JPH05502371A - 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列決定のためのスペクトル分析できるローダミン染料光里■薮麦公団 本発明は一般に核酸の配列を決定するための方法に関するもので、さらに特に、 ゲル電気泳動によって分離された同じ大きさに分類されたＤＮＡフラグメントを 同定するためのローダミン染料の使用に関するものである。

ＤＮＡ配列を決定する能力は遺伝子の機能とコントロールを理解するためおよび 分子生物学の基本技術の多くを応用するために非常に重要である。本来のＤＮＡ は２個の鎖状ポリマー、またはヌクレオチドの連鎖からなる。各鎖はホスホジエ ステル結合によって連結したヌクレオチドの鎖である。２つの連鎖は水素結合に よって２つの連鎖のヌクレオチドの相補的塩基：チミジン（Ｔ）をもつデオキシ アデノシン（Ａ）およびデオキシシチジン（Ｃ）をもつデオキシグアノシン（Ｇ ）、との間で水素結合によって逆平行の配向で共に保持されている。

現在ＤＮＡ配列決定には２つの基本的なアプローチがある；ジデオキシ・チェイ ン・ターミネータ−法、例えばサンガーら、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナ ショナル・アカデミイ・オフ・サイエンシーズ、第７４巻、５４６３〜５４６７ 頁（１９７７）　、および化学分解方法、例えばマキサムら、プロシーディンゲ ス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエンシーズ、第７４ｊｔ！ 、５６０〜５６４頁（１９７７）。鎖末端方法は幾つかの方法で改良され、あら ゆる一般に入手できる自動化ＤＮＡ配列決定機器として役に立っている。例えば サンガーら、ジャーナル・オフ・モレキュラー・バイオロジー、第１４３巻、１ ６１〜１７８頁（１９８０）　；シュライヤーら、ジャーナル・オフ・モレキュ ラー・バイオロジー、１１２９　ｔｋ、１６９〜１７２頁（１９７９）　；スミ スら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、第１３巻、２３９９〜２４１２頁（ １９８５）　；スミスら、ネイチャー、第３２１巻、６７４〜６７９頁（１９８ ７）　；プロパーら、サイエンス、第２３８巻、３３６〜３４１頁（１９８７） 　、セクション■、メソフズ・イン・エンサイモロジー、第１５５巻、５１〜３ ３４頁（１９８７）　；チャーチら、サイエンス、第２４０　巻、１８５〜１８ ８頁（１９８８）　；　オヨ’Ｏ’コアネルら、バイオテクニクス、第５巻、３ ４２〜３４Ｂ頁（１９８７）。

鎖末端および化学分解方法は１またはそれ以上のセントの標識を付されたＤＮＡ フラグメントの世代を必要とし、各々は共通の起源をもち各々は既知の塩基を末 端とする。次にフラグメントの単数または複数のセットは大きさによって分離さ れ配列情報を得る。両者の方法において、ＤＮＡフラグメントは高分解能ゲル電 気泳動によって分離される。最も自動化されたＤＮＡ配列決定機器では、異なる 末端塩基を有するフラグメントは異なる蛍光染料を用いて標識を付され、プライ マーに結合するか、例えばスミスら（１９８７、上記）、あるいは末端ジデオキ シヌクレオチドの塩基に結合する、例えばプロパーら（上記）。標識フラグメン トは一緒にされて電気泳動分離のための同じゲルカラムに装填される。

フラグメントが分Ｎｉ！Ａ程の間に静置検出器を通過するときフラグメントによ って放出される蛍光信号を分析することによって塩基配列は決定される。

異なるフラグメントを標識するための一組の染料を入手することはこのようなり ＮＡ配列決定システムでは主要な難点である。

第１に、有機蛍光染料に対する代表的な発光バンド半幅は約４０〜８０ナノメー トル（ｎ　ｍ）であり可視スペクトルは約３５０〜４００ｎ鵬に過ぎないので、 有意に重なる発光バンドを持たない３種またはそれ以上の染料を見出すことは困 難である。第２に、重ならない発光バンドをもつ染料を見出したとしても、その セットはそれぞれの蛍光効率が低すぎる場合ＤＮＡ配列決定のために未だ不通で あるかも知れない。例えば、プリンゲルら、ＤＮＡ・コア・ファシリティス・ニ ュースレター、第１巻、１５〜２１頁（１９８８）には、増大したゲル荷重が低 い蛍光効率を補償できないことを示すデータがある。第３に、幾つかの蛍光染料 を同時に使用する場合、染料の吸収ハンドが広く分離することが多いので励起が 難しくなる。

最も有効な励起は各染料をその吸収バンドの最高値に相当する波長で発光する場 合に生じる。幾つかの染料を使用する場合、検出システムの感度と各染料に対す る別々の励起源を与えるコスト増加との間にトレードオフを行うように強いられ ることが多い。第４に、ゲルの単一カラム中の異なる大きさに分類されたフラグ メントの数が数百よりも大きい場合、染料の物理化学的性質、およびフラグメン トに連結される手段が臨界的に重要になる。染料およびリンカ−の電荷、分子量 およびコンホメーションは接近した大きさに分類されたフラグメントの電気泳動 による移動度に、広範囲なバンドの広がりが起こるようにあるいはゲル上のバン ドの位置が逆になり、これによってバンドの順序および配列を決定するための核 酸中の塩基の順序との間の一致を壊すように、不利に影響してはならない。

最後に、蛍光染料はフラグメントを造りまたは操作するために用いられる化学勧 賞と相溶性がなければならない。例えば、鎖末端方法においてプライマーに標識 を付けるために用いられる染料および／またはジデオキシ・チェイン・ターミネ ータ−は使用したポリメラーゼまたは逆転写酵素の活性を妨げてはならない。

これらのきびしい制約のために、数組の蛍光染料だけが、自動化ＤＮＡ配列決定 におよび診断および分析の技術に使用できることが見出された、例えばスミスら （１９８５、上記）；プロパーら（上記）；フードら、ヨーロッパ特許出＠８５ ００９６０　；およびコンネルら（上記）。

上記の観点では、ＤＮＡ配列決定のような、多くの分析および診断の技術は、（ １）物理化学的に類似のもの、（２）ゲル上の密に配置されたＤＮＡバンドのよ うな空間的に重なっている標的物質の検出ができるもの、（３）自動化ＤＮＡ配 列決定の最近の方法によって単一ゲルカラム上で決定することができる塩基の数 を広げるもの、（４）広範囲の予備および手先のテクニックと共に使用するため に影響を受けやすいもの、（５）その地上に挙げた多くの必要な条件を満足する もの、である新しいセットの蛍光染料の入手容易性によって有意に促進されるで あろう。

１里Ω量！ 本発明は電気泳動により分離される異なる３“　−末端ヌクレオチドを有するＤ ＮＡフラグメントが異なるローダミン染料によって同定されるＤＮＡ配列決定の 方法にある。特に、本発明は以下に定義したローダミン標識ヌクレオチドおよび 本発明方法におけるそれらの使用を含む。本発明は一部は、ＤＮＡポリメラーゼ 、特にＴａｇＤＮＡポリメラーゼによって成長ＤＮＡ鎖に容易に組み込まれる鎖 末端ヌクレオチドに連結したスペクトル分析できるローダミン染料のセントの発 見に基づ（ものである。ここで使用するように語「鎖末端ヌクレオチド」は、成 長Ｄ　Ｎ　Ａ　１ＸにＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれた後は、さらにポ リヌクレオチド鎖が伸長、または付加することを妨げるヌクレオチドまたはその Ｗ４像体を指す。通常、このようなヌクレオチドの鎖末端性は糖部分の３°　ヒ ドロキシルの不在または改良に依存する。好ましくは、鎖末端ヌクレオチドは２ ’、３’−ジデオキシヌクレオチドである。

ここで使用するように染料のセントに関係する語「スペクトル分析できる」は、 染料の蛍光放出バンドが充分に明確であり、すなわち充分に重なっておらず、各 染料が結合している標的物質、例えばポリヌクレオチドを、例えばバンドパスフ ィルターおよび光電子増倍管のシステムを用いる標準光検出システムまたはその 類似のシステムによって発生した蛍光信号に基づいて区別することができること を意味し、前記システムは米国特許４，２３０，５５８号、４．８１１，２１８ 号等、またはホイーレスら、フロー・シトメトリイ：インストルメンテージョン ・アンド・データ・アナリシス（アカデミツク・プレス・ニューヨーク、１９８ ５）の２１〜７６頁に３己載されたようなシステムが挙げられる。

本発明のローダミンを３゛　−末端ヌクレオチドに標識を付けるために用いると きはいつでも、本発明の重要な特徴は４種の染料によって作られたＤＮＡフラグ メントの電気泳動移動度への事実上回等の貢献である。この結果は、標識と隣接 するヌクレオチドとの間の配座相互作用が主として標ｍＤＮＡフラグメントの電 気泳動移動度における変動性の原因であると信じられているので予期しないこと である。染料標識プライマーが常に、染料は常にヌクレオチドの同し配列と相互 に作用するので、電気泳動移動度において一層小さい変異性を生しることが期待 されていた。しかし、本発明の一部は、３°　−標識ヌクレオチドをもつフラグ メントが染料標識プライマーをもつ同等のフラグメントよりも電気泳動移動度に おいて非常に小さい変異性をもつという発見である。

主里主昆縦広翌皿 本発明のローダミン染料のスペクトル分析できるセントはテトラメチルローダミ ン、ローダミンＸ１０−ダミン１１０　、およローダミン６Ｇから成り、これら は、それぞれ弐■〜■によって表される。全体にわたり、カラー・インデックス （アソシエーシヲン・オフ・テキスタイル・ケミスツ、第２版、１９７１）炭素 ナンバリング図式を使用する、すなわちプライムを付した数字はキサンチン構造 の炭素を指し、プライムを付していない数字は９°　−フェニルの炭素を指す。

Ａは結合官能基に変換することができるカルボキシル、スルホニル、またはアミ ノのような基であり、そしてＢはアニオン酸性基、好ましくはカルボキシルまた はスルホニルであり、最も好ましくはカルボキシルである。

好ましくは、本発明のローダミン標識鎖末端ヌクレオチドは次式で表される： ＸＴＰ−Ｌ−Ｒ 式中、ＸＴＰは鎖末端ヌクレオシドトリホスフェートであり；Ｒはテトラメチル ローダミン、ローダミンＸ５０−ダミン１１０、およびローダミン６Ｇから成る 群れから選ばれたローダミン染料であり；およびＬはヌクレオシドトリホスフェ ートの塩基とローダミン染料との間の連結基である。

ＸＴＰは、組み込まれた後にさらに鎖が伸長することを妨げるのに用いられたＤ ＮＡポリメラーゼの天然のヌクレオシドトリホスフェートの類似体である。幾つ かのこのような類似体は４種の天ヌクレオシドトリホスフェートの各々に対して 入手でき、例えばホソブズら（上記）はリストを示している。好ましくは、ＸＴ Ｐは２°、３°　−ジデオキシヌクレオシドトリホスフェートである。さらに好 ましくは、ＸＴＰは２°、３゛　−ジデオキシ−７＝デアザアデノシントリホス フエート、２°、３°　−ジデオキシシチジントリホスフェート、２′、３゛　 −ジデオキシ−７−デアザグアノシン、２”　、３’　−ジデオキシウリジント リホスフェート、および２°、３°　−ジデオキシ−７−デアザイノシントリホ スフェートから成る群れから選ばれる。ここで使用するように語「ジデオキシヌ クレオシド」は糖部分が環式または非環式であるヌクレオシド類似体を含む。従 来のナンバリングは、ヌクレオシドの塩基または糖の特定の炭素原子に例えばコ ーンバーブ、ＤＮＡレブリケーシッン（フリーマン、サンフランシスコ、１９８ ０）を引用するときはいつでも使用される。

Ｌはジデオキシヌクレオチドと染料との間の結合の長さと閘性を大きく変えるこ とができるように幾らかの異なる形態に従う。

例えば本発明と共に使用できる幾つかの適当な塩基標識方法は、例えば、ギプソ ンら、ヌクレイツク・アシノズ・リサーチ、第１５巻、６４５５〜６４６７頁（ １９８７）　；ゲベイエフら、ヌクレイツク・アシソズ・リサーチ、第１５巻、 ４５１３〜４５３５頁（１９８７）　ｉハララムビジスら、ヌクレイツク・アシ ノズ・リサーチ、第１５１！、４８５６〜４８７Ｇ頁（１９８７）等に報告され た。好ましくは、Ｌは本発明の染料のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ３） エステルをジデオキシヌクレオチドのアルキニルアミノ誘導塩基と反応されて形 成される。

この場合において、Ｌは、（１）ローダミンの５−または６−炭素と（２）ロー ダミンを結合する塩基の炭素との間の部分として使われる。好ましくは、Ｌは３ −カルボキシアミノ−１−プロピニルである。シトシン　チミン、およびアデニ ンのこのようなアルキルアミノ誘導ジデオキシヌクレオチドの合成はホップスら によるヨーロッパ特許出願番号８７３０５８４４．０およびここに引例として挙 げるホップス、ジャーナル・オフ・オーガニック・ケミストリー、第５４巻、３ ４２０頁（１９８’９）によって教示される。簡単には、アルキニルアミノ誘導 ジデオキシヌクレオチドは適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常はホップス ら（上記）によって教示されているような５−ヨードピリミジンおよび７−ヨー トー７−デアザブリンジオキシヌクレオシド）およびＣｕ　（１）をフラスコに 入れ、空気を除くようにＡｒを吹き込み、乾燥ＤＭＦを添加し、続いてアルキニ ルアミン、トリエチルアミンおよびＰ’ｄ（０）を添加して生成される。反応混 合物を数時間、または薄層クロマトグラフィがハロジデオキシヌクレオシドの消 費を示すまで、撹拌することができる。保護されていないアルキニルアミンを使 用する場合、アルキニルアミノヌクレオシドを、反応混合物を濃縮し、カップリ ング反応で生成したハイドロハライドを中和するように水酸化アンモニウムを含 む溶出溶媒を用いるシルカゲルでクロマトグラフ処理を行って単離することがで きる。保護されたアルキニルアミンを使用する場合、メタノール／塩化メチレン を反応混合物に添加し、強塩基性アニオン交換樹脂の重炭酸塩の形によって続け る。次にスラリーを約４５分間撹拌し、濾過し、追加のメタノール／塩化メチレ ンを用いて樹脂を洗うことができる。−緒に合わせた濾液を濃縮しメタノール− 塩化メチレングラディエンドを用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィ ーによって精製することができる。トリホスフェートが標準技術によって得られ る。

上記参照によるアルキニルアミン誘導ジデオキシグアノシンは特に改良されたグ アニン先駆勧賞（６−メドキシー２−メチルチオ−７−デアザプリン、Ｘ）を必 要とし、これは出発物質、６−ヒドロキシ−２−メチルチオ−７−ジアザプリン 、ＸＸから得られる。Ｘｘの６−クロロ−２−メチルチオ−７−デアザプリン、 ＸＸＸへの転換はロビングとノニル（ジャーナル・オフ・ヘテロサイクリック・ ケミストリー、第１巻、３４頁（１９６４）　）に従い、続いてクロロ置換体を メトキサイド（還流メタノール中のナトリウム塩）を用いて置換しＸを生成する ：好マしくは、ローダミンＮＨＳエステルを米国特許出願第０６／９４１．９８ ５号の教示に従って合成する。ローダミンＮＨＳエステルを合成する方法の重要 な特徴は、（１）高収率の生成物を室温で生成するようにローダミン染料の５− または６−形態のエステル化のために存在する実質的に計真量のジーＮ−スクシ ンイミジルカーポネート（ＤＳＣ）および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡ Ｐ）を有する反応条件、および（２）反応体への転換逆行を妨げるように、好ま しくは５以下のＩ）Ｋｍを有する酸性化合物を用いて新しく合成された生成物を 処理することである。本発明の一般的な反応図は式■によって定義される：＋Ｄ ＳＣ＋ＤＭＡＰ　−−→ 皿 これらの方法は酸の形の５−または６−カルボキシローダミン（異性体の混合物 として、または純異性体として）を当量のＤＳＣおよびＤＭＡＰの極性アプロチ ック溶媒の溶液を用いて反応させ、カルボキシル　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ ドエステルを生成することからなる。適当な極性アプロチック溶媒はＮ、Ｎ−ジ メチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、ピリジン、ヘキサメチルホスホルアミド（Ｈ ＭＰＡ）等を含む６ｊ！ｌも好ましくは、ＤＭＦは反応溶媒として用いられる。

異性体として混合されるＮＨＳエステルはさらに使用するために各異性体に分離 することができる。最も好ましくは、試料を保存するために、酸の形の５−また は６−カルボキシルローダミンをまず標準の分離技術、例えばエドムンドソンら 、モレキュラー・イムノロジー、第２１巻、５６１頁（１９８４）によって各異 性体に分離し、次いで各５−または６−カルボキシル異性体を上述のように反応 されて、それぞれ、５−または６−カルボキシルＮＨＳエステルを形成し、これ らを反応混合物から分離し、再び標準技術を用いる。

好ましくは、新しく合成されたローダミンＮＨＳエステルを揮発性の、ｐ　Ｋ　 ａ　＜　５のを機可溶性酸、およびさらに好ましくは、揮発性の、ｐＫ、＜１の 有機可溶性ｆＩＩ】、例えばＨＣＩまたはＨＢｒのメタノール溶液、または最も 好ましくは、トリフルオロ酢酸を用いて処理する。

本発明に使用するためのローダミン染料の若干の異性体混合物は市販品として入 手することができ、例えばモレキュラー・ブローブス・インコーポレーテンド（ Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）　、および他のものは米国特許２，２４２，５７２　；２ ，１５３，０５９　；３，８２２．２７０　；　３．９３２，４１５；および４ ，００５，０９２　Ｆの技術に従って合成でき、これらすべては参照文献に加え られる。

本発明のローダミンは、Ｗ１４Ｏの物理化学的な性質、例えば太きさ、配座、電 荷、疎水性等を有するポリヌクレオチドの一連の接近した間隔のバンドまたはス ポットが線状または二次元の配置に存在する、ゲル電気泳動のような、生物化学 的分離方法に姿ねられたポリヌクレオチドの種類を同定するために特に良く適し ている。ここで使用するように、「バンド」の語は類似のまたは同一の物理化学 的性質に基づいたポリヌクレオチドの空間的配置または凝集を含む。通常のバン ドはゲル電気泳動によって染料−ポリヌクレオチドの共役体を分離する際に生じ る。

好ましくは、本発明に従って同定されたポリヌクレオチドの種類は、対応が４種 の可能な末端塩基と４種のスペクトル分析できる染料との間に確立されるように 末端ヌクレオチド語において定義される。特に、ポリヌクレオチドの種類はＤＮ Ａ配列のチェイン・ターミネータ−法の関係において生し、この方法は染料−ポ リヌクレオチドの共役体をゲル電気泳動によって大きさに従って分離する０例え ばゴールドおよびマシューズ、上述した；リックウッドおよびハメス著、核酸の ゲル電気泳動：実際のアプローチ（ＩＲＬブレス・リミテッド、ロンドン、１９ ８１）　；またはオスターマン、プロティンと核酸の研究方法、第１巻（スブリ ンガーーベルラク、ヘルリン、１９８４）。好ましくはゲルのタイプは約２〜２ ０パーセントの間の濃度（重量対容量）を有するポリアクリルアミドである。さ らに好ましくは、ポリアクリルアミドゲル濃度が約４〜８パーセントの間にある 。好ましくはゲルはストランド分離または変性剤を含む。このようなゲルを構成 するための詳細な方法はマニアチスら、メソッズ・イン・エンザイモロジー、第 ６５巻、２９９〜３０５頁（１９８０）の「９８％ホルムアミドまたは７Ｍ尿素 を含有するポリアクリルアミドゲルにおける低分子量ＤＮＡおよびＲＮＡの分別 」；マニアチスら、バイオケミストリー、第１４巻、３７８７〜３７９４頁（１ ９７５）の「ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動による小さい二重鎖およ び一重鎖ＤＮＡ分子の鎖長決定」；およびマニアチスら、モレキュー・クローニ ング：実験室手法（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、ニューヨ ーク、１９８２）　１７９〜１８５頁によって与えられる。従って、これらの参 照文献を参考として組み込まれる。特別な分離に用いられる最適ゲル濃度、ｐＨ １温度、変性剤の濃度等は、分離すべき核酸の大きさの範囲、それらの塩基組成 ；それらが−重鎖かまたは二重鎖か、情報を電気泳動によって捜すための種類の 性質を含めて、多くのファクターに依存する。従って本発明の応用は特定の分離 のための条件を最適にするための標準の予備試験を必要とするかも知れない。好 ましくは、ポリヌクレオチド鎖の伸長の間にデオキシイノシントリホスフェート を、電気泳動中のいわゆる「バンド圧縮」を避けるためデオキシグアノシントリ ホスフェートの代わりに用いる。例えば、ミルスら、プロシーディンゲス・オフ ・ナショナル・アカデミク・サイエンシーズ、第７６巻、２２３２〜２２３５（ １９７９）。例として、約１０〜５００塩基の間の範囲の大きさを有するポリヌ クレオチドを分離し、次に示すゲル中で本発明に従って検出する＝１９部対１部 のアクリルアミドとビスアクリルアミドから作られ、４８パーセント（重量／容 量）尿素を用いて、ｐＨ８，３（２５℃で測定した）にてトリス−ポレートＥＤ ＴＡ！！ｌ衝液に形成した６パーセントポリアクリルアミド。このゲルは約５０ ℃にて実施される。

ゲル上の染料−ポリヌクレオチド共役体は標準手段、例えば高光度水銀蒸気ラン プ、レーザー等によって発光される。好ましくは、ゲル上の染料−ポリヌクレオ チドはアルゴンイオンレーザ−によって発生したレーザー光、特に、アルゴンイ オンレーザ−の４８８〜５１４　ｎｎの発光ラインによって発光される。

これらのラインで同時にレーザー用として使える幾つかのアルゴンイオンレーザ −は市販品として入手できる、例えばシオニクス社（サニイベール、ＣＡ）モデ ル２００１等。

本発明の重要な特徴はＤＮＡ配列決定方法における鎖伸長のために使用されるＤ ＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明の方法として使用されるポリメラ ーゼは、マンガンまたはマグネシウム緩衝液を用いたＴａｑＤＮＡポリメラーゼ 、イニスらによって記載された、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・ アカデミイ・サイエンシーズ、第８５ｔｋ、　９４３６〜９４４０頁（１９８８ ）　；およびマンガン緩衝液を用いたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、デーバーらによ って記載された、プロシーディンゲス・オフ・ザ・ナショナル・アカデミイ・サ イエンシーズ、第８６巻、４０７６〜４０８０　頁（１９８９）　、から成る群 から選ばれる。一般に、未知の配列を含む一重鎖ＤＮＡ鋳型は標準技術によって 、例えばアプライド・バイオシステムズ・モデル３７０ＡＤＮＡ配列決定システ ムのためのマニュアルに記載されているようなＭ　１３ｍｐ１８において調製さ れる。

同様に、プライマーを鋳型に結合する、アニーリング反応は、標準プロトコール によって行われている。異なる大きさに分類したＤＮＡフラグメントを発生する 伸長反応は、本発明のローダミン標識ジデオキシヌクレオチドおよび使用した特 定のＤＮＡポリメラーゼに対して最も効果的にする。

１施■ 以下の実施例は本発明を説明するためのものである。試薬の濃度、温度、および 他の種々のパラメータの値は単に本発明を例示するためのものであり、それを制 限的に考えるためのものではない。

実施例１．６−ＴＭＲ−ＮＨ３ ６−ＴＭＲＭをカラムクロマトグラフィーによって５−および６−ＴＭＲ酸異性 体の混合物から分離した。８．８２ｍｇの６−ＴＭＲ酸と１０．５ｍｇのＤＳＣ を０．５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中にアルゴン下に溶解した。テトラヒドロフラン（Ｔ ＨＦ）に溶解したＤＭＡＰの０．５モル溶液０．０９ｍ１を一滴ずつ添加した。

室温で２時間後、混合物を５０１１のクロロホルムに入れ、１：１のブラインと 水の溶液を用いて３回洗浄した。クロロホルムを蒸発させて残渣を２０ｇのシル カゲルカラム（３００：３０：８の塩化メチレンとメタノールと酢酸溶離液）で 精製した。約０．４のＲｆの両分を乾燥するまで蒸発させ、酢酸塩として８．６ Ｂの６−ＴＭＲ−ＮＨ３を生成した。

実施例２．５−ＴＭＲ−ＮＨ３ ５−ＴＭＲ−ＮＨ３を、実施例１に記載したように、２＋１１の乾燥ＤＭＦ中、 ８２．３ｍｇの５−ＴＭＲ酸、７５＋ｗｇのＤＳＣ，２＋ｗｌの０．５モルＤＭ ＡＰのＴＨＦ溶液０．７０ＩＩｌから調製した。

実施例３．６−ＲＯＸ−ＮＨ３ ６−ＲＯＭ酸をカラムクロマトグラフィーによって５−および６−酸異性体の混 合物から分離した。４６．２ｍｇの６−ＲＯＭ酸および５５ｍｇのＤＳＣを２ｍ ｌの乾燥ＤＭＦ中にアルゴン下に溶解し、０゜５モルのＤＭＡＰのＴＨＦｔｆＩ 液０．４５＋ｗｌを一滴ずつ添加した。室温で１，５時間後、混合物を１００ｍ １のクロロホルムに入れ、１：１のブラインと水の溶液を用いて４回洗浄した。

クロロホルムを蒸発させて残渣を４０ｇのシルカゲルカラム（３００：３０：８ の塩化メチレンとメタノールと酢酸？８離液）上で精製した。約０．５のＲｆの 両分を乾燥するまで蒸発させ、酢酸塩として５６．４＋ｗｇの５−ＲＯＭ−ＮＨ ３を生成した。

実施例４．５−ＲＯＸ−ＮＨ３ ５−ＲＯＸ−ＮＨ３を実施例３に記載したように、１．０＠ｌの乾燥ＤＭＦ中、 ２７．４ｍｇ（７）　５−　ＲＯＭ酸、３０．２ｍｇノＤ　Ｓ　Ｃ、０，５モル のＤＭＡＰのＴＨＦ溶液０．２４謡！から調製した。

実施例５　、ロー　ミンＮＨＳエスールの　な　入ａ）実施例３からのＱ、４４ １１ｇの６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンＮＨＳエステルおよび０．０１モルの エタノールアミンのメタノール溶液８０μＩを混合した。反応混合物とアセトニ ルおよび０．１モルのトリエチルアンモニウムアセテート緩衝液（ｐＨ−７，０ ）の逆相ＨＰＬＣは、生成物が７０％のＸ−ローダミン酸および３０％のＸ−ロ ーダミンＮＨＳエステル（エタノールアミンを用いたその反応から６−カルボキ シ−Ｘ−ローダミンのエタノールアミドとして観察された）から成っていること を示した。

ｂ）実施例３からのＱ、１５ｍｇの６−カルポキシーＸ−ローダミンＮＨＳエス テルを１０ｋｌのクロロホルムに溶解した；クロロホルム溶液を０．５モルの重 炭酸ナトリウムを用いて２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、０，１ １の酢酸で処理し、乾燥するまで蒸発させた。０．３５ｍｇの生成物をａ）と同 様に正確に処理した；逆相ＨＰＬＣは２０％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン 酸および８０％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミンＮＨ３エステルを示した。

Ｃ）酢酸の代わりにトリフルオロ酢酸を用いた以外は、実施例３からの０．１５ ｍｇの６−カ！レボキシ−Ｘ−ローダミンＮＨＳエステルをｂ）と同様に正確に 処理した。０．１抛ｇの得られた固体をａ）と同様に正確に処理した；逆相ＨＰ ＬＣはく５％の６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン酸および〉９５％の６−カルボ キシ−Ｘ−ローダミンＮ）（Ｓエステルを示した。

実施例６．Ｒ６０□７−ゾアザー２’、３’−ジー゛オキシアデノシントリホス フェート（ｄｄＡ−５Ｒ６Ｇ）の上記のようにして得られた２、０μモルの７− （３”−アミノ−１“−プロピニル）−７−ジアザ−２’、３’−ジデオキシア デノシントリホスフエート（凍結乾燥した）に、１００μｌのＤＭＦ、３１１ｇ の５−ローダミン６Ｇ−ＮＨＳエステルおよび５０／Ｊｌの１．０Ｍトリエチル アンモニウムカーボネートをｐ　Ｈ８，９５で添加する。

これを渦巻撹拌し室温でそのまま終夜放置した。

次いで混合物をＡＸ−３００２２０Ｘ４．６ｍｍの７ミクロンカラム上で１分間 につき１．５＋ｓｌの流速でＨＰＬＣによる精製をした。最初の溶出液は、６０ ％のＯ，１Ｍトリエチルアンモニウムカーボネート、ｐＨ７，０，４０％のＣ８ ３ＣＮであり、６０％の０．２　Ｍ　トリエチルアンモニウムカーボネート、ｐ 　Ｈ７，５，４０％のＣ）ｌｆｆｃＮへの線勾配で４０分かけた。溶媒は収集生 成物から真空下に蒸発させて除去した。残渣を０．０１Ｍ　）リエチルアンモニ ウムアセテートｐ　Ｈ７，０に溶解し、定置した。

実施例７．ＲＯＸ　２’、３’−ジー゛オキシシチジントリホスフェ）　（ｃ！ ｄＣ−６ＲＯＭ）　０：）”　’１５０μｌの水に溶解した３、６μモルの５− （３”−アミノ−１”−プロピニル）−２’、３’〜ジデオキシシチジントリホ スフエート（上記のように得られた）に、６０μｍのＤＭＳＯに溶解した５ｍｇ の６−ローダミンＸ−ＮＨＳエステルおよび５０．ｉ　の１．０Ｍトリエチルア ンモニウムカーボネートｐＨ８，９５を添加した。これを渦巻撹拌し室温でその まま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に精製した。

実施例８．Ｒ１１０−２’、３’−ジデオキシイノシントリホスフェート（ｄｄ Ｇ−５Ｒ１１０）の骨 上記のようにして得られた１、３　μモルの７−（３”−アミノ−１゛−プロピ ニル）−７−ジアザ−２′、３’−ジデオキシグアノシントリホスフエート（凍 結乾燥した）に１００　μｌのＤＭＦ、４ｍｇの５−ローダミン１１０−ＮＨＳ エステル、および１００Ｉｉｌ　の１．０Ｍ）リエチルアンモニウムカーボネー トｐ　Ｈ８，９５を添加した。

これを渦巻撹拌し室温にてそのまま終夜放置した。生成物を実施例６と同様に精 製した。

実施例９．ＴＭＲ２’、３′−ジデオキシチミジントリホスフェート　ｄｄＴ− ６部ＭＲ）のｆ１ 上記と同様にして得られた１５０μＩのＨ２Ｏに溶解した３、１μモルの５−（ ３°゛−アミノ−Ｉ　ＩＩ−プロピニル）−２′、３′−ジデオキシウリジント リホスフェートを、１５０μｌのＤＭＦ、１００μｌの１．０Ｍトリエチルアン モニウムカーボネートＥ）Ｈ８，９５、および４−ｇの６−ＴＭＲ−ＮＨＳエス テルと共に混合した。これを渦を撹拌し室温にてそのまま終夜放置した。生成物 を実施例６と同様に精製した。

実施例１０．０−　ミン　ジー゛オキシヌクレオチドおよびＴａ　ＤＮＡボリメ ー−ゼとマグネシウム　゛いる旦五人父凰立梶 実施例６〜９において調製されたローダミン標識ジデオキシヌクレオチドを使用 して、アプライド・バイオシステムス（フォスター市、ＣＡ）モデル３７０Ａ自 動化ＤＮＡシーケンサ−を用いる鎖末端配列決定のＤＮＡフラグメントに標識を 付した。この製造業者のプロトコール（参照、ユーザー・ブレタン・ＤＮＡシー ケンサ−・モデル３７０、発行第２号、１９８７年８月１２日）をＭ１３ｗｐ１ ８−重鎖鋳型を得るために続けた。（このＭ１３自身は試験配列としテ使った） 、Ｍ１３ユニバーサルブライマーを用いた。次の溶液を調製した：　５　Ｘ　Ｔ ａｑ　Ｍｇ緩衝液（５０ｍＭ　）リス−ＣＩ　ｐ　Ｈ８，５，５抛−のＭｇＣ１ ｚ　、　２５０ｍＭのＮａＣ１）　；染料−ターミネータ−ミックス（２，７８ ＭのｄｄＧ−５Ｒ１１０，９，００ＭＭのｄｄＡ−５１？６Ｇ、　２１６．０８ ＭのｄｄＴ−６７ＭＲ１および５４．Ｏｐ　Ｍ　）ｄｄｅ−６ＲＯＸ）　；およ びｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ　ミｙ　クス（５００ＭＭのｄｒＴＰ、　１００μＭのｄＡＴ Ｐ、　１００／Ｊ　ＭのｄＴＴＰ、および１００μＭのｄＣＴＰ）。アニール反 応は、マイクロ遠心管に３．６μｍの５Ｘ　Ｔａｑ　Ｍｇ緩衝液、０．４ｐモル のＤＮＡ鋳型、０．８　ｐモルのプライマー、および容量１２．０μｍまでの水 を一緒にして行われた。混合物を５５〜６５℃にて５〜１０分間イ分間インキト ベート０〜３０分かけて４〜２０℃の温度までゆっくり冷却し、次いで一度遠心 分離して濃縮物を集め、混合し、氷上に置いた。混合物に次に１．０μｌのｄＮ ＴＰミックス、２．０　μｌの染料−ターミネータ−ミックス、４ユニツトのＴ ａｑポリメラーゼ、および容量ｔＳ、Ｏμｍまでにする水を添加した。混合物を ３０分間６０℃にてインキュベートし、次いで氷上に置き、２５．０μｍ０１０ ａ＋ＭのＥＤＴＡｐＨ８，０と一緒にして反応物を終わらせた。混合物中のＤＮ Ａを次にスピンカラム（例えば１ｍｌのセファデックスＧ−５０カラム、例とし て５プライムから３プライムまでのセレクト−Ｄ、ウェスト・チェスター、ＰＡ ）で精製し、エタノール沈澱をした（４μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムｐ　Ｈ５，２ および１２０／７１の９５％エタノールを添加し、氷上で１０分間インキュベー トし、１５分間遠心分離を行い、上澄液をデカントして排出し、７０％エタノー ルに懸濁し、攪拌し、遠心分離を１５分間行い、上澄液をデカントして排出し、 真空遠心分離機で５分間乾燥することによって）。沈澱したＤＮＡを次に５部の 脱イオンホルムアミドおよび１部の５０−一のＥＤＴＡ　ｐＨ８，０から成る溶 液３μｌに再懸濁させて完全に渦を撹拌をした。ゲル上に装填する前に、混合物 を９０℃にて２分間インキュベートしてＤＮＡを変性させた。４５０塩基以上の Ｍ１３プラスミドを集めてモデル３７０Ａ自動化シーケンサ−の塩基コーリング ルーチンによって同Ｔ７ＤＮＡボリメー−ゼとマンガン　−゛　いる旦Σ人回死 丘灰 実施例１０と同様に配列決定反応を行ったが、（１）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ の代わりに修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ（登録商標５ｅｑｕｅｎ ａｓｅ　、米国のバイオケミカル社から入手できる）を使用する、例えばタボー ルら、プロシーディンング・オフ電ザ・ナショナル・アカデミイ・オフ・サイエ ンシーズ、第８６巻、４０７６〜４０８０頁（１９８９）および第８４巻、４７ ６７〜４７７１頁（１９８７）、および（２）　５Ｘ　Ｔａｑ　Ｍｇｌ！！衝液 の代耐液に５ＸＴ７　’Ｍｎ１ｌ衝液（１耐液ｍＭのトリス−ＣＩ　ｐ　Ｈ７， ５，７５ｄのイソクエン酸ナトリウム、１０ｍＭ　ＭｎＣ１ｚ、２５０ｍＭのＮ ａＣ１）を使用し、染料−ターミネーターミソクスは１．８μＭのｄｄＧ−５Ｒ １１０，５，４９ＭのｄｄＡ−５Ｒ６Ｇ。

５．８９ＭのｄｄＴ−６Ｔ門Ｒ１および９．０９ＭのｄｄＣ−６Ｒ咋から成り、 ｄＮＴＰミックスは７５０９ＭのｄｌＴＰ、　１５０９ＭのｄＡＴＰ、　１５０ ９ＭのｄＴＴＰ、および１５０９ＭのｄＣＴＰから成り、伸長反応は３７℃にて １０分間Ｔａ　ＤＮＡポリメラーゼとマンガン　′　いｉ旦凡人父丑盆梶 実施例１０と同様に配列決定反応を行ったが、５ＸＴａｑＭｇ緩衝液の代わりに ５ＸＴａｑＭｎｗ７に耐液（１００ｍＭのトリス−Ｃ１ｐＨ７，５，７５ｍＭの イソクエン酸ナトリウム、ｉｏｍＭ　ＭｎＣ１ｚ、２５０Ｉの塩化ナトリウム） を使用し、染料−ターミネーターミソクスは、３．６９ＭのｄｄＧ−５Ｒ１１０ ，２，７９Ｍのｄｄ＾−５Ｒ６Ｇ、４３．２μＭのｄｄＴ−６ＴＭＲ１および２ ８．８　ｐ　Ｍ　ノｄｄＣ−６ＲＯＸがら成った。４５０塩基以上ノＭ１３プラ スミドを集めて、モデル３７０　Ａ自動化シークエンサーの塩基コーリングルー チンによって同定した。

前述の本発明の好適例の開示は説明と解説のために示した。この開示された正確 な形に本発明を網羅または制限するものではなく１．多くの改変および変形が上 述の教示の観点から可能であることは明らかである。これらの例は本発明の原理 およびその実際の応用を最良に説明するために選択され記載されたものであり、 これによって当該技術分野における他の熟練者が予期された特定の用途に適合す るように種々の具体化および種々の改変において本発明の範囲はここに添付する 特許請求の範囲によって明確にするつもりである。

国際調査報告 、ｒＴｌｌｌ（ｏｎ／「）１１６５ 喝＋１１−１１１が１ｈｌＡＣり１Ｃ１１１く〉ｒ−Ｎ（ＩＰ（：＝１１１バ” 、＞９０１０５５６５

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．異なる３′−末端ジデオキシヌクレオチドを有するポリヌクレオチドをＤＮ Ａ配列決定のチェインターミネーション法において識別する方法において、この 方法が：第１、第２、第３、および第４の種類のポリヌクレオチドの混合物を形 成し、第１の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキシアデノシンを有 し、テトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミン６Ｇ、およびローダミ ン１１０から成る群から選ばれる第１の染料を用いて標識を付され；第２の種類 の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジデオキシシチジンを有し、テトラメチルロ ーダミン、ローダミンＸ、ローダミン６Ｇ、およびローダミン１１０から成る群 から選ばれる第２の染料を用いて標識を付され；第３の種類の各ポリヌクレオチ ドが３′−末端ジデオキシグアノシンを有し、テトラメチルローダミン、ローダ ミンＸ、ローダミン６Ｇ、およびローダミン１１０から成る群から選ばれる第３ の染料を用いて標識を付され；第４の種類の各ポリヌクレオチドが３′−末端ジ デオキシチミジンを有し、テトラメチルローダミン、ローダミンＸ、ローダミン ６Ｇ、およびローダミン１１０から成る群から選ばれる第４の染料を用いて標識 を付され；混合物中の各種類のポリヌクレオチドが巽なる染料を用いて標識を付 されており； 同じ大きさに分類されたポリヌクレオチドのバンドを形成するように混合物中の ポリヌクレオチドをゲル上に電気泳動によって分離し； ゲル上のバンドを照明ビームを用いて発光させ、この照明ビームは染料に蛍光を 生じさせることが出来；そしてバンド中のポリヌクレオチドの種類を染料の蛍光 または吸収スペクトルによって同定する、 工程から成るポリヌクレオチドの識別方法。
2. ２．前記３′−末端ジデオキシアデノシンが２′，３′−ジデオキシ−７−デア ザアデノシンであり、前記第１の染料が結合基のためにその７炭素原子に結合し ており；前記３′−末端ジデオキシシチジンが２′，３′−ジデオキシシチジン であり、前記第２の染料が結合基のためにその５炭素原子に結合しており；前記 ３′−末端ジデオキシグアノシンが２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノ シンおよび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれ 、前記第３の染料が結合基のためにその７炭素原子に結合しており；前記３′− 末端ジデオキシチミジンが２′，３′−ジデオキシウリジンであり、前記第４の 染料が結合基のためにその５炭素原子に結合している特許請求の範囲第１項記載 の方法。
3. ３．前記結合基が３−カルボキシアミノ−１−ポロビニルであり、前記２′，３ ′−ジデオキシ−７−デアザアデノシン、および２′，３′−ジデオキシ−７− デアザグアノシンおよび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る 群から選ばれる前記ジデオキシグアノシンの、７炭素原子を、前記第１および第 ３の染料の５または６炭素原子に、それぞれ結合し、前記ジデオキシシチジンお よび前記ジデオキシウリジンの５炭素原子を前記第２および第４の染料の５また は６炭素原子に、それぞれ結合している特許請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．さらにプライマーから複数のポリヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼによっ て、ジデオキシアデノシソトリホスフェート、ジデオキシシチジントリホスフェ ート、ジデオキシグアノシントリホスフェート、およびジデオキシチミジントリ ホスフェートの存在で伸長し、前記第１、第２、第３、および第４の種類のポリ ヌクレオチドを形成する工程を含む特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．前記ＤＮＡポリメラーゼがＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＤＮＡポリ メラーゼから成る群から選ばれる特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミン６Ｇの５ 炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがローダミンＸの６炭 素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２′， ３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシ グアノシンがローダミン１１０の５炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオ キシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合している特許請求の 範囲第５項記載の方法。
7. ７．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミンＸの６炭 素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがローダミン６Ｇの５炭 素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２′， ３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキシ グアノシンがローダミン１１０の５炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオ キシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合している特許請求の 範囲第５項記載の方法。
8. ８．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミンＸの６炭 素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがローダミン１１０の５ 炭素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２′ ，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオキ シグアノシンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合し、前記２′，３′ −ジデオキシウリジンがローダミン６Ｇの５炭素原子に結合している特許請求の 範囲第５項記載の方法。
9. ９．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミン６Ｇの５ 炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがローダミン１１０の ５炭素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンおよび２ ′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記ジデオ キシグアノシンがローダミンＸの６炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオ キシウリジンがテトラメチルローダミンの６炭素原子に結合している特許請求の 範囲第５項記載の方法。
10. １０．前記２′，３′−ジデオキシ−７−デアザアデノシンがローダミンＸの６ 炭素原子に結合し、前記２′，３′−ジデオキシシチジンがテトラメチルローダ ミンの６炭素原子に結合し、２′，３′−ジデオキシ−７−デアザグアノシンお よび２′，３′−ジデオキシ−７−デアザイノシンから成る群から選ばれる前記 ジデオキシグアノシンがローダミン６Ｇの５炭素原子に結合し、前記２′，３′ −ジデオキシウリジンがローダミン１１０の５炭素原子に結合している特許請求 の範囲第５項記載の方法。
11. １１．次の群から選ばれるローダミン標識化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲ１は５−および６−カルボキシローダミンＸ、５−および６−カルボ キシローダミン６Ｇ、５−および６−カルボキシローダミン１１０、および５− および６−カルボキシテトラメチルローダミンから成る群から選ばれ、Ｒ２はト リホスフェート、１−チオトリホスフェート、または１０〜６００塩基のポリヌ クレオチドである。）発明の詳細な説明