JPH0543351B2 - - Google Patents
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- JPH0543351B2 JPH0543351B2 JP61101043A JP10104386A JPH0543351B2 JP H0543351 B2 JPH0543351 B2 JP H0543351B2 JP 61101043 A JP61101043 A JP 61101043A JP 10104386 A JP10104386 A JP 10104386A JP H0543351 B2 JPH0543351 B2 JP H0543351B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- pseudomonas
- nitrile
- solution
- salts
- nitriles
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
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- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
発明の背景
本発明は、シユードモナス（Pseudomonas）
属の微生物の産生するニトリルヒドラターゼに基
づくニトリル水和活性の経済的な低下を防止し、
この活性を安定に保持する方法に関する。 近年、固定化酵素および固定化微生物に関する
技術の急速な進歩と共に、微生物、酸素またはそ
れらの固定化物を種々の単位化学反応や複合化学
反応の触媒として利用しようとする動きが活発化
しつつある。 ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和し
て対応するアミド類を生成せしめる酵素として、
本発明者の中の山田らにより見出されており
〔Agric.Biol.Chem.46、1165〜1174（1982）参照〕、
その具体的利用例としてニトリルヒドラターゼを
産生するシユードモナス属の微生物を用いC2-4の
ニトリルから対応するアミドを生成させる方法が
提案されている〔特公昭59−37951号公報および
Agric.Biol.Chem.46、1183〜1189（1982）参照〕。 しかしながら、本発明者らによるその後の検討
において上記ニトリルヒドラターゼのニトリル水
和活性は不安定で、経時的に低下することが判明
した。この低下は、固定化の有無を問わずニトリ
ルヒドラターゼが菌体内にある状態および菌体か
ら分離された状態いずれの場合においても起こる
が、後者の場合の方が大きく、著しい場合には短
期間で全く使用不可能となる。 発明の概要 本発明は、上記の点に解決を与えニトリルヒド
ラターゼのニトリル水和活性を効率的に利用する
ことを目的として、鋭意検討した結果、特定の物
質、すなわち、ニトリル類、アミド類および有機
酸またはその塩類等の使用が該目的に極めて有効
であることを見出し、この知見に基づいてなされ
たものである。 すなわち、本発明は、ニトリル水和活性を有す
るシユードモナス（Pseudomonas）属の微生物
の培養液から分離、所得した微生物菌体、該菌体
から分離、抽出した酵素ニトリルヒドラターゼま
たはこれらの固定化物を懸濁液ないしは溶液の状
態で保存するに際し、安定化剤としてニトリル
類、アミド類、および有機酸またはその塩類の中
から選ばれた少なくとも１種の化合物を添加する
こと、を特徴とするニトリル水和活性の保持方
法、を要旨とするものである。 発明の具体的な説明 微生物： 本発明における微生物は、ニトリルヒドラタ
ーゼを産生し、ニトリル特にアクリロニトリル
を水和して、対応するアミド特にアクリルアミ
ドを生成することができるシユードモナス属の
微生物である。具体的には、例えば、前記特公
昭59−37951号公報に記載のシユードモナス・
クロロラフイス Ｂ 23（Pseudomonas
chlororaphis Ｂ 23）〔微工研条寄第187号〕
およびシユードモナスsp.PS １（Pseudomonas
sp.SP １）〔微工研条寄第188号〕、その他シユ
ードモナス・オバリス（Pseudomonas
ovalis）〔IAM 1002〕、シユードモナス・フル
オレツセンス（Pseudomonas fluorescens）
〔IFO 3081およびIFO 3925〕およびシユード
モナス・レプテイリボーラ（Pseudomonas
reptilivora）〔IFO 3461〕などを挙げることが
できる。これらの微生物は、それぞれ工業技術
院微生物工業研究所（微工研）、東京大学応用
微生物研究所（IAM）および財団法人発酵研
究所（IFO）にそれぞれ上記番号で寄託されて
いる。 これらの微生物の培養は、通常、グルコー
ス、シユークロース、デキストリン、グリセリ
ン等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素等の窒
素源、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペ
プトン等の窒素源、およびプロピオニトリル、
イソブチロニトリル、プロピオンアミド、イソ
ブチルアミド、メタクリルアミド等の酸素誘導
物質その他を適宜含有する倍地に、それぞれの
菌株を接種して好気的に行う。 培養のPHは６〜９程度、好ましくは７〜８程
度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは20〜
30℃程度とし、培養時間は１〜３日程度で充分
である。培養により得た菌体は遠心分離等によ
り集菌することができる。 ニトリルヒドラターゼ： 本発明におけるニトリルヒドラターゼは前記
微生物が産生する酵素であり、その分離、抽出
は次のようにして行うことができる。 先ず、培養液より遠心分離等で集菌した菌体
を所定の菌体濃度となる様にバツフアーに懸濁
し、超音波菌体破砕機、ダイノーミルフレンチ
プレス等により菌体を破砕し、遠心分離等によ
り未破砕菌体および細胞壁、膜を除去し、可溶
性画分（菌体抽出液）を得る。さらに、その菌
体抽出液は常法に従い、適宜、硫安分画、
DEAE−Sephacel Phenyl−sepharose、
sephadex等のカラムを用いたり、さらには結
晶化等により精製することにより、部分精製酵
素液または精製酵素（液）を得ることができ
る。 本発明では、これら精製段階の如何によら
ず、いずれの酵素も対象となる。 固定化菌体・固定化酵素： 本発明における固定化菌体・固定化酵素は、
上記微生物菌体およびニトリルヒドラターゼ
を、常法に従い、それぞれ活性炭等へ吸着させ
る吸着法、イオン交換樹脂等に結合させるイオ
ン結合法ならびにガラスビーズ等に共有結合さ
せる共有結合法およびアクリルアミド、カラギ
ーナン、アルギン酸等で包括する包括法等によ
り得ることができる。 安定化剤： 本発明において使用する安定化剤は、ニトリ
ル類、アミド類および有機酸またはその塩類の
中から選ばれた化合物であり、これらはそれぞ
れ単独にまたは混合して使用することができ
る。 具体的には、例えば次の化合物を挙げること
ができる。 (1) アセトニトリル、プロピオニトリル、イソ
ブチロニトリルのような脂肪族ニトリル類と
対応するアミドおよび酸またはその塩類。 (2) グリシンニトリル、α−アミノプロピオニ
トリル、β−アミノプロピオニトリルのよう
なアミノニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (3) ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリ
ル、β−ヒドロキシプロピオニトリルのよう
なヒドロキシニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (4) アクリロニトリル、メタクリロニトリルの
ような不飽和ニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (5) マロンニトリル、スクシンニトリル、アシ
ポニトリルのようなジニトリル類と対応する
ジアミドおよび二塩基酸またはその塩類。 (6) シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモ
ノシアノアミドおよびモノシアノ酸またはそ
の塩類。 (7) ベンゾニトリル、フエニルアセトニトリル
のような芳香族ニトリル類と対応するアミド
および酸またはその塩類。 (8) ニコチノニトリル、イソニコチノニトリル
のような複素環式ニトリル類と対応するアミ
ドおよび酸またはその塩類。 (9) クロロアセトニトリル、β−クロロプロピ
オニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と
対応するアミドおよび酸またはその塩類。 (10) グリオキサールのようなアルデヒド基を有
する酸またはその塩類。 ニトリル水和活性の保持： 本発明におけるニトリル水和活性の保持は、
前記した化合物を、同じく前記した微生物菌
体、ニトリルヒドラターゼおよびこれらの固定
化物を各種バツフアー溶液、生理食塩水などに
分散ないしは溶解させた懸濁液ないし溶液に添
加することにより達成することができる。安定
化剤の添加量は通常0.01〜50ｇ／の範囲であ
るが、長期保存、コスト等を考慮すると0.1〜
10ｇ／添加することが望ましい。 懸濁液あるいは溶液のPHは５〜８、好ましく
は5.5〜７の範囲で、リン酸バツフアー、トリ
スバツフアー等、各種バツフアー溶液が通常用
いられる。また、場合によつては、塩酸、硫酸
等の酸、カセイソーダ、カセイカリ等のアルカ
リを添加し、PHをコントロールすることも有効
である。 温度は短期間保存の場合は室温でも良いが、
低温、特に０℃付近で保存することが望まし
い。 効 果 本発明によれば、ニトリル水和活性を長期間安
定に保持することができるが、本発明の安定化剤
の添加は、特に、該活性の経時的低下が大きい菌
体から分離した酵素に対して有効である。その効
果は前記酵素精製の各段階での酵素液の保存安定
性ばかりでなく、各精製工程での酵素活性の保持
においても認められる。従つて、安定化剤は各精
製工程において使用する酵素液またはバツフアー
溶液等に添加しておくことが好ましい。 以下、実施例により本発明を説明する。 実験例 下記の実験例中、ニトリルの水和活性は、酵素
液または菌体懸濁液0.1mlを、アクリロニトリル
2.5重量％含むＭ／20リン酸バツフアー（PH7.7）
9.9mlに加えて、10℃、10分間反応させ、この時
生成したアクリルアミドをガスクロマトグラフイ
ーにより定量することにより測定した。また、酵
素液または菌体懸濁液について１分間に1μモル
のアクリルアミドを生成する能力を１単位(U)とし
て表示した。 実施例１〜21および比較例１ シユークロース10ｇ／、KH2PO4 １ｇ／、
K2HSO4 １ｇ／、MgSO4・7H2O １ｇ／、
味液10ｇ／、Ｌ−システイン１ｇ／、
FeSO4・7H2O 10ｇ／およびメタクリルアミド
８ｇ／からなる培地をPH7.2に調整後、それぞ
れ100mlを500ml容三角フラスコに入れて滅菌し
た。 冷却後、これにシユークロース ５ｇ／、ペ
プトン ５ｇ／、酵母エキス ３ｇ／、麦芽
エキス ３ｇ／、PH7.8からなる培地で１日間
予め培養したシユードモナス・クロロラフイス
B23（微工研条寄第187号）菌株の培養液１mlを接
種し、25℃にて２日間好気的に培養した。 培養終了液より遠心分離（３℃、10000rpm、
20分）により、菌体を分離し、生理食塩水にて洗
浄した。洗浄菌体を同一条件にて遠心分離後、生
理食塩水に懸濁し、洗浄菌体懸濁液（菌体濃度約
20ｇ／、1.7×103U／ml）を得た。 この菌体懸濁液2.5mlに、表−１に示すニトリ
ル類を10mg含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを
加えPH6.5に調整後、氷冷下に５日間放置し、放
置前後のニトリル水和活性の測定値からニトリル
水和活性残存率（表中、活性残存率と略す。以下
同じ）を算出し同表に示す結果を得た。
属の微生物の産生するニトリルヒドラターゼに基
づくニトリル水和活性の経済的な低下を防止し、
この活性を安定に保持する方法に関する。 近年、固定化酵素および固定化微生物に関する
技術の急速な進歩と共に、微生物、酸素またはそ
れらの固定化物を種々の単位化学反応や複合化学
反応の触媒として利用しようとする動きが活発化
しつつある。 ニトリルヒドラターゼは、ニトリル類を水和し
て対応するアミド類を生成せしめる酵素として、
本発明者の中の山田らにより見出されており
〔Agric.Biol.Chem.46、1165〜1174（1982）参照〕、
その具体的利用例としてニトリルヒドラターゼを
産生するシユードモナス属の微生物を用いC2-4の
ニトリルから対応するアミドを生成させる方法が
提案されている〔特公昭59−37951号公報および
Agric.Biol.Chem.46、1183〜1189（1982）参照〕。 しかしながら、本発明者らによるその後の検討
において上記ニトリルヒドラターゼのニトリル水
和活性は不安定で、経時的に低下することが判明
した。この低下は、固定化の有無を問わずニトリ
ルヒドラターゼが菌体内にある状態および菌体か
ら分離された状態いずれの場合においても起こる
が、後者の場合の方が大きく、著しい場合には短
期間で全く使用不可能となる。 発明の概要 本発明は、上記の点に解決を与えニトリルヒド
ラターゼのニトリル水和活性を効率的に利用する
ことを目的として、鋭意検討した結果、特定の物
質、すなわち、ニトリル類、アミド類および有機
酸またはその塩類等の使用が該目的に極めて有効
であることを見出し、この知見に基づいてなされ
たものである。 すなわち、本発明は、ニトリル水和活性を有す
るシユードモナス（Pseudomonas）属の微生物
の培養液から分離、所得した微生物菌体、該菌体
から分離、抽出した酵素ニトリルヒドラターゼま
たはこれらの固定化物を懸濁液ないしは溶液の状
態で保存するに際し、安定化剤としてニトリル
類、アミド類、および有機酸またはその塩類の中
から選ばれた少なくとも１種の化合物を添加する
こと、を特徴とするニトリル水和活性の保持方
法、を要旨とするものである。 発明の具体的な説明 微生物： 本発明における微生物は、ニトリルヒドラタ
ーゼを産生し、ニトリル特にアクリロニトリル
を水和して、対応するアミド特にアクリルアミ
ドを生成することができるシユードモナス属の
微生物である。具体的には、例えば、前記特公
昭59−37951号公報に記載のシユードモナス・
クロロラフイス Ｂ 23（Pseudomonas
chlororaphis Ｂ 23）〔微工研条寄第187号〕
およびシユードモナスsp.PS １（Pseudomonas
sp.SP １）〔微工研条寄第188号〕、その他シユ
ードモナス・オバリス（Pseudomonas
ovalis）〔IAM 1002〕、シユードモナス・フル
オレツセンス（Pseudomonas fluorescens）
〔IFO 3081およびIFO 3925〕およびシユード
モナス・レプテイリボーラ（Pseudomonas
reptilivora）〔IFO 3461〕などを挙げることが
できる。これらの微生物は、それぞれ工業技術
院微生物工業研究所（微工研）、東京大学応用
微生物研究所（IAM）および財団法人発酵研
究所（IFO）にそれぞれ上記番号で寄託されて
いる。 これらの微生物の培養は、通常、グルコー
ス、シユークロース、デキストリン、グリセリ
ン等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素等の窒
素源、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、ペ
プトン等の窒素源、およびプロピオニトリル、
イソブチロニトリル、プロピオンアミド、イソ
ブチルアミド、メタクリルアミド等の酸素誘導
物質その他を適宜含有する倍地に、それぞれの
菌株を接種して好気的に行う。 培養のPHは６〜９程度、好ましくは７〜８程
度、培養温度は20〜37℃程度、好ましくは20〜
30℃程度とし、培養時間は１〜３日程度で充分
である。培養により得た菌体は遠心分離等によ
り集菌することができる。 ニトリルヒドラターゼ： 本発明におけるニトリルヒドラターゼは前記
微生物が産生する酵素であり、その分離、抽出
は次のようにして行うことができる。 先ず、培養液より遠心分離等で集菌した菌体
を所定の菌体濃度となる様にバツフアーに懸濁
し、超音波菌体破砕機、ダイノーミルフレンチ
プレス等により菌体を破砕し、遠心分離等によ
り未破砕菌体および細胞壁、膜を除去し、可溶
性画分（菌体抽出液）を得る。さらに、その菌
体抽出液は常法に従い、適宜、硫安分画、
DEAE−Sephacel Phenyl−sepharose、
sephadex等のカラムを用いたり、さらには結
晶化等により精製することにより、部分精製酵
素液または精製酵素（液）を得ることができ
る。 本発明では、これら精製段階の如何によら
ず、いずれの酵素も対象となる。 固定化菌体・固定化酵素： 本発明における固定化菌体・固定化酵素は、
上記微生物菌体およびニトリルヒドラターゼ
を、常法に従い、それぞれ活性炭等へ吸着させ
る吸着法、イオン交換樹脂等に結合させるイオ
ン結合法ならびにガラスビーズ等に共有結合さ
せる共有結合法およびアクリルアミド、カラギ
ーナン、アルギン酸等で包括する包括法等によ
り得ることができる。 安定化剤： 本発明において使用する安定化剤は、ニトリ
ル類、アミド類および有機酸またはその塩類の
中から選ばれた化合物であり、これらはそれぞ
れ単独にまたは混合して使用することができ
る。 具体的には、例えば次の化合物を挙げること
ができる。 (1) アセトニトリル、プロピオニトリル、イソ
ブチロニトリルのような脂肪族ニトリル類と
対応するアミドおよび酸またはその塩類。 (2) グリシンニトリル、α−アミノプロピオニ
トリル、β−アミノプロピオニトリルのよう
なアミノニトリル類と対応するアミドおよび
酸またはその塩類。 (3) ラクトニトリル、ヒドロキシアセトニトリ
ル、β−ヒドロキシプロピオニトリルのよう
なヒドロキシニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (4) アクリロニトリル、メタクリロニトリルの
ような不飽和ニトリル類と対応するアミドお
よび酸またはその塩類。 (5) マロンニトリル、スクシンニトリル、アシ
ポニトリルのようなジニトリル類と対応する
ジアミドおよび二塩基酸またはその塩類。 (6) シアノ酢酸アミド、シアノ酢酸のようなモ
ノシアノアミドおよびモノシアノ酸またはそ
の塩類。 (7) ベンゾニトリル、フエニルアセトニトリル
のような芳香族ニトリル類と対応するアミド
および酸またはその塩類。 (8) ニコチノニトリル、イソニコチノニトリル
のような複素環式ニトリル類と対応するアミ
ドおよび酸またはその塩類。 (9) クロロアセトニトリル、β−クロロプロピ
オニトリルのようなハロゲン化ニトリル類と
対応するアミドおよび酸またはその塩類。 (10) グリオキサールのようなアルデヒド基を有
する酸またはその塩類。 ニトリル水和活性の保持： 本発明におけるニトリル水和活性の保持は、
前記した化合物を、同じく前記した微生物菌
体、ニトリルヒドラターゼおよびこれらの固定
化物を各種バツフアー溶液、生理食塩水などに
分散ないしは溶解させた懸濁液ないし溶液に添
加することにより達成することができる。安定
化剤の添加量は通常0.01〜50ｇ／の範囲であ
るが、長期保存、コスト等を考慮すると0.1〜
10ｇ／添加することが望ましい。 懸濁液あるいは溶液のPHは５〜８、好ましく
は5.5〜７の範囲で、リン酸バツフアー、トリ
スバツフアー等、各種バツフアー溶液が通常用
いられる。また、場合によつては、塩酸、硫酸
等の酸、カセイソーダ、カセイカリ等のアルカ
リを添加し、PHをコントロールすることも有効
である。 温度は短期間保存の場合は室温でも良いが、
低温、特に０℃付近で保存することが望まし
い。 効 果 本発明によれば、ニトリル水和活性を長期間安
定に保持することができるが、本発明の安定化剤
の添加は、特に、該活性の経時的低下が大きい菌
体から分離した酵素に対して有効である。その効
果は前記酵素精製の各段階での酵素液の保存安定
性ばかりでなく、各精製工程での酵素活性の保持
においても認められる。従つて、安定化剤は各精
製工程において使用する酵素液またはバツフアー
溶液等に添加しておくことが好ましい。 以下、実施例により本発明を説明する。 実験例 下記の実験例中、ニトリルの水和活性は、酵素
液または菌体懸濁液0.1mlを、アクリロニトリル
2.5重量％含むＭ／20リン酸バツフアー（PH7.7）
9.9mlに加えて、10℃、10分間反応させ、この時
生成したアクリルアミドをガスクロマトグラフイ
ーにより定量することにより測定した。また、酵
素液または菌体懸濁液について１分間に1μモル
のアクリルアミドを生成する能力を１単位(U)とし
て表示した。 実施例１〜21および比較例１ シユークロース10ｇ／、KH2PO4 １ｇ／、
K2HSO4 １ｇ／、MgSO4・7H2O １ｇ／、
味液10ｇ／、Ｌ−システイン１ｇ／、
FeSO4・7H2O 10ｇ／およびメタクリルアミド
８ｇ／からなる培地をPH7.2に調整後、それぞ
れ100mlを500ml容三角フラスコに入れて滅菌し
た。 冷却後、これにシユークロース ５ｇ／、ペ
プトン ５ｇ／、酵母エキス ３ｇ／、麦芽
エキス ３ｇ／、PH7.8からなる培地で１日間
予め培養したシユードモナス・クロロラフイス
B23（微工研条寄第187号）菌株の培養液１mlを接
種し、25℃にて２日間好気的に培養した。 培養終了液より遠心分離（３℃、10000rpm、
20分）により、菌体を分離し、生理食塩水にて洗
浄した。洗浄菌体を同一条件にて遠心分離後、生
理食塩水に懸濁し、洗浄菌体懸濁液（菌体濃度約
20ｇ／、1.7×103U／ml）を得た。 この菌体懸濁液2.5mlに、表−１に示すニトリ
ル類を10mg含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを
加えPH6.5に調整後、氷冷下に５日間放置し、放
置前後のニトリル水和活性の測定値からニトリル
水和活性残存率（表中、活性残存率と略す。以下
同じ）を算出し同表に示す結果を得た。
【表】
実施例22〜39および比較例２
実施例１〜21において、ニトリル類に代えてア
ミド類を添加した以外は同例と同様にして表−２
に示す結果を得た。
ミド類を添加した以外は同例と同様にして表−２
に示す結果を得た。
【表】
実施例40〜59および比較例３
実施例１〜21においてニトリル類に代えて有機
酸類を添加し、さらにPHを6.0に調整した以外は
同例と同様にして表−３に示す結果を得た。
酸類を添加し、さらにPHを6.0に調整した以外は
同例と同様にして表−３に示す結果を得た。
【表】
【表】
実施例60〜77および比較例４〜９
実施例１と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
（1.8×103U／ml）2.5mlに、表−４に示す安定化
剤25mgを含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加
え所定のPHに調整後、氷冷下にて４日間放置し
た。 それぞれの懸濁液について、放置前後のニトリ
ル水和活性を測定し、活性残存率を算出して表−
４に示す結果を得た。
（1.8×103U／ml）2.5mlに、表−４に示す安定化
剤25mgを含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加
え所定のPHに調整後、氷冷下にて４日間放置し
た。 それぞれの懸濁液について、放置前後のニトリ
ル水和活性を測定し、活性残存率を算出して表−
４に示す結果を得た。
【表】
【表】
実施例78〜94および比較例10
実施例１と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
（1.8×103U／ml）2.5mlに表−５に示す安定化剤
を所定量含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加
えPH6.0（無添加はPH6.5）に調整後、氷冷下にて
３日間放置し、放置前後のニトリル水和活性の測
定値からニトリル水和活性残存率を算出し同表に
示す結果を得た。
（1.8×103U／ml）2.5mlに表−５に示す安定化剤
を所定量含むＭ／10リン酸バツフアー2.5mlを加
えPH6.0（無添加はPH6.5）に調整後、氷冷下にて
３日間放置し、放置前後のニトリル水和活性の測
定値からニトリル水和活性残存率を算出し同表に
示す結果を得た。
【表】
【表】
濃度：放置液中の安定化剤濃度
実施例95および比較例11 実施例１と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
50mlと10ｇ／のイソ酪酸アンモニウム塩を含有
するＭ／10リン酸バツフアー（PH6.5）50mlを混
合した（3.2×103U／ml）。 本菌体懸濁液をフレンチプレス（大岳製作所
製）にかけ、1000〜1500KgＧの圧力にて菌体を破
砕した後、遠心分離（12000rpm、30分）にて未
破砕菌体及び細胞壁等の不溶分を除去し、菌体抽
出液を得た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウム塩を含まな
い同様な菌体懸濁液（3.2×103U／ml）を調製し、
同様にしてフレンチプレス処理、遠心を行ない、
菌体抽出液を得た。 両菌体抽出液を氷令下にて、３日間放置し、放
置開始前後のニトリル水和活性を測定し、表−６
に示す結果を得た。
実施例95および比較例11 実施例１と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
50mlと10ｇ／のイソ酪酸アンモニウム塩を含有
するＭ／10リン酸バツフアー（PH6.5）50mlを混
合した（3.2×103U／ml）。 本菌体懸濁液をフレンチプレス（大岳製作所
製）にかけ、1000〜1500KgＧの圧力にて菌体を破
砕した後、遠心分離（12000rpm、30分）にて未
破砕菌体及び細胞壁等の不溶分を除去し、菌体抽
出液を得た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウム塩を含まな
い同様な菌体懸濁液（3.2×103U／ml）を調製し、
同様にしてフレンチプレス処理、遠心を行ない、
菌体抽出液を得た。 両菌体抽出液を氷令下にて、３日間放置し、放
置開始前後のニトリル水和活性を測定し、表−６
に示す結果を得た。
【表】
実施例96および比較例12
実施例１と同様にして調製した洗浄菌体懸濁液
（含水率75％）40ml、アクリルアミド4.5ｇ、Ｎ，
N′−メチレンビスアクリルアミド0.5ｇおよび
Ｍ／20リン酸バツフアー（イソ酪酸アンモニウム
10ｇ／含有、PH6.0）40mlを混合して、均一な
懸濁液とした。これに、５％ジメチルアミノプロ
ピオニトリル水溶液５mlおよび1.0％過硫酸カリ
ウム水溶液10mlを加えて、10℃に30分保つて重合
させた。得られた塊状の菌体含有ゲルを小粒子に
破砕し、５ｇ／のイソ酪酸アンモニウム塩を含
むPH7.0のＭ／20リン酸バツフアーで充分洗浄し
た固定化菌体約90ｇを得た。 この洗浄固定化菌体を５ｇ／をイソ酪酸を含
む同一バツフアーに入れ、０℃にて５日間放置し
た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウムを含有しな
い、リン酸バツフアーを用いて同様にして、固定
化、洗浄を行い、０℃にて５日間放置した。 これら固定化菌体について、それぞれ放置前後
のゲルの活性を以下の様に測定した。すなわち、
固定化ゲル１ｇとアクリロニトリル５ｇ、Ｍ／20
リン酸バツフアー（PH7.7）97mlを混合し、撹拌
下に０℃で20分間反応させ、それぞれの反応終了
液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイー
で定量した。結果を表−７に示した。
（含水率75％）40ml、アクリルアミド4.5ｇ、Ｎ，
N′−メチレンビスアクリルアミド0.5ｇおよび
Ｍ／20リン酸バツフアー（イソ酪酸アンモニウム
10ｇ／含有、PH6.0）40mlを混合して、均一な
懸濁液とした。これに、５％ジメチルアミノプロ
ピオニトリル水溶液５mlおよび1.0％過硫酸カリ
ウム水溶液10mlを加えて、10℃に30分保つて重合
させた。得られた塊状の菌体含有ゲルを小粒子に
破砕し、５ｇ／のイソ酪酸アンモニウム塩を含
むPH7.0のＭ／20リン酸バツフアーで充分洗浄し
た固定化菌体約90ｇを得た。 この洗浄固定化菌体を５ｇ／をイソ酪酸を含
む同一バツフアーに入れ、０℃にて５日間放置し
た。 比較のため、イソ酪酸アンモニウムを含有しな
い、リン酸バツフアーを用いて同様にして、固定
化、洗浄を行い、０℃にて５日間放置した。 これら固定化菌体について、それぞれ放置前後
のゲルの活性を以下の様に測定した。すなわち、
固定化ゲル１ｇとアクリロニトリル５ｇ、Ｍ／20
リン酸バツフアー（PH7.7）97mlを混合し、撹拌
下に０℃で20分間反応させ、それぞれの反応終了
液中のアクリルアミドをガスクロマトグラフイー
で定量した。結果を表−７に示した。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ニトリル水和活性を有するシユードモナス
（Pseudomonas）属の微生物の培養液から分離、
取得した微生物菌体、該菌体から分離、抽出した
酵素ニトリルヒドラターゼまたはこれらの固定化
物を懸濁液ないしは溶液の状態で保存するに際
し、安定化剤としてニトリル類、アミド類、およ
び有機酸またはその塩類の中から選ばれた少なく
とも１種の化合物を添加すること、を特徴とする
ニトリル水和活性の保持方法。 ２ 懸濁液ないしは溶液中のニトリル類、アミド
類、および有機酸またはその塩類の濃度が0.01〜
50ｇ／である特許請求の範囲第１項記載の保持
方法。 ３ 懸濁液ないしは溶液のPHが５〜８である特許
請求の範囲第１〜２項記載の保持方法。 ４ シユードモナス（Pseudomonas）属の微生
物がシユードモナス・クロロラフイス Ｂ 23
（Pseudomonas chlororaphis Ｂ 23）〔微工研
条寄第187号〕またはシユードモナスsp.PS1
（Pseudomonas sp.PS １）〔微工研条寄第188号〕
である特許請求の範囲第１〜３項記載の保持方
法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61101043A JPS62257386A (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | ニトリル水和活性の保持方法 |
| DE87106285T DE3787194T2 (de) | 1986-05-02 | 1987-04-30 | Verfahren zur Erhaltung der Nitrilhydrierungsaktivität. |
| EP87106285A EP0243966B1 (en) | 1986-05-02 | 1987-04-30 | Method for preservation of nitrile hydration activity |
| US07/045,870 US4900672A (en) | 1986-05-02 | 1987-05-01 | Method for preservation of nitrile hydration activity |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61101043A JPS62257386A (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | ニトリル水和活性の保持方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62257386A JPS62257386A (ja) | 1987-11-09 |
| JPH0543351B2 true JPH0543351B2 (ja) | 1993-07-01 |
Family
ID=14290111
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61101043A Granted JPS62257386A (ja) | 1986-05-02 | 1986-05-02 | ニトリル水和活性の保持方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4900672A (ja) |
| EP (1) | EP0243966B1 (ja) |
| JP (1) | JPS62257386A (ja) |
| DE (1) | DE3787194T2 (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5187140A (en) * | 1989-10-18 | 1993-02-16 | Union Carbide Chemicals & Plastics Technology Corporation | Alkylene oxide catalysts containing high silver content |
| JPH03138646A (ja) * | 1989-10-25 | 1991-06-13 | Konica Corp | ハロゲン化銀写真感光材料の処理方法 |
| JP3009421B2 (ja) * | 1990-02-28 | 2000-02-14 | 秀明 山田 | 有機酸の生物学的製造法 |
| US5593871A (en) * | 1990-09-20 | 1997-01-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for the preparation of enantiometric 2-alkanoic acid amides from nitriles |
| EP0486289B1 (en) * | 1990-11-14 | 1997-07-09 | Nitto Chemical Industry Co., Ltd. | Biological process for producing alpha-hydroxyamide or alpha-hydroxy acid |
| JP3163224B2 (ja) * | 1994-10-14 | 2001-05-08 | 三菱レイヨン株式会社 | 菌体または固定化菌体の懸濁液の保存方法 |
| US6060265A (en) * | 1996-12-18 | 2000-05-09 | Cytec Technology Corporation | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| US5863750A (en) * | 1996-12-18 | 1999-01-26 | Cytec Tech Corp | Methods for the detoxification of nitrile and/or amide compounds |
| CZ299166B6 (cs) * | 1997-07-22 | 2008-05-07 | Lonza Ag | Mikroorganismy rodu Amycolatopsis nebo Actinomadura, enzymy z nich získané a zpusob výroby amidu |
| JP3428404B2 (ja) * | 1997-10-23 | 2003-07-22 | 三菱レイヨン株式会社 | アミド化合物の製造方法 |
| US6677149B2 (en) | 1999-07-12 | 2004-01-13 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells with carbamate salts |
| US6251646B1 (en) | 1999-07-12 | 2001-06-26 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells |
| US6368804B1 (en) | 1999-07-12 | 2002-04-09 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Method for stabilizing nitrilase activity and preserving microbial cells |
| AU2003296731B2 (en) * | 2003-01-08 | 2009-07-09 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for preserving and/or storing cells having a nitrilase or nitrile hydratase activity |
| GB0327906D0 (en) | 2003-12-02 | 2004-01-07 | Ciba Spec Chem Water Treat Ltd | Biocatalyst composition |
| US7816106B2 (en) | 2003-12-02 | 2010-10-19 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Ltd. | Manufacture of amides |
| NZ599631A (en) | 2006-01-30 | 2013-08-30 | Univ Georgia State Res Found | Induction and stabilization of enzymatic activity in microorganisms |
| US7943549B2 (en) | 2007-04-02 | 2011-05-17 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Biological-based catalyst to delay plant development processes |
| US9993005B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-06-12 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Preventing or delaying chill injury response in plants |
| WO2014160354A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Georgia State University Research Foundation, Inc. | Inhibiting or reducing fungal growth |
| JP2019176834A (ja) * | 2018-03-30 | 2019-10-17 | 三井化学株式会社 | 死菌化微生物の製造方法及び微生物を死菌化する方法 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS594987B2 (ja) * | 1980-09-30 | 1984-02-02 | 日東化学工業株式会社 | ニトリラ−ゼ活性の高い細菌菌体の製造法 |
| JPS5937951B2 (ja) * | 1981-11-18 | 1984-09-12 | 秀明 山田 | アミドの生物学的製造法 |
| JPS5991879A (ja) * | 1982-11-16 | 1984-05-26 | Hideaki Yamada | シユ−ドモナス属細菌の培養法 |
| BR8400054A (pt) * | 1983-01-10 | 1984-08-14 | Nitto Chemical Industry Co Ltd | Processo para cultivar bacterias pseudomonas |
| JPS6083581A (ja) * | 1983-10-13 | 1985-05-11 | Hideaki Yamada | シユ−ドモナス属細菌の培養法 |
| US4629700A (en) * | 1983-11-30 | 1986-12-16 | Standard Oil Company (Indiana) | Selective conversion of cyano compounds to amides and carboxylic acids |
-
1986
- 1986-05-02 JP JP61101043A patent/JPS62257386A/ja active Granted
-
1987
- 1987-04-30 EP EP87106285A patent/EP0243966B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-30 DE DE87106285T patent/DE3787194T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-01 US US07/045,870 patent/US4900672A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0243966B1 (en) | 1993-09-01 |
| EP0243966A2 (en) | 1987-11-04 |
| US4900672A (en) | 1990-02-13 |
| DE3787194T2 (de) | 1994-03-31 |
| EP0243966A3 (en) | 1988-06-15 |
| JPS62257386A (ja) | 1987-11-09 |
| DE3787194D1 (de) | 1993-10-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |