JPH0546376B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は不溶化タンパク質の安定化法に関す
る。詳しくは、不溶性支持体に固定された生物学
的に活性なタンパク質、例えば酵素や種々の病因
疾患等に特有な抗原あるいは抗体の失活を防止
し、長期間に亘り安定な不溶化タンパク質を提供
する不溶化タンパク質の安定化に関する。 不溶性支持体に固定されたタンパク質（不溶化
タンパク質）は、その酵素的活性、免疫反応的活
性等を利用するために有用であり、近年特に血
液、あるいは体液中に含まれる生理活性物質を測
定する臨床検査法のひとつである免疫化学的測定
法に広く用いられている（特公昭58−16471号、
特公昭57−62020号、特公昭57−33546号、特開昭
54−128396号、特開昭57−125353号、特開昭57−
136165号、特開昭54−128396号、特開昭53−
29923号、各公報参照）。 不溶化タンパク質の製造法は種々開発されてい
るが、活性なタンパク質を不溶性支持体に固定し
た場合におけるタンパク質の変性及び失活等に関
する安定性に問題があつた。 この問題の解決法として、不溶化タンパク質を
適当な緩衝溶液中に保存する方法、血清アルブミ
ン、血清グロブリン等の不活性タンパク、チトク
ロームＣ又は乳糖、蔗糖等の糖類を含んだ溶液で
不溶化タンパク質を処理する方法等がある。緩衝
溶液中に保存する方法は取り扱い上不便であり、
その他の方法も必ずしも満足しうる効果が得られ
ていない（特公昭58−16471号特開昭58−128396
号、特開昭50−82230号、各公報参照）。 そこで本発明者らは、種々研究の結果、簡単な
操作で長期安定性を有し、また取り扱いの簡便な
不溶化タンパク質の安定化法を開発した。 本発明は、不溶性支持体に固定されたタンパク
質（不溶化タンパク質）を硫酸マグネシウムある
いは硫酸マグネシウムと不活性タンパク質を含む
溶液で処理するという簡単な方法でよい。 不溶性支持体としては、ポリスチレン、ポリエ
チレン、ポリアクリル酸エステル及びアクリルア
ミド等の合成樹脂、セルロース及びデキストラン
等の多糖類、紙、ガラスまたは金属等その他にも
前記特開昭53−29923号公報の第５頁に例示のあ
るものからなるチユーブ状、ビース状、シート
状、棒状または繊維状等のものを目的に応じて適
宜選ぶことができる。 タンパク質としては、特開昭57−136165号公報
第５頁及び特公昭56−15231号公報第２頁に記載
のあるα−フエトプロテイン、CEA、フエリチ
ン等の癌関連抗原、HB抗原、HA抗原等の肝炎
関連抗原及びインシユリン、TSH、LH等のホル
モン関連抗原並びにこれらの抗体あるいはパパイ
ン、アミラーゼ、リパーゼ等の加水分解酵素類、
グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ等のレドツ
クス酵素類及びグルタミン類−ピルビン酸トラン
スアミナーゼ等のトランスフエラーゼ酵素類が挙
げられる。 不溶性支持体へのタンパク質の固定化法として
は不溶性支持体にタンパク質を物理的に吸着させ
る方法、グルタルアルデヒド、アミノシラン等を
架橋剤としてタンパク質を固定する方法、不活性
タンパク質で処理した不溶性支持体に共有結合に
よりタンパク質を結合させる方法等がある（特開
昭51−63931号、特開昭53−29923号、特開昭55−
111788号、各公報参照）。 尚、前記に示す不溶化タンパク質の製造法に関
する不溶性支持体及びタンパク質の種類並びに固
定化法等は、本発明の性質上特別な限定をするも
のでなく、それぞれ目的に応じて適宜選択決定す
ればよい。 不溶化タンパク質の安定化に際しては、不溶性
支持体に固定されたタンパク質を硫酸マグネシウ
ムあるいは硫酸マグネシウムと不活性タンパク
質、例えば牛血清アルブミン、人血清アルブミ
ン、牛ガンマグロブリン等を含む緩衝溶液に浸漬
した後乾燥させればよい。 不活性タンパク質を含めなくとも本目的は達成
できるが含めることによつて良い結果が得られる
こともある。 硫酸マグネシウム及び不活性タンパク質の適当
な濃度は、用いる不溶化タンパク質の種類、形状
及び性質、例えば不溶化タンパク質を製造すると
きの不溶性支持体の種類や形状、タンパク質の種
類、精製度合及び希釈程度並びに固定化法等によ
る不溶性支持体へのタンパク質の結合度合等によ
り差はあるが、一般に硫酸マグネシウムの濃度は
0.005〜1.0M、但し、濃すぎると不溶化タンパク
質を乾燥後、不溶化タンパク質同士が付着する場
合があるので好ましくは0.05〜0.5M、不活性タ
ンパク質の濃度は0.01〜10％（ｗ／ｖ）好ましく
は0.1〜５％（ｗ／ｖ）ということができる。 浸漬及び乾燥は通常の室温で行うのがよく、数
時間浸漬させた後一夜乾燥させればよい。また減
圧乾燥すれば乾燥は数時間に短縮できる。 次に本発明の方法、効果等を実施例によつて示
すが、本発明はこれらの実施例によつて限定され
るものではない。 実施例 １ ヒトがん胎児性抗原（CEA）をヤギに免疫し
て得た抗ヒトがん胎児性抗原ヤギ血清のガンマグ
ロブリン分画（CEA抗体）をPH6.4の0.001Mリン
酸緩衝液で１：2500に希釈した。この液に直径約
0.7cmのポリスチレン小球を加え、室温で一昼夜
放置した後、小球を精製水で洗浄した。次いで小
球を0.1M硫酸マグネシウムを含むPBS液（0.1M
リン酸緩衝液0.5M塩化ナトリウムPH7.4）に室温
下３時間浸した後、減圧乾燥して、安定化処理し
たCEA抗体を不溶化したポリスチレン小球（不
溶化CEA抗体小球）を得た。 実施例 ２ 実施例１と同様にして0.1M硫酸マグネシウム
と0.5％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミン含むPBS液
を用いて処理して安定化処理した不溶化CEA抗
体小球を得た。 実施例 ３ ラジオイムノアツセイ法（RIA法） 試験管に標準溶液又は被検血清をそれぞれ50μ
ずつを入れた後、0.1M酢酸緩衝液（PH6.0）
200μずつと実施例１及び実施例２で得た不溶
化CEA抗体小球１個ずつを入れる。そしてロー
テーターを用いて室温で４時間インキユベーシヨ
ンを行つた後、試験管内液を除去し、さらに生理
食塩液１mlで洗浄する。次いでヨウ化CEA抗体
（¹²⁵）溶液（実施例１で得たOEA抗血清をクロ
ラミンＴ法で¹²⁵標識し、ゲル濾過にて精製し
た後１％牛血清アルブミンを含む0.05Mトリス緩
衝液（PH8.6）にて希釈した溶液）200μずつを
加えた後、ローテーターを用いて一晩インキユベ
ーシヨンを行う。次いで試験管内液を除去し、さ
らに２度生理食塩液を1.0mlで洗浄した後各試験
管の放射能量を測定するいわゆるサンドイツチ法
によるラジオイムノアツセイ法（RIA法）により
標準曲線及び被検血清中のCEAの値を求める。
その結果を図面と表１に示す。 なお、表１には、比較のため実施例１に準じて
公知技術である不活性タンパク質（特開昭50−
82230号公報）又は糖類（特開昭54−128396号公
報）で処理した不溶化CEA抗体小球を用いた時
の測定結果も併せて示した。

【表】 不溶化タンパク質は上記の保存温度で３日間、
但し本発明の方法については４日間保存した。 以上の結果から本発明の方法によつて処理した
不溶化タンパク質を用いた場合、４℃と45℃での
測定値の変化は少なく安定化効果が認められた。 またラジオイムノアツセイに良好な標準曲線を
得た。 実施例 ４ 実施例３と同じ条件で実施例２の硫酸マグネシ
ウムの添加量を変えて５日間保存し、その効果を
検討した。その結果を表２に示す。 この結果から、硫酸マグネシウム濃度が0.005
〜1.0Mの範囲で安定化効果が認められるが、特
に0.05M以上ではいずれの濃度においても優れた
効果が認められる。

【表】 実施例 ５ エンザイムイムノアツセイ法（EIA法） ヒトα−フエトプロテイン（AEP）を用いて
実施例２と同様にして不溶化AEP抗体小球を得
た。なおこの時のPBS液は0.01Mリン酸緩衝液
0.5M塩化ナトリウム（PH7.4）を用いた。 試験管に標準溶液又は被検血清をそれぞれ20μ
ずつを入れた後PBS液（0.01Mリン酸緩衝液
0.5M塩化ナトリウムPH7.0）と上記の不溶化AFP
抗体小球１個ずつを入れる。室温で１時間静置
後、試験管内液を除去し２回生理食塩液1.5mlで
洗浄する。次いでペルオキシダーゼ標識AFP抗
体溶液（石川らの方法にてAFP抗体を西洋ワサ
ビペルオキシダーゼで標識し、精製後PBS液
（PH7.0）にて希釈した溶液（300μを加えた後、
室温で２時間放置する。その後試験管内液を除去
し、再び２回生理食塩液1.5mlで洗浄後、ｏ−フ
エニレンジアミン−過酸化水素混液300μを加
え室温で30分間放置する。次いで反応停止液
（0.10Mクエン酸−リン酸緩衝液PH1.02mlを加え
た後492nｍにおける吸光度を比色計にて計測す
るいわゆるエンザイムイムノアツセイ法（EIA
法）により被検血清中のAFPの濃度を測定した。
その結果を表３に示す。 実施例 ６ ヒト肝フエリチンを用いて実施例２と同様にし
て不溶化フエリチン抗体小球を得た。なおこの時
のPBS液は0.01Mリン酸緩衝液、0.5M塩化ナト
リウム、PH7.4を用いた。 この不溶化フエリチン抗体小球を用いて実施例
３のRIA法に基づいて、被検血清中のフエリチン
の濃度を測定した。ただし、用いる標準溶液又は
被検血清は25μ酢酸緩衝液500μの代わりに
PBS液（PH7.0）300μ、ヨウ化CEA抗体（¹²⁵
）溶液200μの代わりにヨウ化フエリチン抗
体（¹²⁵）溶液300μを用い、またインキユベ
ーシヨンをそれぞれ室温で１時間及び２時間とし
た。その結果を表３に示す。 実施例 ７ 実施例６で得た不溶化フエリチン抗体小球を用
いて実施例５のEIA法に基づいて被検血清中のフ
エリチンの濃度を測定した。但し、ベルオキシダ
ーゼ標識AFP抗体溶液の代わりにベルウオキシ
ダーゼ標識フエリチン抗体溶液を用いた。その結
果を表３に示す。

【表】 不溶化タンパク質は３日間保存した。
上記結果の示す如くいずれの場合も良好な安定
化効果が認められた。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明によつて処理した不溶化CEA抗
体を用いて得たラジオイムノアツセイの標準曲線
である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 不溶性支持体に固定されたタンパク質（不溶
   化タンパク質）を硫酸マグネシウムあるいは硫酸
   マグネシウムと不活性タンパク質を含む溶液で処
   理することを特徴とする不溶化タンパク質の安定
   化法。