JPH0214035B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、安定な酵素組成物に関するものであ
る。さらに詳しくは、ペルオキシダーゼ単独およ
び／あるいはペルオキシダーゼと免疫活性物質と
結合した複合物のペルオキシダーゼ酵素の安定化
に関するものである。 ペルオキシダーゼは、近年種々の目的で使用さ
れるようになつてきており、特に臨床検査部門で
の診断試薬として用いられ、酵素免疫測定法の進
歩により、この測定法のラベル酵素としてのペル
オキシダーゼの重要性は増加してきている。しか
しながら、ペルオキシダーゼは、他の成分（例え
ば免疫活性物質）と結合していても、又、単独遊
離状態でも低濃度の水溶液状態においてきわめて
不安定であり、測定に必要な酵素活性を維持する
ことは非常に困難である。そこで一般には、ペル
オキシダーゼ活性を長期間保持するためには、凍
結乾燥といつた手段を用いて安定化が行なわれて
いるが、この場合でも凍結乾燥時にペルオキシダ
ーゼの酵素活性が相当低下することも明らかにさ
れている。これらの理由よりペルオキシダーゼを
使用する際、かなり限定された使用法にならざる
をえない。 本発明者等は上記欠点を有しないペルオキシダ
ーゼの安定化法を開発すべく鋭意研究した結果本
発明に到達した。即ち、本発明はペルオキシダー
ゼ、血清蛋白質およびポリアルキレングリコール
を含む安定な酵素組成物である。 本発明の安定化剤は特に溶液中のペルオキシダ
ーゼを著しく安定化させる。 本発明に用いるポリアルキレングリコールとし
ては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレン
グリコール、エチレンオキサイド・プロピレンオ
キサイド・コポリマー、ポリテトラメチレングリ
コールなどが挙げられる。本発明において用いる
ポリアルキレングリコールの分子量は約1000〜
20000、好ましくは約4000〜6000のものである。
添加量としては水性組成物に対して約１〜10重量
対容量（Ｗ／Ｖ）％、好ましくは３〜６％重量対
容量（Ｗ／Ｖ）％である。10重量対容量（Ｗ／
Ｖ）％を越える添加は血清蛋白質の沈殿をひきお
こし好ましいものではない。 又、血清蛋白質としては、牛アルブミン、ヒト
アルブミン、牛血清、ヒト血清、ウマ血清、等多
種挙げられるが、好ましくは、家兎血清である。
血清蛋白質の添加量は水性組成物に対して乾燥微
粉末なら５〜30重量対容量（Ｗ／Ｖ）％、血清な
ら５〜50容量％であることが好ましい。 ポリエチレングリコールは、ラジオアイソトー
ブを用いた免疫測定法、即ちラジオイムノアツセ
イ法で免疫複合体の沈殿剤として使用されている
が酵素の安定化、特にペルオキシダーゼの安定化
に使用された例はない。 本発明の組成物におけるペルオキシダーゼの安
定化作用は、血清蛋白質とポリアルキレングリコ
ールがペルオキシダーゼに作用し、その特殊構造
を保持しているものと考えられる。 ペルオキシダーゼは、遊離状態でも、免疫活性
物質と結合した結合状態のものであつてもよい。
また遊離状態のものと結合状態のものとの混合物
であつてもよい。 免疫活性物質としては、ハプテン、多価抗原、
抗体等があげられる。ハプテンとしては、チロキ
シン、ヒスタミン、ジゴキシン、アドレナリン、
プロスタグランジン、ステロイドホルモン、例え
ばプロゲステロン、エストラジオール、テストス
テロン−エストリオールなど、及び抗生物質、例
えばペニシリンなどが用いられる。多価抗原とし
てはホルモン、例えば、成長ホルモンなどタンパ
ク質、例えばアルブミン、グロブリン、α−フエ
トプロテインなど及び種々の細菌、ウイルス、例
えば連鎖球菌、肝炎ウイルス、風疹ウイルスなど
が用いられる。抗体としては、従来既知の方法
で、ヤギ、ウサギなどの哺乳動物に上記ハプテン
又は抗原を免疫することによつて得られた抗体
（例えば、抗インスリン抗体、抗α−フエトプロ
テインなど）が用いられる。又、ハイブリドーマ
法によつて作成された抗体も同様に使用できる。 また、免疫活性物質とペルオキシダーゼ結合物
の結合形態としては、共有結合があげられ、種々
の公知の方法、例えばグルタルアルデヒドを架橋
剤として免疫活性物質のアミノ基とペルオキシダ
ーゼのアミノ基を共有結合する方法
（Avrameas、S.；Immunochemistry、６；43−
52、〔1969〕）及びペルオキシダーゼに含まれる糖
鎖を過ヨー素酸で酸化切断し、アルデヒド基を導
入後免疫活性物質のアミノ基とシツフ塩基を作製
し結合させる方法（Nakane、P.K.、＆
Kawaoi、A.；J.Histochem.Cytochem、22：
1084−1091、〔1974〕）などを用いて共有結合を作
ることができる。 遊離のペルオキシダーゼあるいは共有結合して
いるペルオキシダーゼの酵素活性は、過酸化水素
と適当な発色剤、例えばｏ−アミノフエノール、
４−アミノアンチピリン−フエノール、ｏ−フエ
ニレンジアミンなどを用い比色法によりその酵素
活性を定量することが可能である。 又、本発明の組成物は、緩衝作用を有する任意
成分を添加しても良いし、生理食塩水濃度の塩化
ナトリウムを添加しても良い。緩衝剤としては、
リン酸緩衝液、トリス緩衝液などが用いられ、水
性溶液のPHが６〜８を示すものが好ましい。水性
組成物を調製する場合、各物質の添加順序はとく
に限定されない。 本発明による安定化されたペルオキシダーゼ組
成物を用いた有利な検査薬としては、免疫診断用
試薬、特に酵素免疫測定法があげられる。又、酵
素免疫測定法以外の診断薬として、例えばグルコ
ースを定量するためのグルコースオキシダーゼ法
の試薬としても使用可能である。 以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。 実施例 １ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡績株式会
社製、グレード１−Ｃ）をポリエチレングリコー
ル＃4000（半井化学社製）５重量対容量（Ｗ／Ｖ）
％と家兎血清10容量％を含む0.01Mリン酸緩衝液
（以下0.01MPBと略す）に溶解した。対照例１と
してポリエチレングリコール＃4000を含まないも
の、又対照例２として家兎血清を含まないものを
用意し、以下の酵素安定性試験に供した。また西
洋ワサビペルオキシダーゼの濃度は、各々、1.0μ
ｇ／であつた。 各溶液は0.22μｍの殺菌過機で過し、５ml
の殺菌したビンにとり、４℃と40℃で貯蔵した。
０、７、14、21、28日目の酵素安定性を調べた。
安定性は、40℃貯蔵の酵素活性の４℃貯蔵で示す
活性に対するパーセントで示した。 酵素活性は過酸化水素0.02％およびｏ−フエニ
レンジアミン二塩酸塩（以下OPDと略す）を３
mg／ml含むPH5.0のシトレート・ホスフエート
0.1M緩衝液0.5mlに上記各溶液を50μを加え、
室温、30分放置後、1N硫酸2.0mlを加え、492nｍ
にて吸光度を測定した。 その結果を第１表に示す。

【表】 実施例 ２ ポリエチレングリコール＃1000（半井化学社製）
について実施例１記載の方法で、安定性を調べ
た。ポリエチレングリコール＃1000の濃度は、８
重量対容量（Ｗ／Ｖ）％とした。その結果を第２
表に示す。

【表】 実施例 ３ ポリエチレングリコール＃20000（半井化学社
製）について、実施例１記載の方法で安定性を調
べた。ポリエチレングリコール＃20000の濃度は、
２重量対容量％とし、その結果を第３表に示す。

【表】 実施例 ４ 過ヨウ素酸塩酸化法（Nakane、P.K.、＆
Kawaoi、A.；J.Histochem.Cytochem.22、1840
−1091、〔1974〕）により家兎イムノグロブリンＧ
（以下家兎IgGと略す）と結合させた西洋ワサビ
ペルオキシダーゼをセフアデツクスＧ−200によ
るゲル過で遊離のペルオキシダーゼを除去した
結合ペルオキシダーゼとゲル過をかけず、遊離
のペルオキシダーゼと結合したペルオキシダーゼ
とが共存する場合の各々について、ポリエチレン
グリコール＃6000（半井化学社製）４重量対容量
（Ｗ／Ｖ）％及び家兎血清10容量％を含む0.05M
リン酸緩衝食塩水（以下0.05MPBSと略す）に加
えた場合と、対照例１として、ポリエチレングリ
コール＃6000だけを除いたもの、対照例２として
家兎血清だけを除いたものについて実施例１に記
載の操作法で、溶液中のペルオキシダーゼの安定
性を調べた。その結果を第４表に示す。

【表】 実施例 ５ 実施例４に記載の家兎IgG結合西洋ワサビペル
オキシダーゼを実施例２記載のポリエチレングリ
コール＃1000、10重量対容量（Ｗ／Ｖ）％と家兎
血清10容量％を含む0.05MPBSに溶解した。対照
例１として、ポリエチレングリコール＃1000を含
まないもの、対照例２として家兎血清を含まない
もの、対照例３として、ポリエチレングリコール
＃1000のかわりにポリエチレングリコール＃200
（半井化学社製）10重量対容量（Ｗ／Ｖ）％を含
むものについて、実施例１に記載の操作方法で溶
液中のペルオキシダーゼの安定性を調べた。その
測定結果を第５表に示す。

【表】 実施例 ６ 実施例４に記載の方法で西洋ワサビペルオキシ
ダーゼとヒトイムノグロブリンＧを結合させセフ
アデツクスＧ−200によるゲル過により結合し
たペルオキシダーゼを分離した。この結合したペ
ルオキシダーゼをポリエチレングリコール
＃4000、５重量対容量（Ｗ／Ｖ）％および牛血清
アルブミン10重量対容量（Ｗ／Ｖ）％を含む、
0.05MPBSに溶解した。対照例１としてポリエチ
レングリコール＃4000を含まないもの、対照例２
として牛血清アルブミンを含まないものを実施例
１の操作方法で、溶液中のペルオキシダーゼの安
定性を調べた。その結果を第６表に示す。

【表】 実施例 ７ 実施例６記載のヒトイムノグロブリンＧに結合
しているペルオキシダーゼをポリプロピレングリ
コール、ジオールタイプ平均分子量2000（和光純
薬工業社製）５重量対容量（Ｗ／Ｖ）％、および
家兎血清10容量％を含む0.02M PBSに溶解した。
対照例１としてポリプロピレングリコールを含ま
ないもの、対照例２として家兎血清を含まないも
のについて、実施例１記載の操作方法で溶液中の
ペルオキシダーゼの安定性を調べた。その結果を
第７表に示す。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ペルオキシダーゼ、血清蛋白質およびポリア
   ルキレングリコールを含む安定な酵素組成物。 ２ ペルオキシダーゼが遊離状態のペルオキシダ
   ーゼおよび／あるいは結合状態のペルオキシダー
   ゼであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の安定な酵素組成物。 ３ 結合状態のペルオキシダーゼがペルオキシダ
   ーゼと免疫活性物質との結合体であることを特徴
   とする特許請求の範囲第２項記載の安定な酵素組
   成物。