用いてさらにカラムの溶
出を行つた。インターフエロン活性の残量（86
％）が非常にわずかのもとの蛋白質（２％未
満）を伴つて回収された。これらの実験の幾つ
かは最近公表された（CarterW.A.、Methods
in Enzymology78：576−582、1981）。 上記の実験は、インターフエロンは血清アル
ブミンと結合することができるが、他のほとん
どの細胞蛋白質は結合できないことを示した。
他の固定化蛋白質、例えばチトクロームＣを用
いる実験は、インターフエロンが蛋白質と結合
する一般的性質を有することを示した。本発明
者は、インターフエロンの強い疎水性が他の蛋
白質の通常はかくれている疎水性ポケツトと強
引に相互作用することを仮定し、そして上記の
実験はこの仮定が正しいことを示唆した。機構
のいかんにかかわらず、上記の実験は蛋白質と
の複合体の形成がインターフエロンを安定化せ
しめることを示した。 この目的で本発明者によつて開発された方法
は次の通りである。ヒト−インターフエロンを
任意の生物的分離源−ヒト−細胞、組換微生物
等−から任意の常用手段によつて分離すること
ができる。精製した後、ヒト−血清アルブミン
又は他の蛋白質性担体を過剰に、通常は３mg／
mlに加えることができる。溶液を燐酸緩衝化塩
溶液又は他の適当な緩衝液に対して透析し、そ
して凍結乾燥することができる。典型的な例に
おいては、100万ユニツトの精製インターフエ
ロンを3.46mgの燐酸ナトリウムと共に凍結乾燥
した。 この急速に変化する分野において、この方法
と多くの変法を用いることができる。アルブミ
ン又はチトクロームＣ以外の担体蛋白質を用い
ることができる。他の担体分子又は構造、例え
ば脂質、小疎水性リガンド、膜断片、又は固体
粒子も用いることができる。他の結合手段、例
えばイオン結合又は共有結合も適当である。他
の塩もしくは緩衝剤、又は塩もしくは緩衝剤の
他の濃度（塩又は緩衝剤を使用しない場合を適
用することができる。ある場合には透析は必要
ない。基本的に、この発明の目的はタバコと組
合わせることができ、そして生物学的活性を保
持することができる安定な形のインターフエロ
ンを提供することである。 インターフエロンの断片とタバコとの組合わ
せ この節において、「インターフエロン」は全
インターフエロン及び前に定義した「インター
フエロンの断片」を意味し、そして逆にこの節
において使用する「インターフエロンの断片」
は全分子をも含む。 知られているすべてのヒト−タイプのインタ
ーフエロンを本発明者の研究室において標準的
と認められる方法により調製した〔天然線維芽
細胞（β）インターフエロンについてはCarter
及びHoroszewicz、Pharmacology and
Therapeutics、Vol8、359−377頁、1980；天
然白血球（α）インターフエロンについては
Mogensen及びCantell、Pharmacology and
Therapeutics、Vol、369−381頁、1977；天
然免疫（γ）インターフエロンについては
Mizarhi、O′Malley、Carter等、Journal of
Biological Chemistry、Vol23、7615頁、1978
を参照のこと〕。 インターフエロンは、インターフエロンの生
物学的活性を保持し、そしてタバコの煙の吸引
によりインターフエロンが口腔を通つて肺に移
行するようにタバコに加えられなければならな
い。組合わせ方法の詳細は、好ましい生物学的
活性、例えば口びる、口腔、及び肺における抗
腫瘍効果、免疫的効果及び抗ウイルス効果を最
大にするものでなければならない。 インターフエロンの断片とタバコとを組合わ
せる若干の方法がこれらの基準を満たす。１つ
の典型的な例を下に記載するが、これは方法の
単なる適当な形にすぎないと考えられる。 インターフエロンの断片及び完全分子は及
びにおいて例示したようにして調製し、そし
て常用の方法及び装置を用いて微細な乾燥粉末
に凍結乾燥した。0.01〜100％純度のインター
フエロンが適当である。一般に、１部のインタ
ーフエロンと99部のヒト−アルブミン、フラク
シヨンの混合物を一緒に凍結乾燥して、所望
の大きさと稠度を有し不所望の生物的効果を有
しない粒子を得る。他の混合物も可能であり、
そして均等であると考えられ、これらにはイン
ターフエロンとセルロース粒子及び食塩のよう
な担体との組合わせが含まれる。但し上記の性
質（稠度、力価、副作用がないこと）が最終製
品の目的に一致することが必要である。インタ
ーフエロン含有粉末は、フイルター＋フイルタ
ー自体の長さまでの距離を実質上越えない距離
に所定量のインターフエロンを移動させるよう
に短時間継続する空気の吹き込みを用いて、あ
らかじめ製造されたタバコのフイルターの端に
吹き込むことができる。インターフエロン粒子
は酢酸セルロースのフイルターとゆるやかに混
合されそしてその中に付着する。この酢酸セル
ロースは強い結合によつて粒子を保持しない物
質である。この方法は酢酸セルロースのフイル
ターを有するタバコに限定されず、インターフ
エロンを永久的に化学的に結合せずそして酢酸
セルロース又は他のプレフイルターの添加によ
り変性され得る任意のフイルターを、任意の他
の種類のフイルターを含むタバコに含めること
も適当である。この発明の方法は、喫煙物の煙
の流路にインターフエロン粒子を混合したセル
ロース、酢酸セルロースのような基材を含める
ことによりフイルターなしタバコ、葉まきタバ
コ、パイプ及び他の喫煙物に適用することがで
きる。喫煙行為はインターフエロンとタバコを
組合わせるために使用したのとは逆の空気の流
れを生じさせ、そしてインターフエロンの粒子
を煙の中に引き出し、インターフエロンをタバ
コの煙に暴露される細胞に運ぶであろう。 インターフエロン粒子とタバコフイルター又
はプレフイルターを組合わせるための例示的な
装置を第４図に示す。常用の通気源…コンプレ
ツサー、インペラモーター、ダイアフラム等に
より空気流を供給する。空気がチユーブにそつ
て押出され、インターフエロン分散装置、例え
ば空中インターフエロン粒子の密度を均一に保
持するために撹拌され、あるいは乾燥され又は
構成された、そしてその所定量の内容物を分配
する室を通つてチユーブに流れる。第４図には
ピストン装置を図示したが、適当な量のインタ
ーフエロンをチユーブに供給できるものであれ
ば任意の装置を使用することができる。所定体
積の空気中粒子を、空気の噴流を発生させる直
前にチユーブに導入する。空気噴射の間、イン
ターフエロン粒子がタバコ中一定の距離に運ば
れる。このタバコは常法に従つて製造されたも
のである。空気噴射を停止し、そしてインター
フエロン粒子をフイルター材料に付着せしめ
る。そしてチユーブを次のタバコに移動せしめ
（又はタバコを移動せしめ）、そしてこの工程を
反復する。上記の方法は例として詳細に説明し
た。凍結乾燥により調製したインターフエロン
粒子をフイルターと組合わせるのに他の方法が
可能であり、この方法には、重力、噴霧、散
布、又は粒子の移動を生じさせる他の方法、あ
るいは電気的吸引、磁気的吸引、あるいはその
他のコート法又はプレート法により、インター
フエロン粒子をフイルターに付着せしめる方法
が含まれる。これらの方法及びその他の代り得
る方法がこの発明に含まれる。さらに、フイル
ター製造の任意の段階でインターフエロン粒子
をフイルターと組合わせることができるが、こ
の場合にはその後の段階においてフイルターを
850℃（ペプチド結合を破壊するために必要な
温度）以上に加熱してはならない。インターフ
エロンをフイルターとではなくタバコと組合わ
せ、又はあとでタバコに連結されるプレフイル
ターと組合わせることができる。インターフエ
ロンは、溶液又は半コロイドもしくはコロイド
として、フイルター材料、タバコ又はプレフイ
ルター上に、同様の結果をもつて付着させるこ
とができるが、この場合脱着効率は低い。これ
らの変法及びこの変化する分野における従来の
適用はすべてこの発明の部分であると考えられ
る。基本的には、この発明は、インターフエロ
ン分子、又はインターフエロンと粒子状又は非
粒子状の他の物質との生物学的に活性な形での
複合体から成るインターフエロン含有粒子と
を、喫煙物により生成した煙中に乗せることが
できるように、インターフエロン又はインター
フエロン粒子を固定化する基準を満足する。 上記の記載から、生物学的活性及び強化され
た安定性を有するインターフエロンの断片を生
成せしめ、分離し、そしてタバコに含有せしめ
ることができることが明らかである。従つてこ
の発明は、喫煙の潜在的に危険な効果に対抗
し、そしてヒトの呼吸系に、感冒、ウイルス等
に対する一般的保護効果が与えるための新規な
手段を提供する。幾つかのアミノ酸が欠失して
いるインターフエロン断片の使用は、天然抗癌
剤であるインターフエロンとタバコを組合わせ
る単なる例示である。インターフエロンのその
他の変形も可能であり、これにはアミノ酸の付
加、存在するアミノ酸の変化、及び除去、付加
又は変形による種々の糖補欠分子族の変化が含
まれる。 この発明に従えば、所望の性質、高い生物学
的活性、強化された安定性、タバコに含有され
そして煙中に放出される可能性を有するインタ
ーフエロン断片を操作するための方法が提供さ
れる。その結果、喫煙の潜在的に危険な効果を
克服することができ、そしてたしかに、喫煙者
の一般的健康の増進がはかられる。 前述の発明を、明確にしそして理解に供する
ために説明及び例により幾分詳細に説明した
が、添付した請求の範囲の範囲内において幾つ
かの変法又は変化を行うことができることは言
うまでもない。 インターフエロン誘発物質とタバコとの組合
わせ 体自体のインターフエロンの保留を促進する
合成化学物質を一般にインターフエロン誘発物
質又はインターフエロン誘発／活性化物質と称
する（「Selective Inhibitions ofViral
Functions」W.A.Carter編、Chemycal
Rubber Company、1973における総説を参照
のこと）。これらの誘発物質は、二重鎖RNA
（リボヌクレオチド）、又は種々の小分子量化学
物質、例えばポリアニオン、ピランコポリマー
等を含む化学的に多様な種類の化合物から成る
（さらに「Interferon」I.Creccer編、1981を参
照のこと）。 この発明は上記の種々の群の化学的及び／又
は生化学的物質のいずれかを用いて実施するこ
とができる。但しこれらの物質はタバコから一
慣して脱着し、そして呼吸空間に付着した後に
活性を現わし続けそして不所望の副作用を有し
ないものでなければならない。 これらの有効生を証明するために、２種類の
誘発物質、すなわちポリＩ・Ｃ及びアンプリゲ
ン（不均整RNAらせんから成る誘発物質につ
いての商標）を、タバコのフイルターの端に粉
末を軽くふりまくことによつてタバコフイルタ
ー上に凍結乾燥物の形で付着せしめた。第４図
に記載した例示的装置はまた、誘発物質を用い
て、又は誘発物質粒子とインターフエロン粒子
の任意の組合わせを調製するためにも使用する
ことができる。体外で行われた種々の試験にお
いて、２種類の物質の組合わせは通常より顕著
な、又は相乗的な、好ましい生物学的効果を生
じさせる。 例 例についての背景 ヒトの肺及び周囲の組織は、ガス交換（酸素の
受け入れと二酸化炭素の廃出）中における外来性
環境物質の攻撃に対して反応する多くの異る種類
の細胞から成る複雑な器官である。この発明の有
利な効果を評価するために、発明者は、体外で小
組織培養容器、ペトリ皿、又はウエルに維持され
た種々のヒトの生細胞を使用して、体外での呼吸
器防御系の成分を研究することを選択した。この
ような皿又はヒトの細胞を増殖せしめるための他
の装置において、ヒトの体内で生ずるであろう幾
つかのタイプの相互作用を刺激する方法で、生細
胞に煙をふきかけることができる。 例 １ 100000国際比較単位（IRU）の天然線維芽細胞
（β）インターフエロン（タバコＡ）、もしくは
に記載した100000IRUの天然βインターフエロン
断片ペプチド（タバコＢ）、又は10μｇの不均整
RNAインターフエロン誘発物質（Carter等、
Journal of Molecular Biology、Vol70、567
頁、1972）（タバコＣ）と同等の量を凍結乾燥物
の形で前もつて付加したフイルター型（酢酸セル
ロース）のタバコから、ヒトの志願者が吸入し
た。凍結乾燥したインターフエロン成分を含浸せ
しめたフイルターを通つて煙を吸引した後、すぐ
に、志願者は彼の口腔及び鼻を通して、煙を直接
に、血清を補給したRPMI1640培地中に保持され
たヒトの正常な生線維芽細胞を含有する開放ペト
リ皿に放出した。次にこのペトリ皿を二酸化炭素
（５％）にもどし、そして液体培地環境にさらに
10時間おき、この時間はインターフエロンの効果
が生じ得る時間であり、この後線維芽細胞におけ
るインターフエロン抗ウイルス活性をウイルス誘
導細胞病理効果の阻害の標準的測定法により測定
した（Armstrong J.A.、Applied
Microbiology、Vol21、723−725頁、1971を参照
のこと）。小水泡生口内炎ウイルスをチヤレンジ
ウイルスとした。インターフエロン含浸フイルタ
ーを通過し、そして次に志願喫煙者の口腔を通過
した煙を受理したすべての皿において、抗ウイル
ス状態の強力な証明が、存在する線維芽細胞中で
観察された。インターフエロン処理フイルターを
有しない「対照フイルター」を用いる同様の実験
において抗ウイルス効果は認められず、タバコの
煙それ自体は、チヤレンジウイルスに対してヒト
の組織を保護しないことを示した。 例 ２ 志願者は、すでに記載されている方法
（Mizrahi等、前記、1978）により調製された天
然ヒト免疫インターフエロン（γ）100000IRUを
含有する同じ方法で製造されたタバコＡ、Ｂ、
Ｃ、及びＤを用いて前記の方法を反復した。γイ
ンターフエロンは、蛋白質mg当り100000IRUを含
み、約１％の予想純度を有する。この場合、健康
なヒトの血液からの細胞を用いるフイコル−ハイ
パク（Ficol−Hypaque）勾配を含む標準技法
（Zarling、Carter等、Journal of Immunology、
Vol123、63−70頁、1979；及び同Vol124、1852
−1857頁、1981を参照のこと）により分離された
ヒト−免疫ナチユラルキラー（NK）細胞を含有
するウエル中に直接放出した。次にペトリ皿を８
時間インキユベートし、この後標準法を用いて
NK細胞を再分離し、そしてヒト−腫瘍標的細胞
K562を殺す能力について試験した（上記の文献、
及びさらにMarx、Science、Vol210、624−626
頁、1981を参照のこと）。タバコＡ、Ｂ、Ｃ、及
びＤからの煙に暴露された結果として、NK細胞
の殺滅力は約30〜100％増加したと考えられる。
「対照」タバコからの煙は増強能力を示さず、こ
の効果は非特異的なものではなく、むしろ目的を
もつてタバコに添加されたインターフエロン含有
成分及びインターフエロン誘発物質により生ずる
ことが示された。 例 ３ 志願者は、こんどは異なる標的細胞及び処理さ
れたタバコの拡大されたパネルを用いて上記の実
験を反復した。この場合、標的細胞は、正常な固
体の血中で循環している細胞から誘導されたヒト
−マクロフアージ（プラスチツクペトリ皿への付
着によつて定義される）から成る（Zarling、前
記；さらにSchultz及びChirigos、Cancer
Research、Vol38、1003−1007頁、1978を参照の
こと）。この場合、NK細胞は、表面に付着しな
いので、最初に廃棄し、そして残留するマイクロ
フアージを、ウシ胎児血清を補給したRPMI1640
培地に、生存段階に保持した。インターフエロン
タバコの拡大されたパネルは、上記の（タバコ
Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）並びにクローンA2と称さ
れる凍結乾燥された合成（細菌製）ヒト白血球イ
ンターフエロン（さらにGoeddel D.V.等、
Nature、Vol290、20−26頁、1981）100000IRU
を含有するＥから成る。マイクロフアージ活性化
物質を、煙に暴露してから12時間後の鉄粒子の拡
大により測定した。しばらくの間、細胞を、加湿
した５％CO2室中に37℃にて保持した。例１及び
２の場合と同様に、インターフエロン担体タバコ
からの煙に暴露されたすべてのヒト−マクロフア
ージ標品は一貫して活性化されたが、「対照」タ
バコからの煙は効果を示さなかつた。 例 ４ 志願者は、ヒト−腫瘍HL60細胞を含有する新
しい標的組織培養ウエルを用いて実験３（タバコ
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）を反復した。HL60細
胞は、そのもとの細胞構成から示唆されるよう
に、非常に悪性の白色病腫瘍細胞であるが、しか
しながら、インターフエロンへの暴露により一定
比率の細胞が形態学的に変化し、そして成熟及び
正常細胞の形態及び機能への復帰が示される
（Carter、PO1CA295445及びこれに引用された文
献）。各々の煙の流れに暴露した後、HL60を含
有するペトリ皿を加湿された５％CO2室中の
MEM培地中、37℃に保持した。次の５〜10日間
において48時間ごとに、細胞をインターフエロン
含有煙に反復して暴露し、そしてCO2室中で再イ
ンキユベートした。実験開始後約７日から始めて
そして14日間続けて、インターフエロン処理
HL60培養物（タバコＡ〜Ｅのインターフエロン
フイルターを通つた煙に暴露された）は、対照培
養物に比べて、成熟及び正常な発達の漸進的な微
候を示す。成熟及び正常化への復帰の微候には、
細胞核の漸進的な分裂、核小体のゆるやかな消
滅、及び核の大きさの縮小、細胞質顆粒形成の証
明、成熟多形核白赤球例えば正常なヒト末梢血中
に存在するものへの分化の証明、が含まれる。 例 ５ に記載したようにしてアルブミンを伴つて又
は伴わないで調製されそして凍結乾燥されたイン
ターフエロンを、１mlの蒸留水に溶解し、そして
種々の温度でポリエチレン容器に貯蔵した。間隔
をおいてアリコートを採取し、そしてインターフ
エロンの抗ウイルス活性を測定した。結果を次の
第１表に示す。
断片を喫煙可能なタバコ製品に加えることを含ん
で成る該製品に薬剤付与する方法。 ２ インターフエロンが安定化されている請求の
範囲第１項記載の方法。 ３ 前記インターフエロンを担体に付加すること
によつて安定化を行う請求の範囲第２項記載の方
法。 ４ 前記担体が血清アルブミンである請求の範囲
第３項記載の方法。 ５ 担体がチトクロームＣである請求の範囲第３
項記載の方法。 ６ 前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第１
項記載の方法。 ７ 前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第１
項記載の方法。 ８ 前記製品がパイプタバコである請求の範囲第
１項記載の方法。 ９ ヒトの体中でインターフエロンの産生を誘発
する物質を喫煙可能なタバコ製品に加えることを
含んで成る該製品に薬剤を付加する方法。 １０ 前記物質が二重鎖RNA、ピランコポリマ
ー、ポリアニオン、及びリンホカインから成る群
から選ばれる請求の範囲第９項記載の方法。 １１ 前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第
９項記載の方法。 １２ 前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第
９項記載の方法。 １３ 前記製品がパイプタバコである請求の範囲
第９項記載の方法。 １４ 外部的に適用されたインターフエロンを含
有する喫煙可能なタバコ製品。 １５ 前記インターフエロンが安定化されている
請求の範囲第１４項記載の製品。 １６ 前記インターフエロンを担体に付加するこ
とにより安定化を行う請求の範囲第１５項記載の
製品。 １７ 前記担体が血清アルブミンである請求の範
囲第１６項記載の製品。 １８ 前記担体がチトクロームＣである請求の範
囲第１６項記載の製品。 １９ ヒトの体内でインターフエロンの生産を誘
導する外部から適用された物質を含んで成る喫煙
可能なタバコ製品。 ２０ 前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第
１９項記載の製品。 ２１ 前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第
２０項記載の製品。 ２２ 前記製品がパイプタバコである請求の範囲
第１９項記載の製品。 ２３ 前記物質が二重鎖RNA、ピランコポリマ
ー、ポリアニオン及びリンホカインから成る群か
ら選ばれる請求の範囲第１９項記載の製品。 明細書 幾つかの特許が、一般的に（A.B.Kleinの米国
特許第977635号；J.L.Jordan等の米国特許第
1974242号；S.S.Fredericksonの米国特許第
2418296号；P.Speiser等の米国特許第4021364
号）、ビタミンによる（A.Viscardi等の米国特許
第2198188号；G.Fachini等の米国特許第2890973
号；B.Stoneの米国特許第3244180号：J.
Waterbury等の米国特許第3339558号；M.J.
Waterbury等の米国特許第3667478号）、電荷によ
る（R.Roystenの米国特許第3240212号）タバコ
への薬剤付与を試みている。これらの薬剤付与
は、それ自体の有利性、又は喫煙者により吸引さ
れる煙の毒作用、例えば生長の抑制、呼吸困難、
枯草熱、癌、気腫及び心臓疾患を中和しもしくは
軽減することを目的としている。これらの特許
は、思うに、タバコの喫煙によつて消耗される生
物学的化合物の保存修復のための手段、又は喫煙
の疑わしい悪い効果に対向するための手段を提供
するが、これらは薬剤の別々の投与によりもたら
される効果よりさらに効果的な薬剤付与を目的と
していない。今や、これらの得られる結果を考慮
して、発明者は、たばこの煙と相乗的に作用する
薬物を使用することにより実質上さらに良好な結
果が得られるものと予想する。この発明は、タバ
コを天然薬物であるインターフエロンと組合わせ
ることによる相乗作用に関し、インターフエロン
の活性は喫煙の条件により強調され、そして喫煙
によつて撹乱される細胞を標的にする。この発明
はさらに、インターフエロンを安定化し、その生
物学的活性を、タバコ製造、貯蔵及び使用の通常
の条件を通じて保持することができる新規な方法
を提供する。 インターフエロンはまず有効な抗ウイルス剤と
して特徴付けられ（Isaacs及びLindenmann、
Proceedings Royal Society London、シリーズ
B.Vol147、258−276頁、1957）、そして以来抗生
長（抗癌）活性を有することが見出された
（Paucker等、Virology、Vol17、324−334頁、
1962）（Gresser編、InterferonVol.2、13〜46頁、
1981においてTaylor−Papadimitriouにより総説
されている）。インターフエロンはさらに腫瘍免
疫系を活性化する（Trinachieri等、Journal of
Experimental Medicine、Vol147、1299−1305
頁、1978）。発明者はまず、インターフエロンが
適当な濃度において実際にある種の悪性細胞を、
「分化」と称する過程又は細胞成熟を通して正常
細胞に変えることができることを推定した
（Carter等、1980年７月に提出された特許明細書
POICA29545；Gillespie及びCarter、Texas
Reports in Biology and Medicine、41：37−
42、1981−82）。Gillespie及びCarterにより行わ
れた（前記）実験的証明は、腫瘍細胞が成熟又は
正常な発達過程を通じて正常になるように方向付
けられる時間にわたつて、その腫瘍細胞がインタ
ーフエロンに暴露されれば、インターフエロンは
癌をその初期の段階において除去することができ
るとする発明者の推論を支持する。 この発明はたしかに、悪性細胞の最初の小さい
巣が発生する身体の部位に反復的且つ効果的にイ
ンターフエロンを供給する有効な方法が工夫され
れば、腫瘍細胞がヒトの体内に発生する際にそれ
らの細胞は除去されるであろうことを予想させ
る。このような腫瘍の巣がもしチエツクされずに
放置されれば、通常それらの局所的拘束を越えて
拡散し、最終的には兆候ある病気と死をもたらす
であろう。さらに、発明者は、肺癌を有する個体
は、体中でのインターフエロンの不適当な関与か
ら生ずると考えられる免疫監視系の不全を有する
という証明を得た（Strayer、Carter等、印刷中、
1982）。 従つてこの発明は、インターフエロンと、イン
ターフエロンによりその不利益な効果が防止され
る物質であつてその製造、貯蔵又は使用がインタ
ーフエロンの生物学的活性と適合しない物質とを
組合わされることを目的とするインターフエロン
の安定化に関する。発明者が記載するインターフ
エロンの安定化のための２つの方法は新規であ
り、そして自明でない。 重要な例として、この発明は、インターフエロ
ンと、集合的にタバコと称する喫煙物との組合わ
せを目的とするインターフエロン蛋白質の安定化
に関する。この組合わせは相乗的である。これ
は、インターフエロンの効果がタバコの煙によつ
て加温された細胞において高められるために相乗
的である。すなわちHron及びBergにより発見さ
れた低温効果である（Nature274：508−510、
1978）。この研究において、２〜３℃という小さ
い環境温度の上昇が、白血病細胞の生育を阻害す
る低投与量のインターフエロンの効果を約800％
増大せしめることを示した。さらに最近において
は、Delbruck等（Biomedicine33：239−241、
1980）は、骨肉腫細胞を殺すインターフエロンの
効果が、37℃から39℃への２℃の温度上昇により
100位上昇することを示した。タバコから出る煙
の温度は40〜50℃である（Repart of Surgeon
General、Department of Health、Education
and Welfare、1979、14頁、36）から、口腔、咽
喉、及びおそらく肺の細胞表面が実質上上昇し、
そしてこれらの細胞に運ばれるインターフエロン
の効果を強化するであろう。さらに、疎水性安定
化インターフエロンは、煙の成分、例えば３，４
−ベンゾピレンのごとき疎水性発癌物質及びこの
発癌物質を担持する粒子と結合し、そして従つて
インターフエロンが特異的に煙の発癌物質により
撹乱された細胞、すなわち潜在的癌細胞に集中す
る。さらに、Horoszewic等により示されたよう
に（Science206：1091−1093、1979）、インター
フエロンは腫瘍細胞、例えば前の喫煙により生じ
た細胞と選択的に相互作用するから相乗的であ
る。最後に、インターフエロンが喫煙と同時にそ
して局所的に適用されるから相乗性が強化され
る。喫煙者によつて摂取されるインターフエロン
量は、喫煙されたタバコの数、すなわち発癌物質
への露出に直接関連する。さらに、インターフエ
ロンが喫煙物の構成部分であるから、喫煙者が喫
煙前にインターフエロンの補給を失念することが
ない。従つて、引続いて又は同時に適用されたイ
ンターフエロンが喫煙によつて生じた癌に対して
有効である可能性は明らかであるが、本発明者が
発見したインターフエロンとタバコとの相乗作用
は明らかではなく、そしてタバコと組合わせるた
めのインターフエロンの安定化のために適する手
段は自明ではない。 タバコの煙をふくむ空気中環境汚染物は、肺癌
及びおそらく他の癌の機会を増加するであろう
が、潜在期間が長く、そのため早い段階におい
て、生じた癌を効果的に阻止し、そして根絶する
ことは不可能であつた。多くのヒトの癌は、この
疾患に対する身体的物質（先天的又は後天的）を
有する固体が環境的引金と称する第２の事実に反
復して暴露された結果である（U.S.Depertment
of Research、1971−1981、における総説、1981
を参照のこと）。この発明は、肺癌の発生に関す
る上記の両条件を正しくする方法すなわち、(1)外
来性インターフエロンを身体組織に与えて体自体
によるインターフエロンの産生の不足（先天的又
は後天的）を補足し（これによつて癌に対する免
疫不全を回復せしめ）、そしてさらに(2)毒性発癌
物質の癌促進効果（これはある場合には身体的防
御系を圧倒する）を攻撃し、そして最終的には、
投与されたインターフエロンの追加の局在効果、
すなわち悪性細胞を「分化」の過程を通じて直接
正常化することにより除去する方法を含む。 この発明の目的は、多くの有用な効果を有する
天然物質を身体の特定の部分に移行せしめること
を促進するために規則的喫煙の利益を得ることで
ある。 タバコ製品へのインターフエロンの導入は、イ
ンターフエロンを病気に冒された口腔、肺及び鼻
に移行せしめる新規な方法を提供し、この方法は
種々のインターフエロン効果、例えばインターフ
エロンによりもたらされる種々の防御効果を発生
せしめ、この防御効果は、可能性ある発癌物質を
含む種々の空中環境汚染物に長期間暴露された場
合に生ずる癌細胞を包括的に除去するものであ
る。この結果、この発明は、種々の癌、特に肺、
咽喉及び口腔中に生ずる癌の発生率を低下せしめ
るはずである。この発明はさらに、他の疾患、例
えば外来性粒状物の慢性的吸入により生ずる疾患
（気腫及び慢性気管支炎に関連する）、及び空気伝
染性のヒト−ウイルスにより生ずる疾患（肺炎、
インフルエンザ症候群、感冒等の種々の感染性疾
患に関する）に対する身体の全体的耐性の増加に
関しても試験した。試験管内試験におけるこれら
の結果（例を参照のこと）は、個体によるこの発
明の規則的な実行（すなわち種々のタイプのイン
ターフエロンを含浸せしめたタバコの喫煙）が、
多くの有利な身体的効果、例えば癌の率の低下、
気腫／慢性気管支炎の率の低下、並びにウイルス
性及び感染性疾患の減少に伴う一般的に良好な健
康状態をもたらすことを示した。あるタイプの血
管系疾患に対する感受性の低下は、ヘビースモー
カーにおいて増加するが、インターフエロンが血
管壁の閉塞（閉鎖）に寄与するある種の因子に拮
抗する場合にも生ずるであろう。 この多数の有利な効果を達成するために、すべ
てのタイプのインターフエロン及びすべてのタイ
プのインターフエロン誘発物質（体内でインター
フエロンの産生を開始させる物質）とタバコとを
組合わせる方法が提供される。この方法は、癌及
び他の危険な疾患の発生率を低下せしめることに
より、ヒトにとつて明らかに有用であり、これら
の疾患の危険な効果は、傷つきやすいそして／又
は早期に病気にかかつた細胞と物理的に並行して
反復して投与されたインターフエロンにより中和
される。この方法はさらに、ヒトの体の入口にお
いて高濃度のインターフエロンの局在した効果に
より対抗を受けるあらゆる種類の他の発癌物にも
適用できよう。 しかしながら、天然のヒト−インターフエロン
は蛋白質の１群であり、そして蛋白質の生物学的
活性は、ある条件〔例えば、熱的変化、酸／アル
カリ環境、撹流、及び／又は剪断効果（渦流）
等〕のもとではしばしば感受性である（破壊され
る）。インターフエロンの生物学的活性の感受性
を低下せしめるために、発明者はさらに、新しい
クラスのインターフエロンを導入した。このイン
ターフエロンは天然又は合成インターフエロンの
断片であり（成分又は特定のアミノ酸配列）、広
範囲の種類の異る環境条件のもとで所望の生物学
的活性を保持する点において分子の安定性をもた
らすものである。この断片は典型的には、インタ
ーフエロンの正常な分子の長さの約10〜15％であ
ればよく、通常の約162の構成アミノ酸ではなく
むしろせいぜい25〜45アミノ酸である。完全な長
さのヒト−インターフエロンからのこれらの必須
アミノ酸断片（配列）の決定は、脊椎動物の進化
の過程で保存された種々のインターフエロンの領
域の発明者等による新規な解析（コンピユーター
により促進される）により可能にされた。好まし
い物理−化学的性質に加えて、インターフエロン
断片又は配列はさらにコスト／効果の観点から有
用であり、サイズが小さいことにより、全インタ
ーフエロン分子のコストの小部分により、そして
多様な製造方法、例えば組換DNA技法、固相合
成等により大規模生産が可能になる。 しかしながら、発明者は、インターフエロンの
安定なそして生物活性を有する断片の製造及び試
験は、この発明を実施する場合に満足できない遅
延をもたらすことを認識する。従つて、発明者
は、分子がとりうる異る状態の数を限定すること
により天然インターフエロンを安定化させるため
の簡単で経済的な手段を発明した。発明者は、イ
ンターフエロンと他の基剤、通常は蛋白質との間
の弱い疎水性相互作用を生起させることにより、
このことを達成した。 発明者は、紙巻タバコを含むタバコ製品とイン
ターフエロンとを組合わせる。発明者は、高温、
破壊的化学物質及び長期間の貯蔵に直面した場合
に生物学的活性を保持するために、「インターフ
エロンの断片」を用いることにより、そしてイン
ターフエロンとある種の担体を組合わせることに
よりインターフエロンを安定化するための必要か
つ新規な手段を記載する。 安定化されたインターフエロンの幾つかは煙の
粒子と結合し、これによつて病気にかかつた細胞
に集中し、インターフエロンを別々に例えばアト
マイザーを用いて導入したのでは不可能なインタ
ーフエロンとタバコの煙との間の相乗作用が得ら
れる。 従来技術の簡単な記載 Carter W.A.、1979、Life Sciences25：717−
728；Carter W.A.等、1980、Program Grant
Proposal POICA 29545 the National Cancer
Institute；Carter W.A.及びHoroszewicz J.S.、
1980、Pharmacology and Therapeutics ８：
359−377；Isaacs及びLindenmann、
Proceedings Royal Society London、シリーズ
Ｂ Vol147、258−267頁（1957）；Paucker等、
Virology Vol17、324−334頁（1962）；Taylor
Papadimitriou、「Interferon」（Gresser編）、
Vol2、13−46頁（1981）；Derynk等、Nature、
Vol285、542−547頁（1980）；Goeddel等、
Nature、Vol290、20−26頁（1980）；Shepard
等、Nature、Vol294、563−565頁（1981）。 発明の要約 生物学的活性及び強化された安定性を有するイ
ンターフエロンの断片の製造及び精製方法及び組
成物が提供される。インターフエロンの断片又は
全インターフエロン（又はインターフエロン誘発
物質）とタバコとを組合わせて、タバコの煙に暴
露された細胞に対する強化されたインターフエロ
ン効果を得る方法及び組成物が提供される。多く
の好ましい、そして有利な結果が得られる。 (1) インターフエロン及び喫煙は、癌細胞の発
生、呼吸器ウイルスの感染等に対して監視する
ために相乗的に作用する。このような好ましい
医療的効果の発生におけるインターフエロンの
生物学的効果は、タバコの煙中の上昇した温度
により増強される（Horon及びBergにより発
見された高温効果、Nature274：508−510、
1978）。 (2) インターフエロンが無毒と推定される薬剤
（揮発性物質又は粒状物）と同時に標的ヒト細
胞に移送され、細胞が悪性化し続けるのではな
くむしろ正常化することを促進するため、喫煙
者に対する発癌効果は種々のヒト組織の入口部
分において克服される。 (3) 肺微小環境において非毒性外来性粒状物を清
掃し、飲み込み、そしてさもなければ破壊し、
これによつて慢性気管支炎、気腫等の衰弱及び
疾患の発生を防止することにより肺を正常に保
つ細胞（マクロフアージ）の効果を増加せしめ
るこの発明の証明された可能性により、外来性
粒状物（分子状炭素等）の気管支破壊効果が最
小となり又は除去される。 (4) 低いインターフエロンレベルによる肺におけ
る局所的な免疫不全はこの発明により直接修正
され、そしてさらに、肺を通過し、蓄積された
インターフエロンに一時的に暴露されることに
より能力が増大した免疫細胞（体の全免疫系の
一部分を構成する）は次に体の他の部分に循環
することが合理的に信じられる。こうして、イ
ンターフエロンは局所的に投与されても増加し
た、そして最終的に体の種々の他の部分に拡散
される有利な効果（全身的効果と称する）を有
するであろう。このような効果は、病理的過程
により動脈及び静脈を閉塞する全体的過程にお
ける成分である血小板生長因子の不活性化のご
とき他の好ましい全身的効果有することができ
る。 (5) ヒトの全呼吸器（鼻、口、咽頭、気管、肺
等）にわたるウイルスへの暴露は非常に高い組
織の抵抗に合うであろう。インターフエロンの
抗ウイルス作用は種々の体の領域に拡散するか
らである。この発明が規則的に実行される場合
はいつでも、呼吸組織上の生物活性を失つたイ
ンターフエロンは常に新鮮で活性なインターフ
エロン分子により置き換えられるであろう。 発明者は、インターフエロンとタバコを含むタ
バコ製品を組合わせる。発明者は、高温、破壊的
化学物質及び長期間の貯蔵に直面して、インター
フエロンの断片を使用することにより、そしてイ
ンターフエンロンとある種の担体を組合わせるこ
とによりインターフエロンを安定化する必要且つ
新規な手段を記載する。安定化されたインターフ
エロンの幾らかが煙粒子と結合し、そしてそれに
より病気にかかつた細胞に集中し、インターフエ
ロンを例えばアトマイザーにより導入することに
よつては不可能なインターフエロンとタバコの煙
との相乗作用が得られる。 発明者は、ある大きな人口群が、癌、及び種々
のウイルスに関する病気を含む他の危険な病気に
対して通常より大きな危険を有することを見出し
た。癌に対する増加した素質を生じさせる遺伝的
欠陥のためにこれらの群の危険がより大きいので
ある。これらの欠陥は、前記の人口群が空気中発
癌物質又はウイルスに環境的に暴露された場合に
特に拡大される。この発明は、インターフエロン
及びその断片並びにインターフエロン誘発物質に
より体の免疫監視系を強化することによりこれら
の欠陥の修正をもたらす。癌又はウイルスに増加
した危険（一般より大きな）を有する個体におい
て、免疫監視細胞はしばしば不十分である。発明
者は、このような細胞が肺組織を正常に一時的に
通過する間における、このような細胞のインター
フエロン（タバコ製品の使用によりすでに与えら
れそして蓄積している）に対する短時間の暴露
が、不十分な細胞活性を修正し、そして活性な癌
防止機能を回復するのに十分であることを見出し
た。 具体的な態様の記載 この発明は、生物活性を保持しながら高い安定
性を得るためにインターフエロン分子の一部分を
除去し又は変形する新規な実行を採用する。この
発明の方法は、タバコの煙により影響を受けた組
織において生ずる癌細胞の連続的分子的監視及び
除去を行うためにインターフエロンとタバコを組
合わせることによる相乗的組合わせを提供する。
「たばこ」は葉まきたばこ、パイプたばこ等を含
むすべての喫煙物を意味する。「インターフエロ
ン」及び「インターフエロンの断片」なる語は、
互換的に使用され、天然インターフエロン、並び
にペプチド部分及び炭水化物部分の変形を伴うす
べての変形物を含み、ヒトの細胞のみならず、細
菌、酵母、モンキー細胞等を含むヒト以外の細胞
において生産されたものも含む。さらに、この発
明は、例えば天然インターフエロン又はその誘導
体を疎水性担体に結合することにより、これらの
分子がとりうる異る状態の数を限定することによ
り、これらを安定化せしめる方法を記載する。 この発明の方法は次の段階に分けられよう。 インターフエロン領域の認識。 選択された領域を有するインターフエロン断
片の調製。 担体によるインターフエロンの安定化。 インターフエロン断片及び全インターフエロ
ン分子とタバコとの組合わせ。 インターフエロン誘発物質／活性化物質とタ
バコとの組合わせ。 インターフエロン領域の認識 インターフエロンをコードする遺伝子はクロ
ーン化されている（例えば、Derynk等、
Nature、Vol285、542−547頁、1980）。これ
らの遺伝子は配列決定され（Goeddel等、
Nature、Vol290、20−26頁、1980；Derynk
等、Nature、Vol285、542−547頁、1980）、
そして種々のインターフエロンの９個の一次構
造か決定された。コンピユータープログラムを
用いて、本発明者はインターフエロン系の幾つ
かの生物学的性質に必要な領域を決定した
（Gillespie及びCarter、Handbook of
Experimental Pharmacology of Interferon、
Volume71、Berlin；Spring−Vealag、pp45
−63、1984）。 抗ウイルス反応を生じさせるインターフエロ
ンの先祖アミノ酸配列は配列25−40及び115−
141を含む（第１図）。すべてのインターフエロ
ンは抗ウイルス反応及び抗新生物反応の両方を
生じさせるから、この領域の位置は、インター
フエロンの１つの種から他の種にわたるこの領
域の一次アミノ酸配列の保存性を基礎にして推
定され、この保存がmRNA（メツセンジヤー
RNA）又は蛋白質の形態の保存によつて説明
されない場に特にそうである。生物学的反応領
域は外界に露出されており（第２図及び
Gillespie及びCarter、1982）そして他の細胞
成分との相互作用を促進するであろう。
Streuli等（Proceedings National Academy
of Sciense、U.S.A.、Vol78、2848−2852頁、
1981）は、ある範囲の宿主細胞において生物学
的活性を生じさせるためにはインターフエロン
分子の両端が必要であると提案した。 特定の細胞受容器に結合するために必須であ
ると決定されたインターフエロン領域はアミノ
酸115−141を含有する（Gillespie及びCarter、
1982）。この領域の位置は、部分的に決定され、
又はコレラトキシンのＢサブユニツト（Lai、
Journal Biol.Chem.Vol252、7249−7256頁、
1977）、すなわち受容器と結合するためにイン
ターフエロンと競争する物質との相同性によつ
て促進される。 タバコに生物学的監視を与えるために少なく
とも２つのインターフエロン断片が有用であ
る。１つの断片は生物学的反応領域それ自体か
らなり、純粋であり又は感受性細胞への移入を
促進する他の部分と結合している。第２の断片
は、受容器結合領域に隣接する生物学的反応領
域から成る。完全ポリペプチド及び補欠分子
族、それへの付加又はそれからの欠失、又はこ
の両者、又はこの変形を含む他のインターフエ
ロン断片もま、有用であろう。 さらに、この発明は任意の天然の又は合成的
に（細菌又は酵母）調製された全インターフエ
ロン分子〔一般にα（白血球型）、β（線維芽細
胞型）又はγ（免疫型）インターフエロンと称
する〕を用いて実施することができる。インタ
ーフエロン断片の利点には、安定性、タバコか
ら肺への移入の容易さ（分子量が小さいため）、
より良好な組織への透過性及び低い抗原性が含
まれる。 選択領域を有するインターフエロン断片の調
製 インターフエロンの断片は幾つかの方法で調
製することができる。例示により１つの適当な
方法を次に記載する。他の方法、例えば天然イ
ンターフエロンの化学的変形又はクローニング
された（合成）完全インターフエロンの化学的
変形、インターフエロン誘導体、等も容易に明
らかであり、そしてこの発明の範囲である。 クローニングされたインターフエロン遺伝子
は、特定の制限エンドヌクレアーゼを用いて特
定の場所で切断することができる（第３図）。
得られたインターフエロン遺伝子断片はインタ
ーフエロンポリペプチドの断片をコードしてお
り、これをRNAポリメラーゼプロモーター、
リボゾーム結合部位、開始コドン及び他の必要
なシグナルを含有する発現ベクターと融合せし
めることができる。この組換DNAは、インタ
ーフエロンの断片を合成するために適当な宿主
細胞に導入することができる。 ポリＡ・dTに連結されそしてpBR322中でク
ローニングされたヒト−インターフエロン−β
の遺伝子5μｇを、37℃にて２時間、20ｍＭの
トリス、PH7.4、10ｍＭのMgCl2、50ｍＭの
（NH4）2SO4及び100mg／mlのウシ血清アルビミ
ン中50ユニツトのEndoR・P1と共にインキユ
ベートすることによりインターフエロン遺伝子
を塩基203−206の単鎖を残して切断した（第３
図）。DNAを酢酸カルシウムにおいて0.3Mと
し、そしてエタノールから沈澱せしめた。
DNAを、100mlの50ｍＭ燐酸カリウム、PH7.4、
6.7ｍＭのMgCl2、１ｍＭのメルカプトエタノ
ール、35ｍＭのデオキシアデノシン及びデオキ
シシチジン、並びにエセリヒア・コリDNAポ
リメラーゼのクレノウ断片25ユニツト、に溶解
した。DNAを酢酸カリウムについて0.3ｍＭと
し、そしてエタノールから沈澱せしめた。沈澱
を100mlの30ｍＭ酢酸ナトリウム、PH4.6、50ｍ
ＭのNaCl、１ｍＭのZnSO4、５％のグリセリ
ン及び25ユニツトのS1ヌクレアーゼ、に溶解
し、そして37℃にて１時間インキユベートし
た。これにより平滑末端を有する、ヌクレオチ
ド204までの完全なインターフエロン遺伝子断
片が生成し、第１は、45位のロイシンをコード
するコドンに存在した（第１及び３図）。酢酸
ナトリウムを0.3Mになるように加え、そして
DNAをエタノールから沈澱せしめた。 別に、ポリdA・dTに連結されそして
pBR322中でクローニングされたヒト−インタ
ーフエロン−βの遺伝子５ｇを、37℃にて２時
間、10ｍＭのトリス、PH7.9、６ｍＭのKCl、
10ｍＭのMgCl2、１ｍＭのジチオスレイトール
及び100mg／mlのウシ血清アルブミン中50ユニ
ツトのEndo Ｒ Mboと共にインキユベート
した。DNAをエタノールから沈澱せしめ、そ
して上記のようにしてS1ヌクレアーゼにより
処理した。インターフエロン遺伝子のヌクレオ
チド401−688を含有する288塩基対の平滑末端
断片を、３％アガロースによる電気泳動により
精製した。この断片のアリコート25mgを、Pst1
処理し、DNAポリメラーゼ処理しそしてS1ヌ
クレアーゼ処理したDNA5μｇと共に導入し
た。 ２つのDNA断片から成る沈澱を、10ユニツ
トの殺菌性アルカリホスフアターゼを含有する
PH8.0の10ｍＭトリス10mlに溶解し、そして37
℃にて２時間インキユベートした。次に溶液
を、2.3Mの酢酸ナトリウムにより100mlに稀釈
し、65℃にて30分間保持し、CHCl3にて抽出
し、次にエタノールから沈澱せしめた。沈澱
を、10mlの70ｍＭトリス、PH7.5、100mlの
KCl、10ｍＭのMgCl2、５ｍＭのジチオスレイ
トール、300ｍＭのリボアデノシントリホスフ
エート、１ユニツトのポリヌクレオチドキナー
ゼ及び10ユニツトのT4DNAリガーゼに溶解
し、そして37℃にて２時間インキユベートし
た。 こうして得られたDNAは、アミノ酸46−111
が欠失したインターフエロンポリペプチドをコ
ードする、ヌクレオチド205−400を欠失したイ
ンターフエロン遺伝子を含有していた。 次の例において、この物質を「インターフエ
ロン断片ポリペプチド」と称する。 この組換インターフエロン断片は、常用の技
法を用いて、細菌又は哺乳動物細胞中で発現せ
しめるために適する多くのベクターに挿入する
ことができる。インターフエロン又はインター
フエロン断片は、標準的方法により精製するこ
とができる。但し、この発明は、有害な物質が
存在しない限り１％未満のインターフエロンを
用いて実施することができる。例えば、インタ
ーフエロンを含有する溶液中の蛋白質は、エチ
レン又はポリエチレングリコールの非存在下で
シバクロームブルー（Cibachrom blue）セフ
アロースに結合する。カラムを、インターフエ
ロン以外の蛋白質のほとんどを除去する種々の
溶液で洗浄し、そしてインターフエロンを、エ
チレンもしくはポリエチレングリコール、又は
他の適当な溶離剤を含有する溶液により溶出す
る（Carter等、Pharmacology and
Therapeutics、Vol8、359−377頁、1980）。所
望により、結合及び溶出のための常用の条件を
用いて、インターフエロン含有溶剤を抗−イン
ターフエロン抗体を含有するカラム基剤に通す
ことにより、シバクロームブルー画分又は他の
材料の精製をさらに行うことができる。 上記の組換DNAは、同じ酵素の幾つか又は
すべてを異る条件下で又は異る順序で使用し
て、あるいは上記の酵素又はインターフエロン
遺伝子の変形を用いて調製することができる。
他の適当な組換DNAは他の酵素及び他の方法
を使用して形成することができる。最後に、イ
ンターフエロンの断片を得るために組換DNA
を使用することは、インターフエロンの断片を
生成せしめるための方法の単なる例示である。
他の手段、例えば固相合成、無傷の材料、又は
細菌及び酵母中で調製された遺伝的にクローニ
ングされたインターフエロンの蛋白質分解的切
断を、同様に用いることができる。 担体によるインターフエロンの安定化 インターフエロンは、他の蛋白質と同様に、
比較的不安定な化学物質である。水溶液中の溶
解性及び生物活性は、種々の線状に配列したア
ミノ酸の非常に特異的な三次元配置に依存する
（第１図参照）。具体的には、細胞への結合及び
複雑な生物反応の惹起のために機能するインタ
ーフエロン分子の領域は適切に露出されそして
整列されていなければならない。しかしなが
ら、他の非機能的方向の多くの配列も可能であ
り、自由に形成され得る。これらの異る状態は
熱、ある種の外来性化学物質及び長期に及び貯
蔵により助長される。 異る不活性状態の形成を防止するための１つ
の解決方法は、IFN活性を示すが限定された数
の異る状態を有する分子、すなわち．に記載
したインターフエロン断片を形成することであ
る。本発明者によつて開発された他の解決方法
は、インターフエロンを担体分子又は構造上に
固定化することにより異る状態の形成を制限す
ることである。 活性酵素はしばしば、細胞膜、核酸、蛋白質
等に結合した複合構造の部分として見出され、
そして酵素は通常、複合した状態においてより
安定である。このような方法の実施可能性を評
価するため、本発明者は、効果的な安定剤であ
ると考えられる種々のリガンドを含有する幾つ
かのカラム基剤を形成した（第２図、Carter
等、1980、Pharmac.Ther.8：359−377）。ア
ルブミンを結合せしめることによりカラムを特
徴付けた。１ml中に11500ユニツト及び0.99mg
の蛋白質を含有する100mlの透析してないイン
ターフエロン標品を、ペリスタルポンプを用い
て、60ml／cm2／時の流速でカラムに適用した。
アルブミンカラムを、0.15MのNaClを含有す
る0.02Mの燐酸ナトリウム（PH7.4）を用いて
平衡化した。カラムからの溶出液を流れ分割装
置により１：９の比率で分割した。溶出液の10
％の部分を、0.02Mの燐酸ナトリウム及び
0.15MのNaClを含有する血清アルブミンの１
％溶液１ml中に集め、そしてインターフエロン
活性の測定に使用した。溶出液の90％部分は蛋
白質濃度を測定するのに使用した。画分全体
に、適用した蛋白質の約98％が含まれており、
そして適用したインターフエロン活性の１％未
満が含まれていた。50（ｖ／ｖ）％のエチレン
グリコール及び50％の0.04M燐酸塩（PH7.4）
及び0.30MのNaClを用いてさらにカラムの溶
出を行つた。インターフエロン活性の残量（86
％）が非常にわずかのもとの蛋白質（２％未
満）を伴つて回収された。これらの実験の幾つ
かは最近公表された（CarterW.A.、Methods
in Enzymology78：576−582、1981）。 上記の実験は、インターフエロンは血清アル
ブミンと結合することができるが、他のほとん
どの細胞蛋白質は結合できないことを示した。
他の固定化蛋白質、例えばチトクロームＣを用
いる実験は、インターフエロンが蛋白質と結合
する一般的性質を有することを示した。本発明
者は、インターフエロンの強い疎水性が他の蛋
白質の通常はかくれている疎水性ポケツトと強
引に相互作用することを仮定し、そして上記の
実験はこの仮定が正しいことを示唆した。機構
のいかんにかかわらず、上記の実験は蛋白質と
の複合体の形成がインターフエロンを安定化せ
しめることを示した。 この目的で本発明者によつて開発された方法
は次の通りである。ヒト−インターフエロンを
任意の生物的分離源−ヒト−細胞、組換微生物
等−から任意の常用手段によつて分離すること
ができる。精製した後、ヒト−血清アルブミン
又は他の蛋白質性担体を過剰に、通常は３mg／
mlに加えることができる。溶液を燐酸緩衝化塩
溶液又は他の適当な緩衝液に対して透析し、そ
して凍結乾燥することができる。典型的な例に
おいては、100万ユニツトの精製インターフエ
ロンを3.46mgの燐酸ナトリウムと共に凍結乾燥
した。 この急速に変化する分野において、この方法
と多くの変法を用いることができる。アルブミ
ン又はチトクロームＣ以外の担体蛋白質を用い
ることができる。他の担体分子又は構造、例え
ば脂質、小疎水性リガンド、膜断片、又は固体
粒子も用いることができる。他の結合手段、例
えばイオン結合又は共有結合も適当である。他
の塩もしくは緩衝剤、又は塩もしくは緩衝剤の
他の濃度（塩又は緩衝剤を使用しない場合を適
用することができる。ある場合には透析は必要
ない。基本的に、この発明の目的はタバコと組
合わせることができ、そして生物学的活性を保
持することができる安定な形のインターフエロ
ンを提供することである。 インターフエロンの断片とタバコとの組合わ
せ この節において、「インターフエロン」は全
インターフエロン及び前に定義した「インター
フエロンの断片」を意味し、そして逆にこの節
において使用する「インターフエロンの断片」
は全分子をも含む。 知られているすべてのヒト−タイプのインタ
ーフエロンを本発明者の研究室において標準的
と認められる方法により調製した〔天然線維芽
細胞（β）インターフエロンについてはCarter
及びHoroszewicz、Pharmacology and
Therapeutics、Vol8、359−377頁、1980；天
然白血球（α）インターフエロンについては
Mogensen及びCantell、Pharmacology and
Therapeutics、Vol、369−381頁、1977；天
然免疫（γ）インターフエロンについては
Mizarhi、O′Malley、Carter等、Journal of
Biological Chemistry、Vol23、7615頁、1978
を参照のこと〕。 インターフエロンは、インターフエロンの生
物学的活性を保持し、そしてタバコの煙の吸引
によりインターフエロンが口腔を通つて肺に移
行するようにタバコに加えられなければならな
い。組合わせ方法の詳細は、好ましい生物学的
活性、例えば口びる、口腔、及び肺における抗
腫瘍効果、免疫的効果及び抗ウイルス効果を最
大にするものでなければならない。 インターフエロンの断片とタバコとを組合わ
せる若干の方法がこれらの基準を満たす。１つ
の典型的な例を下に記載するが、これは方法の
単なる適当な形にすぎないと考えられる。 インターフエロンの断片及び完全分子は及
びにおいて例示したようにして調製し、そし
て常用の方法及び装置を用いて微細な乾燥粉末
に凍結乾燥した。0.01〜100％純度のインター
フエロンが適当である。一般に、１部のインタ
ーフエロンと99部のヒト−アルブミン、フラク
シヨンの混合物を一緒に凍結乾燥して、所望
の大きさと稠度を有し不所望の生物的効果を有
しない粒子を得る。他の混合物も可能であり、
そして均等であると考えられ、これらにはイン
ターフエロンとセルロース粒子及び食塩のよう
な担体との組合わせが含まれる。但し上記の性
質（稠度、力価、副作用がないこと）が最終製
品の目的に一致することが必要である。インタ
ーフエロン含有粉末は、フイルター＋フイルタ
ー自体の長さまでの距離を実質上越えない距離
に所定量のインターフエロンを移動させるよう
に短時間継続する空気の吹き込みを用いて、あ
らかじめ製造されたタバコのフイルターの端に
吹き込むことができる。インターフエロン粒子
は酢酸セルロースのフイルターとゆるやかに混
合されそしてその中に付着する。この酢酸セル
ロースは強い結合によつて粒子を保持しない物
質である。この方法は酢酸セルロースのフイル
ターを有するタバコに限定されず、インターフ
エロンを永久的に化学的に結合せずそして酢酸
セルロース又は他のプレフイルターの添加によ
り変性され得る任意のフイルターを、任意の他
の種類のフイルターを含むタバコに含めること
も適当である。この発明の方法は、喫煙物の煙
の流路にインターフエロン粒子を混合したセル
ロース、酢酸セルロースのような基材を含める
ことによりフイルターなしタバコ、葉まきタバ
コ、パイプ及び他の喫煙物に適用することがで
きる。喫煙行為はインターフエロンとタバコを
組合わせるために使用したのとは逆の空気の流
れを生じさせ、そしてインターフエロンの粒子
を煙の中に引き出し、インターフエロンをタバ
コの煙に暴露される細胞に運ぶであろう。 インターフエロン粒子とタバコフイルター又
はプレフイルターを組合わせるための例示的な
装置を第４図に示す。常用の通気源…コンプレ
ツサー、インペラモーター、ダイアフラム等に
より空気流を供給する。空気がチユーブにそつ
て押出され、インターフエロン分散装置、例え
ば空中インターフエロン粒子の密度を均一に保
持するために撹拌され、あるいは乾燥され又は
構成された、そしてその所定量の内容物を分配
する室を通つてチユーブに流れる。第４図には
ピストン装置を図示したが、適当な量のインタ
ーフエロンをチユーブに供給できるものであれ
ば任意の装置を使用することができる。所定体
積の空気中粒子を、空気の噴流を発生させる直
前にチユーブに導入する。空気噴射の間、イン
ターフエロン粒子がタバコ中一定の距離に運ば
れる。このタバコは常法に従つて製造されたも
のである。空気噴射を停止し、そしてインター
フエロン粒子をフイルター材料に付着せしめ
る。そしてチユーブを次のタバコに移動せしめ
（又はタバコを移動せしめ）、そしてこの工程を
反復する。上記の方法は例として詳細に説明し
た。凍結乾燥により調製したインターフエロン
粒子をフイルターと組合わせるのに他の方法が
可能であり、この方法には、重力、噴霧、散
布、又は粒子の移動を生じさせる他の方法、あ
るいは電気的吸引、磁気的吸引、あるいはその
他のコート法又はプレート法により、インター
フエロン粒子をフイルターに付着せしめる方法
が含まれる。これらの方法及びその他の代り得
る方法がこの発明に含まれる。さらに、フイル
ター製造の任意の段階でインターフエロン粒子
をフイルターと組合わせることができるが、こ
の場合にはその後の段階においてフイルターを
850℃（ペプチド結合を破壊するために必要な
温度）以上に加熱してはならない。インターフ
エロンをフイルターとではなくタバコと組合わ
せ、又はあとでタバコに連結されるプレフイル
ターと組合わせることができる。インターフエ
ロンは、溶液又は半コロイドもしくはコロイド
として、フイルター材料、タバコ又はプレフイ
ルター上に、同様の結果をもつて付着させるこ
とができるが、この場合脱着効率は低い。これ
らの変法及びこの変化する分野における従来の
適用はすべてこの発明の部分であると考えられ
る。基本的には、この発明は、インターフエロ
ン分子、又はインターフエロンと粒子状又は非
粒子状の他の物質との生物学的に活性な形での
複合体から成るインターフエロン含有粒子と
を、喫煙物により生成した煙中に乗せることが
できるように、インターフエロン又はインター
フエロン粒子を固定化する基準を満足する。 上記の記載から、生物学的活性及び強化され
た安定性を有するインターフエロンの断片を生
成せしめ、分離し、そしてタバコに含有せしめ
ることができることが明らかである。従つてこ
の発明は、喫煙の潜在的に危険な効果に対抗
し、そしてヒトの呼吸系に、感冒、ウイルス等
に対する一般的保護効果が与えるための新規な
手段を提供する。幾つかのアミノ酸が欠失して
いるインターフエロン断片の使用は、天然抗癌
剤であるインターフエロンとタバコを組合わせ
る単なる例示である。インターフエロンのその
他の変形も可能であり、これにはアミノ酸の付
加、存在するアミノ酸の変化、及び除去、付加
又は変形による種々の糖補欠分子族の変化が含
まれる。 この発明に従えば、所望の性質、高い生物学
的活性、強化された安定性、タバコに含有され
そして煙中に放出される可能性を有するインタ
ーフエロン断片を操作するための方法が提供さ
れる。その結果、喫煙の潜在的に危険な効果を
克服することができ、そしてたしかに、喫煙者
の一般的健康の増進がはかられる。 前述の発明を、明確にしそして理解に供する
ために説明及び例により幾分詳細に説明した
が、添付した請求の範囲の範囲内において幾つ
かの変法又は変化を行うことができることは言
うまでもない。 インターフエロン誘発物質とタバコとの組合
わせ 体自体のインターフエロンの保留を促進する
合成化学物質を一般にインターフエロン誘発物
質又はインターフエロン誘発／活性化物質と称
する（「Selective Inhibitions ofViral
Functions」W.A.Carter編、Chemycal
Rubber Company、1973における総説を参照
のこと）。これらの誘発物質は、二重鎖RNA
（リボヌクレオチド）、又は種々の小分子量化学
物質、例えばポリアニオン、ピランコポリマー
等を含む化学的に多様な種類の化合物から成る
（さらに「Interferon」I.Creccer編、1981を参
照のこと）。 この発明は上記の種々の群の化学的及び／又
は生化学的物質のいずれかを用いて実施するこ
とができる。但しこれらの物質はタバコから一
慣して脱着し、そして呼吸空間に付着した後に
活性を現わし続けそして不所望の副作用を有し
ないものでなければならない。 これらの有効生を証明するために、２種類の
誘発物質、すなわちポリＩ・Ｃ及びアンプリゲ
ン（不均整RNAらせんから成る誘発物質につ
いての商標）を、タバコのフイルターの端に粉
末を軽くふりまくことによつてタバコフイルタ
ー上に凍結乾燥物の形で付着せしめた。第４図
に記載した例示的装置はまた、誘発物質を用い
て、又は誘発物質粒子とインターフエロン粒子
の任意の組合わせを調製するためにも使用する
ことができる。体外で行われた種々の試験にお
いて、２種類の物質の組合わせは通常より顕著
な、又は相乗的な、好ましい生物学的効果を生
じさせる。 例 例についての背景 ヒトの肺及び周囲の組織は、ガス交換（酸素の
受け入れと二酸化炭素の廃出）中における外来性
環境物質の攻撃に対して反応する多くの異る種類
の細胞から成る複雑な器官である。この発明の有
利な効果を評価するために、発明者は、体外で小
組織培養容器、ペトリ皿、又はウエルに維持され
た種々のヒトの生細胞を使用して、体外での呼吸
器防御系の成分を研究することを選択した。この
ような皿又はヒトの細胞を増殖せしめるための他
の装置において、ヒトの体内で生ずるであろう幾
つかのタイプの相互作用を刺激する方法で、生細
胞に煙をふきかけることができる。 例 １ 100000国際比較単位（IRU）の天然線維芽細胞
（β）インターフエロン（タバコＡ）、もしくは
に記載した100000IRUの天然βインターフエロン
断片ペプチド（タバコＢ）、又は10μｇの不均整
RNAインターフエロン誘発物質（Carter等、
Journal of Molecular Biology、Vol70、567
頁、1972）（タバコＣ）と同等の量を凍結乾燥物
の形で前もつて付加したフイルター型（酢酸セル
ロース）のタバコから、ヒトの志願者が吸入し
た。凍結乾燥したインターフエロン成分を含浸せ
しめたフイルターを通つて煙を吸引した後、すぐ
に、志願者は彼の口腔及び鼻を通して、煙を直接
に、血清を補給したRPMI1640培地中に保持され
たヒトの正常な生線維芽細胞を含有する開放ペト
リ皿に放出した。次にこのペトリ皿を二酸化炭素
（５％）にもどし、そして液体培地環境にさらに
10時間おき、この時間はインターフエロンの効果
が生じ得る時間であり、この後線維芽細胞におけ
るインターフエロン抗ウイルス活性をウイルス誘
導細胞病理効果の阻害の標準的測定法により測定
した（Armstrong J.A.、Applied
Microbiology、Vol21、723−725頁、1971を参照
のこと）。小水泡生口内炎ウイルスをチヤレンジ
ウイルスとした。インターフエロン含浸フイルタ
ーを通過し、そして次に志願喫煙者の口腔を通過
した煙を受理したすべての皿において、抗ウイル
ス状態の強力な証明が、存在する線維芽細胞中で
観察された。インターフエロン処理フイルターを
有しない「対照フイルター」を用いる同様の実験
において抗ウイルス効果は認められず、タバコの
煙それ自体は、チヤレンジウイルスに対してヒト
の組織を保護しないことを示した。 例 ２ 志願者は、すでに記載されている方法
（Mizrahi等、前記、1978）により調製された天
然ヒト免疫インターフエロン（γ）100000IRUを
含有する同じ方法で製造されたタバコＡ、Ｂ、
Ｃ、及びＤを用いて前記の方法を反復した。γイ
ンターフエロンは、蛋白質mg当り100000IRUを含
み、約１％の予想純度を有する。この場合、健康
なヒトの血液からの細胞を用いるフイコル−ハイ
パク（Ficol−Hypaque）勾配を含む標準技法
（Zarling、Carter等、Journal of Immunology、
Vol123、63−70頁、1979；及び同Vol124、1852
−1857頁、1981を参照のこと）により分離された
ヒト−免疫ナチユラルキラー（NK）細胞を含有
するウエル中に直接放出した。次にペトリ皿を８
時間インキユベートし、この後標準法を用いて
NK細胞を再分離し、そしてヒト−腫瘍標的細胞
K562を殺す能力について試験した（上記の文献、
及びさらにMarx、Science、Vol210、624−626
頁、1981を参照のこと）。タバコＡ、Ｂ、Ｃ、及
びＤからの煙に暴露された結果として、NK細胞
の殺滅力は約30〜100％増加したと考えられる。
「対照」タバコからの煙は増強能力を示さず、こ
の効果は非特異的なものではなく、むしろ目的を
もつてタバコに添加されたインターフエロン含有
成分及びインターフエロン誘発物質により生ずる
ことが示された。 例 ３ 志願者は、こんどは異なる標的細胞及び処理さ
れたタバコの拡大されたパネルを用いて上記の実
験を反復した。この場合、標的細胞は、正常な固
体の血中で循環している細胞から誘導されたヒト
−マクロフアージ（プラスチツクペトリ皿への付
着によつて定義される）から成る（Zarling、前
記；さらにSchultz及びChirigos、Cancer
Research、Vol38、1003−1007頁、1978を参照の
こと）。この場合、NK細胞は、表面に付着しな
いので、最初に廃棄し、そして残留するマイクロ
フアージを、ウシ胎児血清を補給したRPMI1640
培地に、生存段階に保持した。インターフエロン
タバコの拡大されたパネルは、上記の（タバコ
Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）並びにクローンA2と称さ
れる凍結乾燥された合成（細菌製）ヒト白血球イ
ンターフエロン（さらにGoeddel D.V.等、
Nature、Vol290、20−26頁、1981）100000IRU
を含有するＥから成る。マイクロフアージ活性化
物質を、煙に暴露してから12時間後の鉄粒子の拡
大により測定した。しばらくの間、細胞を、加湿
した５％CO2室中に37℃にて保持した。例１及び
２の場合と同様に、インターフエロン担体タバコ
からの煙に暴露されたすべてのヒト−マクロフア
ージ標品は一貫して活性化されたが、「対照」タ
バコからの煙は効果を示さなかつた。 例 ４ 志願者は、ヒト−腫瘍HL60細胞を含有する新
しい標的組織培養ウエルを用いて実験３（タバコ
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ）を反復した。HL60細
胞は、そのもとの細胞構成から示唆されるよう
に、非常に悪性の白色病腫瘍細胞であるが、しか
しながら、インターフエロンへの暴露により一定
比率の細胞が形態学的に変化し、そして成熟及び
正常細胞の形態及び機能への復帰が示される
（Carter、PO1CA295445及びこれに引用された文
献）。各々の煙の流れに暴露した後、HL60を含
有するペトリ皿を加湿された５％CO2室中の
MEM培地中、37℃に保持した。次の５〜10日間
において48時間ごとに、細胞をインターフエロン
含有煙に反復して暴露し、そしてCO2室中で再イ
ンキユベートした。実験開始後約７日から始めて
そして14日間続けて、インターフエロン処理
HL60培養物（タバコＡ〜Ｅのインターフエロン
フイルターを通つた煙に暴露された）は、対照培
養物に比べて、成熟及び正常な発達の漸進的な微
候を示す。成熟及び正常化への復帰の微候には、
細胞核の漸進的な分裂、核小体のゆるやかな消
滅、及び核の大きさの縮小、細胞質顆粒形成の証
明、成熟多形核白赤球例えば正常なヒト末梢血中
に存在するものへの分化の証明、が含まれる。 例 ５ に記載したようにしてアルブミンを伴つて又
は伴わないで調製されそして凍結乾燥されたイン
ターフエロンを、１mlの蒸留水に溶解し、そして
種々の温度でポリエチレン容器に貯蔵した。間隔
をおいてアリコートを採取し、そしてインターフ
エロンの抗ウイルス活性を測定した。結果を次の
第１表に示す。
【表】
＊＝最初の活性の％。
＊＊＝検出されず。
＋＝
溶液中のインターフエロンはアルブミンにより
明らかに安定した。乾燥インターフエロンはアル
ブミンの存在下で室温において１年間にわたつて
安定であつた。 例 ６ 本例は、煙草の煙に吸収されたインターフエロ
ン（INF）が癌、気腫、気管支炎を減らし、そし
て抗ウイルス状態をもたらすことを実証する。す
なわち、これらの実験は、煙草の煙に吸収された
INFが医学的効用を有していることを証明するこ
とを意図したものである。 煙草の煙に吸収されたインターフエロンが、相
乗的効果をもたらさないレチン酸とは対照的に体
の免疫系を相乗的に高揚しつつ、ウイルスおよび
癌細胞に対する相乗的効果を発揮するということ
を実証する。 ここで、レチン酸およびINFをしばしば試験化
合物と言う。 以下の実験を行つて煙草の煙に吸収されたイン
ターフエロンの相乗的抗ウイルス効果を実証し、
そしてこの効果を煙草の煙に吸収されたレチン酸
に関するものと比較した。６種の試験グループを
与えてこの試験を実施した。 実験法は、ヒト細胞を空気（グループ１）、煙
（グループ２）、INF−処理煙草フイルターに通過
させたことによりINFを含有する煙（グループ
３）に暴露するものとした。レチン酸−処理煙草
フイルターに通過させたことによりレチン酸を含
有する煙を使用して同一の方法を続けた（グルー
プ５）。付加的に、INFおよびレチン酸の両者を
直接添加してヒト細胞のグループを分けた
（各々、グループ４およびグループ６）。このよう
にして処理された各グループを数時間温置して取
り込をした。 煙（試験化合物有りまたは無し）への暴露は、
ペトリ皿中の細胞を空気、煙または試験化合物を
含有する煙の流れを２〜５分間の等時間暴露する
ことによつて達成された。煙中にインターフエロ
ンを吸収させるために、標準天然インターフエロ
ンまたはインターフエロンフラグメントポリペプ
チド約100000インターナシヨナル・リフアレン
ス・ユニツト（IRU）を親油性形態でフイルター
付き（酢酸セルロース）煙草フイルターに堆積さ
せた。等量のインターフエロン、好適には液体食
塩溶液中で再構成されたものを各検定グループに
おけるプレートに直接添加した。各グループに液
状で直接添加されたインターフエロンの最終濃度
は、培養培地１ml当たり数千IRU以上とした。 ５×10-5モルの投薬量範囲で細胞培養培地に直
接添加したレチン酸を同様にして試験した。ま
た、インターフエロンを添加したのと同様な方法
で等量のレチン酸をフイルター付き煙草に粉末と
して添加した。 前記した実験の結果をウイルス力価（プラーク
形成単位の数）の３回の平均として表１に要約す
ること。
＊＊＝検出されず。
＋＝
溶液中のインターフエロンはアルブミンにより
明らかに安定した。乾燥インターフエロンはアル
ブミンの存在下で室温において１年間にわたつて
安定であつた。 例 ６ 本例は、煙草の煙に吸収されたインターフエロ
ン（INF）が癌、気腫、気管支炎を減らし、そし
て抗ウイルス状態をもたらすことを実証する。す
なわち、これらの実験は、煙草の煙に吸収された
INFが医学的効用を有していることを証明するこ
とを意図したものである。 煙草の煙に吸収されたインターフエロンが、相
乗的効果をもたらさないレチン酸とは対照的に体
の免疫系を相乗的に高揚しつつ、ウイルスおよび
癌細胞に対する相乗的効果を発揮するということ
を実証する。 ここで、レチン酸およびINFをしばしば試験化
合物と言う。 以下の実験を行つて煙草の煙に吸収されたイン
ターフエロンの相乗的抗ウイルス効果を実証し、
そしてこの効果を煙草の煙に吸収されたレチン酸
に関するものと比較した。６種の試験グループを
与えてこの試験を実施した。 実験法は、ヒト細胞を空気（グループ１）、煙
（グループ２）、INF−処理煙草フイルターに通過
させたことによりINFを含有する煙（グループ
３）に暴露するものとした。レチン酸−処理煙草
フイルターに通過させたことによりレチン酸を含
有する煙を使用して同一の方法を続けた（グルー
プ５）。付加的に、INFおよびレチン酸の両者を
直接添加してヒト細胞のグループを分けた
（各々、グループ４およびグループ６）。このよう
にして処理された各グループを数時間温置して取
り込をした。 煙（試験化合物有りまたは無し）への暴露は、
ペトリ皿中の細胞を空気、煙または試験化合物を
含有する煙の流れを２〜５分間の等時間暴露する
ことによつて達成された。煙中にインターフエロ
ンを吸収させるために、標準天然インターフエロ
ンまたはインターフエロンフラグメントポリペプ
チド約100000インターナシヨナル・リフアレン
ス・ユニツト（IRU）を親油性形態でフイルター
付き（酢酸セルロース）煙草フイルターに堆積さ
せた。等量のインターフエロン、好適には液体食
塩溶液中で再構成されたものを各検定グループに
おけるプレートに直接添加した。各グループに液
状で直接添加されたインターフエロンの最終濃度
は、培養培地１ml当たり数千IRU以上とした。 ５×10-5モルの投薬量範囲で細胞培養培地に直
接添加したレチン酸を同様にして試験した。ま
た、インターフエロンを添加したのと同様な方法
で等量のレチン酸をフイルター付き煙草に粉末と
して添加した。 前記した実験の結果をウイルス力価（プラーク
形成単位の数）の３回の平均として表１に要約す
ること。
【表】
以下の実験を行つて、マクロフアージ活性化を
測定することによつて気管支炎および気腫との戦
いにおける煙中に吸収されたINFの有効性を示
す。 マクロフアージ活性化を測定するために、本発
明者は、マクロフアージを空気、煙、INFを含有
する煙を流れに暴露し、次いで暴露が引き起こし
たINF産生の量を測定する定量法を選択した。ヒ
トマクロフアージを収穫し、空気（グループ１）、
煙（グループ２）またはINF−含有煙（グループ
３）に暴露し、次いで液体の収穫に先立つて３日
間保持してINF分子の存在について測定した。ヒ
トマクロフアージ培養液の製造および一般的条件
は、既述しており、そして当業者に周知である。
例えば、Epstein、L.、Methods in
Enzymology、第78巻、第148頁、1981年を参照
のこと。 第７段落の実験の結果を、表２に示す。
測定することによつて気管支炎および気腫との戦
いにおける煙中に吸収されたINFの有効性を示
す。 マクロフアージ活性化を測定するために、本発
明者は、マクロフアージを空気、煙、INFを含有
する煙を流れに暴露し、次いで暴露が引き起こし
たINF産生の量を測定する定量法を選択した。ヒ
トマクロフアージを収穫し、空気（グループ１）、
煙（グループ２）またはINF−含有煙（グループ
３）に暴露し、次いで液体の収穫に先立つて３日
間保持してINF分子の存在について測定した。ヒ
トマクロフアージ培養液の製造および一般的条件
は、既述しており、そして当業者に周知である。
例えば、Epstein、L.、Methods in
Enzymology、第78巻、第148頁、1981年を参照
のこと。 第７段落の実験の結果を、表２に示す。
【表】
以下の実験を行つて煙中に吸収されたIFNが体
の免疫系を相乗的に増加することを示し、そして
煙中に吸収されたレチン酸の体の免疫系に対する
効果を測定する。 詳しく述べると、以下の細胞毒実験を行つて
NK（天然キラー）細胞がINFを含有する煙に暴
露されることによつてこれらの殺傷能を増加でき
るかを実証した。また、この実験は、レチン酸の
固有の活性がその煙への吸収によつて同様にして
変化されるかどうかについて示すことも意図した
ものである。５種類の試験グループを利用して実
験を行つた。 実験法は、先ず等量のNF細胞を等しい時間
（２ないし５時間）空気対照、煙の流れ（グルー
プ１）、または試験化合物を含有する煙、すなわ
ち煙草フイルター中に含有される試験化合物に通
過させた煙の流れ（試験グループ２および４）の
いずれかに暴露されたものである。また、試験化
合物（レチン酸またはINF）をペトリ皿培養培地
に直接添加した（試験グループ３および５）。煙
のIFNおよびレチン酸のレベルおよび直接添加し
たもののレベルは、第４段落に記載のものと同様
とした。 次に、（ヒトK562）癌細胞を、51Cr（クロムの放
射性同位体）を含有する化合物にこれらを取り込
ませることによつて放射線標識した。この方法
は、公知であり、そして記載されている。
Strayer等、Cancer Research、第44巻、第370
頁、1987年を参照のこと。次いで、これらの癌細
胞を、NK細胞と一緒にNK細胞１に対して腫瘍
細胞6.2の比率で温置した。NK細胞により殺され
た腫瘍細胞は、51Crを放出する。従つて、51Crのカ
ウントは、NK細胞殺傷能の増加の直接的尺度で
ある。NK細胞により癌細胞から放出された特異
的51Crのパーセンテージを、以下の式を用いて計
算した。（注：「CPM」は、毎分のカウントであ
る）。 実験放出（cpm）−自然放出（cpm）／最大放出（cp
m）−自然放出（cpm）×100 注：上記の式は、51Cr−放射線標識された細胞
から自然に放出された少量の背景51Crを考慮す
る。全ての結果は、４回で得られた。 前記の実験の結果を表３に示す。
の免疫系を相乗的に増加することを示し、そして
煙中に吸収されたレチン酸の体の免疫系に対する
効果を測定する。 詳しく述べると、以下の細胞毒実験を行つて
NK（天然キラー）細胞がINFを含有する煙に暴
露されることによつてこれらの殺傷能を増加でき
るかを実証した。また、この実験は、レチン酸の
固有の活性がその煙への吸収によつて同様にして
変化されるかどうかについて示すことも意図した
ものである。５種類の試験グループを利用して実
験を行つた。 実験法は、先ず等量のNF細胞を等しい時間
（２ないし５時間）空気対照、煙の流れ（グルー
プ１）、または試験化合物を含有する煙、すなわ
ち煙草フイルター中に含有される試験化合物に通
過させた煙の流れ（試験グループ２および４）の
いずれかに暴露されたものである。また、試験化
合物（レチン酸またはINF）をペトリ皿培養培地
に直接添加した（試験グループ３および５）。煙
のIFNおよびレチン酸のレベルおよび直接添加し
たもののレベルは、第４段落に記載のものと同様
とした。 次に、（ヒトK562）癌細胞を、51Cr（クロムの放
射性同位体）を含有する化合物にこれらを取り込
ませることによつて放射線標識した。この方法
は、公知であり、そして記載されている。
Strayer等、Cancer Research、第44巻、第370
頁、1987年を参照のこと。次いで、これらの癌細
胞を、NK細胞と一緒にNK細胞１に対して腫瘍
細胞6.2の比率で温置した。NK細胞により殺され
た腫瘍細胞は、51Crを放出する。従つて、51Crのカ
ウントは、NK細胞殺傷能の増加の直接的尺度で
ある。NK細胞により癌細胞から放出された特異
的51Crのパーセンテージを、以下の式を用いて計
算した。（注：「CPM」は、毎分のカウントであ
る）。 実験放出（cpm）−自然放出（cpm）／最大放出（cp
m）−自然放出（cpm）×100 注：上記の式は、51Cr−放射線標識された細胞
から自然に放出された少量の背景51Crを考慮す
る。全ての結果は、４回で得られた。 前記の実験の結果を表３に示す。
【表】
【表】
イルターによ
る)
5.レチン酸直接 9.63 p＝0.005未処理細
添加 胞より40％高揚。
以下の実験を行つてINFの抗癌効果を測定し、
そしてレチン酸による効果を比較した。 この実験法は、INFを含有する煙が癌性細胞の
成熟の高揚を引き起こす範囲を直接投与された
IFNにより期待されたものと比較して証明するこ
とを特に意図したものである。 用語「成熟」（表４においては「分化」とも言
われる）とは、癌性細胞が該癌性細胞が変化を受
けることを意味し、これは実際に正常細胞に形質
転換することを示す。分化（転化）の評価基準お
よびHL60腫瘍細胞の成長条件は、当該技術分野
に公知である（StrayerD.R.等、The Interferon
System：Ａ Current Review（Part ）、
Texas Reports on Biology and Medicine、第
41巻、第663〜671頁、1982年を参照のこと）。代
表的には、本書に記載する実験において、各試験
グループにおいて100個の細胞を、「処理」後７日
に開始して、日々検査する。分化された細胞は、
細胞内で以下の構造変化の内の少なくとも２つの
存在を必要とする。すなわち、(a)核のセグメンテ
ーシヨン；(b)細胞質顆粒；(c)細胞質サイズに関す
る核サイズの減少；(d)核子体（核「細胞器官」）
の消失である。 第11段落に記載された実験からの結果を表４に
要約する。
る)
5.レチン酸直接 9.63 p＝0.005未処理細
添加 胞より40％高揚。
以下の実験を行つてINFの抗癌効果を測定し、
そしてレチン酸による効果を比較した。 この実験法は、INFを含有する煙が癌性細胞の
成熟の高揚を引き起こす範囲を直接投与された
IFNにより期待されたものと比較して証明するこ
とを特に意図したものである。 用語「成熟」（表４においては「分化」とも言
われる）とは、癌性細胞が該癌性細胞が変化を受
けることを意味し、これは実際に正常細胞に形質
転換することを示す。分化（転化）の評価基準お
よびHL60腫瘍細胞の成長条件は、当該技術分野
に公知である（StrayerD.R.等、The Interferon
System：Ａ Current Review（Part ）、
Texas Reports on Biology and Medicine、第
41巻、第663〜671頁、1982年を参照のこと）。代
表的には、本書に記載する実験において、各試験
グループにおいて100個の細胞を、「処理」後７日
に開始して、日々検査する。分化された細胞は、
細胞内で以下の構造変化の内の少なくとも２つの
存在を必要とする。すなわち、(a)核のセグメンテ
ーシヨン；(b)細胞質顆粒；(c)細胞質サイズに関す
る核サイズの減少；(d)核子体（核「細胞器官」）
の消失である。 第11段落に記載された実験からの結果を表４に
要約する。
【表】
【表】
前記表１に要約された実験およびデータが、煙
に吸収されたIFNが、相乗的効果のある抗ウイル
ス剤としての効用を有しているということおよび
直接添加されたIFNに対する煙の抗ウイルス協力
的効果が試験グループ３および４の比較によつて
示されるということ；並びにレチン酸が試験グル
ープ５および６を比較により示される通りに抗ウ
イルス活性を有していないということを論証して
いる。 前記表２に示された実験およびデータが、INF
を含有する煙に暴露された際にマクロフアージ
IFN産生が著しく高揚することによつて実証され
る通り、煙に吸収されたIFNがマクロフアージを
著しく活性化するということを論証する。この多
大な効果（試験グループ２および３の比較によつ
て示される通り煙のみに対して12000％）は、気
腫および気管支炎等の障害との戦における煙に吸
収されたIFNの効用を示している。 前記表３に示された実験およびデータが、煙に
吸収されたIFNが、試験グループ２および３の比
較によつて示される通り体の免疫系の協力的高揚
を示すということを実証している。レチン酸は、
協力的高揚を示さず、そして事実、試験グループ
４および５の比較により煙中への吸収がNK活性
能を抑制するということを論証している。 表２に示された実験およびデータが、煙に吸収
されたIFNの癌細胞に対する効果が強く相乗的で
あり（直接添加IFNに対して350％増加）、一方レ
チン酸は、癌細胞に対してかゝる協力的効果を表
さない（直接添加レチン酸に対して分化が５％減
少）ということを実証している。 上記実験が、 Ａ 煙に吸収されたIFNが明白に実証された医学
的効用を示すということ Ｂ 煙に吸収されたIFNが煙に吸収されたレチン
酸に比較して予想されない相乗的効果を示すと
いうこと、 を実証している。 例 ７ タバコに付着したインターフエロン誘発剤の
効果 タバコのフイルター端に凍結乾燥したインター
フエロン誘発剤アンプリゲン（ミスマツチ二本鎖
RNA）を噴霧することによりタバコを調製した。
ハンブルグ喫煙装置を用いてラツトを新鮮なタ
バコの煙にさらした。この装置の主要部は喫煙プ
レート、喫煙チヤンバー、及び動物保持コンパー
トメントである。この喫煙装置は10匹のハムスタ
ー、10匹のラツト又は10匹のマウスを収容するよ
うに調整することができる。動物を、固定装置及
び喫煙チヤンバーへの開口を含む個々のチユープ
状コンパートメントに入れた。各喫煙プレートは
１吸いの体積（25ml）、１吸いの時間（２秒間）
及び吸引頻度（１分間に１回）の標準的条件下で
30本のタバコを消費する。動物は新鮮な空気と喫
煙チヤンバーからの新鮮なタバコの煙との７：１
の比率の混合物を吸込み、そして希釈されたタバ
コのエーロゾルを最大耐量にさらされた。タバコ
の煙にさらしてから24時間後に動物を殺し、そし
て肺を肺動脈を通してかん流することにより、肺
の毛細管リンパ球を回収した。 ラツト肺毛細血管内リンパ球の天然キラー細胞
活性をYAC−１細胞に対して次の様してに分析
した。肺毛細血管内リンパ球を遠心分離によりペ
レツト化し、そして冷２×HBSSで直接希釈され
た水中に再懸濁することにより赤血球を溶解し
た。次に、細胞をHBSSで２回洗浄し、そして組
織培養媒体中に再懸濁した。培養物中に維持され
たYAC−１細胞を標的細胞として用いた。細胞
を完全培地中で250μCiの52Crによりラベルした。 取り込まれていないラベルを組織培地での洗浄
により除去した。エフエクター細胞を標的細胞と
200：１、100：１及び50：１で混合し、そして96
−ウエルマイクロタイタープレート中で37℃にて
４時間インキユベートした。上清を細胞からの
51Crの放出について４連平行して分析した。標的
細胞の８枚のレプリカを完全培地中でインキユベ
ートして天然の51Crの放出を測定し、そして８枚
のレプリカを４％ヘキサデシルメチルアンモニウ
ムブロミド中でインキユベートして最大放出を決
定した。エフエクター細胞毒生の％を標的細胞か
ら放出される特異的52Crの量から、次の式により
算出した。 実験放出（cpm）−自然放出（cpm）／最大放出（cp
m）−自然放出（cpm）×100 ２−5Aシンセターゼの活性をラツト肺毛細血
管内リンパ球のNP−40抽出物中で次の様にして
測定した。反応混合物は10ｍＭ HEPES（PH
7.5）、2.5ｍＭ MgCl2、60ｍＭ KCl、５％グリ
セロール、2.5ｍＭジチオスレイトール、３ユニ
ツト／mlクチレアチンホスホキナーゼ、10ｍＭク
レアチンホスフエート、2.5ｍＭ ATP、及び３
〜5μCiの32P ATPを含有しており、これを、細
胞溶解物からの２−5Aシンセターゼがあらかじ
め結合しているポリ（Ｉ：Ｃ）アガロースに加え
た。30℃にて20時間のインキユベーシヨンの後、
ポリ（Ｉ：Ｃ）−アガロースを遠心分離によりペ
レツト化した。２−5Aシンセターゼ活性を２−
5Aの合成により測定し、これを薄層クロマトグ
ラフイーにより分析した。細菌アルカリホスフア
ターゼで処理された２−5AをポリグラムCsi
300PEIプレート上でのクロマトグラフイーによ
り分離した。２−5Aの収率（％）を、２−5Aに
取り込まれた放射能の量対全放射能を測定するこ
とにより計算した。 ハンブルグ喫煙チヤンバー中のラツトは10μｇ
の凍結乾燥されたミスマツチRNAインターフエ
ロン誘発剤を含有するタバコからの煙を吸つた。
ラツトを、煙にさらしてから24時間後に殺し、そ
して肺毛細血管内リンパ球を単離した。これらの
細胞を、天然キラー標的細胞YAC−１を溶解す
る能力、及びインターフエロンにより誘導される
酵素である2′−5′Aシンセターゼの増加について
検討した。肺毛細血管リンパ球は、ベースライン
レベルの10％の細胞溶解に比較して約20％への
YAC−１細胞の溶解の増加を示した。２−5Aシ
ンセターゼのレベルもまた、肺毛細血管リンパ球
において約８時間増加した。ミスマツチ二本鎖
RNAを欠くフイルターを用いての対照タバコを
用いての類似の実験において、細胞溶解活性の増
加及び２−5Aシンセターゼ活性の増加は見られ
ず、タバコの喫煙それ自体はこれらの細胞の活性
化を生じさせないことが示された。
に吸収されたIFNが、相乗的効果のある抗ウイル
ス剤としての効用を有しているということおよび
直接添加されたIFNに対する煙の抗ウイルス協力
的効果が試験グループ３および４の比較によつて
示されるということ；並びにレチン酸が試験グル
ープ５および６を比較により示される通りに抗ウ
イルス活性を有していないということを論証して
いる。 前記表２に示された実験およびデータが、INF
を含有する煙に暴露された際にマクロフアージ
IFN産生が著しく高揚することによつて実証され
る通り、煙に吸収されたIFNがマクロフアージを
著しく活性化するということを論証する。この多
大な効果（試験グループ２および３の比較によつ
て示される通り煙のみに対して12000％）は、気
腫および気管支炎等の障害との戦における煙に吸
収されたIFNの効用を示している。 前記表３に示された実験およびデータが、煙に
吸収されたIFNが、試験グループ２および３の比
較によつて示される通り体の免疫系の協力的高揚
を示すということを実証している。レチン酸は、
協力的高揚を示さず、そして事実、試験グループ
４および５の比較により煙中への吸収がNK活性
能を抑制するということを論証している。 表２に示された実験およびデータが、煙に吸収
されたIFNの癌細胞に対する効果が強く相乗的で
あり（直接添加IFNに対して350％増加）、一方レ
チン酸は、癌細胞に対してかゝる協力的効果を表
さない（直接添加レチン酸に対して分化が５％減
少）ということを実証している。 上記実験が、 Ａ 煙に吸収されたIFNが明白に実証された医学
的効用を示すということ Ｂ 煙に吸収されたIFNが煙に吸収されたレチン
酸に比較して予想されない相乗的効果を示すと
いうこと、 を実証している。 例 ７ タバコに付着したインターフエロン誘発剤の
効果 タバコのフイルター端に凍結乾燥したインター
フエロン誘発剤アンプリゲン（ミスマツチ二本鎖
RNA）を噴霧することによりタバコを調製した。
ハンブルグ喫煙装置を用いてラツトを新鮮なタ
バコの煙にさらした。この装置の主要部は喫煙プ
レート、喫煙チヤンバー、及び動物保持コンパー
トメントである。この喫煙装置は10匹のハムスタ
ー、10匹のラツト又は10匹のマウスを収容するよ
うに調整することができる。動物を、固定装置及
び喫煙チヤンバーへの開口を含む個々のチユープ
状コンパートメントに入れた。各喫煙プレートは
１吸いの体積（25ml）、１吸いの時間（２秒間）
及び吸引頻度（１分間に１回）の標準的条件下で
30本のタバコを消費する。動物は新鮮な空気と喫
煙チヤンバーからの新鮮なタバコの煙との７：１
の比率の混合物を吸込み、そして希釈されたタバ
コのエーロゾルを最大耐量にさらされた。タバコ
の煙にさらしてから24時間後に動物を殺し、そし
て肺を肺動脈を通してかん流することにより、肺
の毛細管リンパ球を回収した。 ラツト肺毛細血管内リンパ球の天然キラー細胞
活性をYAC−１細胞に対して次の様してに分析
した。肺毛細血管内リンパ球を遠心分離によりペ
レツト化し、そして冷２×HBSSで直接希釈され
た水中に再懸濁することにより赤血球を溶解し
た。次に、細胞をHBSSで２回洗浄し、そして組
織培養媒体中に再懸濁した。培養物中に維持され
たYAC−１細胞を標的細胞として用いた。細胞
を完全培地中で250μCiの52Crによりラベルした。 取り込まれていないラベルを組織培地での洗浄
により除去した。エフエクター細胞を標的細胞と
200：１、100：１及び50：１で混合し、そして96
−ウエルマイクロタイタープレート中で37℃にて
４時間インキユベートした。上清を細胞からの
51Crの放出について４連平行して分析した。標的
細胞の８枚のレプリカを完全培地中でインキユベ
ートして天然の51Crの放出を測定し、そして８枚
のレプリカを４％ヘキサデシルメチルアンモニウ
ムブロミド中でインキユベートして最大放出を決
定した。エフエクター細胞毒生の％を標的細胞か
ら放出される特異的52Crの量から、次の式により
算出した。 実験放出（cpm）−自然放出（cpm）／最大放出（cp
m）−自然放出（cpm）×100 ２−5Aシンセターゼの活性をラツト肺毛細血
管内リンパ球のNP−40抽出物中で次の様にして
測定した。反応混合物は10ｍＭ HEPES（PH
7.5）、2.5ｍＭ MgCl2、60ｍＭ KCl、５％グリ
セロール、2.5ｍＭジチオスレイトール、３ユニ
ツト／mlクチレアチンホスホキナーゼ、10ｍＭク
レアチンホスフエート、2.5ｍＭ ATP、及び３
〜5μCiの32P ATPを含有しており、これを、細
胞溶解物からの２−5Aシンセターゼがあらかじ
め結合しているポリ（Ｉ：Ｃ）アガロースに加え
た。30℃にて20時間のインキユベーシヨンの後、
ポリ（Ｉ：Ｃ）−アガロースを遠心分離によりペ
レツト化した。２−5Aシンセターゼ活性を２−
5Aの合成により測定し、これを薄層クロマトグ
ラフイーにより分析した。細菌アルカリホスフア
ターゼで処理された２−5AをポリグラムCsi
300PEIプレート上でのクロマトグラフイーによ
り分離した。２−5Aの収率（％）を、２−5Aに
取り込まれた放射能の量対全放射能を測定するこ
とにより計算した。 ハンブルグ喫煙チヤンバー中のラツトは10μｇ
の凍結乾燥されたミスマツチRNAインターフエ
ロン誘発剤を含有するタバコからの煙を吸つた。
ラツトを、煙にさらしてから24時間後に殺し、そ
して肺毛細血管内リンパ球を単離した。これらの
細胞を、天然キラー標的細胞YAC−１を溶解す
る能力、及びインターフエロンにより誘導される
酵素である2′−5′Aシンセターゼの増加について
検討した。肺毛細血管リンパ球は、ベースライン
レベルの10％の細胞溶解に比較して約20％への
YAC−１細胞の溶解の増加を示した。２−5Aシ
ンセターゼのレベルもまた、肺毛細血管リンパ球
において約８時間増加した。ミスマツチ二本鎖
RNAを欠くフイルターを用いての対照タバコを
用いての類似の実験において、細胞溶解活性の増
加及び２−5Aシンセターゼ活性の増加は見られ
ず、タバコの喫煙それ自体はこれらの細胞の活性
化を生じさせないことが示された。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/386,447 US4498485A (en) | 1982-08-05 | 1982-08-05 | Interferon and interferon inducers combined with tobacco products |
| US386447 | 1982-08-05 | ||
| PCT/US1983/001199 WO1984000477A1 (en) | 1982-08-05 | 1983-08-04 | Interferon and interferon inducers combined with tobacco products |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59501496A JPS59501496A (ja) | 1984-08-23 |
| JPH0543347B2 true JPH0543347B2 (ja) | 1993-07-01 |
Family
ID=23525614
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP83502817A Granted JPS59501496A (ja) | 1982-08-05 | 1983-08-04 | インタ−フェロン及びインタ−フェロン誘発物質とタバコ製品との組合わせ |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4498485A (ja) |
| EP (1) | EP0116085B1 (ja) |
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