JPS59501496A - インタ−フェロン及びインタ−フェロン誘発物質とタバコ製品との組合わせ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターフェロン及びインターフェロン誘発物質とタバコ製品との組合わせ 幾つかの特許が、一般的に（Ａ、Ｂ、　Ｋｌｅｉｎの米国特許第９７７．６３５ 号；　Ｊ、Ｌ、　Ｊｏｒｄａｎ等の米国特許第１．９７４，２４２号：　Ｓ、Ｓ 、　Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎの米国特許第２．４１８，２９６号：　Ｐ、　５ ｐｅｉｓｅｒ等の米国特許第４，０２１，３６４号）、ビタミンによる（Ａ、　 Ｖｉｓｃａｒｄｉ等の米国特許第２．１９８，１８８号：　Ｇ、　Ｆａｃｈｉｎ ｉ等の米国特許第２．８９０，９７３号：　Ｂ、　５ｔｏｎｅの米国特許第３， ２４４，１８０号；　Ｊ、　Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ等の米国特許第３，３３９，５ ５８号；Ｍ、Ｊ、　Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ等の米国特許第３，６６７，４７８号） 、電荷による（Ｒ，Ｒｏｙｓｔｅｎの米国特許第３，２４０，２１２号）タバコ への薬剤付与を試みている。これらの薬剤付与は、それ自体の有利性、又は喫煙 者により吸引される煙の毒作用、例えば生長の抑制、呼吸困難、枯草熱、癌、気 腫及び心臓疾患を中和しもしくは軽減することを目的としている。これらの特許 は、思うに１．タバコの喫煙によって消耗される生物学的化合物の保存修復のた めの手段、又は喫煙の疑わしい悪い効果に対抗するだめの手段を提供するが、こ れらは薬剤の別々の投与によりもたらされる効果よりさらに効果的な薬剤付与を 目的としていない。今や、これらの得られる結果を考慮して、発明者は、たばこ の煙と相乗的に作用する薬物を使用することにより実質上さらに良好な結果が得 られるものと予想する。この発明は、タバコを天然薬物であるインターフェロン と組合わせることによる相乗作用に関し、インターフェロンの活性は喫煙の条件 により強調され、そして喫煙によって攪乱される細胞を標的にする。この発明は さらに、インターフェロンを安定化し、その生物学的活性を、タバコ製造、貯蔵 及び使イ皆常の条件を通じて保持することができる新規な方法を提供する。

インターフェロンはまず有効な抗ウィルス剤として特徴付けられ（Ｉｓａａｃｓ 及びＬｉｎｄｅｎｍａｎｎ　＋Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｒｏｙａｌ　５ｏｃｉ ｅｔ’ｙ　Ｌｏｎｄｏｎ、シリーズＢ。

Ｖｏｌ　１４−７，２５８−２７６頁、１９５７）、そして以来抗生長（抗癌） 活性を有することが見出された（Ｐａｕｃｋｅｒ等、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｖ ｏｌ　１７．　３２４−３３４頁。

１９６２　）　（Ｇｒｅｓｓｅｒ編、　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｖｏｌ、　２＋ 　１３〜４６頁、１９８１においてＴａｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ によシ総説されている）。インターフェロンはさらに腫瘍免疫系を活性化する（ Ｔｒｉｎａｃｈｉｅｒｉ等、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ 　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　Ｖｏｌ　１４７　＋　１２９９−１３０５頁、１９７８ ）。発明者はまず、インターフェロンが適当な濃度において実際にある種の悪性 細胞を、「分化」と称する過程又は細胞成熟を通して正常細胞に変えることがで きることを推定した（Ｃａｒｔｅｒ等。

１９８０年７月に提出された特許明細書ＰＯＩＣＡ　２９５４５；Ｇｉ自ｅｓｐ ｉｅ及びＣａｒｔｅｒ　＋　Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、印刷中、１９８２　）　ｏ　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ 及びＣａｒｔｅｒにより行われた（前記）実験的証明は、腫瘍細胞が成熟又は正 常な発達過程を通じて正常になるように方向付けられる時間にわたって、その腫 瘍細胞がインターフェロンに暴露されれば、インターフェロンは癌をその初期の 段階に２いて除去することができるとする発明者の推論を支持する。

この発見はたしかに、悪性細胞の最初の小さい巣が発生する身体の部位に反復的 且つ効果的にインターフェロンを供給する有効な方法が工夫されれば、腫瘍細胞 がヒトの体内に発生する際にそれらの細胞は除去されるであろうことを予想させ る。このような腫瘍の巣がもしチェックされずに放置されれば、通常それらの局 所的拘束を越えて拡散し、最終的には兆候ある病気と死をもたらすであろう。さ らに、発明者は、肺癌を有する個体は、体中でのインターフェロンの不適当な関 与から生ずると考えられる免疫監視系の不全を有するという証明を得た（Ｓｔｒ ａｙｅｒ＋Ｃａｒｔｅｒ等、印刷中、１９８２）。

従ってこの発明は１．インターフェロンと、インターフェロンによりその不利益 な効果が防止される物４ 質であってその製造、貯蔵又は使用がインターフェロンの生物学的活囲と適合し ない物質とを組合わされることを目的とするインターフェロンの安定化に関する 。発明者が記載するインターフェロンの安定化のための２つの方法は新規であり 、そして自明でない。

重要な例として、この発明は、インターフェロンと、集合的にタバコと称する喫 煙物との組合わせを目的とするインターフェロン蛋白質の安定化に関する。この 組合わせは相乗的である。これは、インターフェロンの効果がタバコの煙によっ て加温された細胞にｐいて高められるた検に相乗的である。すなわちＨｒｏｎ′ ＆びＢｅ　ｒｇにより発見された低温効果である（Ｎａｔｕｒｅ　２７４：５０ ８　５１０＋　１９７８　）。この研究において、２〜３℃といり小さい環境温 度の上昇が、白血病細胞の生育を阻害する低投与量のインターフェロンの効果を 約８００　％増大せしめることを示した。

さらに最近においては、Ｄｅｌｂｒｕｃｋ等（Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ３３：　 ２３９−２４１．１９８０）は、骨肉腫細胞を殺すインターフェロンの効果が、 ３７℃から３９℃への２℃の温度上昇により１００位上昇することを示した。タ バコから出る煙の温度は４０〜５０℃である（Ｒｅｐａｒｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓ ｕｒｇｅｏｎ　Ｇｅｎｅｒａｌ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＨｅａｌｔｈ、 　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｗｅｌｆａｒｅ＋　１９７９　＋　１４頁、３ ６）から、口腔、咽喉、及びおそらく肺の細胞表面が実質上上昇し、そしてこれ らの細胞に運ばれるインターフェロンの効果を強化するであろう。さらに、疎水 性安定化インターフェロンは、煙の成分、例えば３．４−ベンゾピレンのごとき 疎水性発癌物質及びこの発癌物質を担持する粒子と結合し、そして従ってインタ ーフェロンが特異的に煙の発癌物質により撹乱された細胞、すなわち潜在的癌細 胞に集中する。

さらに、Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃ等により示されたように（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０ ６二１０９１−１０９３．１９７９）、インターフェロンは腫瘍細胞、例えば前 の喫煙により生じた細胞と選択的に相互作用するから相乗的である。最後に、イ ンターフェロンが喫煙と同時にそして局所的に適用されるから相乗性が強化され る。喫煙者によって摂取されるインターフェロンの量は、喫煙されたタバコの数 、すなわち発癌物質への露出に直接関連する。さらに、インターフェロンが喫煙 物の構成部分であるから、喫煙者が喫煙前にインターフェロンの補給を失念する ことがない。従って、引続いて又は同時に適用されたインターフェロンが喫煙に よって生じた癌に対して有効である可能性は明らかであるが、本発明者が発見し たインターフェロンとタバコとの相乗作用は明らかではなく、そしてタバコと組 合わせるためのインターフェロンの安定化のために適する手段は自明ではない。

タバコの煙をふくむ空気中環境汚染物は、肺癌及びおそらく他の癌の機会を増加 するであろうが、潜在期間が長く、そのため早い段階において、生じた癌を効果 的に阻止し、そして根絶することは不可能であった。多くのヒトの癌は、この疾 患に対する身体的素質（先天的又は後天的）を有する個体が環境的引金と称する 第２の事実に反復して暴露された結果である（Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐｅｒｔｍｅｎｔ 　ｏｆ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　１９７１−１９８１、における総説、１９８１を 参照のこと）。

この発明は、肺癌の発生に関する上記の両条件を正しくする方法すなわち、（１ ）外来性インターフェロンを身体組織に与えて体自体によるインターフェロンの 産生の不足（先天的又は後天的）を補促しくこれによって癌に対する免疫不全を 回復せしめ）、そしてさらに（２）毒性発癌物質の癌促進効果（これはある場合 には身体的防御系を圧倒する）を攻撃し、そして最終的には、投与されたインタ ーフェロンの追加の局在効果、すなわち悪性細胞を「分化」の過程を通じて直接 正常化することによシ除去する方法を含　、む０ この発明の目的は、多くの有用な効果を有する天然物質を身体の特定の部分に移 行せしめることを促進するために規則的喫煙の利益を得ることである。

タバコ製品へのインターフェロンの導入は、インターフェロンを病気に冒された 口腔、肺及び鼻に移行せしめる新規な方法を提供し、この方法は種々のインター フェロン効果、レリえばインターフェロンによりもたらされる種々の防御効果を 発生せしめ、この防御効果は、可能性ある発癌物質を含む種々の空中環境汚染物 に長期間暴露された場合に生ずる癌細胞を包括的に除去するものである。この結 果、この発明は、種々の癌、特に肺、咽喉及び口腔中に生ずる癌の発生率を低下 せしめるはずである。この発明はさらに、他の疾患、［Ｆ＋１えば外来性粒状物 の慢性的吸）＼によシ生ずる疾患（気腫及び慢性気管支炎に関連する）、及び空 気伝染性のヒト−ウィルスにより生ずる疾患（肺炎、インフルエンザ症候群、感 冒等の種々の感染性疾患に関する）に対する身体の全体的耐性の増加に関しても 試験した。試験管内試験におけるこれらの結果（例を参照のこと）は、個体によ るこの発明の規則的な実行（すなわち種々のタイプのインターフェロンを含浸せ しめたタバコの喫煙）が、多くの有利な身体的効果、例えば癌の率の低下、気腫 ／慢性気管支炎の率の低下、並びにウィルス性及び感染性疾患の減少に伴う一般 的に良好な健康状態をもたらすことを示した。あるタイプの血管系疾患に対する 感受性の低下は、ヘビースモーカーにお８ いて増加するが、インターフェロンが血管壁の閉塞（閉鎖）に寄与するある種の 因子に拮抗する場合にも生ずるであろう。

この多数の有利な効果を達成するために、すべてのタイプのインターフェロン及 びすべてのタイプのインターフェロン誘発物質（体内でインターフェロンの産生 を開始させる物質）とタバコとを組合わせる方法が提供される。この方法は、癌 及び他の危険な疾患の発生率を低下せしめることによシ、ヒトにとって明らかに 有用であり、これらの疾患の危険な効果は、傷つきやすいそして／又は早期に病 気にかかった細胞と物理的に並行して反復して投与されたインターフェロンによ り中和される。この方法はさらに、ヒトの体の入口において高濃度のインターフ 工０ンの局在した効果により対抗を受けるあらゆる種類の他の発癌物にも適用で きよう。

しかしながら、天然のヒト−インターフェロンは蛋白質の１群でチシ、そして蛋 白質の生物学的活性は、ある条件〔例えば、熱的変化、酸／アルカリ環境、撹流 、及び／又は剪断効果（渦流）等〕のもとではしばしば感受性である（破壊され る）。インターフェロンの生物学的活性の感受性を低下せしめるために、発明者 はさらに、新しいクラスのインターフェロンを導入した。このインターフェロン は天然又は合成インターフェロンの断片であり（成分又は特定のアミノ酸配列） 、広範囲の種類の異る環境条件のもとて所望の生物学的活性を保持する点におい て分子の安定性をもたらすものである。この断片は典型的には、インターフェロ ンの正常な分子の長さの約１０〜１５チであればよく、通常の約１６２の構成ア ミノ酸ではなくむしろせいぜい２５〜４５アミノ酸である。完全な長さのヒト− インターフェロンからのこれらの必須アミノ酸断片（配列）の決定は、を椎動物 の進化の過程で保存された種々のインターフェロンの領域の発明者等による新規 な解析（コンｔ　ｓ、−ターによシ促進される）によシ可能にされた。好ましい 物理−化学的性質に加えて、インターフェロン断片又は配列はさらにコスト／効 果の観点から有用でちり、サイズが小さいことによシ、全インターフェロン分子 のコストの小部分によシ、そして多様な製造方法、例えば組換ＤＮＡ技法、固相 合成等により大規模生産が可能になる。

しかしながら、発明者は、インターフェロンの安定なそして生物活性を有する断 片の製造及び試験は、この発明を実施する場合に満足できない遅延をもたらすこ とを認識する。従って、発明者は、分子がとりうる異る状態の数を限定すること により天然インターフェロンを安定化させるだめの簡単で経済的な０ 手段を発明した。発明者は、インターフェロンと他の基剤、通常は蛋白質との間 の弱い疎水性相互作用を生起させることにより、このことを達成した。

発明者は、紙巻タバコを含むタバコ製品とインターフェロンとを組合わせる。発 明者は、高温、破壊的化学物質及び長期間の貯蔵に直面した場合に生物学的活性 を保持するために、［インターフェロンの断片］を用いることにより、そしてイ ンターフェロンとある種の担体を組合わせることによりインターフェロンを安定 化するだめの必要かつ新規な手段を記載する。

安定化されたインターフェロンの幾つかは煙の粒子と結合し、これによって病気 にかかった細胞に集中し、インターフェロンを別々にし１］えばアトマイデーを 用いて導入したのでは不可能なインターフェロンとタバコの煙との間の相乗作用 が得られる。

従来技術の簡単な記載 ＣａｒｔｅｒＷ、Ａ、　＋　１９７９．Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　２５　ニ ア　１７−７２８　：Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ及びＣａｒｔｅｒ、　１９８２　ａ　 。

２８５　：　５４２−５４７　；Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ及びＣａｒｔｅｒ、　１９ ８２ｂ。

Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　、印刷中；　Ｃａ　ｒ　ｔ　ｅ ｒ　＋　ＷＡ、＋Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐｈａ ｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｏｎＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　＋印刷中＋　１９８２　；５ ｔｒａｙｅｒ　Ｄ、Ｒ，、ＣａｒｔｅｒＷ、Ａ、等＋　１９８２　＋Ａｂｓｔｒ ａｃｔｓ　ｏｆ　１３ｔｈ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　Ｃｏｎ ｇｒｅｓｓ＋印刷中：　Ｃａｒｔｅｒ　Ｗ、Ａｏ等、　１９８０゜Ｐｒｏｇｒａ ｍ　Ｇｒａｎｔ　Ｐｒｏｐｏｓａｌ　ＰＯＩＣＡ　２９！ｂ　−５ｔｈｅ　Ｎａ ｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ：　Ｃａｒｔｅｒ　Ｗ、Ａ、及 びＩ（ｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚＪ、ｓ、＋　１９８０　、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇ ｙ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　８　：３５９−３７７　：　ｌ５ａａ ｃｓ及びＬｉｎｄｅｎｍａｎｎ＋　ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓＲｏｙａｌ　５ｏｃ ｉｅｔｙ　Ｌｏｎｄｏｎ＋シリーズＢ　Ｖｏｌ　１４７，２５８−２６７頁（１ ９５７）　：　Ｐａｕｃｋｅｒ等、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ　１７　＋３２ ４　３３４頁（１９６２）　；　Ｔａｙｌｏｒ　Ｐａｐａｄｉｍｉｔｒｉｏｕ＋ ｒＥｎＬｅｒｆｅｒｏｎＪ　（Ｇｒｅｓｓｅｒ編）　、　Ｖｏｌ　２．１３−４ ６頁（１９８１）　：Ｄｅｒｙｎｋ等、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ　２８５　＋ 　５４２−５４７頁（１９８０）　；　Ｇｏｅｄｄｅｌ等、　Ｎａｔｕｒｅ、　 Ｖｏｌ　２９０゜２０−２６頁（１９８０）　：　５ｈｅｐａｒｄ等＋　Ｎａｔ ｕｒｅ、　Ｖｏ１２９４．５６３−５６５頁（１９８１）。

発明の要約 生物学的活性及び強化された安定性を有するインターフェロンの断片の製造及び 精製方法及び組成物が提供される。インターフェロンの断片又は全インターフェ ロン（又はインターフェロン誘発物質）トタバコとを組合わせて、タバコの煙に 暴露された細胞に対する強化されたインターフェロン効果を得る方法及び組成物 が提供される。多くの好ましい、そして有利な結果が得られる。

（１）　インターフェロン及び喫煙は、癌細胞の発生、呼吸器ウィルスの感染等 に対して監視するために相乗的に作用する。このような好ましい医療的効果の発 生におけるインターフェロンの生物学的効果は、タバコの煙中の上昇した温度に より増強される（）（ｏｒｏｎ及びＢｅｒｇにより発見された高温効果、　Ｎａ ｔｕｒｅ２７４：５０８−５１０．１９７８）。

（２）　インターフェロンが無毒と推定される薬剤（揮発性物質又は粒状物）と 同時に標的ヒト細胞に移送され、細胞が悪性化し続けるのではなくむしろ正常化 することを促進するため、喫煙者に対する発癌効果は種々のヒト組織の入口部分 において克服される。

（３）　肺微小環境において非毒性外来性粒状物を清掃し、飲み込み、そしてさ もなければ破壊し、これによって慢性気管支炎、気腫等の衰弱及び疾患の発生を 防止することにより肺を正常に保つ細胞（マクロファージ）の効果を増加せしめ るこの発明の証明された可能性によシ、外来性粒状物（分子状炭素等）の気管支 破壊効果が最小となり又は除去される。

（４）低いインターフェロンレベルによる肺における局所的な免疫不全はこの発 明によシ直接修正され、そしてさらに、肺を通過し、蓄積されたインターフェロ ンに一時的に暴露されることにより能力が増大した免疫細胞（体の全免疫系の一 部分を構成する）は次に体の他の部分に循環することが合理的に信じられる。こ うして、インターフェロンは局所的に投与されても増加した、そして最終的に体 の種々の他の部分に拡散される有利な効果（全身的効果と称する）を有するであ ろう。このような効果は、病理的過程により動脈及び静脈を閉塞する全体的過程 における成分である血小板生長因子の不活性化のごとき他の好ましい全身的効果 有することができる。

（５）　ヒトの全呼吸器（鼻、口、咽頭、気管、肺等）にわたるウィルスへの暴 露は非常に高い組織の抵抗に合うであろう。インターフェロンの抗ウィルス作用 は種々の体の領域に拡散するからである。この発明が規則的に実行される場合は いつでも、呼吸組織上の生物活性を失ったインターフェロンは常に新鮮で活性な インターフェロン分子により置き換えられるであろう。

発明者は、インターフェロンとタバコを含ムタバコ製品を組合わせる。発明者は 、高温、破壊的化学物質及び長期間の貯蔵に直面して、インターフェロンの断片 を使用することにより、そしてインターフェロンとある種の担体を組合わせるこ とにょシインターフェロンを安定化する必要且つ新規な手段を記載する。安定化 されたインターフェロンの幾らかが煙粒子と結合し、そしてそれにより病気にか かった細胞に集中し、インターフェロンをし１］えばアトマイザ−により導入す ることによっては不可能なイン夛−フエロンとタバコの煙との相乗作用が得られ る。

発明者は、ある大きな人口群が、癌、及び種々のウィルスに関する病気を含む他 の危険な病気に対して通常より大きな危険を有することを見出した。癌に対する 増加した素質を生じさせる遺伝的欠陥のためにこれらの群の危険がよシ大きいの である。これらの欠陥は、前記の人口群が空気中発癌物質又はウィルスに環境的 に暴露された場合に特に拡大される。

この発明は、インターフェロン及びその断片並びにインターフェロン誘発物質に より体の免疫監視系を強化することによシこれらの欠陥の修正をもたらす。

癌又はウィルスに増加した危険（一般より太さな）を有する個体において、免疫 監視細胞はしばしば不十分である。発明者は、このような細胞が肺組織を正常に 一時的に通過する間における、このような細胞のインターフェロン（タバコ製品 の使用によりすでに与えられそして蓄積している）に対する短時間の暴露が、不 十分な細胞活性を修正し、そして活性な癌防止機能を回復するのに十分であるこ とを見出した。

具体的な態様の記載 この発明は、生物活性を保持しながら高い安定性を得るためにインターフェロン 分子の一部分を除去し又は変形する新規な実行を採用する。この発明の方法は、 タバコの煙にょシ影響を受けた組織において生ずる癌細胞の連続的分子的監視及 び除去を行うためにインターフェロンとタバコを組合わせることによる相乗的組 合わせを提供する。「たばこ」は葉まきたばこ、パイプたばこ等を含むすべての 喫煙物を意味する。「インターフェロン」及Ｕ「インターフェロンの断片」なる 語は、互換的に使用され、天然インターフェロン、並びににプチド部分及び炭水 化物部分の変形を伴うすべての変形物を含み、ヒトの細胞のみならず、細菌、酵 母、モンキー細胞等を含むヒト以外の細胞において生産されたものも含む。

さらに、この発明は、例えば天然インターフェロン又はその誘導体を疎水性担体 に結合することにょシ、これらの分子がとシうる異る状態の数を限定することに より、これらを安定化せしめる方法を記載する。

この発明の方法は次の段階に分けられよう。

■、インターフェロン領域の認識。

■１選択された領域を有するインターフェロン断片の調製。

■、担体によるインターフェロンの安定化。

■、インターフェロン断片及び全インターフェロン分子とタバコとの組合わせ。

■、インターフェロン誘発物質／活性化物質とタバコとの組合わせ。

■、　インターフェロン領域の認識 インターフェロンをコードする遺云子はクローン化されている（し１１えば、Ｄ ｅｒｙｎｋ等、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｆ２８５．５４２−５４７頁、１９８０） 。これらの遺伝子は配列決定され（Ｇｏｅｄｄｅｌ　等、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖ ｏｌ　２９０　＋　２０−２６頁＋　１９８０　；　Ｄｅｒｙｎｋ等、　Ｎａｔ ｕｒｅ、、Ｖｏ）２８５゜二ロンの９個の一次樺造が決定された。コンピー−タ ープログラムを用いて、本発明者はインターフェロン系の幾つかの生物学的性質 に必要な領域を決定した（　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ及びＣａｒｔｅｒ、　Ｈａ’ｎ ｄｂｏｏｋ　ｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ｐｆ 　ＩＩｒＩｔｅ’ｒｆｅｒｏｒｒ、印刷中）。

抗ウイルス反応を生じさせるインタ一フェロンの先祖アミノ酸配、列は配列２− ’５−．．４０及びＬｉ２−１４１を含む（第１図）。すべて−のインターフェ ロンは抗ウイルス反応及び抗新生物反応の、両方を生、−じさせるカラ、この領 域の位置は、インターフェロンの１つ０種力）ら他の稲−にわ゛たるこの領域の 一次アミノ酸配列の保存性を基礎にして推定され、この妥存がｍＲＮＡ反応領域 は外界ＫＮ出されており（第２図及びＧ目１ｅｓｐｉｅ及びＣａｒｔｅｒ、　１ ９８２　）そして他の細胞成分との相互作用を促進するであろう。５ｔｒｅｕｌ ｉ等（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ ｃｉｅｎｓｅ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、Ｖｏｔ７８，２８４８−２８５２頁、１９８１）は、ある範囲の 宿主細胞に２いて生物学的活性を生じさせるだめにはインターフェロン分子の両 端が必要であると提案した。

特定の細胞受容器に結合するためて必須であると決定されたインターフェロン領 域はアミノ’Ｊ　ｌ　ｌ　５−１１１を含有する（　Ｇ１１ｌｅｓｐｉｅ及びＣ ａｒｔｅｒ。

１９８２）。この領−域の位置は、部分的に決定され、又はコレラトキンンのＢ ザブユニ、ｔ　ト（Ｌ、ａｉ、ＪｏｕｒｎａｌＢｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　ＶｏＡ 　２５２．７２４９−７２５６頁、１９７７７）、、すなわち受容器と結合する だめにインターフェロンと競争する物面との相同性によって促進される。

タバコに生物学的監視を与えるために少なくとも断片は生物学的反し領域それ自 体からなり、純粋であり又は感受性細胞への移入を促進する他の部分と結合して いる。第２の断片は、受容器結合領域に隣泉する生物学的反応領域から成る。完 全ポリ被プチード及び補欠分子族、それへのけ加又はそれからの欠失、又はこの 両者、又はこの変形を含む他のインターフェロン断片もまだ有用であろう。

さらに、この発明は任意の天然の又は合成的に（細菌又は酵母）調製された全イ ンターフェロ７分はｒ（免疫型）インターフェロンと称する〕を用いて実施する ことができる。インターフェロン断片の利点には、安定性、タバコから肺への移 入の容易さく分子量が小さいため）、よ゛り良好な組織への透過性及び低い抗原 性が含まれる。

インターフェロンの断片は幾つかの方法で調製することができる。例示により１ つの適当な方法を次に記載する。肋の方法、例えば天然インターフェロンの化学 的変形又はクローニングされた（合成）完全インターフェロンの化学的変形、イ ンターフェロン誘導体、等も容易に明らかでるり、そしてこの発明の範囲である 。

クローニングされたインターフェロン遺伝子は、特定の制限エンドヌクレアーゼ を用いて特定の場所で切断することができる（第３図）、得られたインターフェ ロン遺伝子ｉ片はインターフェロンポリペプチドの断片をコードしており、これ をＲＮＡ　７ｆ！リメラーゼプロモ〜ター、リボゾーム結合部位、開始コドン及 び他−の必要なシグナルを含有する発現ベクターと融合せしめることができる。

この組換ＤＮＡは、インターフェロンの断片を合成するために適当な宿主細胞に １人することができる。

ポＩＪＡ−ｄＴに連結されそしてｐＢＲ３２２中でクローニングされたとトーイ ンターフェロンー！の遺伝子５ｔ４を、３７℃てて２時間、２０　ｒｒ＋Ｍのト リス、ＰＨ７４，１０ｍＭのＭｇＣｌ２．５０ｒｒｕＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４及 び１００　ｍｑ／ｍｌのつ／血清アルブミン中５０二二、トのＥｎｄｏ　Ｒ・Ｐ ｌと共にインキュベートすることによりインターフェロン遺伝子を塩基２０３− ２０６の単鎖を残して切断した（第３図）。ＤＮＡを酢酸カルシウムにおいて０ ．３Ｍとし、そしてエタノールから沈澱せしめた。ＤＮＡを、Ｌｏｏｍ（！の５ ０ｍＭ燐酸カリウム。

ｐＨ７，４、６，７ｍＭのＭｇＣｌ２．１　ｍＭのメルカプトエタノール、３５ ｍＭのデオキシアデノ７ン及びデオキ７ノチノン、並びにエセリヒア・コリＤＮ Ａ　、ｆ？リメラーゼのフレノウ断片２うユニ、ト、に溶解した。ＤＮＡを酢酸 カリウムについて０．３ｒｒｕＭとし、そしてエタノールから沈・殿せしめた。

沈澱を１００ηＩｌの３０　ｒｍＶＩ酢虚ナトリウム、ＰＨ４，６、５０ｍＭの ＮａＣ１、ｌ　ｍＭのＺｎＳＯ４，５％のグリセリン及び２５ユニ、トのＳｌヌ クレアーゼ、に浴解し、そして３７°Ｃにて１時間インキ−ベートした。これに より平滑末端を有する、ヌクレオチド２０４までの完全なインターフェロン遺伝 子断片が生成し、第１は、４５Ｍのロイノンをコードするコドンに存在した（第 １及び３図）。酢酸ナトリウムを０．３　Ｍになるように加え、そしてＤＮＡを エタノールから沈澱せしめた。

別に、ポ１ＪｄＡ・ｄＴに連結されそしてｐＢＲ３２２中でクローニングされた ヒト−インターフェロン−βの遺伝子５ｇを、３７℃にて２時間、１０ｍＭのト リス、ＰＨ７，９、６ｍＭのＫＣｔ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２，１　ｍＭのノチオ スレイトール及び１０’Ｏｍ９／ｍｌのつ／血清アルブミン中５０ユニットのＥ ｎｄｏ　ＲＭｂｏ　ＩＩと共にインキュベートした。ＤＮＡをエタノールから沈 澱せしめ、そして上記のようにしてＳ１ヌクレアーゼにより処理した。インター フェロン遺伝子のヌクレオチドを、３係アガロースによる電気泳動により精製し た。

この断片のアリコート２５ｍりを、Ｐｓｔｌ処理し、ＤＮＡ　、１ｅリメラーゼ 処理しそしてＳｌヌクレアーゼ処理したＤＮＡ　５μＩと共に導入した。

２つのＤＮＡ断片から成る沈澱を、１０ユニ、トの細菌性アルカリホスファター ゼを含有するｐＨ８，０の１０ｍＭ）リス１０ｍ１に溶解し、そして３７°Ｃに て２時間インキ−ベートした。次に溶液を、２．３Ｍの酢酸す）　ＩＪウムによ り１００ｍ１に稀釈し、６５℃にて３０分間医持上、ＣＨＣｌ３にて抽出し、次 にエタノールから沈ン殿せしめた。沈澱を、１０ｄの７０ｒｎＭトリス、ｐＨ７ ，５，１００−のＫＣｌ、　ｌ　ＯｍＭのＭｇＣｌ２．５ｍＭのノチオスレイト ール、３０１）ｍＭのりボアデノシントリホスフェート、■ユニットのポリヌク レオチドキナーゼ及びｌＯユニ、トのＴ　４　ＤＮＡリガーゼに溶解し、そして ３７℃にて２時間インキ−ベートした。

こうして得られたＤＮＡ　’ｔｉ、アミノ酸４６−１１１が欠失したインターフ ェロンＩり被プチドをコードする、ヌクレオチド２０５−４００を欠失したイン ターフェロン遺伝子を含有していた。

次のし１１において、この物質を「インターフェロン断片ポリ梗プチド」と称す る。

との組換インターフェロン断片は、常用の技法を用いて、細菌又は哺乳動物細胞 中で発現せしめるために適する多くのベクターに挿入することができる。

インターフェロン又はインターフェロン断片ハ、標進的方法により精製すること ができる。但し、この発明は、有害な物質が存在しない限り１％未満のインター フェロンを用いて実施することができる。例えば、インターフェロンを含有する 溶液中の蛋白質は、エチレン又はポリエチレングリコールの非存在下で７バクロ ームプルー（Ｃｉｂａｃｈｒｏｍ　ｂｌｕｅ）セファロースに結合する。カラム を、インターフェロン以外の蛋白質のほとんどを除去する種々の溶液で洗浄し、 そしてインターフェロンを、エチレンもしくはポリエチレングリコール、又は他 の適当な溶離剤を含有する溶液により溶出する（　Ｃａｒｔｅｒ等。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、　Ｖｏｌ　８ 　、３５９−３７７頁、１９８０）。所望により、結合及び溶出のだめの常用の 条件を用いて、インターフェロン含有溶液を抗−インターフェロン抗体を含有す るカラム基剤に通すことにより、シバクロームブルー画分又は他の材料の精製を さらに行うことができる。

上記の組換ＤＮＡは、同じ酵素の幾つか又はすべてを異る条件下で又、は異る順 序で１吏用して、あるいは上記の酵素又はインターフェロン遺伝子の変形を用い て調製することができる。他の適当な組換ＤＮＡは１也の酵素及び曲の方法を使 用して形成することがでに組換ＤＮＡを使用することは、インターフェロンの断 片を生成せしめるだめの方法の単なる例示である。

他の手段、例えば固相合成、無傷の材料、又は細菌及び酵母中で調製された遺伝 的にクローニングされたインターフェロンの蛋白質分解的切１析を、同様に用い ることができる。

■、担体によるインターフェロンの安定化インターフェロンは、他の蛋白質と同 様に、比較的不安定な化学物質である。水溶液中の溶解性及び生物活性は、種々 の線状に配列したアミノ酸の非常に特異的な三次元配置に依存する（第１図参照 ）。

具体的には、細胞への結合及び複雑な生物反応の惹起のために機能するインター フェロン分子の領域は適切に露出されそして整列されていなければならない。し かしながら、他の非機能的方向の多くの配列も可能であり、自由に形成され得る 。これらの異る状態は熱、ある種の外来性化学物質及び長期に及び貯蔵により助 長される。

異る不活性状態の形成を防止するだめの１つの解決方法は、ＩＦＮ活性を示すが 限定された数の異る状態を有する分子、すなわち■、に記載したインターフェロ ン断片を形成することである。本発明者によって開発された池の解決方法は、イ ンターフェロンを担体分子又は構造上に固定化することにより異る状態の形成を ｊｊｊ：Ｉ限することである。

活性酵素はしばしば、細胞膜、核酸、蛋白質等に結合した複合構造の部分として 見出され、そして酵素は通常、複合した状態においてより安定である。

、　このような方法の実施可能性を評価するため、本発明者は、効果的な安定剤 であると考えられる種々のＩＪ　、ｆンドを含有する幾つかのカラム基剤を形成 した１　（第２図、　Ｃａｒｔｅｒ等＋　１９８０　＋　Ｐｈａｒｍａｃ、　Ｔ ｈｅｒ、　８　：３５９−３７７）。アルブミンを結合せしめることによりカラ ムを特徴付けた。１　ｍｌ、中に１１，５００ユニ、）及び０．９９　ｍ（ｌの 蛋白質を含有する１００ｒｎｌの透析してないインターフェロン標品ヲ、イリス タルポンプを用いて、６０ｍ１／Ｃｒｎ２／時の流速でカラムに適用した。

アルブミンカラムを、０１５ＭのＮａＣ１を含有する０、　０２　Ｍの燐酸す） 　ＩＪウム、（ｐＨ７，４）を用いて平衡化した。カラムからの溶出液を流れ分 割装置により１°９の比率で分割した。溶出液の１０係の部分を、００２Ｍの燐 酸ナトリウム及び０１５ＭのＮａＣ１を含有するつ／血清アルブミンの１％溶ｉ １ｍＡ中に集め、そしてインターフェロン活性の測定に使用した。

溶出液の９０％部分は蛋白質着席を測定するのに使用した。両分全体に、適用し た蛋白質の約９８％が含まれており、そして適用したインターフェロン活性の１ 係未満が含まれていた。５０　（ｖ／ｖ）％″のエチレングリコール及び５０％ の０．０４　Ｍ燐酸塩（ｐＨ７４）及び０．３０　ＭのＮａＣ４を用いてさらに カラムの溶出を行った。インターフェロン活性の残ｔ（８６係）が非常にわずか のもとの蛋白質（２５ｂ未満）を伴って回収された。これらの実験の幾つかは最 近公表された（　Ｃａｒｔｅｒ　Ｗ、Ａ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ７８：５７６−５８２．１９８１）。

上記の実、験は、インターフェロンは血清アルブミンと結合することができるが 、他のほとんどの細胞蛋白質は結合できないことを示した。他の固定化蛋白質、 例えばチトクロームＣを用いる実験は、インターフェロンが蛋白質と結合する一 般的注質を有することを示した。本発明者は、インターフェロンの強い疎水囲が 他の蛋白質の通常はかくれている疎水性ボケ、トと強引に相互作用すること全仮 定し、そして上記の実験はこの仮定が正しいことを示唆した。

機溝のいかんにかかわらず、上記の実験は蛋白質との複合体の形成がインターフ ェロンを安定化せしめることを示した。

この目的で本発明者によって開発された方法は次の通りである。ヒト−インター フェロンを任意の生物的分離源−ヒト−細胞、組換微生物等−から任意の常用手 段によって分離することができる。精製した後、ヒトー血清アルブミン又は他の 蛋白質性担体を過剰に、通常は３ｍ麹に加えることができる。溶、夜を燐酸援衝 化塩溶液又は他の適当な緩衝液に対して透析し、そして凍結乾燥することができ る。典壓的な列においては、１００万ユニ、トの精製インターフェロンを３４６ ■の燐酸ナトリウムと共に凍結乾燥した。

この急速に変化する分野において、この方法の多くの変法を用いることができる 。アルブミン又はチトクロームＣ以外の担体蛋白質を用いることができる。他の 担体分子又は構造、例えば脂質、小疎水性リガンド、膜断片、又は固体粒子も用 いることがで訪る。他の結合手段、例えばイオン結合又は共有結合も適当である 。他の塩もしくは緩衝剤、又（ｄ塩もしくは緩衝剤の他の濃度（塩又は緩衝剤を 使用しない場合、を適用することができる。ある場合には透析は必要ない。基本 的に、この発明の目的はタバコと矩合わせることができ、そして主力学的活性を 保持することができる安定な形のインターフェロンを提供することである。

この節において、「インターフェロン」は全インターフェロン及ヒ前ニ定義した 「インターフェロンの断片」を意味し、そして逆にこの節において使用する「イ ンターフェロンの断片」は全分子をも含む。

知うしているすべてのヒト−タイプのインターフェロンを本発明者の研究室にお いて標準的と認められる方法によシ調製した〔天然線維芽細胞（β）インターフ ェロンについてはＣａｒｔｅｒ及びＨｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、　Ｖｏｌ　８ 　ｒ　３５９−３７７頁、１９８０；天然白血球（α）インターフェロンについ てはＭｏｇｅｎｓｅｎ及びＣａｎｔｅｌｌ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄ 　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、　Ｖｏ７　Ｌ　３６９−３８１頁、１９７７：天 然免疫（γ）インターフェロンについてはＭｉ　ｚａｒｈ　ｉ　＋０’Ｍａｌｌ ｅｙ、　Ｃａｒｔｅｒ等、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ　２３　、７６１５頁、　１９７８を参照のこと〕。

インターフェロンは、インターフェロンの生物学的活性を保持し、そしてタバコ の煙の吸引によりインターフェロンが口腔を通って肺に移行するようにタバコに 加えられなければならない。組合わせ方法の詳細は、好ましい生物学的活性、し Ｑえば口ひる、口腔、及び肺に２ける抗腫瘍効果、免疫的効果及び抗ウイルス効 果を最大にするものでなければならな１ハ。

インターフェロンの断片とタノ々コとを組合わせる若干の方法がこれらの基準を 満たす。１つの典型的な［ｔＱを下）て記載するが、これは方法の単なる適当な 形にすきないと考えられる。

インターフェロンの断片及び完全分子は■及び■において例示したようにして調 製し、そして常用の方法及び装置を用いて微細な乾燥粉末に凍結乾燥した。０． ０１〜ｂ 当である。一般に、１部のインターフェロ７８９９部のヒト−アルブミン、フラ クションＶの混合物を一緒に凍結乾燥して、所望の大きさと稠度を有し不所望の 生物的効果を有しない粒子を得る。他の混合物も可能であり、そして均等である と考えられ、これらにはインターフェロンとセルロース粒子及び食塩のような担 体との組合わせが含まれる。但し上記の性質（稠度、力価、副作用がないこと） が最終製品の目的に一致することが必要である。インターフェロン含有粉末は、 フィルター生フィルター自体の長さまでの距離を実質上越えない距離に所定量の インターフェロンを移動させるように短時間継続する空気の吹き込みを用いて、 あらかじめ製造されたタバコのフィルターの端に吹き込むことができる。インタ ーフェロン粒子は酢酸セルロースのフィルターとゆるやかに混合されそしてその 中に付着する。この酢酸セルロースは強い結合によって粒子を保持しない物質で ある。この方法は酢酸セルロースのフィルターを有するタバコに限定されず、イ ンターフェロンを永久的に化学的に結合せずそして酢酸セルロース又＋ｉ　曲の プレフィルタ−の添加により変性され得る任意のフィルターを、任意の他の種類 のフィルターを含むタバコに含めることも適当である。この発明の方法は、喫煙 物の煙の流路にインターフェロン粒子を混合したセルロース、酢酸セルロースの ような基材を含めることによりフィルターなしタバコ、葉まきタバコ、・ぐイブ 及び他の喫煙物に適用することができる。喫煙行為はインターフェロンとタバコ を組合わせるために使用しだのとは逆の空気の流れを生じさせ、そしてインター フェロンの粒子を煙の中に引き出し、インターフェロンをタバコの煙に暴露され る細胞に運ぶであろう。

インターフェロン粒子とタバコフィルター又ハブレフィルターを組合わせるだめ の例示的な装置を第４図に示す。常用の空気源−コンプレッサー、インにラモー ター、グイアフラム等（でより空気流を供給する。空気がチューブにそって押出 され、インターフェロン分散装置、列えば空中インターフェロン粒子の密度を均 一に保持するだめに攪拌され、あるい（ｄ操作され又は構成された、そしてその 所定量の内容物を分配する室を通ってチューブに流れる。第４図にはピストン装 置を図示したが、適当な量のインターフェロンをチューブに供給できるものであ れば任意の装置を使用することかできる。所定体積の空気中粒子を、空気の噴流 を発生させる直前にチューブに導入する。空気噴射の１間、インターフェロン粒 子がタバコ中一定の距離に運ばれる。この夕・ぐコは常法に従って製造されたも のである。空気噴射を停止シ、そしてインターフェロン粒子をフィルター材料に 付着せしめる。そしてチューブを次の夕・ぐコに移動せしめ（又は夕・々コを移 動せしめ）、そしてこの工程を反復する。上記の方法は例として詳細に説明した 。凍結乾燥により調製したインターフェロン粒子をフィルターと組合わせるのに 他の方法が可能であり、この方法には、重力、噴霧、散布、又は粒子の移動を生 じさせる曲の方法、あるいは電気的吸引、磁気的吸引、あるいはその曲のコート 法又はプレート去ニよす、インターフェロン粒子ラフイルターに付着せしめる方 、去が邑−まれる。これらの方法及θその他の代り得る方法がこの発明に含まれ る。さらに、フィルター製垣の任意の段階でインターフェロン粒子をフィルター と組合わせることができるが、この場合にはその後の段階においてフィルターを ８５０　′Ｚ　（ｄプチド結合を破壊するために必要な温度）以上に加熱しては ならない。インターフェロンをフィルターとではなくタバコと組合わせ、又はあ とでタバコに連結されるプレフィルタ−と組合わせることができる。インターフ ェロンは、溶液又は半コロイドもしくはコロイドとして、フィルター材料、タバ コ又はブレフィルター上に、同様の結果をもって付着させることができるが、こ の場合脱着効率は低い。これらの変法及びこの変化する分野における将来の適用 はすべてこの発明の部分であると考えられる。基本的には、この発明は、インタ ーフェロン分子、又はインターフェロンと粒子状又は非粒子状の他の物質との生 物学的に活性な形での複合体から蜘るインターフェロン含有粒子とを、喫煙物に より生成した煙６コに乗せることができるように、インク　・−フェロン又はイ ンターフェロン粒子を固定化する基準を満足する。

上記の記載から、生物学的活性及び強化された安定性を有するインターフェロン の断片を生成せしめ、分離し、そしてタバコに含有せしめることができることが 明らかである。従ってこの発明は、喫煙の潜在的に危険な効果に対抗し、そして ヒトの呼吸系に、感冒、ウィルス等に対する一般的保護効果を与えるだめの新規 な手段を提供する。幾つかのアミノ酸が欠失しているインターフェロン断片の使 用は、天然抗癌剤であるインターフェロンとタバコを組合わせる単なる例示であ る。インターフェロンのその他の変形も可能であり、これにはアミノ酸の付加、 存在するアミノ酸の変化、及び除去、付加又は変形による種々の糖補欠分子族の 変化が含まれる。

この発明に従えば、所望の愕質、高い生物学的活性、強化された安定性、タバコ に含有されそして煙中に放出される可能性を有するインターフェロン断片を操作 するだめの方法が提供さｎる。その結果、喫煙の潜在的に危険な効果を克服する ことができ、そしてたしかに、喫煙者の一般的健康の増進がはかられる。

前述の発明を、明確にしそして理解に供するために説明及び例により幾分詳細に 説明したが、添付した請求の範囲の範囲内において幾つかの変法又は変化を行う ことができることは言うまでもない。

■、　インターフェロン／誘発物質活性化物質とタバコとの組合わせ 体自体のインターフェロンの保留を促進する合成化学ＷＭを一般にインターフェ ロン誘発物質又はインターフェロン誘発物質／活性化物質と称する（　ｒ　５ｅ ｌｅｃｔｉ、ｖｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｓ　ｏｆＶｉｒａｌ　Ｆｕｎｃｔｉｏ ｎｓ　ＪＷ、　Ａ、　Ｃａｒｔｅｒ　％、　Ｃｈｅｍｙｃａｌ　Ｒｕｂｂｅｒ　 Ｃｏｍｐａｎｙ＋　１９７３における総説を参照のこと）。これらの誘発物質は 、二重鎖ＲＮＡ　（ＩＪゴヌクレオチド）、又は鍾々の小分子量化学物質、例え （ばポリアニオン、ピランコポリマー等を含む化学的に多様な種類の化合物から 成る（さらにｒ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｊ　ＬＧｒｅｓｓｅｒ編、１９８１を 参照のこと）。

この発明は上記の種々の群の化学的及び／又は生化学的物質のいずれかを用７い て実施することができる。但しこれらの物質はタバコから一慣して蜆着し、そし て呼吸空間に付着しり後に活性を現わし続けそして不所望の副作用を有しないも のでなければならない。

これらの有効性を証明するために、２種類の誘発物質、すなわちポＩＪＩ−Ｃ及 びアンプυヶ゛ン（不均整ＲＮＡらせんから成る誘発物質についての商漂）を、 タバコのフィルターの端に粉末を軽くふりまくことによってタバコフィルター上 に原語乾燥物の形で付着せしめた。第４図に記載した例示的装置はまた、誘発物 質を、中いて、又は誘発物質喧子とインターフェロン粒子の任意の組合わせを調 製するためにも使用することができる。体外で行われた種々の試験に駁いて、２ 種類の物質の組合わせは通常より顕著な、又は相乗的な、好ましい生物学的効果 を生じさせる。

例 ヒトの肺及び周囲の組織は、ガス交喚（設素の受け入れと二酸化炭素の廃山）中 に２ける外来性環境物質の攻撃に対して反応する多くの異る種類の細胞から成る 複雑な器官である。この発明の有利な効果を評価するために、発明者は、体外で 小組１条培養容器、槓トリ皿、又はウェルに維持さユた種々のヒトの生細胞を防 用して、体外での呼吸器防御系の成分を研究することを選択した。このような皿 又はヒトの細胞を増殖せしめるだめの他の装置において、ヒトの体内で生ずるで あろう幾つかのタイプの相互作用を刺激する方法で、生細胞に煙をふきかけるこ とができる。

例１ １００．０００国際比狡単位（ＩＲＵ）の天然線維芽細胞（β）インターフェロ ン（タバコＡ）、もしくは■に記載したｌ　ＯＯ，０００ＩＲＵの天然βインタ ーフェロン断片イプチド（タバコＢ）、又は１０μＩの不均整ＲＮＡインターフ ェロン誘発物質（−、Ｃａｒｔｅｒ等。

Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏ７７０　 、５６７頁。

Ｌ、９７２）（タバコＣ）と同等の量を凍結乾燥物の形で前もって付加したフィ ルター型（酢酸セルロース）のタバコから、ヒトの志願者が吸入した。凍結乾燥 したインターフェロン成分を含浸せしめたフィルターを通った煙を吸引した後、 すぐに、志願者は彼の口腔及び鼻を通して、煙を直接に、血清を補給したＲＰＭ Ｉ　１６４０培地中に保持されたヒトの正常な生線維芽細胞を含有する開放被ト リ皿に放出した。次にとのにトリ皿を二酸化炭素（５％）にもどし、そして液本 培地環境にさらに１０時間おき、この時間はインターフェロンの効果が生じ得る 時間であり、この後線維芽細胞におけるインターフェロン抗ウィルス活性をウィ ルス誘導細胞病理効果の阻害の標準的測定法により測定した（　Ａｒｍｓｔｒｏ ｎｇ　Ｊ、Ａ、、　ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　ｖｏｚ　２１ 　＋　７２３−７２５頁、　１９７１を参照のこと）。小水症性口内炎ウィルス をチャレンジウィルスとした。インターフェロン含浸フィルターを通過し、そし て次に志願喫煙者の口腔を通過した煙を受理したすべての皿において、抗ウイル ス状態の強力な証明が、存在する線維芽細胞中で観察された。インターフェロン 処理フィルターを有Ｌ＆い「対照フィルター」を用いる同様の実存において抗ウ イルス効果は認められず、タバコの煙それ自体は、チャレンツウィルスに対して ヒトの組織を保護しないことを示した。

例２ 志願者は、すでに記載されている方法（Ｍｉｚｒａｈｉ等、前記、１９７８）に より調製された天然ヒト免疫インターフェロン（γ）　１００，０００　ＩＲＵ を含有する同じ方法で製造されたタバコＡ、Ｂ、Ｃ１及びＤを用いて前記の方法 を反復した。γインターフェロンは、蛋白質ｍり当りｌ　、００，０００　ＩＲ Ｕを含み、約１％の予想純度を有する。この場合、健康なヒトの血液からの細胞 を用いるフィコルーハイｐＰり（Ｆｉｃｏ、１−Ｈｙ’ｐａｑｕｅ）勾配を含む 標準技法（Ｚａｒｌｉｎｇ、　Ｃａｒｔｅｒ等、　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｉｍｍ ｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｊ　１２３，６３−７０頁、１９７９；及び同Ｖｏｌ　 １２４，１８５２−１８５７頁、’１９８１を参照のこと）により分離されたヒ トー免疫ナチーラルキラ＝（ＮＫ　）細胞を含有するウェル中に直接放出した。

次に被トリ皿を８時間インキ−ベートし、この後標準法を用いて洲細胞を再分離 し、そしてヒト−腫瘍標的細胞に５６２を殺す能力について試涙した（上記の文 献、及びさらにＭａｒｘ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　ＶｏＡ　２１０　ｒ　６２４− ６２６頁、１９８］を参照のこと）。タバコＡ、Ｂ。

Ｃ１及びＤからの煙に暴露された結果として、ＮＫｍ胞の殺波力は約３０〜１ｏ ｏづ増加したと考えられる。「対照」タバコからの煙は増強能力を示さず、この 効果は非特異的なものではなく、むしろ目的をもつ、てタバコに添加されたイン ターフェロン含有成分及びインターフェロン誘発物質により生ずることか示され た。

汐１１３ 志願者は、こんどは異る標的細胞及び処理されたタバコの拡大された・ぐネルを 用いて上記の実験を反復した。この場合、標的細胞は、正常な囲体の血中で循環 している細胞から誘導されたヒト−マクロファージ（プラスチ、り−ｚ　）　Ｉ Ｊ皿への付着によって定義される）から成る（　Ｚａｒｌｉｎｇ、前記：さらに ５ｃｈｕｌｔｚ及びＣｈｉｒｉｇｏｓ、　Ｃａｎｃｅｒ’Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　 Ｖｏｔ３８゜１００３−１００７頁、１９７８を参照のこと）。この場合、照細 胞は、表面に付着しないので、最初に廃棄し、そして残留するマクロファージを 、ウシ胎児血清を補給したＲＰＭＩ　１６４０培地に、生存段階に保持した。

インターフェロンタバコの拡大すれた・ぐネルハ、上記の（タバコＡ、Ｂ１Ｃ， 及びＤ）並びにクローンＡ２と称される凍結乾燥された合成（細菌製）ヒト白血 球インターフェロン（さらにＧｏｅｄｄｅｌ　Ｄ、Ｖ、等。

Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｊ　２９０　ｒ　２０−２６頁、　１９８１　）　１００ ，０００ｉＲＵを含有するＥがら成る。マクロファージ活性化８ 物質を、煙に暴露してから１２時間後の鉄粒子の拡大によりＪ１１１定した。し ばらくｐ間、細胞を、加湿した：）　％　ＣＯ２室中に３７℃にて保持した。例 １及び２の場合と同様に、インターフェロン担体タバコカラの煙に暴露されたす へてのヒト−マクロファージ標品は一貫して活性化されたが、「対照」タバコか らの煙は効果を示さなかった。

り１１４ 志願者は、ヒト−腫瘍ＨＬ　６０　Ｎａ胞を含有する新しい標的組織培養ウェル を用いて実験３（タバコＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、及びＥ）を反復した。ＨＬ　６０　Ｍ Ｊ胞は、そのもとの、細胞構成から示唆されるように、非常に５惟の白色病腫瘍 細胞であるが、しかしながら、インターフェロンへの暴露により一定比率の細胞 が形態学的に変ｒヒし、そして成熟及び正常細胞の形態及び機能への１夏帰が示 される（　Ｃａｒｔｅｒ、　ＰＯＩＣＡ２９５４４５及びこれに引用さ４１だ文 献）。各々の煙の流れシて暴咳した後、ＨＬ　６０を含有するセトリ皿を加湿さ れた５％Ｃ０２室中のＭＥＭ培地中、３７℃に保持した。次の５〜ｌＯ日間にお いて４８時間ごとに、ａ胞をインターフェロン含有煙に反復して暴露し、そして ００２室中で再インキュベートした。実り開始後約７日から初めてそし、て１４ 日間続けて、インターフェロン処理ＨＬ６ｏ培養物（タバコＡ−Ｅのインターフ ェロンフィルターを通った煙に暴露された）は、対照培養物に比べて、成熟及び 正常な発達の漸進的な徴候を示す。成熟及び正常化への復帰の徴候には、細胞核 の漸進的な分裂、核小体のゆるやかな消滅、及び核の大きさの縮小、細胞質顆粒 形成の証明、成熟多形核内赤球例えば正常なヒト末梢血中に存在するものへの分 化の証明、が含まれる。

例５ ■に記載したようにしてアルブミンを伴って又は伴わないで調製されそして凍結 乾燥されたインタ一フェロンを、１　ｍ！の蒸留水に再溶解し、そして種々の温 度でポリエチレン容器に貯蔵した。間隔をおいてアリコートを採取し、そしてイ ンターフェロンの抗ウィルス活性を１ｌｌｌｌ定した。結果を次の第１表に示す 。

＋＋２２℃　９９　７９　３７　０＊＊−７５１６０，１０＊＊ 千　４℃以下　１００　１００　９５　３０−　＋　９７　８５　３８　０＊＊ ＋＋２２℃　１００　１００　１００　１００＊−最初の活性の係。

★＊＝検出されず。

溶液中のインターフェロンはアルブミンによす明らかに安定化した。乾県インタ ーフェロンはアルブミンの存在下で室噴において１年間にわたって安定であった 。

浄書（内容に変更なし） 手続補正書（方式） 昭和５９年６月７９日 特許庁長官　若　杉　和　夫　殿 ■　事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８３１０１１９９ ２　発明の名称 インターフェロン及びインターフェロン誘発物質とタバコ製品との組合わせ ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 に４　カーター、ウィリアム　アルビン４代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５　補正命令の日付 ６　補正の対象 図面の翻訳文 ７　補正の内容 図面の翻訳文の浄書（内容に変更な′−）８　添付書類の目録 図面の翻訳文の浄書　１通

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．　インターフェロン又はその生物学的に活性な断片を喫煙可能なタバコ製品 に加えることを含んで成る該製品に薬剤付与する方法。 ２　インターフェロンが安定化されている請求の範囲第１項記載の方法。 ３　前記インターフェロンを担体に付加することによって安定化を行う請求の範 囲第２項記載の方法。 ４　前記担体が血清アルブミンである請求の範囲第３項記載の方法。 ５　担体がチトクロームＣである請求の範囲第３項記載の方法。 ６　前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第１項記載の方法。 ７　前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第１項記載の方法。 ８　前記製品が／ｅイブタバコである請求の範囲第１項記載の方法。 ９　ヒトの体中でインターフェロンの産生を誘発する物質を喫煙可能なタバコ製 品に加えることを含んで成る該製品に薬剤を付加する方法。 １０　前記物質が二重鎖ＲＮＡ、＆ランコポリマー、ポリアニオン、及びリンホ カインから成る群から選ばれる請求の範囲第９項記載の方法。 １１　前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第９項記載の方法。 １２　前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第９項記載の方法。 １３、前記製品がパイプタバコである請求の範囲第９項記載の方法。 １４　外部的に適用されたインターフェロンを含有する喫煙可能なタバコ製品。 １５、前記インターフェロンが安定化されている請求の範囲第１４項記載の製品 。 １６　前記インターフェロンを担体に付加することにより安定化を行う請求の範 囲第１５項記載の製品。 １７　前記担体が血清アルブミンである請求の範囲第１６項記載の製品。 １８、前記担体がチトクロームＣである請求の範囲、第１６項記載の製品。 １９　ヒトの体内でインターフェロンの産生を誘導する外部から適用された物質 を含んで成る喫煙可能なタバコ製品。 ２０、前記製品が紙巻タバコである請求の範囲第１９項記載の製品。 ２１、前記製品が葉巻タバコである請求の範囲第２０項記載の製品。 ２２、前記製品がノやイゾタバコである請求の範囲第４３ １９項記載の製品。 ２３　前記物質が二重鎖ＲＮＡ　、ピランコ、ｆ　ＩＪママ−ポリアニオン及び リンホカインから成る群から選ばれる請求の範囲第１９項記載の製品。