PT95180A - Processo de preparacao de composicoes farmaceuticas a base de anticorpos anti-alfa 4 beta 1 para inibicao da aderencia de linfocitos as celulas endoteliais - Google Patents

Description

/ i, *3·ών 3á24~07ò~aiâ

ί1 <Τ -2-1. INIRQSyggQ. u presente invento diz respeito a ua processo para a imoição da adesão de una célula a outra. Bsseia-ss na aecerminação de que o receptor os matriz sstrscsiuiar cc40i promove a adesão de linfácitos a células endoteliais, por meio de xiqaçso a usa cadeia péptidica definida. Em cone reti zaç Sss particulares do inventa, podem usar-se péptidos ou anticorpos monoclonais para inibir a ligação de linfácitos a células enaoteiiais, impedindo desse modo a entrada de linfácitos no tecido e -suprimindo a resposta imunoiágica.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

2.1. RECEPTORES PA .. mrRU . EIIBâCELULâR Têm sido descritos receptores CR) da superficie celular específicos de componentes da matriz estraceluiar (£CN> , tais como colagênio, fibronectina e 1 asinina C revisão de Hynes, 19S7?. Cell, 488045-5541 Hemler, 1988, Xmmunol. Today, 9si09). As funçaes dos receptores da matriz entraceiular CECHRs I5 II ε VI) foram definidas por cromatografia de afinidade CWayner and Cárter, 1987, <3. Cell Biol., 105§ 1075-1884; Staatz st ai., 1989, u. Cell Biol., 198 % 1917-1924) e através da preparação da anticorpos monoclanais que inibissem especificaaiente a interseção de células com iigandos purificados (bfayner and Cárter, 1987, 3.

Cell Biol., 10581873—1884) ou ECIi (Wayner et al. 1988, ã. Cell Biol., 10781881-1891).

Idsntificou-se uma diversidade de ECNRs, utilizando estas técnicas. Utilizando anticorpos monoclonais, Wayner e Cárter <1987, J. Cell Biol., 105s1873—1884) identificaram duas C i. S = de receptores da superfície celular para o colagênio nativo, em células de fibrossarcoma Humano; a classe I estava envolvida na adesão das células ao colagênio, f ibronactirsa s laminina, enquanto a classe II estava envolvida na adesão das células apenas a colagênio nativo. Hayner st al_ (1988, J. Cell Biol., i.07s 1881—1891) idsntif içaram anticorpos acmcclontis que inibia® ··-"y ϊ 4sy 5o24-07ó-l 13

—3— a adesão de células humanas ao colagénio CP1H5), fibronectina ifiFê ou PlDé) e a ambos, colagénio e fibronectina (PlBSj 3 determinou-se que a P1FS e o PiDò reagiam com ura receptor de supsrfacis. de 14m kl?®,, conheca. do sor ECMR ví c Ki.tr32.cEi i êi á (1988, 3. Biol. Chem., 263s4516—4519i, relataram que ο FINS isuprai também inibia especificamente a adesão de plaquetas humanas inactivatías ao colagénio das I e III, mas não a TiQronectina» Isolou-ss um complexo, que compreendia pelo menos rrés g1icoprotelnas, a partir de fibroblastos d© embrião cs galinha . utilizando anticorpos monoclonais que bloqueavam a adesão das células à fibronectina (Knudsen et ai, 1985, Exp. Deli Kes., 157;218-228; Chem et ai, 1983, 3. Cell Biol., 100;1103--iíi4j, ao passo que a partir de células de mamiferos se isolou um completo de duas g1icoprotelnas, utilizando cromatografia de afinidade à vitronectina (Pytela et al« 1985, Proc. Matl. Acad. 8ci« ii.S.A., 82§5766—5770p Pytela et al, 198ê, Science, 231s1559—1562). Determinou-se que as g1icoprotelnas mais importantes Ilb e Illa, da superfície das plaquetas, existiam na forma de um complexo iil não-covalente, na membrana da plaqueta Uennings and Phillips, 1982, J= Biol. Chem., 257s 10458-10463) , e que serviam de ECÍ1R para fibrinogénio (Bennett et al, 1983, Prcc. Hatl. Acad. Sei. U.S.A., 80;2417—2421 p Harguerie et al. 1934, Eur. 3. Biochem., 159 s5-11). fibronectina CBardner and Hynes, 1985, Cell, 42s439-448; Plog gi a|.5 1985, Slood, 6Ã;724-727$ „ factor de von ãJillebrand (Ruggeri et al. 1982, Proc. WatI. Acad. 8ci. U.S.A., 79;8058-6041) e vitronectina íPytela et al. 1988·, Science, 231;1559-1562). 0 imenso conjunto de receptores da matriz extraceluiar partilha homologia estrutural. Os ECMRs são membros da família da inregrina de moléculas que aderem ãs células e possuem suounidades s únicas complexadas com a subunidade Bi da integrina 1. Hynes, 1937, Cell, 48;549-554; Isiaynsr and Cárter, 1987, d» Cell Biol., 105; 1S75-18S4; tóayner et al. 1988, 3. Cell BIOL., 107s1881—1891s» Outros membros da família de receptores da intsgnna, incluem proteínas de adesão de leucócitos s os antigenes de VLA. As proteínas de adesão de leucócitos incluem

é}‘ 7i *69 5624-076—118

..ti -4- l.Fh-1, wac-i @ P15Q/95 e são g 1 icoproteinas tiiméricas compostas por oifarentss cadeias a s uma cadeia p, cot 95 kDay coituif l kishiomoto et al, 1907 , Cell, 48 g 481-490¾ „ Os an ti génios de vLA são designados a partir do seu aparecimento muito tardio em linfocitos T cultivados (Heetler st al, 1983, d» Immunol. , 15x5334-5408 Heraler et al , 1984, J. Iraraunol.15285011-5018% Hemier et al.» 1985, Eur. J. Immunol., 15§502-508). ileterminou-se que antissoros da subunidade VUH bloqueavam a adesão ds células a fibronectina ou á laminina (Talcada et al, 1987, Nature, 3268607-610).

Idaiti'ficaram-se inter-relaçSes entre essas £CMRs» 0 ECMR VI e xdêntico ao receptor de fibronectina protótipo CPytela et al„ 1985, Cell, 40s191-198) aõpi, g1icoproteána (gp) Ic/IIa das plaquetas s VL.A5, o ECMR II è idêntico a «2pi, glicoproteána la/íla das plaquetas e VLA 2 (Hemler et ai. 19-87, 7= Biol. Chetn ,, 262ϊ11478-11485) e o ECMR I é idêntico ao «301 e VLA 3 CKunicki et al« 1988, J. Biol. Chem., 265§4516—4519? Takada et al» 19S8, u · Cellular Biochem», 57§585-395% Hayrter et. al, 1988, J» Cell fiioi. 107.11881—1891) =, Anticorpos monoclonais de 0:2131, «3131 e solsi (F1H5, P1D6 s PIB5), inibem a adesão de fibroblastos ou plaquetas a coiagénio. , fibronectina e superfícies revestidas com laminina iKunicki et al. 19SS, J. Cell Biol.., 107s 1881—1891 § téayner st ai, 1988, supra?. A Tabela I lista alguns dos membros da tarailia as. xntegrina descrita acima e a Tabela II lista um conjunto as anticorpos monoclonais que reconhecera diversos ECMRs» *71 489 5624-076 -118 118

Tabela I; Família do Receptor da Integrina Receptor_Composição das Subunidades Ligandos Conhecidos_Funções Conhecidas

Fh | 1 1 ce ce φ Φ O CQ •rl O •rH r* 1 G c Tá ro P O s p ft CQ *0) •H •H o D] ft rH •rl Φ - G rH P -P 0 P o Φ •H O m iH 0) O O ICO •H -P o CH CQ CQ G 3 3 Φ Φ o O •rl Φ " vO ctí O rH G !z; rH r-1 σ< c G ce Ό o Fh Fh rH W rH pt| 3 Ό) to o O 00 O Ό - p 3 H •H G Η O © G G Φ 3 G o 3 rH Φ rH rH r Ό) o X -P G Φ O o ce Φ *0) G Φ 'Φ |Z| ο α> P Ή •H 00 rH ·Η S G O o ce -P O Ό •H 1¾ i> ce rH CQ o o •H β> O co Φ'Φ Φ o Φ •H Φ G 'ϋ ο ce ce Φ ce P P V -p P 'd Φ -P Φ T) Μ O -P O •H 'Φ CQ ο ο» tcd o o Ο Φ O Ό O O O O O rH O O -H ice g X ice ice ice 3 ICO G ice ό IG l«S IcO Φ tá IG G m G φ ce co a w CH (0 H 03 o Cl CQ o> G CQ M -H Φ SD C o φ φ φ ce Φ Φ 3 X φ <D G σ' CD Φ rH Tá ·Η O -H Ό Ό *3 rH Ό o Tá Φ A Tá Fh cq Ό Φ < a ϋ P < <1 <e ft <i ce <5 Η O 00 Φ <í <i P

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TABELft II Anticorpos anti—EíCípIR

HniitQfpD Receptor !_ÍQSnúD Referência PiH5 Colagénio Latuinina C Wayner et ai.» 9 1987 ? ã Cell Bioi.,105s1873-1334 ? felaynar et ai.» 5 i?BS? ã. Cell Biol.,107·1881-1391) ΚΧ13Ϊ3 a3*l Colagénio Fibronactina Cláayner st. al.»1997 J.Ceii Biol.s 105 g1073-13S4 P4t2 S4&1 F i bronsc tina: ÇCS-i) Ceiuia r±uts ^5^1. F i b ron sc t i n a C Arg-SIi-Asp--Ser) (íslayner et ai«« 1988;, ã. Cell Biol»3 105s1873-1884 P4CI0 P4Í19 Bi p2 CCdlS) FMg CQLS LAM i 7 λ 489 5624—076—1 18

—S~

As integrinas &1 são expressas diferencialments ss tecido -a células cultivados e demonstram diferenças claras na expressão aependente de activaçSo» Por exemplo, a expressão de *a5íái em células nematopoiéticas restringe-se a subpopulaçeíes de timòcitos e iinfõcitos do sangue periférico, monácitos, leucemias agudas iinfociiicas ou mieiogenosas, células T actávades, células precursoras hemopoiéticas migradoras e a algumas linhagens qe céáuias T, B ou eritroleucêmicas CBernardi et al., 1937, «Ja Cell Biol., 105s489-498s Cardarei li et aL., 1988, J. Csll Biol., Jiúós2i8S-2i90; Sareia—Pardo et al.. 1989 Sarcia-Pardo st ai.. 1989, Exp. Cell Res., 181g420-431s 6iancotti et al., 1986, ã. Csll. Biol., 103g429-437| Liao st al», 1987, Exp. Csll Res., 171s 306-320j Hayner et aL. 1988« J. Cell Biol. 107s 1881-1891.

2=2. FIBRONECTINA A fibronectina é uma proteína detectada na matriz extraceluiar bem como no plasma e na euperficie de certos tipos oe células (Akiyama and Yamada, 1987, Adv. Enzymcl., 59 g1—57 j. Ma pi asma, a f ibronectina existe na forma de um he teroá limero g x icoprotelco, que consiste de duas subunidades similares idesxgnaaas cadeias ή e B), cada uma delas com uma massa moiecular de 220 fcDa, aproximadamente (Akiyama and Yamada, 1987, Adv. Enzymcl. , 59s 1-57% Erickson et, al . 1981, «3. Cell Bioí . , 9is675—678). Podem cindir—se múltipios domínios intramoleculares especializados (Ruoslahii et ai. 1981, J. Biol. Chem. 256¾7277-—7281) da molécula de fibronectina, com fragmentos, os quais, por seu turno, são capazes de interactuar co® colagénio, fibrina, neparina e superfícies de células, de uma maneira análoga à da moiécuia Intacta (Hynes and Yamada, 1982, J· Cell Biol., 95i369- õs heterotilmeros da fibronectina celular e do plasma compreendem polipéptidos similares mas nêo idênticos. A variaòilx-oade da estrutura das suhunidades da fibronectina deriva de variações na sequência primária do resRlyn da fibronectina devido a

entreiaçamen"nativos e® peio menos 2 regiáíss do ®Rí\iA da pre-fibronectina (as regiões EB e IIICS).

/ i 4âv 5624-076-1iS \ «v, ιι,ιΓίΓ* -9- « fibronectina á capas de promover a saesSo ds usa siverâidads de tipos da células, tais coso fibroblssios (Srinsll et ai, 1977, Εκρ. Cell Rss. , liOs 175-210), macrófagos CBeviàacque at ai. JL9S1, J. Εκρ. Med., 155s42—60), leucócitos polimorfonueleares íMarina et. al. 1965, 0« Lab. Clin. Med., jlOjs725-730i 3 plaquetas CKoteiiansky et al. 1981, Fed» Huro =

Biocneas. Sqc», 123s59—62) e queratinócitos (Clark et al 1985, 5« ínvest. Berma to 1. , 04s373—383}, para nossas-- apenas alguns (Liao et al« 1989, Εκρ. Csll Rss. 183s348-361) » Observou-se interacçâo entre fibronectina s uma proteína da supsrficis celular com uma massa molecular de 140 kBa, aproKimadamente, em fibrobiastos ^Brown e Juliano, 1985, Science, 228¾ 1448-1451 % Akiyama et ai 1986, J« Cell Biol., 102s442-448p Brotan e Juliano, 19Sé, J„ Csll Biol . 5 103sl595-1603s Wylie et al., 1979, J. Cell Biol. .80s585- -402), células endoteiiais (Piow et al, 1986. Proc. Matl. Acad. Sei. U.S.A., 83g6002-6006), células linfóides (Brown and Juliano, 1986, u. Cell Biol., 105g1595-1603), plaquetas CPytela et ai. 1986, Science, 228a1559—1562; Sardner e Hynes, 1985, Cell, 42s439-446). células músculares {Horowitz st. al« 1985, J. Cell Biol., 101g2154-21445 Bambsky et al, 1985, J. Cell Biol., 100gí528—1559g Chapman, 1984, ã. Cell Biochem., 259s109—121), e células de osteossarcoma (Pytela et alB 1935, Cell, 40ã191-198}» A ligação da fibronectina às superfícies celulares pode ser competitivamente inibida por fragmentos de fibronectina (Akiyama et ai. 1985, ã. Biol. Chea., 260g13256—13260). Utilizando péptidos de síntese, identificou—se uma sequ'1'ncia do que se pensou ser c único sítio mínimo de reconhecimento da célula, como senão o tetrapéptido Arg-Sli—Asp—Ser CPSDS) CPierschbacher e Ruasiahti, 1984, Nature, 309g30-53§ Pierschbacher st aL, 1982,

Proc. Mati. Acad. Sei. U.S.A., 80§1224—12271 Pierschbacher et al., 1984, Proc. Matl. Acad. Sei. U.S.A.. 8185985-5988g Akiyama et al., 1985, J. Cell Biol., 102g442—448). A sequSncia RGDS presente no domínio “de ligação de células" da fibronectina, é o xigando para o protótipo do receptor de fibronectina descrito por Pytela et al <1985, Cell 40g191-198).

Diversas obssrvaçSss sugeriram que regiffes que nlo a fitàiiS 71 4Β9 5e>24—076-118 -ΙΟ-podiam actuar na ligação da fibronectina (Humphries et al«, 1986, a. Celi Biol., 103s2657-2647). Por exemplo, determinou-se que a afinida.de dos péptidos de síntese, para se ligarem, era sudstanc ia1men te mais baixa do que a afinidade de ligação associada a fragmentos maiores ou á fibronectina Intacta (Akiyama et ai.5 19855 ã. Bioi» Chem., 260s10402-10405§ Akiyamaet st al.« 1985, ã. Biol. Chem., 260g13256-13260). McCarthy et d. (1986, 3. Celi Biol., 102:179—188) relataram afinidade de ligação entre um fragmento de fibronectina do plasma, com 33 kBa e células tumorais de melanoma B16—F1G. Bernardi et al, <1987, J. Ce!2 Biol., 105:489-498), relataram que células linfóides precursoras aderem a dois sítios diferentes na fibronectina§ a linhagem de células BaF3 interagia com o domínio R6D de ligação, enquanto a linhagem de células PD31 parecia interactuar com u® domínio diferente, localizado no segmento do terminal carboxilo e associado com um sitio de ligação de elevada afinidade em relação a heparina.

Ti9S

Humphríes et &l_ <1986, ã« Cell Biol., 103s2637-2647) compararam a capacidade dos fragmentos da fibronectina para formarem interacçães adesivas com melanoma versus células fxbrobiásticas. Observou-se que as células fibroblâsticas BHK se expandiam rapidamente sobre um fragmento com 75 kDa, que representava o domínio de ligação de células que continha R8BS, ao passo que as células de melanoma B16-FI0 não parecias expandir-se sobre o fragmento com 75 kDa, observando—se» em vez 01550. que se expandiam sobre um fragmento com 113 kDa derivado da porção de fibronectina que contém a região de diferenciação, ao segmento de conexão CCS) do tipo III, ou região V (na qual pode ocorrer entrelaçamento alternado do oRNA)» Nessa região íiiCS, localizada perto do terminus carboxilo da fibronectina, a sequência Arg-SIu-Asp-Val CREDV) parece ter significSncxa funcionai. Humphries et. âl. C1987, J» Bioi. Chem», 262 s 6886-6392), estudaram uma série de péptidos de síntese parcialmsnte sobreponíveis que abarcavam a região ÍIICS. Seterraínau-ss que oois péptidos não adjacentes, CSi e C55, eram competitivamente inioidores da adesão da fibronectina a células de mel anemia, -11- 5é24-07to-li8 nâo s células fibroblásticas, mostrando o CSI numa actividade inioidora maior do que a do CS5» Liso et ai (1989. Exp. Ceil Res., 181i340-361)5 relataram que as células linfóides ΜΟΡΟ 315. segregadoras de Igâ3 para além da se ligarem ao domínio da ixgaçâo da células, por meio de uma interaeção RSD, se ligavam preferencialmente ao domínio de ligação de heparina do terminai carooxilo, através de um mecanismo independente de RSB. No entanto, não foram identificadas a(s) sequênciaCs) de adesão presente(s) nas reglSss do terminal carbfisilo da fibronectina, nem o(s) receptoríes) da superfície celular responsáveis pela adesão de células a essas sequências de adesão.

2-3. FUNÇÕES BIOLÓGICAS DE MOLÉCULAS SE ADEQUO DE DtLULftS

Determinou-se que ocorriam interseções adesivas entre células durante muitas ocorrências biológicas importantes, incluindo diferenciação, crescimento e desanvo1viaento de tecidos, também parecendo desempenhar um papel crítico na patogénese de diversas doenças (Humphries et al., 1986, J. CeII Biol., 105s2637-2647s Brinnell, 1984, J. Cell Biochem., 26-107--116; Hynes, 1986, Sei. Am. 254§42-51).

Por exemplo, sabe—se que as InteracçSes adesivas são ex tremamen te importantes no sistema imanológico| no qual a localização de células mediadoras imunológicas parece ser devida peio menos em parte, a interacçSes adesivas entre as células, A recirculaçlo de células linfóides não é aleatória (Haia g£ al.. m “Advanced Xmmunology*5, 3 = B. Lippincatt Co., Philadelphia, p. 14.4 - 14.5)$ os linfócitos demonstram uma preferência peio tipo de orgâo linfóide secundário no qual se vlo introduzir. Ao deslocarem—se através de um orgão linfóide secundário, os ixnfôcitas têm de se ligar, primeiro ao endotélio vascular de vénulas pós-capi1ares apropriadas, depois, têm de abrir as junções estreitas entre as células endoteliais e, por fim, têm d® migrar para o tecido subjacente. Associou—se a migração da iinfócitos em recirculação, do sangue para tecidos linfóides especificas, designada por “regresso a casa", com moléculas de •aaesão complementar, da superfície dos linfócitos e sobre as

céiuias endoteliais das vénulas endoteliais superiores. ua mesmo modo, pensa-se que a aderância de leucócitos poiimorfonucieares ao endotélio vascular seja uma ocorrincia chave no tíesenvo 1 vimento de uaia resposta inflamatória aguda, e parece ser requerida para uma resposta quimio tásc ica eficaz , bem como era certos tipos de lesões vasculares mediadas por

neutrófiios CZimmerman e Mclntyre, 1988, 3. Clin.Snvest.,81s531--337| Harlan et al., 1987, no “Leukocyte Emigration and its Sequelae“, Movat, ed. S. Karger AS, Basel, pp. 94-104, Zimmsrman et al., ibid., pp. 105-118). Quando estimulados por substâncias antagonistas específicas, os leucócitos polimorfonucleares (Tonnensen et ai. 1984,J. Clin. Invest., 74g1581-1592>, as células endoteliais (Zimmerman et al. 1985, 3. Clin. Invest., 76s2235g2246§ Bevilacque et al. J= Clin. Invest., 76s2003-2011) ou ambos (Samhle et al. 1985, Proc. MatI. Acad. Sei. U.S.A., 82s8667-8671) tornam—se adesivos; como resultado, os leucócitos poixmorfonucleares acumulam-se sobre a superfície das células endoteliais. i

Além disso, estudos com anticorpos específicos antig1icoproteínas, em pacientes com deficiências imuno1ôgicas, inoicaram que são precisos um ou mais componentes do compleno CDi6 para a eficácia da quimiotania neutrofílica e de outras funções relacionadas com a adesão (Zimmerman e Maclntyre, 1988, 3. Clin. Invest., 81 a531-557). 0 completo CD18 é idêntico â subfamília da 02 integrina ísupra).

Durante a maturação e a diferenciação, as subpopulações de ixnfòcitos localizam-se em diferentes sítios anatómicos; por exemplo, as células T imaturas localázam-se no timo. õxmuiarmente, observou—se que as células B produtoras de IgA, se iocalizavam na mucosa intestinal CParrott, 1976, Clin. Dastroenterol., 5:211-228). Em contraste, as células B produtoras tíe Ig8 iocalizam-se, fundamentalmente, nos gângiios linfáticas, dos quais é segregado Ig8 para a circulação sistémica (Parrott s aeãousa, 1966, Mature, 2l2t1316-161/). As células i parecem ser maxs abundantes na epiderme da pele do que nas mucosas tíe

5624-076—IIS —13— revestimento fCahill et ai, 1977, J. Exp. Med. 145s420-428i«

h importância fisiológica das proteínas oa adesão de leucócitos ΐsuorai ê sublinhada pela existência de uma doença genética humana, a deficiência da adeslo leucócitória C “LAD,£ p hnders-on et al, 1985, J. Infect. Pis..152s668; Arnaout et ai, 1985, Fed» Proc - , 44 s2664) . Diversos estudos têm indicado que a oefeito molecular associado à LAD resulta ou da falta da síntese da cadeia β comum, ou numa velocidade de síntese normal seguida por degradação rápida (Liowska-Brospierre gt al.1986. Eur. ã -immunol., iàs205s Diamanche at al, 1987, Eur. J. Immunol., 1/84171. Na forma grave de LfiD, nem L.FA-I, nem Mac-i» nem pl50/95 são expressos na membrana do leucócitos observaram—se níveis baixos de expressão na membrana Xeucoeitária, em pacientes que sofriam da forma moderada da doença. Isto leva a uma mobilização incompleta dos monócitos e dos leucócitos poiiffiorfonucIsares, da vasculatura para os tecidos, durante a resposta inflamatória, com as consequentes infecçSes bacterianas recorrentes (Antíerson et al. J. Infect. Dis., 1528 668; ftmatsut et al. 1985, Fed Proc..44¾26643. 1

Também se observou que os ECHRs estão associados a funçbes exteriores ao sistema imunolôgico. A perda do complexo g iícoproteíco Ilb/IIIa da superfície das plaquetas, parece resultar em funcionamento deficiente das plaquetas, numa doença genética conhecida por trombastenia do Blanzmann (Hynes, 1987, Celly 48s 549-554). Humphries st al_ (1988, u. Celi Biol«, 106 s1289-1297), observaram que os neurónios do sistema nervoso periférico eram capazes de estender nevritss a substratos contendo o dominio central de ligação de células e s região IIICS da fibronectina. Para além disso, mostramos recentemente que a formação de nervites sobre laminina chi fibronectina, pode ser inibida por anticorpos dos ECMIfte. 3 = RESONQ E0.......1

[O 0 presente invento diz respeito a um processo para a inibição da adesão de uma célula a outra, compreendendo a interferência na interacçâo entre o rscsptor da matriz

excracelular e o seu ligando»

J ú invente baseia-se na determinação da que o receptor ®4i3i aa matriz entracelular promove a adesão da linfôcitos a células endoteliais, por vía da ligação a uma sequência peptídica definida. Antes do presente invento , o ligando do receptor «40i não tinha sido identificado, nem era, também, conhecida a função ao receptor s4fll na ligação dos linfôcitos. Ao impedir a interacção entre o receptor a40i e os seus ligandos, usando anticorpos ou sequências peptídicas definidas, o presente invento possibilita, pela primeira vez, uma intervenção especifica na migração dos linfôcitos, através do endotélio vascular para os tecidos. Portanto, o presente invento possui uma utilidade clinica particular, na supressão da resposta imunolôgica; em diversas concrstizaçSss especificas do invento, pode-se inibir sistematicamente a aderência dos linfôcitos ao endotélio, ou pode-se, a1ternativamente, localizar em tecidos particulares ou áreas circunscritas» Em con formidade, o presente invento proporciona o tratamento de doenças que envolvam respostas auto--imunuiôgicas, bem como outras activaçães crónicas ou recorrentes do sistema imunológico, incluindo alergia, asma e estados inflamatórios crónicos da pele. i

3=1. ABREVIATURAS

As sequências de péptidos aqui definidas representam-se pelos símbolos dos resíduos de aminoácidos, com uma letra, como se segues A <aiamina), R (arginina), N Casparagina), D (ácido

aspártico), C (cisteina), 0 (glutamina), E (ácido glutãmico), S (glicinaj, H (histidina), I (isoleucina), . L (leucina), K í lisina), SI (metionina), F (fenilamina), P (prolina), S (serina) , T (treonina), M (triptofano), Y (tirosina), V (valina).

4= DESCRIÇÃO.. DAS FISORAS

Figura is Adesão de linfôcitos T (Holt 4), células K562-1, RD ou HT1080, à fibronectina do plasma, inibição com anticorpos monoclonais PiDé» e enpressão de aS.Si na superficie celular. —15—

/ J. ^cíV

5624-ú7ó-iiS incubaram-se células marcadas cosa SjiCr CIO5 células/ml ), com anticorpo monoclonal P1B6 (50 pg/ml > , durante 60 minutos a 4-C3 s permitxr-se que se ligasse® a superfícies plásticas revestidas com fibraneciina (20 pg/mi), na presença de -PID6 {barras a cheio) ou IgS de ratinho (barras em branco), durante 30 min CH7 1080 ou Húí ou 4 h tWolt 4 ou K562),' a 37-C. A adesão a fibronectina do plasma (pFN) exprime-se na forma das cpm de 5lCr ligados ãs superfícies plásticas, A expressão de «5(31 na superfície celulsr foi determinada por citometria de fluxo,, corando as células as suspensão com anticorpo monoclonal P1D6» 0 log da fluorescãncia do Piií6 (oarras a tracejado) ê expresso na forma do número médio de canais (0—255) acima do fundo»

Figura 2s Precipitação imunológica do receptor da fibronectina de linfócitos a partir de extractos detergentes de células HT 10890 s Molt 4 ou T (Lak) CD8+, c ron icamen te ac ti vades»

Extraíram—se células Molt 4, LAK ou HT10K>, marcadas com ijl£:3I, cora Triton X-100 a 1%, na presença ds f luoreto de fenxlmetilsulfanilo (1 mM), N-etilmalelmida (1 mM), leupeptina C1 pg/mi) e fluorofosfato de di—isopropi1o (1 mH), como inibidores aa protease» Precipitaram—se imunologicamente allquotas desses extrac tos, com anticorpos monoc lenais dirigidos contra «3(31 CP1B5J, «281 (P1H5) e «401 CP3E30)= 0s antigénios íffluno1ogIcamente precipitados, foram submetidos a geles SD8—PftSE loodecilsulfato de sódio-electroforese em gei de poliacrilamitía) a 7,5%, na ausência de 2-fHE, e foram visualizados per autorrátíiografia» Indicam—se as três bandas imunologicamente precipitadas com P3E3 de linfócitos T (setas).

Figura 3s Identificação do receptor especifico da fibronectina de linfócitos como sendo o Integrina «401,

Extrairam-se células de Jurkat marcadas na superfície com i,íi3I ? com CHAPB a 0,3%, na presença de CaCi.2 imM, f luorof osf ato de αί-isopropilo 1 mH, fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mH, W-—etilmalelmlda I mM, 1 pg/ml de leupeptina e 2 pg/ml de inibidcr tripsina de soja» A seguir, imunoprecipitaram-se allquotas dos extractos, com sobrenadante de cultura de mieloma (SP2) ou com 71 489 Õô24·—ú /8—λχΒ

-16-anticorpos monocionais P3E3, P4C2S P469 ou com P1D6 (anti-aSgl). suometeram-se os precipitados imunolôgicos a geles SS8-PASE a 8%, na ausSncia de agentes redutores e visualizaram-se por autorrâdiograria. Uo lado esquerdo, mostram—se marcadores de massas moleculares- Indicam-se as subunidades «5 e fií bera como as oandas presentes em imuno-precipitados preparados com P3E3, P4C2 e P4S9 C setas). rigura 4s Localização de a4@l e ciSpi em adesões focais sobre superfícies revestidas com fibronectina»

Tripsinarara-se células RO e deixaram-se aderir a lamelas, de vidro, silanadas e revestidas com fibronectina (20 ' pg/ml), na ausência de soro, durante 1 hora, a 37® C« No final desse período, prepararam—se as células para a localização de receptores em adesões tocaiSj como se descreve ( Procedimentos Experimentais)-rts imagens A e L* mostram adesSes focais Cset-as) - visualizadas por microscopia de interferência -de reflexo, quando células RD estão aderentes à fibronectina. A imagem B mostra a reorganização do receptar cíOssÍ do protótipo RBD de fibronectina, corado com anticorpo AB33 para as adesSes focais (setas). A imagem D, mostra a reorganização de a4gl, corada com P4B9 (FSTC), também para as aaesSes focais, quando as células RD estio aderentes è fibronectina (setas). As imagens A e B„ são do mesmo campo s as imagens C e D são do mesmo campo.

Figura 5As Estrutura dos domínios da fibronectina do plasma numano tpFN), mostrando a origem dos fragmentos utilizadas neste estudo. Bs Análise em gel SBSHPASE (10% de acrilamida), demonstrando a pureza dos fragmentos. O fragmento com.80 kDa tinha a sequência de aiaino—ácidos r-o terminal N, SD( )VPSP“R( )LQF e, portanto, começa na posição 874 da molécula da fibronectina (Kornblihtt et âi? 1985, EN30 J.„4s1755-1759)» Esse fragmento contém o domínio da ligação a células (célula) e a sequência RSBS da fibronectina (*). Os fragmentos com 58 kDa e 3B kDa tinham a sequência de amxno-ácidos do terminal N, TAGPDQTEMTIEGLQ. Ambos os fra@®sntos contêi» o domínio de ligação a Heparina, do terminal C, (Η®Ρ ΣΣ) ® resultam

—17—

ae cisões diferentes das duas cadeias da fibronectina? pela tripsina. 0 fragmento com -3S kDa compreende os primeiros 67 resiauos de aminoácido do segmento de conexlo alternativamente entrelaçado fepiáced) da fibronectina CHS CS) {Sare ia—Pardo? 1937 f Biochem» J.s 241s923—92S) e deriva? portanto? da cadeia A* 0 fragmento com 38 kDa nâo cem têm o sitio de adesão KEDV, reconhecido por células de melanoma Blé—FIO {Humphries st. al 1986? supra % Humphries st al, 1987? supra). O fragmento com 58 kDa também deriva da cadeia B da fibronectina? faltando—lhe a região 1IICS C Sare ia—Fardo et al* 1989, ERHBO 3. ? submetido a apreciação). O fragmento com 58 kDa também contém o domínio de ligação àfibrina do terminal C da fibronectina (Fib 11} s é similar aos fragmentos? relatados anteriormente, desta regilo da fibronectina do plasma (Ciick? E.M. ? e Balian? G. ? 1985?

Biochem.? 24s6685-6696). As bandas foram visualizadas através de mancha com prata.

Figura 6s Adesão de células hematopoiéticas à fibronectina do plasma e aos fragmentos tripticos purificados, com 38 kDa e 80 kDa? da fibronectina do plasma.

J

Deixaram—se aderir células K562 (eritroleucemia), ãurkat (linfócito T CD3+) e YT (linfécito T CD3-)? (109/alvéolo), ás superfícies de plástico que tinham sido ravestidas com fibronectina de plasma (pFN) intacta ou com os fragmentos tripticos purificados com 00 kDa e 38 kDa? com as concentrações indicadas? durante 2 horas, a 37®0= No final desse tempo? removeram-se as células nSío-aderen tes, por lavagem 3 s so1ubiiizaram-se as células ligadas? em SDS/MaOH e contaram-se. Ds resultados exprimem-se na forma de cpm de SACr ligado.

Figura 7s Efeito dos anticorpos monoclonais P1D6 e P4C2 contra os receptores a5@i e «401 da integrina C respectivamente)? na adesão de linfócitos T â fibronectina de plasma ípFN) intacta ou aos fragmentos tripticos purificados com 80 kDa e 38 kDa. durante 1 hora? a 4fflC. A seguir?

Incubaram-se células riolt marcadas com 5iCr, com anticorpos monoclonais P1D6 e P4C2 purificados (5Q pg/ml) ou IgS de ratinho pu rificada C 50 pg/ml)?

J

deixaram—se aderir a superfícies de plástico que tinham sido revestidas com fibronectina ds pi asma esc ta ou com os fragmentos trípticos de 80 kDa e •?o kDaf CQITê concentraç òes maitadaSf durara te 1 hora, Md final desse tempo, removeram—se as

CêiU.Í55 niâO ãOSPEÍltlSS p por J.cãVcã£jeí!S $ S5 @θίΐΛΩΧ JLXHâfâíil—SS SS CélUiSS aderentes e contaram-se os cpm de 5iCr ligado, num contador gama.

J

Exprimiram—se os resultados na forma ds I|_«STs liOSOOS bigara 8s Efeito do péptido BÍ2 da US”3L sobre a adesão ds linfôcitos T a células MOVE activ adas com IL—1S= floura 9s

í a) D x a o r a ít; a da^=- r x te·"· iJX uS s 00—i B (b) Sequência de aminoácidos das CS-1, A13 e 812.

5» DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Observou-se, em experiências concebidas para examinar a função de sopi em linfóci tos, que os linfôcitos T CÍS Ss&n^-tA© periférico SsTí repouso s cultivados {Moit 4 ou Jurkafc) « expressavam uma aíxnxdade sara a fxbronectins in d spendente d0 receptor protótipo da fibronectina ob@i. Apesar de essas células se fixarem -a superfícies rsvsstxtías com τ 1,bronsctina;i expressavam nivexs baixos ou indetectéveis ds «513 í, reconhecida peio anticorpo raonoclonal funcionalmente definido, F±Dà íWayner st al_f 1988, J. Ce11 Biol*« 107s1801-18911« Para além disso, a adesão d© linfôcitos T à fibronectina apenas ρε lOS gSf pSCCisIêRSn te inibi ,ds por péptidos pLtêS COSI tin hetíft r*" J-lJô ou. Pl^jQ H 0 ou© supsrB 0 envo iviraento CÍS OUtrOS CSCSíρtiorss ds fxbronect&na no p rocesso de adesão. tm •S ΐ ILtef ΓΠδ LΛ. V-S κ £ SòStofSCS d^r' 011 Lr-ss cê?! u 1 sc- s f i bronec tina <, tais como fibrob1astos asalitous uLi traass •formados e linfôcitos f Sl. lÍVSOuis C ?_ é 1 u 1 a^r- EA -í j pSde ser completamen te inibida po Γ P 2 Dá * is tio sugeria que os linfôcitos T do sangue periférico. sms repouso ? e células T de 1 euc em x a c lí 11 x vad as ? ξ-jjí Οχ- sTiU I sH X Ο X OS rSC setores da fibr onectina indepenoentss e funcionais. O^f a^-ord·—i cu-in o pres-ente xde^stxf icou—ss rs^—^pior fibronectina altemativo, preparando anticorpos monoclonais da

J

J que inibiam sspecifícárneote a adesão de Iinfócitos T, mas não tís outras células à fibronectina. Esse rece»tor era id&ntieo ao receptor o:4pl da integrina e mediava a iiqaçSe de Iinfócitos de sangue periférico, linhas de células- Ϊ cultivadas e células RD à fibronectina do plasma. Para além disso? os Iinfócitos 7 e?ípressavaiu uma preferencia nítida oor um fragmento tríptico, com 33 kDa, de fibronectina do plasma (Garcia Pardo et al_? 3.987, Biochem. J«, z4l = 923-920) que continha o domínixo de Heparina II e à>7 resíduos de aminoácido do segmento de ςοπεκίο do tipo III ií1ICS}F abrangendo as regiSes CS—1. CS—2 e CS—3 (definidas oor Humphries et al, 1986s J. Cell. Bioi-, 103§2637-2647 Humphries et ai,, 1987? J. Bioi» Chem», 262:6886—6392). Ds acordo com o presente invento, determinou—se que os iinfócitos 7 se fiscavam apenas ao CS—1 e que anticorpos monoclonais contra ¢:4(31 P4C2, P4B9| inibiam completamente a-adesão ds linfócito: ( P3E-3 5 I ao

J fragmento s-u>n 38 kDa e ao uS—1= lambém se deÍtírsssiFiQu que o=. iinfócitos S se finavam (com muito menor afinidade) a um sitio presente no domínio da Heparina II e que os anticorpos monoci anais contra ¢:4131 também inibiam essa interacção. Os anticorpos monocionais funcionalmente definidos contra o «401 não iniPiasni a adesão ds iinfócitos T a um fragmento críptico com SC kDa¥ de fibronectina do plasma, que continha s sequência RGB, ao passo que anticorpos contra o 5 (31 (o receptor protótipo da fibronectina) inibiam complstamente essa interseção»

Além disso, O sit© inV^H 1C Q |JX3: QllS Ο Ρ"θ£ϋ! SpílGlr* ê$i€3£ÍSXâ. S XnÍIS?“SCÇ· células endoteliais. De acordo com o anticorpos ou péptidos para bloquear < fSSpSX LO -izl f dbr ia entre Iinfócitos e as i nvento„ podem—ss usar í adesão de Iinfócitos a células endoteliais

Para efeitos ds clareza ds descrição, s não como limitação, o presente mvsnto será descrito nas subsecçães seguintes: (i)

Preparação ds anticorpos contra reesptores da matriz ®íi£-^âcaíular fEOI^IPs) § (ii)

Caracterização da interseção tOIR-ligando; Prc*cessas de intervenção na adesão de célu (iii)

í v} Réptidos e anticorpos do invento. s.i. pREPmmm de anticorpos hontra receftqres Lm MATRIZ EXTRACELOLAR i

Pode-se ssscuíar a preparação de anticorpos contra receptores da matriz es trace lu lar usando qualquer um dos processos de geração de anticorpos conhecido na arte. Como imunogénio, podem utilizar-se células intactas ou receptor da matriz extracelular purificado (ECHR). Preferívelmen te, a imunização de um hospedeiro enecuta—se utilizando imunogénio obtido tíe uma fonte Kenogénics. Os anticorpos podem ser poiiclonais ou monoclonais. Para a produção de anticorpos poiiclonais contra epitopos de um dado EHCR, podem utilizar-se diversos processos conhecidos na arte. Para a produção de anticorpos, podem imuniza?—se diversos animais hospedeiros9 através de injecção de uma proteína de ECHR ou de u.ma proteína de sintese ou. de um seu fragmento ou, alternativamentSg podem utilizar—se células intactas. Podem—sa utilizar diversas adjuvantes, para aumentar a resposta

I xmunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo, mas não se lhes limxtendo, os de Freund (completo e incompletoj, geles mxnerais, tal como hidrôsfido de alumínio. staínc ias tens-ioactivas, tais como lisolecitina, poiianiães, péptidos emulsões oleosas, (Fissurella), dinitrofenol e adjuvantes úteis, tais como BCB (bacilo Calmette—Bue po1ióis p1urônicos, hemocíartin®s da lapa humanos potencia1men te ¥~ Xs”â J S ÍjÇS a8" VQS_^sMC Γ XΧΙΓΒ parvura»

Pode—se preparar um anticorpo monoclonal para um epitopo de um ECHR, utilizando qualquer técnica que proporcione a produção de moi X S£ de anticorpo por linhas de células, cultura. Estão incluidas mas não se lhes li hibridoma, descritas originalmente por Kohler e Wxistexn

1 ς COnilnLsas, Ti fcasi f as fcêcnic&s ?” © H i. 1 £ "CS i. Γ5 f «L97S

Nature, 256 s 495—49/) e laggart e Samloff íivS3, St_aencs 219s 1228—1230)e a técnica, mais recente, do hibriduwaa da célula ti

/ ί 4e¥ 5624—076-118 humana (Kozbor et al_, 1983, Xmmunology Today, 4?72) e a técnica tjBV—hibridona íCesie et al „ 1985, Monoclonal Arstibodiss and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp» 77-96)=

Os anticorpos flionoc1onais para utxlxzação terapêutica podem ser anticorpos monoclanais humanos ou anticorpos monoclonais i s= cm· numerosas s) = us ars ticorpos por qualqu .SI5" SHS Teng et si. 1983, técnica^ conhet-iaas na arte (g»u« seno et ai

Prcc. Nati. Acad. Sei. U.S.A», SCs730857512% Kozbor et al, 1983, ímmunoiogy Today, 4s72-79? Olsson et al« 1982, íleth. Enzymol. 92ϊ3—16). Podem—se preparar moléculas de anticorpo quiméricas, que contenham um domínio de ligação ao antigénio de ratinho caos regi 8es humanas constantes (Horrxíson et si; 1984, Proc» Matl. Acad» Sei.U.8.A., 81-6851§ Takeda et al„ 1985, Nature, 3143452).

Pode—se preparar um clorse molecular de um anticorpo contra um epltopo tíe ECliR» através de técnicas conhecidas. Para construir sequências de ácido nucleico que codificam uma molécula de anticorpo monoclonal, ou uma sua região de ligação tío antigénio, pode usar—se o processo do ASM recombinante (veja—se, e»q =

Maniatis et al, 1982, Molecular Cloninq

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York),

As moléculas de anticorpo podem ser purificadas por técnicas conhecidas, e.d.« cromatografia de imunoabsorçlo ou

imunoafinidade, métodos cromatogràficos, tal como HPLC (cromatografia líquida de elevada resolução), ou uma sua combinação, etc.

Podem —se gerar fragmentos tíe anticorpo que f**j* c t»S J >τ·^ΐ 3 rj xaiõtipo da molécula, através de récnicas conn ecidas. F :D f exemplo, esses fragmentos xncluem. mas não se lhes 1imitams a fragmento FC ab'í2ί que pode ser ρ roduzitío por digestão da molécula ^hticorpo com pepsinag os fragmentos s-ab' que podem s gerados reduzindo as pontes dissulfureto do fragmento F (ab')-*, os fragmentos 2 Fab ou Fab, que podem ser gerados tratando paqa^ma e com um a o s mca retíu*cor = molécula de anticorpo com

71 489 5624—076—1IS -22~

De igual modo, podem-se identificar e ‘seleccionar anticorpos, que sejais reactivos com ECHRs produzidos pelos métodos supra» através de qualquer técnica conhecida na arte. Por exemplo, anticorpos que mostreis ligar—s® a β/ou iisunoprec i pi tem uib ECMR conhecido, que tenha sido purificado ou separado de outras proteínas, por outra forma como num gel de po1iacri1amida. AIternativamente, podem-se identificar anticorpos contra ECHRs pela sua capacidade para competirem com anticorpos contra ECHR« conhecidos anterior-mente por se ligarem aos ECHRs» Os anticorpos que se ligam a ECHRs também podem ser identificados pela sua capacidade para bloquearem uma interseção ECMR/ligando. Por exemplo, e não como limitação, pode—se verificar que as células que contenham um receptor para ECMR que se ligam â fibroneciina {que não precisa de ter sido, ele próprio, identificado cu caracteri zado, mas meramente definido funciona latente), aderem a um substrato revestido com fibronectina» Se antissoros ou um inibe sobrenadante de hibridoma mostrar que/a aderência de células ao substrato, os anticorpos contidos nos antissoros ou sobrenadanta devem reconhecer o receptor do ECMR»

Ds acordo com o invento, podem-se preparar os anticorpos çue reconheçam o receptor «401 pelos métodos delineados suara. Numa das concretizações preferidas do invento, podem-se produzir anticorpos monoclonais dirigidos contra a «401 tal como se segues devem-se imunizar ratinhos, obtidos de ratinhas RBF/DN, com cerca de 100 μ! de linfócitos T empacotadasp subsequentemente, devem-se remover os seus baços e fundi-los co® células de mieloma, por exemplo, células de mieloma NS-I/FOX-NY, como ê descrito por Oi e Nerzenoerg {1980, no "Siected Hedode Ση Cellular Imissunology*1, rlishell and Shiigi, eds., Freeman and Co., San Francisco, pp.351-373) e por Taggart e Samloff C1983, Science, 219s1229— -1230). fi seguir, podem-se seleccionar hstsrocarifías viáveis e® meio RPM1 1640 suplementado com adenina/sminopterina/timidin®. Gs hibridomas que produzem anticorpos dirigidos contra ECHRs de linfócitos, podem ser rastreados através da arisslc a superfície revestidas com fibronectina e danados por diluição liraitante. Es particular, podem-se identificar anticorpos dirigidos contra

/1 4tí¥ õó24—07é> 1 IS a4tíi, por exemplo? psiêi capscxdsde e® bloquearem s adsr§ncis iinfôcitos a substrato revestido com péptiao CS-Í3 s!J seu‘* derivados? ou. a células endoteliais. Mo entanto? os anti—®6, h^~ que reconheça® o ©481 não inibirão a ligação de célttl** α-αχ= contenha® o receptor o:Spi5 a um substrato revestido co® peptiU'-» RSÕ. A1 tsrnaiivamente, podem~se identificar anticorpos dirigido-* .·,»-. » *. φ B **”*<55^ contra ο ρ>ι··;:·i ? pela sua capacxoaoe para. 3. i ass-^-5·' anii-s4pl conhecidas competjlLivaííSttsití=; a -ligação de anticorpos (tais como P4C2 ou P4C10), ou li) se ligarem â. mesma proteína q--l-~ os anticorpos anli—cs4f31 conhecidos {e. q., num gel de proteínas? mancha de 1 sequencial). stern; ou. em experiências de imunoprecxpi-^-v®

5.2. CARACTERIZAÇÃO DA INTERACSÃQ ECMR/LISftNDO A interseção com um receptor da. membrana extracelular pooa ser caracterizada? por exemplo? e não como limitação? pelos processos sequintess xI Determinação da distribuição e da função do receptor? ii) Intervenção na ligação receptor/ligando? iii) Isolamento e caracterização química de receptor s/ou 1igando«

Estes métodos serão descritos mais completamsnis nas tr'es subsecções seguintes.

2.1. õEjfcfíMINAygO

DISTRIBUIÇÃO E DA FUNÇÃO DO RECEPTOR

De acordo com os processos do invento? pode ser determinada a distribuição da receptor utilizando qualquer um dos processos conhecidos na arte. Por exemplo? e não como limitação? podem-se identificar populações de células que contenham o ECMR, «utilizando anticorpos monoelanais dirigidos contra o ECMR de interesse. Pode-se detectar a ligação tío anticorpo ao . ECMR utilizando técnicas imuno-histoqulmicas? tais como imunofluorescência e coloração imunoperoxidásica. Aiternativamente, podem recolher-se populações de células que contenham o ECMR de interesse? utilizando técnicas de separação ae células- activadas por fiuaresctncis.

/1 489 5ó24-07è-ilS

24-

Porque parece haver una reorgan i zaçSo especifica. dos receptores de adesão da superfície das- células, em relação ás adesões focais, quando se cultivai células sobre os liganaos apropriados (Burridge et ala 1983, Asm» Rev. Cell Bioi*. 4j4B7--525}, uitt processo para caracterizar a interacçãa funcional entre um dado receptor e un ligando potencial? envolve a determinação da naneira coma o ECMR de interesse se distribui nas adesões focais formadas entre a célula e o substrato do ligando» Por exemplo? e não como limitação? pode mostrar—se que o s4Si interage com a fibronectina, cosi uma relação receptor/1 igantío? através do processo seguinte íveja—se também a secção 6«2«3.? infra}.

Devem deixar-se os linfócitos aderir a um substrato de fioronectina e, por microscopia de interferência de reflexão? podem visualizar-se as adesões focais entre células e substrato íízzard et al. 1976, J. Cell 8ci.? 21 a 129-159)e Para mostrar que? na ausência de soro? o <s4f31 se redistribui nas adesões focais-, podem usar—se anticorpos que reconheçam o *s4B±5 tais como P489 ou P4C10 ? utilizando técnicas imuno-histoquímicas padrão? s»q» f i uoro-isotiocianato = A interacção entre o ECMR e o ligando também pode ser caracterízada testando a capacidade do ECMR para aderir a uma diversidade de substratos- diferentes» Por exemplo? pode testar—ss um tipo de célula com interesse ou um ECMR com interesse? quanto á capacidade de se ligarem a substratos- que consistam da componentes da matriz extracelular purificados? tais como fibronectina? cologénio? vitronectina ou laminina. Numa concretização especifica do invento? pode mostrar-se que células que contenham o a4pl aderem á fibronectina? mas não a substratos de cologénio ou laminina? como resultado da interacção «401/fibronectina»

Noutras concretizações do invento? nas quais, ss mostra que um ECMR de interesse se liga a um ligando proteico particular? podem testar—ss substratos? que contenham subfragmentos do ligando proteico? quanto â capacidade de se ligarem a um ECMR da /1 489 5624—076—118

-25- superficie da célula, permitindo,, desse modo, a iocsiisaeSo do sitio da ligação entre o £CMR e o ligando. Numa corcretisaçã-o específica do inventa, na qual o receptor é o a481, qUe e(a verificou ligar-se à fibronectina (supra). podem tsstar-=* substratos que contenham subfragmentos de fibronectina quanto. & sua capacidade para ligarem células que contenham s4|3i, como é exemplificado na Secção 6, infra. Apesar de os linfócitos τ fixarem ao domínio de íigaç-ΐο de células, com 80 kDa. da fibronectina contendo receptor s4pi (Figura 5A), aqu**lía« demonstraram uma clara preferencia por uma região qus n5f>_ continha RBB, localizada num fragmento tríptico, com 3g ΐφ^ derivado da cadeia A (ou pesada) da fibronectina do plasma» Os linfócitos T também reconheceras s ligaram-se a um outro fragmento com 58 kDa que continha Ηερ II» No entanto o sítio 4« ligação a linfócitos com elevada afinidade, localizava-s® no fragmento com 38 kDa» Numa base molar, o fragmento com 3B kDa foi três vezes mais eficiente do que o fragmento cm 58 kDa,na mediação da adesão de linfócitos 7» Gomo se mostra na Figura 5,0, derivaram—se os fragmentos cora 38 kDa e 58 kDa, das cadeias fi e B de fibronectica do plasma, respsctivamenie. Portanto, diferem na presença ou ausência de IIICS (Kornblihtt et al» 1935, supras «Sarcia-Pardo, 1987, suora). Assim, é possível que os fragmentos com 3S kDa e 58 kDa, aqui usados, partilhem um sítio de ligação comum com uma baixa afinidade para os linfócitos T localizado- no domínio Hep II, s que estejam presentes outras sítios de adesão com elevada afinidade para linfócitos T, na única região OICS do fragmento com 38 kDa. De facto, os linfócitos T parecem reconhecer e ligar-se especificament® a CS-i, o qual tem sido definido como um sítio ds adesão com elevada afinidade para células de melanoma BI6 s células da cristã, neural das ava-=· (Humphries et al_, 1987, supras Humphries et aL, 1988, 3.

Biol., 10621289-1297§ Dufour et ai, 1988, EMBO ·!., 7s2661-26/4i. O Cs-i é uma região com heterogeneidade molecular (geraaa Pcr entrelaçamento alternativo), presente no domínio CS do tipc da cadeia A da fibronectina do plasma»

5.2,2» U

g.%0 MA LlSftÇffO REÇEPTOR/tISAMDO 7± 4S9 5624—076-118 -26-

Pode caracterizar-se melhor a relação ECMR/1igando identificando e avaliando agentes que interfiras na ligação receptor/Iigando.

Podes usar-se, por exemplo* anticorpos dirigidos contra 0¾ EC11R de interesse, para inibir a ligação receptor /1 igando. Dada a onservação da que ua tipo particular de célula adere a um dado xigando ou substrato celular, pode ser interessante identificar o ECMR envolvido na interacçSo. Pode testar-se uui painel de anticorpos monoclonais, cada um deles dirigido correra ua ECKFc diferente, quanto à capacidade para bloquear a aderência de células ao substrato» ft inibição da ligação por ua anticorpo particular sugeriria que o ECMR reconhecido pelo anticorpo estaria envolvido na interacçSo adesiva. Numa concretização especifica do invento, pode inibir—se a aderência de lintácitos a células endateliais em cultura, através de anticorpos dirigidos contra ο α4β1, nas não através de anticorpos dirigidos centra usa diversidade de outros EOIRs Cveja-se a Secção 7, abaixo), o que indica que o o:4|3i é necessário na adesão de linfácitos a células endoteliais. Adicionalmente, podem usar-se anticorpos aonoclonais para determinar a relação entre o ECNR e o substrato do ligando»

Como se exeeplifica na secção- 6, infra, a adesão de linfácitos T aos fragmentos com 30 e 58 kDa pode ãsr completamente inibida por anticorpos monoclonais, funeionalmente definidos, contra ο «4gl» Para além disso, a adesão de linfácitos T ás superfícies revestidas coa CS-1 (conjugado coe Ig8), também pode ser completamente inibida por P4C2, P3E3 ou P4S9* Estes dados, mostram claramente que o s4pi é, nos linfácitos T, o receptor do CS-1» Em contraste, estes anticorpos não conssgueo inibir a adesão de células T ao fragmento com 80 kDa que contém a sequência protótipo de adesão arg-gli-asp (RSD)» A adesão de células T ao fragmento com 80 kDa pode ser completamente inibida por um anticorpo eonoclonal contra (P1D6) ou par RSDS. 0 P1D6 e o RSDS não conseguem inibir a adesão de linfácitos T aos fragmentos co® 3-8 e 58 kDa ou ao CS—i» Em conjunto, estes dadas mostram que o sc4pl funciorta como receptor do domínio de adesão do terminal carboxilo, do receptor da fibronectina do plasma, para 7 i 489 5ó24~U / êt~'JL Ifcs

„27-

sequências ds adesão alternativas em IIICS (CS—1} eP possive 1 ínente, sus Hep II»

Noutras concretizações do invento, pode caracterizar-ss a relação ECHR/ligando por determinação da estrutura do ligando» Era particular, pode avaliar-se a capacidade de agentes para competir®® com o ligando na interseção ECHR/ligsrida = Por exemplo, quando o ligando for una proteína, pode® ser testados diversos fragmentos da proteína quanto â sua capacidade para inibirem competitivamente a ligação receptor/1igando. Numa concretização particular do invento, na qual se observa que os linfócitos ss ligam quer a células endoteliais, quer á fifcronect ina , podem testar-se fragmentos peptidicos de fibronectina quanto à capacidade para inibirem competitivamente a ligação de linfócitos ao substrato de células endoteliais. Como se exemplifica na Secção 7, infra» o péptido CS-í ®, em particular, o péptido ElLJDVPST, é capaz de inibir competi tivamen te a ligação de linfócitos à fibronectina e às células endoteliais, localizando--se, desse modo, o sitio de ligação do ligando numa região idêntica ou homóloga a EILDVPST»

5.3. PROCESSOS DE IHTERVEHggQ Nft ADESÃO QfeLULftR

De acordo com o invento, a adesão de uma célula a outra pode ser inibida intervindo sobre a interacçlo ECMR/1igando. Numa concretização particular do invento, pode inibi*—se a ligação de linfócitos a células endoteliais, interferindo na ligação do «4il ao seu ligando. Isto pode conseguir-se utilizando anticorpos dirigidos contra o ECMR ou, al temati vamen te, contra o seu ligando (podem gerar-se anticorpos contra o ligando de uma maneira análoga à que se descreveu na Secção 5.1), Em outras concretizações do invento, podem usar-se péptidos que inibam a ligação do s4|3I ao seu ligando que por sua vez, inibem a aderência de linfócitos às células endoteliais.

Numa concretização específica do invento, pode usar—se um anticorpo anti-«4õl ou um seu fragmento ou derivado, para inibir a ligação de linfócitos, que contenham receptores <x4$i, às células vasculares endoteliais» Em concretizações preferidas, o

ϊί 489 5824—076—iiS

anticorpo P4C2 («4| incluindo é um anticorpo monoclonal , Si) ou P4C10 Cpii, ou os seus anticorpos quiméricos com as em particular o fragmentos ou. mesmas sspscitxc anticorpo derivados, idades de ligação.

Noutras concretizações do invento, podem usar para inibir a ligação do linfócitos, que contenham receptores «4131, às células vasculares endoteliais. Numa concretização preferida, o péptido compreende pelo menos uma porção da sequência da região variável IlíCS da fihronectina. Numa concretização mais preferida? o péptido compreenda pelo manos uma porção do péptido CS-1, como ê definido por Humphries et a!. ç1987, ã. Biol. C hem., 262s6886—8892)« que é aqui inc :orpor s o n-s sua totalidade por referência. ou um péptido que 1hs é su bstanc ia1mente homólogo. Numa concretização ainda m&is preferida, o pé ptido compreense pelo menos uma porção da sequência EILDVPST, ou uma sequência que lhe é substancialmente homóloga.

5.4. UTILIDADE DO INVENTO

Sg sOtitlSX lei

De acordo com o Invento, pode inibir—se a aderência de uma célula a outra interferindo na ligação entre o ECMR e o seu ligando. Em concretizações particulares do invento, pode inibir-se a aderência ds linfocitos a células endozeliais, interferindo na ligaç-So do o:4pi dos linfócitos ao seu ligando, na superfície da célula endotelial. Pe acordo com o invento, prevê—se a interseção de outros ECMRs com 1igandos ds células endoteliais, e a inibição da adesão dessas células ao endotélio, interferindo na interaeção ECMR/célula endotelial. For exemplo, a adesão de macrófagos ao endotélio também pode ser inibida -através de intervenção na interaeção do ECMR do maerófago/célul o

Do mesmo modo., as células de melanoma, que também reconhecem péptido CS—i, podem ser inibidas de se metastizarem e ds entrarem nos tecidos, usando os pêptidos ou anticorpos do invento. impedimento do tilar s para rtes. proporciona um o presente

Portanto, o processo do invento é útil no egresso de linfócitos, através do endotélio vasc tecidos. Em conformidade, o presente invento

J

/ ί n-sSV

Dá324-u?'í3-i iS

2ύ— oracesso αε suprimir a resposta xmunoiogxca. sim pacientes nuíã-sncs nus necessitem os tal tratamento. £m concretizações particulares„ o presente inventa proporciona processos oe tratamento as aoenças associsoas com actxvação crónxtza. ou recorrente do sistema imunoiógico* inciuinao doenças vasculares do coiagénia e outras aoenças auto-imuneiógxcas (tais tomo lúpus eritsaatoso sistémico e artrite reumatóide)* asclsross múltipla* asma e aisrqia, para nomear apenas algumas, ú presente invento também proporcxona processos de tratamento de acfcivações rslativamente

agudas do sistema imunológico* em pacientes que necessitem oe tal trataíESTito, incluindo, por exemplo e nSa como limitação, doença enxerto versus/hospedeiro* rejeição de aloenxertos e reacção a t ran 3 fu 5 £ es *

Dependendo da natureza do distúrbio do paciente * pode ser desejável inibir sistemicamente a migração os linfócitos para os tecidos ou, em a1ternativa, localmente. Por exemplo* ss aoenças que envolvam sistemas de orgãos máitiples, tal como na lúpus sri tema toso sistemático , pode ser desejável inicir

J sistemicamente a adesão de linfócitos. durante um agravamento clínxco. No entanto3 numa dermatite de contacto localizada. poda ser preferível restringir a migração de linfócitos apenas aos tecidos afestados» O controlo da utilização sistémica versus localizada dos processos do presente invento* pode conseguir—se modificando as composições dos anticorpos ou dos péptidos adm in istrados * ou alterando a estrutura desses agentes ou as suas composições farmacológicas. Por exemplo* os anticorpos ou péptidos do invento podem ser administrados por qualquer via* incluindo a subcutânea* a intramuscu1ar, a intravascular* a intravenosa, a inira—arterial * a intranasal *a orai * a intr&peritoneal* a rectal* a infcratraoueaΪ ou a intraiecal. Contudo·, para se obter inibição local da adesão de linfócitos ao endotêiio* pode ser desejável administrar os anticorpos ou péptidos do invento subcutansatsnte ou xn tramuscu1arraen te * em quantidades tsrapfuticas e num veículo farmacológico adequado. Em alternativa* para se obter a iníoição sistemática da adesão de linfócitos* pode ser desejável cf Λ /1. -30- 3to24—Ú7é>—i itó administrar os anticorpos ou péptides intravenosamente.

Em diversas concretizações do invento, é vantajoso utilizar um veiculo farmacológica que facilite a disseminação aos anticorpos. péptidosg etc. do invento. Por exemplo, quando cs anticorpos, péptidos, etc. são para ser disseminados na pele i'e.a.. no tratamento de situações inflamatôrias crónicas dermatológicas), pode ser vantajoso um veiculo farmacológico que ajuae a penetração na cutícula, epiderme e derme. & . disseminação dos péptides ou anticorpos do invenço tamoém pode ser controlada alterando a semi-vida do péptido ou anticorpo ou a sua semi-vida eficaz = Por exemplo, os péptides do envento podem ter uma semi-vida relativamente curtas se se admi -mstrarem esses péptidos num implante de libertação sustida , a area de tecido adjacente ao implante será exposta ao péptido (e.o.. uma articulação num paciente com artrite reumatóide), embora o péptido possa degradar—se antes de atingir tecidos mais distantes.

Ai ternativamente, se se raodificar o péptido para se obter uma semi-vida mais longa, através de modificações químicas que produzam derivados, incluindo, mas não se Ibes limitando, substi tuíções de aminoácidos, g1icosiaçSes, substituição de vsnantes enantioméricas (i.e., enantiómeros D de aminoácidos constituintes), adições, etc., é mais provável que o péptido seja cocaimente distribuído com níveis mantidos. Como exemplos adicionais, pode modificar-se o terminal N ou o terminal C dos péptidos, resultando em maior estabilidade.

Noucras concretizações, podem conjugar-se os anticorpos ou péptidos do invento com anticorpos ou outros ligandoe que possam dirigir os anticorpos ou péptidos a tecidos específicos. Por exemplo, e não como limitação, podem conjugar-se péptidos do invento com anticorpos que t@m por alvo células enaoteliais. Para além disso, podem produzir-se anticorpos que imitem o ECMR s que, por isso5 se prendam aos ligandos das células endoteliais, oioqueando a adesão de linfócitos»

/ í 4S9 Sõ24—076—i IS

-31-

5.5« PÉPTIDOS E ANTICORPOS 00 INVENTO

Os péptidos da inventa inclusa todas os péptidos qus sejam capazes de interactuar cosi o ECHR ám interesse» isíuma concretização especifica do invento, podem usar—se todos os péptidos que sejam capazes de interactuar com o racsptor 5431* para inioir a ligação de linfócitos ao endotéiic. D® preferência, esses péptidos devem mostrar que inibem a adesão de linfócitos ao endotélio, in vifcro» antes da utilização in vivo» Numa concretização preferida da invento, os péptidos compreendem peio mersos uma porção da região 3XICS da fibronectina» Numa concretização mais preferida, os péptidos compreendem peio menos uma porção da sequência peptádic® do CS-i,ou uma sequência substancialmsnte homóloga è sequência do CS-1, como se apresenta na Figura 9(a) e (b) - Numa concretização ainda sisais preferida, os péptidos oo invento compreendem pelo menos uma porção da sequência EILDvPST ou uma sequência peptidica que lhe seja substancia1raente homóloga. “ Subefcanc ia l mente homólogo** deve ser interpretado cose significando que os péptidos do invento podem ser alterações da sequência especificada, tais que um ou mais aminoácidos seja substituído por um aminoácido funcionamento equivalente na sequência peptidica, produzindo assim uma alteração silenciosa, ror exemplo, podem substituir—se um ou mais resáduos / aminoácido, centro da sequência, por outro .aminoácido de polaridade similar, que actue como equivalente funcional. Ge substitutos de um aiRi-noáczdo dentro da sequência, podem seleccionar—se de outros membros da classe á qual pertence o aminoácido. Por exemplo, os aminoácidos não-polares í hidrofóbicos), incluem a alanina, a leucina, a isoleucina, a valina, a prolina, a fersilanina, o triptfano e a metionxna. Os aminoácidos polares neutras, incluem a glicina, a serina, a treonina, a cisteina, a tirosina, a aspa-raçina e· a glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente i oásxcos) incluem a argirsina, a iisina e a histidina. Os aminoa— cidos carregados negativamente Cácidos) incluem o ácido «sp&rtico e o ácido glutêmico = Além disso, como se discutiu na Secção 5.3, c presente invento também diz respeito a derivados dos péptidos supramenctonados.

J

.-liásssesSBai 7i 4B3 3^24-07^-113 -32

Os anticorpos do invento? produzidos e definidos cosio se aescreve® suara . incluem anticorpos ®onoc locais ;í be© coso policionazs, e seus fragmentos e derivados» incluindo os fragmentos Fiat')2? Fab' s Fab. 6« EXBELOg e am&c-mmmím do feceptor da

ADE8S0 DE LINFáCITOS, PARA OM.DOMÍNIO.....êLTERSMfiTlVO DE

OL7^£^0-...-SF-J^LyEft§g_1MLJÕÍ.BEQMeCTIMA ΏΟ FLASM.A i

As experitncias seguintes descreve® u® nove receptor da fibronectina que parece ser idêntico ao receptor da intsgrina c4Sl iHemler et ai_5 19S7s supra)« expresso preferencialmenie por células hematopoiéfcicas nucleadas. A identificação oo <s43i cosia um receptor especifico da fibronectina baseou-se (i) na inibição aa adesão ds células à fibronectina, por anticorpos emocionais (P4C2, P3E3 e P4B9), e CiiJ na reorganização e concentração especificas de cc431 em adesões focais dependentes da fibronectina. Estas verificações, sugere® que o a4pl e o o receptor protótipo da fibronectina, funcionam em conjunto como. mediadores primários da atíesSo de células è fibronectina« i

6-i. MATERIAIS E PROCESSOS 6-i-i. SEâSENTES

0 fiuoreto de fenilmetilsulfonilo, a n-etilmalelmida, a leupeptina, o f luorofosf ato di-isopropi 1 ico, o 2—msrcaptcetsnol a albumina do soro bovino { “B3A") ,· o Triton X—100, a fi-agaross para proteínas, o inibidor tripsina de soja e a VS protease {de õtapbvíococcus aursas, estirpe VS, tipo XVII de protease), foram adquiridas à Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). A iactoperoxidase e a giucose—oxidase fora® adquiridas á Calbicche® tSan Diego, CA). A 7PCK—tripsina foi adquirida à Csoper Bicmeaical, Mal vem, PA. As IgB e igM anfei-ratinho (cabra) conjugadas com fiuorescelna (cadeias H e Lj ou as xgS e IgM anta-coelho (cabrai conjugados com rodaãiina Ccadeias ri e L) fora© obtidas na Tago, Inc. • (líur lingame, CA) . Adquiriu—se a estrepâvidxna conjugada com R-fieoeritrina na Biomeda {Foster City, CA) . Obteve—se o antissoro Xgâ (H+L) ar* ti-ratίη ή o aa /X 4-89 Õé24-ú7à—i18 -33— cselho, na Cappsl (Cooper Biomedical , halvern, PA). Adquiriu-se o cromado tíe sódio-3^Cr na Engiand íMuclear, O fax adquirido na Amersham CArlingtors Hts., IL)« A in ter1euquina-2 recombinante humana CÍL-2.J foi oferta generosa de Sr» B= Llrdal limmunex Corp», Seattie, Mfii = Adquiriu-s® a laminina à õoi iaberative Research, Inc» (Bedford, MA) e a fibronectina as plasma purificada e o coiogénxo dos tipos 1 s 111, foram preparados como descrito anteriormente CWayner, E. A« e Cárter, W»i3», 1987, supra s «aynsr et ajL, 1988, supra)»

J -5*1=2=

As células RS {rabdomiossarcoma humano) s HTiOSO f ibrossarcoraa humano), obtiveram—ss da American Typs Cuiture Coliection CRockvills, MB). As células mononucleares do sangue periférico (PBKC), as plaquetas e populações de granulõcitos da aadores humanos normais, fora® preparadas coíbo descrito (Kunicki et ai., 1988, supras Wayner et al., Í988, supra). As células da sangue periférico de pacientes com leucemia linfocítioa aguda, de iinfocitos granulares grandes (LSL) ou mielogénica, fora® obtidas na Dr« Ϊ» Bernstein e na Dr. T» Loughran CFrsd Hufcchinson Câncer Research Center)» As células assassinas humanas activadas pela ixnraquina (LAK) , £500 U/ml IL—2) e a linha de células d® )

iinfocitos T monoclonais citotóxicos (C7L) humanos especificas tís HLA B7, C1C4, foram preparadas de acordo CCTL) co® protocolos padrão (Srimm st ai. . , 1982, J = Exp» iled., 155g 1923-1941 % Slasebroofc, A. L» e Fitch, F. lnj., 1980, J« Exp» Med», 151s87è~ —8951 Brooks, 1983«, Madure, 305§155—158 § Mayner5 E = A, e Brooks, C. S., 1984, J. immunol., 132§2135-21421 Wayner, E» A» s Cárter, W. 8-, 1987, J» Cell Biol», 105§1873-1884)» A linha de células tíe Iinfocitos 38 £BLCL), transformados por EBV, ST-1, procedeu do Paço do dador utilizado na produção da linha CIC4 dos CTL» Todas as outras linhas ds células e condições de cultura ds células foram conforme anteriormente descritas (Wayner, £» A» a Cárter. W. 8., 1987, suprag Wayner et al, 1988, supra),

6=1,3, AWT1CQRP0S

Usou-se um anticorpo policlanai de ccslho, AB33, preparado /X 409 tjo24-ú'/ó-J. l'ã

-34- contra o domínio citoplásmico do receptor «5BI da fibronectina, para oetactar «531 ess adesdes focais. Os anticorpos monoclonaas hIbS, contra a subunidade pi da integrirta comi <Hynes, 0. , 1987, supraI da família VLA de receptores (Hemler, Μ. E. , 1988,, suorai , s B5-S10 contra a subunidade ® da VLA 4· f Hess ler ei ai . 1987, suorai , fora® obtidos do Br = Hartirs Hemler, do Dana--Fardsr Câncer Irsst», Boston, HA. Os anticorpos monaclonais contra receptores «381 (PiB5), «2pl (FiH3j s «581 ÇPIDo), aa integrina, já foram descritas s forais desenvolvidos neste isoorstório» Ο P1H5 a o PID6· inibem a adesão de fibroblastos e as plaquetas ao cologènio e a substratos revestidos coo fibro-nectina, respectivamente (Wayner, E.A. s Cárter, W« S, 3 1937, supras Kunicki et al., 19tá8, suprap Wayner et al_, ivsJfeu suora), ús anticorpos monaclonais contra os receptorss da aáesSo de iinfõciics, foram produzidos pelos métodos de Qi s Herzenbsrg (ui, V.T. e Herzenberg, L.A., 1980, Xmmunoglobulin protíucinç hybrid cell lines. Hos Selected Metheds in Csllular Imflmnoloqy.

SdLs_sur_B.B» Hishell a B.M. Shiigi» M.H. Freeman e Co.. San

Francisco. pq» 351-375) e Taggart e Saraloff (Taggart, e

Samioff, I.H., 1903, Science, 219, 1228-1230} como descrito i^aynar s Cárter, 19875 ^layner st al., 19S8) . Removeram-se paços de ratinhos RBF/DN imunizados com 100 μΐ de Iinfõcitos T empacotados, s fundiram-se com células de mieloma NS-i/FGX—NY. Se i ecc iansras-se lieterocariSes viáveis em seio RPHI 1640 suplementado com aden ina/aminopter ina/1 ieiid ina (Taggart s

Eamloff, 1983)= Rastrearam-se os hibridomas produtores de um anticorpo dirigido contra receptorss da adesão de Iinfõcitos, através de inibição especificai da adesão de linfócitos as superfícies revestidas com fibroneotina e clanaram-se por diluição limitante.

Apesar da ο A1A3 (Hemler et al, 1987=, J. 3ioi. Che®., 2é253300-33091 reagir especificamente com a subunidade 31 dos receprores de integrina, e da ter sida relatada que inibe a adesào de células CTakeda et al. 1983, 8= Cell» Biochem, nunca foi observado que esse reagente inibisse a 37s385s393), / X ΗΒΥ 5624—076—118

-35- aaesào ae iinfócitos a nenhuma superfície, Portanto, protíuziu-ss ura anucorso raonoclonal funcionalraente definido anti-il, P4C 10, utilizando as técnicas anteriorraente descritas Csuara) e rastreando a inibição da adesão de células a múltiplos ligandos. Mostrou—se que o P4CÍ0 inibe a adesão de células às superfícies revertidas com fibronectina, CS-i, cologénio e lasinins, s que reage com pi. através de critérios bioquímicos padrão.

6.1.4. IMlBiggQ Dh ADESÃO DE CfÈLOLAS A F1BRONECT1 Nft INTACTA EA FRAOHENTOS DE_FIBRONECTINA

Identi f icaram-se anticorpos que alterariam a adesão da ceiuias à fibronectina do plasma purificado, fragmentos trípticos e péptidos CS* como descrito anteriormente CHayner e Cárter, 1987). Resumi d asnente, revestiram—se placas de sstirsno virgens cora 48 alvéolos, cora fibronectina de plasma humano £5 μΐ/ml). Bioquearam-se as placas, cora PBS supleraentado cora 10 rag/ml de BSA aesnaturado por aqueciraento (HBSA). Marcaram—se os linfócizos T ou as células HT108Ô cora Nag s^Cr04 £50 μ Ci/atl, durante 2-4 noras), lavarara—se, e incubaran-se 5 X 10^ células NTI0S0 ou céiuias T cultivadas ou 5 X 10iCí PBL/alvéolo, cora sobrenadaites de cultura de hibridoraa (diluição is2 era PBS· supleraentado cora 1 mg/ral de BSA desnaturado por aqueciraento), ou com sobrenadante de cultura de células de raieloraa, de controlo, durante 15 minutos, a temperatura ambiente. Deixaram-se as células aderir as superfieies revestidas cora proteína, na presença dos soorenadantes de hibridoraa, durante 15—30 rainutos (HT10S0), ou durante 2—4 horas (linfócitos), a 37®C. Removeram-se as células não aderentes, lavando com PBS, e dissoiveram-se as células aderentes sm SDS/rlsOH, contando-se os cpm de 5iCr ligado num contador gama. 6.1.5. IHUNQFRECIPITAçaq E IMUNOeBECjPITâggO..-SEQUENCIAL,, MAFEAMENTO FEPTfDICO......DA.Vg-EBBIi&SE. pLECTRgFOP^l

ESE EM BEL DE POLIACR ΣLAMIDA

SÍS

Marcou-se a superfície de células viáveis cora iodo 125, coiro descrito ífeJsynsr e Cárter, 1987), seguindo-se extracção cora detergente Triton X—100 a 1%, v/v, ou detergente CHAPS a 0,3%,

7 i 4S·?· ifc>24—ύ7é>—i IS

-36-

J saiuçãa salina tamponad-a com fosfato 50 mM, pH 7,,2. Em alguns casos? adicionou-se CaCl2 1 mM ao tampão de lisa» Como inibidores ca protease, uti1isaram-se fluoreto de f en i ϊmeti1su1fona1 i mH, h-etiImaleímida imH ieupsptina I μΐ/ml e inibidor de tripsina da soja i pg/mi. Executou-se a imunoprecipitação e as imunoprec ± pi taç Ses sequenciais exactamente canfaniss descrito anteriormente (feSayner e Cárter, 1987, supra). â análise peotidics seguiu-se aos proced imen tos básicos de C levei and et, aj. (1977, í. óiol Chem., 232ã1102-1106I, com modificações conforme descrito *i»ayner e Cárter, 1987). Prepararam-se placas da gel de poiiacrilamida, contendo tíodecilsulfato de sódio (geles SOS-FABE), seguindo o sistema básico de preparação de geles de Laemm.li (1970, Nature, 227s 680-685).

6.1.6. PREPARAÇÃO PE FRAGMENTOS, TRIPTICOS DE FIBROIMSCTI NA DE PLASMA HUMftWO E SÍNTESE DE PéPTIDOB CS i A fibronectina da plasma humano foi uma oferta generosa aos Drs. rlorowits e R. Schulman (Νβββ York Blood Center, NY) . Digeriu-se fibronectina com tripsina TPCK, durante 90 min, a 37fcC« e fraccionou-se o digerido por cromatografia de afinidade s permuta tónica, como descrito an ter iormen te (8arc ia-Pardo et -ai., 1987, Biochem. J. 9 241s923-928¾ Barcia-Pardo et, al.„ 1989, Εκρ. Ce II Res, 181s 426-431). Sin teti saram-se dois péptidas parciaimente sobreponlvsis9 que abrangiam os 48 residuos iniciais oa região 71103 da fibronectina humana (CS-i e CS-2 s acoplaram-se a lg8 de coelho, como descrito (Humphries et al., 1986, e Humphries et al.. 1987, a. Biol Chem. 262s6886-68923.

6.1.7. ANÁLISE POR FLUORESCÊNCIA DA EXPRESSÃO 50 RECEPTOR

Analisou-se a exprasslo de ECNRs em células em suspensão, através de citometria de fluxo de uma ou duas cores, num separador de células de duplo laser (Coulter, Hialeah, FL). Determinou-se a fluorescSncia numa escala logarítmica de 3 décadas” (decade) e exprimiu-se a intensidade de f luoresc&ncia (iog IF.í na forma do número de canais médio (0-255). Determinou--se a fiuorescõncia do fundo para um controlo não-imune, negativo a IgS de ratinho, em cada população de células, e subtraiu-se.

/1 4b'-?' 5624—07'6—I íB

•37- 'i rxpsxnaram-se as células aderentes e deixaram-se recuperar ourar:te x5 minutos, a 37® G, na presença de soro, antes da utilização na citometria de fluxo. Para as mediçSes de fluorescência de uma ou duas cores, incubarara-se 10a células em suspensão, durante 30 minutos, com IgS de cabra purificada eia 3— —áepharose para proteínas (20 pg/ml) e, a seguir, com anticorpos oe primeira fase, a 4®C, durante 60 minutos, lavaram-se em solução salina equilibrada de Hanks (“Hanks* Balanced Bali soiucion") - contendo 10 mg/ml de HBSA e 0,02% de az ida de sódio (“Hanks/BSA/SA”), e incubaram-se com IgS de coelho anti-ratinho conjugada com FITC, durante 60 minutos, a 43C, em Hanks/3SA/3A» LavarsíB-se e fixaram-se em paraformaldeído frio, a 2%, (preparado de frasco) em PBS. Para a fluorescfncia de duas cores, adicionou-se anticorpo monoclonal biotinado às células coradas com FíTC e fixadas, até uma concentração final de 1 pg/ml em Hanks/BSA/SA, e incubou-se durante 60 min a 4®C« A fixação prévia com paraformaldeído a 2% teve um efeito pequeno na expressão dos receptores de integrina de linfócitos. Lavaram—se as células fixadas e incubaram-ss em 0,5 ml de Hanks/3SA/SA contendo estreptavidina conjugada com ficoeritrina (Bionetics), numa diluição de 1/50, durante 30 min», a 4®C« Por fim, lavaram—s® as células coradas e fixaram—se de novo em parafarma1deído a 2%, em PÔS, mantendo-se depois a 4®C, no secura, par® análise no citometro de fluxo EPICS»

6.Í.S. L.0CAL 1ZAÇKO DE RECEPTORES Eli ADESSEB FOCAIS

Tripsinaram—se células aderentes, lavaram—se em RPS1I suplementado com i pg/mi de BSA mais 100 ug/ml de inibidor tripsina de soja e deixaram—se aderir a lamelas de cobertura, de vidro, lavadas com ácido e silanadas, revestidas com fibronsctina, iamxnxna ou colagénxo (20 pg/mi), na ausência de soro, surants 1-4 horas, como descrito (Cárter e Wayner, artigo em preparação). (mo fxnal da incubação, removeram-se as células nfio aderentes e fixaram-se as células aderentes em cacotíilafco de sódio 100 aM, sacarose 100 mM, CaClg 4,5 mH, formal deído a 2%, durante 20 min. Permeabxixzaram-se com Triton X-100 a 0,5%, durante 5 minutos e, a seguxr lavaram-se e bloquearam-se com soro de cabra, a 25%, em V1 409 oe»£4—Ο 76—11 β

-30- PBB . Coraram-se as células permeabiiizadas, cem anticorpos de receptores especificas <60 minutas, ã temperatura ambiente) ? iavaram-se e incubarass-se, ou cora iaS anti-ratinho de cabra conjugado cosi FITC ou com IgB antá-coelho de cabra conjugado cs-i' roaamina (45 minutos, á temperatura ambiente)e iavaram-se de novo. inverteram-se as 'lamelas, de cobertura sobre lâminas de vidro para microscópio, para microscopia de fluorescência e de interferência de reflexão (”IRM") como descrito CIzzard, S.C. e Lochner, L.R., 1976? âu Celi. Sei., 21, 129-159). 6-1-9 CQLGRftÇgQ S0 TECIDO. ueterminou-se a distribuição dos receptores de integrina em tecidos,por microscopia de fluorescência ds secções criostáticas. Prepararam—se secçSes cristáticas (6 μιη) de amostras de peie, amagdaias ou tumores, humanas embebidas em meio OCY, depois ds congelação rápida em isopentano/azoto liquido. Finaram-se todas as secções em paraformaldeido a 4%, em PÍBS, antes de se incabars® com anticorpos primários e anticorpos secundários fluorescenfces, conforme descrito (Cárter e Nayner, 1988, 3. Bioi, Che®., 26¾¾4193-4201). Nas experiências de controlo não se detectou nenhuma fΪuorescência da rodamina, utilizando os filtros da fiuoresceina, ou vice—versa.

6.2. RESULTADOS 6-2.1. IDENTIFI.CftÇÃD DE UN RECEPT08 BE FIBRONECTINA ALTERNATIVO.

Células de linfócitos T Criolt 4), de X562, ds RD

(raodomiossarcoma) e de HT10B0 Cfibrossarcoraa) cultivadas e FBI. derivados de fresco (não apresentados), aderiram a superfícies revestidas com fibronectina (Figura isbarras a branco). No encanto, as células íioit 4 e RD expressaram níveis baixos ou intíerectáveis do receptor protótipo de fibronectina iaSúi da ancegrina), reconhecido pelo anticorpo monoclonal P1D6 (Figura is narras a tracejado). Consistente com isto, a adesão de células «oit 4 e RD a fibronectina não pôde ser compIetaments inibida pelo P1D6 (Figura is barras a cheio). A1 tem&tivasssnte, a adesão ds ceiuias, ã fibronectina, que expressara® «sõSI em qualidade (HT

/ ί. 489 5*24—U/£>—i ÍS

-39-xOfeu e K5é>2ji, pôde ser inxbida efxcazmente peio PIDé^ Para ale® disso, o péptido PSBSj de síntese, não inibiu cGmp 1 etamente a aoesào de ixnfócitos T à fibronectina do plasma C 30—70% para as células ftolt 4 ou Jurkat versus 80-90% para fihroblastos a 100% para células K562—i)° Em conjunto, estes dados sugeriam que aigumas células, tal como os Iinfócitos T, expressavam outros receotores da adesão á fibronectina, que não o <s5fll.

Tentamos identificar outros receptores de fibronectina

J putatxvos preparando anticorpos monoclonais contra Iinfócitos T cultivados, e rastrsando-os quanto ã sua capacidade d® inibirem especifícamente a adesão de Iinfócitos, mas não de fibroblastos, a superfícies revertidas com fibronectína=, Usando este protocolo, xdencifxcaram-se diversos anticorpos monoclonais CP4C2, P3E3, 1*409), que inibiam a adesão de Iinfócitos T cultivados mas nãc de células HTlOSO, & fibronectina (Tabela 3). i -40- V j. íj-ãv 5624-076-118

TABELA III INIBIÇSO ESPECÍFICA DA ADESSO DE LINFÓCÍTOS a flBmUECJim DO PLASHAs PELOS ANTICORPOS nONOCLONAIB P3E3, P4C2 DE PPG49 ADESÃO DE FIBRONECT11¾A C% DO CONTROLO) CÉLULAS %5ϋ““ PIDé <«5^1> P4C2 P4B9 Pèi_ 100% 43% 38% 10% 52% uurRât 100% 22% 33% 12% 4S% TlQlt 4 100% 18% 12% 8% 39% 5%

HTiOSO 100¾ 98% 93% 104% / X θ£»24-ϋ/6—i a6

-41- A imuno-prscipitaçâo a partir as ixsados coa detergente iriton ã-íuu? preparados cu» células P3L, mio apresentadasj, ftoit 4 ou HTiOSO (Figura 2) , mareadas à superfície cc® i:i5i revelou que os anticorpos monoclonais iniPiáores Ceados apresentados para ο P3E3) reagias cose usa única proteína presente em extractos oe iinfócitos, que migrava a M 150.000 (pi50j, na presença (não apresentado) ou na ausência (Figura 2) de agente reautor. Sob estas condiçSes de precipitação imunolégica, a pi 50 carecia de u®a estrutura subunitária a—fs autêntica e nlo migrou ne<n com a subunxdade e nsa cose a subunidaas β dos rsceptores s2Si ou s3gi Pa inteqrina (Figura 2). O antigénio imuno-precipitado de eKtractos em detergente Triton X-100, preparados co® CTL (não apresentado) ou Iinfócitos T assassinos (LAK) CDS-v , cronieamente activaaos, continha, para além da pl50, quantidades relativamente grandes de duas proteínas sais pequenas que ®igrara® a H S©„00© & M 70.000, na presença (nlo apresentado) ou na ausfneia tíe agente redutor. A sequenciaçSo peptídiea co® protease VB, revelou que as oSG e p7© era® fragmentos proieo! í ticos da pi 50 Críâo apresentado), Estas formas, com massas moleculares mais baiKas, pudera® ser imuno-prec i pi tadas a partir de células T cronicamente activadas, mesno quando os extractos e® detergente fora® preparados na presença de múltiplos inibidores cia protease C legenda da Figura 2i« A pSO s a p7© estava® virfcualmen-te ausentes da extractos preparados com FBL e® repouso, leucemias cultivadas de células T (Molt 4, Jurkat) ou B e células PíDv

As caractaristicas bioquímicas da pi50 sugeriam que petóia estar relacionada co® o antigénio da VLA 4 descrito por He®ler i. hem ler at ai, 1987)= Isto foi confirmado por imune-precipitação sequencial (não apresentada) co® u® anticorpo monocionai específico da VLA 4, ο B3-610. Provou-se que a pio© era uma suounidade s da super-fa®í1ia da integrina, através da sua associação co® §1, quando se levara® a cabo imuno-precipitaçôes de iinfócitos T, marcados à superfície co® 5 apôs soiubiiisação co® detergente CHAPS (0,3%), na presença de Ca'2'"1' i ®h' (Figura 3). Sob estas condiçSes, o «4 foi precipitado coo fBi, na forma de um heterodíeero. A identidade de &í foi confirmada

J

71 4ÔY ÔÓ24-07ó—ii8 -42- i

I por sequenciaçlo peptidics co® V8 protease (nlc apresentadaj. itetrau-se que o heterodíaera «4gi, xmuna-precipitado a partir as íxfifdcitos T coai as anticorpos «emocionais inibidores fP3E3? P4C2 e P4S9i, era distinto do receptor protótipo da fibronectins, <2Õ!íi? imano—precipitada co® PIB&, por três critérios» i> 4e quantidades relativas de a4@i a ®5PIg presentes e® extraotos ce ixnfecitos T e® detergente, era® distintas, estando prassntss níveis mais elevados de «4pi (Figura 3}» Isto estava e® acordo co® os dados que obtivemos usando cito®etria de fluxo (Figura i). 2j E® experiências de inuno-precipitaçlo sequencial, os anticorpos monoclonais contra a4pl nSo pré-anu1arara o «aõpi £não apresentado^. 3j Os raspas de péptidos da V8 protease, obtidos a partir das subunidades ®4 e «3, precipitadas cora anticorpos monoclonais P3E3 e P1D6, era® clara®ente discemíveis (não apresentado;. Para alé® disso, sob as condiçSes ÍCHAPS a 0,3% e CaCÍ2 i ®H) utilizadas para solubilizar o conjugado de <h4£Í, & partir de células Jurkat (Figura 3), uma outra proteína, cor raaior sassa ®oiecular (plSO), també® reagiu co® os anticorpos monoclonais ou co—precipitou—se co® α481» A pi3ô estava ausente aos extractos preparados co® o anticorpo ®onocional PiDé (Figura 3), células nâo-linfóides ou extractos era detergente Triton X-100 preparados na ausência de Ca ++. n&a è conhecida a relação da piSO com outras integrinas. Una vez que a «4 p8de ser xmuno-—precipitada se® gi, após so1ubi1izaçSo de células T co® Triton X~±00m na ausência de Ca1", isto revelou oue os anticorpos monoclonais inibidores reconhecia® epítopos presentes na subunidade a4 (Figura 2Ϊ.

*-2.2. D|SIEIjyi,ggO^Mti._E..g581 EM SéLULftS £ TECIDO mãimm

Tal como foi relatada anteriormente (Hemler, supra)* a ®4gí axstribui-se ampiamente em células hematopoiéticas nucl O ·£?. ;Cr i.Tabela IVj =

7 X 4&V 0624-076-118

-43-

TftBELft IV

DISTRIBUIÇÃO DOS RECEPTQRE3 s4pl E sS|3i DA fibrqmectiha em células mmmm

Intensidade ot F1 uaresc@nc 1®

Relativa

Leiiíias 'SpJJ j_ kéjilMs^ematoBQiêticas

rÈL LSL fCD3-5 CD16+) ί’ϊοπãcitos (GDI6-5-) Õranuiócitos

Plaquetas

Paso

Amígdala Al_L 1T ou B)

LóL Leucemia (C03+, CD44-J

Hisí..

ÓL.CL rtolt 4 *CB3+, CD4+) úurka (CD3+, CD4+) VT (CD3-/

BI as tos PHA CCB4-H G i!_ í Ll?3+ 9 L-iJB-í" .1 lhS CCD3+, CB8-H HL—feu 0457 -I—I—é- + / — ou

4-4-4- 4-/- OU 4-4- -r-i- 4- 4-

4-

/ X ·4*£Γ*? U / c»— i X S

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Ci 1 LÕc, I- 2. LJ Γ“LJΟ X 3i‘as- UDto «ff ípâj -r -1· ΗΪiú&O * -g~g- i-,u *4* V&±3

CeiLliaS LplLSiiai-S uC-i

uVUHK“4/ í 4/U

J

h citOíiistria de fluxo a duas cores, revelou que toaas as subpopuiaçôss os linfécitos derivados de baço* amígdalas e sangue periférico expressava®* e® quantidade* «481. Além disso* os monécitas de sangue periférico* as leucemias linfocíticas (T ou B) agudas* derivadas de fresco* todas as leucemias mieiociiicas e linfocíticas granulares grandes CLSL) s as linhas de células de linfécitos T e B cultivados que examinámos* expressava® e® quantidade (Tabela IV) = As siaruet&s e os

J granuiôcitos nornais de sangue hunano fora® negativos quanto a &4âl iTabala IV). £® contraste* as únicas populaçSes de células hemaropolêticas que expressara® α5β! fora® plaquetas* monocifcos* granuiécitos e células T activadas, leucemias 1 inf oeiticas <T ou Bi e ffiielociticas agudas e células K5&2* HL—40 e 0937 cultivadas. Algumas linhas de células T (Holt 4 ou JurRat) s B íST-i) cultivadas* expressara® baixos níveis de «381* como se detectcu através do antxcorpo monoclonal P11M>» Em alguns indivíduos normais. u®a subpopulação de PBL foi positiva quanto a i f 1 uoresc‘éncia de P1S6* detectada por citometria de fluxo» Estamos a investigar a natureza dessa subpopu1ação de PBL que expressa aSsái, As células TY* um lin forna de células CS3 T* fora® cosnpietamente negativas quanto a PIB6, por citometria de fluxo. Estes resultados mostra® que o principal rsceptor da fibronectina expresso constitutivamente por linfécitos T e® repouso* é o g4Si e. como relatámos anteriormente (lifayner st al. 1933) * a expressão de sSfsi e® linfécitos T restringe-se a células cultivadas activadas ou leucémicas. έ intsressaits que a maior parte das linhas de células fibroblásticas tenha expressado níveis baixos da «401, enquanto células sndoteliais de grandes artérias (HUVEs) e células epifceliais cultivadas fora® negativas quanto a «või* por cítometria de fluxo» linfécitos E® tecidos* o «481 estava presente e® gânglios linfáticos* amígdalas, e caço de adultos* e estava praticamente ausente de todos os outros tecidos que examinámos. Além disso, as quantidades relativas dos receptores de adesão á fibronectina expressos por células e® domínios de tecido sspecíficos* variara® extraordinariamente. Por exemplo* as PBL e os -46“ / ί 489 Ôà24-07ò-xl3 enpressara® grandes quantidades de «401 mas prafcicamenfce nsnntifit aõwi era amígdalas, no córten e em áreas centrais germinais també'"!s se encontrou «481 em regi fies epiteiiais de tecido linfático de adulto, mas não ficou claro se isso foi resultado ca infiltração de xinfócitos nessas áreas, se da esípressão de «481 por células ixníatiças epiteiiais.

s-2.3. Q.....«MlXOCâLIIârrBE......Ep.....flD£Sm_FOCâlS,, DE0£èjDEfegES

BA FIERQNECTI^A Há usa reorganização específica dos receptorss tíe adesão da superfície das células às adesêes focais, guando se cultiva® células sobre os ligandos apropriados, na ausência de sor-o i revxsêo de Burridge et al. 1988, finrs. Rev. ‘Cell Biol., 4, 487--525¾. Uma vez que alguns fibroblastos expressa® «401, xnvestxgamos se esse receptor se distribuiria nas adssÊíss focais quando se usasse fibronectina cimo substrato da adesão. Com© se pode ver na Figura 4Ch s C)s os sítios de contacto focal primário ou adssSíss focais, puderam visua 1 izar-se . por microscopia de interferência de reflexão (Xzzard, S.C. e Lochner, L.R., 197és ã. Cell. Sei., 21, 129—159), quando s® cultivaram células RD ai· fiaronectína. Tal como nós e outros relatámos {Roman, <3., LaChance, R., Broekelmann, T.sJ., Roberts, C.J», Mayner, E,;A», Cárter, M.6., e Nacdonald, J. , 1988, J. Dell Biol., 108s2529— -2543), na ausência de soro, o «501 concentrou-se nas adesães focais, quando se cultivaram células RD sobre supsrfícies revestidas com fibronectina (Figura 4B, setas), mas nâo com laminina. Do mesmo modo, a coloração com anticorpo monoclonal P4I39 CFigura 4D, setas), revelou que o «401 também se concentrara nas adesSes focais, quando se cultivara® as células score superfícies revestidas com fibronectina, mas não com lamininaínão apresentado). Estes resultados demonstra® uma interaeção especifica as «401 com fibronectina presente s® adesSss focais,a estrutura de adesão primária de células cultivadas. A presença tíe ambos os receptores em contactos focais sugeriu a possxbi1idade de que o «401 e o «501 se ligassem a sequências tíe adesão distintas, na fibronectina. Be facto.

J / i. 5ís24-C!7fc-i 18 -47- ooteve-se svídlocia disto* quando se usaram simu itaneamente« para inibir a adaslío de células ae piasma Intacta, fitando usados em corsjuntoP o inibiram corno 1stamente a adesão de linfócitos T à plasma Intactay inibindo parcialmente a adesão iVabeia Vi,

J

P4C2 m PxÍJhf â fibronsctir.a P1D6 a o P4C2 fibronsctina do de células RD i

7 2 4δ*

-43-

TiASELA V

EFEITO COIBINADO DOS ANTICORPOS HONOCLONAIS PID6 E P4C2 NA ADESÃO DE LINFéClTOB T E CÉLULAS RD A FIBRONECT Σ NA CÉLULAS ANTICORPO ESPECIFICIDADE ADESâO C% do controlo ± dp; nL* iss — IOOÃ PiDò a5BI SI ± II P4C2 s4pl 99 t 7 PiDé + 36 ± 3 P4C2 JarKaí ise - 100% PÍD6 ei5pl 26 ± 9 P4C2 ®4pi se t 14 Plíié Ί- 0 P4C2 i 0024-076-118 -49-

A y è xnteressante que, ao contrário doe linfòcitos 7, nem o riDó nem o P4C2, isolados, foram dons inibidorss da acssáo as células RD à fibronectina do plasma Intacta. Ά adesão de células RD á fíbronectina apenas pôde ser eficazmente inibida por PIDá e P4C2 quando usados e® conjunto»

6-2.4. 0 a4gj FUMGIGÈfò_çgm_REÇE?TQB.....DE.......UH.......SÍTIO

miãmm......âLIER^AJgVO, INBSPEMML5E ia^LEMim

Os resultados precedentes (Tabela 111, Tabela V, Figura í, i-igura 4) indicam, claramente, que a ligação de algumas células à fibronectina do plasma era sediada por dois receptores inoependentes oa superfície celular, o «4pi e o aõ:31» Foi ben documentado que o ligando para o «Sgl, na fibronsctina, è o domínio de ligação de células com 00 kDa, que contém a sequência R6D íPyteia, R., Fierschbacher, H.D., e Ruoslahti, E», 1935,

Dell, 40s191-198)» Para determinar qual a região da fibronsctina que interagia com o «481, examinámos a adeslo de Xirsfâcitos 7 cultivados a civersos fragmentos proteoiíticos de fibronsctina do piasma ivejam-se as Figuras 5A e SB), bem como o efeito sos anticorpos monocionaxs PÍB6 e P4C2 sobre a adesão de linfâcitos a esses fragmentos. Como se mostra na Figura 6, as células Juritat; r f e Holc 4 ligam-se muito mais eficientements a im fragmento ccr 38 kDa, que contém o domínio Hspsrirss (Hep) II, do que a uss fragmento que contenha RS D (80 kDa). As células Jur-kat . s Halt 4 também se liga®, de um modo dependente da dose, a ura outro fragmento de 58 kDa, que contém o domínio Hep 11» Contudo, o máximo da ligação de células ao fragmento com 58 kDa atingia apenas 50% do que se atingiu com o fragmento da fibronectina coa 58 kDa. Isto sugere que o fragmento com 38 kDa contém u® sítio de ligação com elevada afinidade para linfécitos T, Os linfõcitos T não aderiram ao frageento com 29 kDa do terminal ÍM da fibronectina de plasma, que continha o domínio Hep 1. Em gerai, Pfei- derivadas de fresco revelaram um padrão de ligação similar ao ass células Durkat ou Molt 4, e a capacidade de P3L derivadas de frsscc se ligarem ao fragmento com 80 kDa corre1acionava—se com a expressão de eSisJU Outras linhas de células hematopoiéticas,

i x *ter* 5ο2*ί·—ύ ? 6-- x x 8 tais como células K562 (Figura o), SKioiraa uma preferèncxa ratios asio fragmento da fibronectina do plasma ca® 80 kDa» enauanto as células RD manifestaram adesão indiscriminada a todos os fragmentos de fibronectina do plasma testadas, e^cepto ao fragmento do terminal W com 29 kDa. R83S 11 sg/si) inifezu pare ia i msn te (50%) a adesão de células Jurkat è. fibronsctiTia Intacta, tendo inibido completamente (100%) a sua adesão ao fragmento com 30 kDa. A adesão de células Jurkat ao fragmento cora 3ò Kôa não foi afectada por RSDS (até i mg/mi).

Tal como mostrámos anteriorments (Tabela 3 a Figura 1), os anticorpos monoclanais contra s4pl e <h5|3I inibiram parcialmente a adesão de iínfdcitos T à fibronectina do plasma Intacta (Figura / , topoj. Como se esperava5, ο P1B6 inibiu complet&mente a adesão cs células T ao fragmento com SO kDa que continha a sequência RGG cs aaesão (Figura 7, meio). 0 P1D& não inibiu a adesão de iinfócitos T aos fragmentos cora 3S kDa (Figura 7, base) ou 58 jfeúa. Peio contrário, o P4C2 inibiu completamente a adesão da iinfócitos T ao fragmento com 38 kDa e não teve nenhum efeito socre a adesão ao fragmento cora 80 kDa (Figura 7). rara aléc ai5SO? a adesão ds Iinfócitos T ao fragmento com 33 kDa oue tamoém continha Hep II- pode ser inibida por P4C2. Em todos os casos, outras linhas1·· . de células de Iinfócitos T que expresse® ambos, o e o «Spi (tal como células <5urkat), comportam-se e?<actamente como as células ftolt 4 (Figura 7). Como se viu na íaoeia 4, as células í<562 apenas expressam ο α501. A adesão de células KSés2 aos fragmentos com 38 kDa (Figura 6) e 58 kDa, foi granaemente reduzida, quando comparada com a sua adesão ao fragmento com 80 kDa (Figura 6). A adesão destas células a Tzoronectzna de plasma Intacta (Figura i) ou ao fragmento com 80 KDa, póds ser completamente inibida por PID&. Por outro laao, as células ¥7, que não expressam cí5|3i (Tabela IV), aoerem oeficientemente â fioronectina de plasma Intacta s ao fragmente com 80 kDa (Figura è). Estas células requerem 2—3 vezes mais tempo, para aderirem a superfícies revestidas com fibronectina ás piasma, do que as células Jurkat ou Molt 4= Contudo, as células yY aderem sficasmente e de um modo dependente da quantidade, ao

fragmento com 38 kfta (Figura 6) e a adesão aessas celauas sc rragmeaito com 3S feíia pôde ser cosipístassente inibida cora P4C-2* Estes dados indicam uma correlação directa entre a εκpressão cê a^ssi s a capacidade de ligação a fragmentos de fioronectina cs plasma que contenham as rsgiSes Hep 11 e ΣΣΣ03. Para além disso, sstes dados mostram inequlvocamente que ο &4£i funciona como o receptor para este domínio alternativo de adesão de células. 8.2.5. 0 a4Qí É O RECEPTOR: DGS LINFáCITOS P8RA 0 CS--

J fi região 111CS presente na cadeia A da fíbroneetina os-pi asma Figura 5), contém pelo aasos dois sítios responsávais pexa mediação da adesão de células a fíbronectina (Humphries et ai. , x9Sór, Csll Biol . , 103a2637—2647% Husiíphrlss st al . 8 1957=,

<3. Bioi. Chem. 9 262 8 6886-6892 $ HusBpliriss et ai „ g 1988, 5. Ceí I i óioi.í 106s1289-1297). Utilizando uma série c® páptidos ds sxntese. parcialmente sobrepon£veis? que abrangiam toda a rsgife: íílCS tpéptidas CS), Humphries e colaaoradores mostraram que os peptidos CS-I (terminal 1¾) continham sequSnczas de adesão reconhecidas por células ds melanoma de ratinho (Humphries st ai =, 1966, i987j. Aqui? mostrámos que o fragmento com 38 kõa contém um sitio ds adesão com elevada afinidade, reconhecido por iintácitos '» humanos e que o s4Sl é o receptor que medeia a adesão ae iirifocitoà 7 ao fragmento com 38 kBa. Este fragmento não contém o sitio CS-S mas contém, de facto, toda a região 08-1 (Sareia—Paroc et ai, í9S73 Biochem. J., 241g923—928j „ que foi definida como ur Sitio de adesão com elevada afinidade para células de meianosa (s-fumphries et ai . 1987, J. Biol. Chem. . 262s6866-6892) .Fortanto, era interessante determinar se os lirtfácifcos T reconheceriam o t-S-i e se se lhe ligariam, e se o «4;31 seria o receptor envoivido nesta interseção.

Os iinfócitos T (células Jurkat ou Molt 4) reconhecem superfícies plásticas revestidas cora CS—± (conjugado com Igè as coeino) e 1igam-se-1hes (Tabela VI)« Os linfácitos 7 (Jurkat) não se ixga® a superfícies revestidas com CS-2 (eonjugaco com ig& ae coelho i ou a superfícies plásticas revestidas apenas coai IgS as coexho. Para aiém disso, anticorpos monoclonais do s4pí |P4C2;

-5^- xnxoiram CQapisrasísnts a adesão de Izofocitos T a CS-i* sn-3L?arrc.D anticorpos oo ciSfâi íPlDesj não tivera® sfexto sbso 1utamsn ts nenhum iYabeia VI). Tal coso mostrámos anteriarmente, anticorpos ao -34wi xnihir&m completa e especifàcamente a atiesSo as iinfõcitos T ao fragmento com 38 kDs {Taoeia VI)s anquantc antxcaroos do «Spi inibiram especificemente a adesSo ao fragmentes com 80 k£sa que continha RSD»

J

J

/ ι 489 ó62*i—ú7ó~3.áú Ί ABELfe. y I. DA ADESSG DE L1WFÓCITOS T hO PéPTWO CS-i, COM ANTICORPOS HONOCLQNAIS Bú «4§1 ANTICORPO·1

IgS P4-C2 Plúó ay κ úa S560 *“e* 214 7154 -r 39e 202 Z 105 J/'Ζΐ L'-. "·. 22éB0 1014 114 -ê- 78 24917 t 352 Oi3~A 44339 513 841 -5- 555 42897 í 728 u6~\2 2576 4- 214 535 -f- 250 435 H 160 ΕΓ™..... *

J /1 *rs$¥ 0624-076-1 l8

6.3 il&QJSiSÚ

J

J utilizando tecnologia de anticorpos leonoclonais ti-Jayn-sr, c.k. , Cárter 5 H«@. , Piatrowicz, R* e T.J. tíunicfci, i¥6Ss ã. C®1 i isioi., xQs 1381-1891 identif içámos um novo receptor «4131 da Txcrcnecuns. -Os anticorpos monoclonais P3E3, P4C2 e P469 recontsecersm epítopos r»a sttbun idade «4 e inibira® completafrents a aoesao de iinfócitos T cultivados e de sangue periférico a um fragmento trlptico com 38 kDa da fibronectina de plasma, que continha o tíoiainio Heparina II do terminal earboxi e parte do segmento de conexão do tipo ΣΙΣ (111035,= 0 ligando para o no liiCS era a região CS-i, ®nteriormente definios como sitio de adesão para células de meianoma. Os anticorpos monoc lonsi-s funeionalmente definidos para a c?4P inibiram parcial mente -a •adesão de iinfócitos T a fibronectina de plasma Intacta e nâo tiveram nenhum efeito sobre a sua ligaçSo a um fragmento triotico co® 80 fcDa que continha a sequência RSD de adesSo. Anticorpos tTionocionais (P1D6 e PiFS) do receptor da fibronectina, descrito ar« ter iormen te, inibira® completamente a adesão da Iinfócitos T ao fragmento com 80 kBa, mas não tivera® nenhum efeito na sua ligação ao fragmento com 38 kOa ou a CS-i» Ambos, s4yi e o50i, se localizaram para adesões focais quando se cultivara® fibrob1astos, que skpressavam esses rscsptorss, sobre superfícies revestidas com fibronectina. Estas determinações asasonetraras uma interseção especifica de ambos os rscsptorss com flãronsccinsr nos contactos focais»

Racentemente, Bemardi st al., 1987, suorai Liao et ai c =, 1987, Εκρ. Cell, Res», 171 g306-320p Liao st aL, 1989, Exp» Ce 11 Res., . lãi?348-361, relataram que algumas linhas · de células is iinfócitos B se ligavam a uma região da fibronectina tís plasma locaiizaoa dentro do domínio Hep II do terminal carboxi» Liao sc ax. 1987, suara. iden ti f içaram um receptor semelhante é mtegrina, em células B= Contudo, não sstã claro se a proteína que eles descreveram era o4gl, s2j3i ou e5iãi» Bsrnardi et al» 1987, supra, também identificou receptorss ds fibronectina expressos por Iinfócitos B» é in teressan te que, nssse estuo o, as cexuias & que se prendiam a fragmentos que continha® Hep 11} /f $//. 7 x ^-89 Õ624-Ú / er*i 13 c ·“"> // ' - -t é* -55- enoressassem uai receptor semelhante ao «4t5x , enquanto as células aue se prendiam ao domínio de adesão de células que nantínna ftáD, e«pressavam un receptor similar ao sSíSI = Contudo, tamoé® não τει possível, a partir destes dados, identificar ciaramente c receptor envolvido na ligação. Eai conjunto, os resultados cesses relatórios anteriores & as presentes determinações, proqo-ciorsa indicações ciaras em apoio i) da eKístincia de um domínio a© aassâo alternativo, presente na região do terminal c&rãoxi os. ficrenectina de plasma e iij de um papel para o «4ϋχΓ como receptor para este sitio de adesão alternativo». Será interessar te oeterminar as ssquincias exactas de a®ino—ácidos que s& responsáveis pela interseção do s4|3i com fiferonactina. lima ves que nem os fragmentos com 33 kDa e 5S k&a, nem o CS—I, confim uma sequência stSB íKornblibfcl et al., 1935, sacras Sareia-Pardc, 1937, supra? Humphries et al,., 1986, sugrai e Huapfcriss et al. , .:.987, supra) „ é evidente que -a caracterização do ligando para o identificará uma nova sequincia de amino-ácidos, importante para a adesão de células a fibronectina. lima vez que o fragosnto cgs 3S kl)a não contém CS—5 (6arcia-Pardo , 1987 r supra i, a sequência minima de amxno-ácidos responsável pela sassSo &e iinfccitos 7 ao fragmenta com 38 kBa e, portanto, a ligando para o a4Sijnessas células, não é arg-glu-asp-val ou REDV(Humphries et aí. iv&à, supra).

Tal ctmo a <a2|Bl, a subunidade ®4 está fracamante associara com a subunidade ®1« Os dados aqui apresentados (Figura 2i e as nossas determinações anteriores (felayner, E.i-s. e Cárter, iv»=Ss _supra e Wayner jgfc. al., 1933, supra) mostra® qus os anticorpos monocionais funcionalmente definidos para o «2£i s o «461 interactua® se1ec tivamen te cora epítopos presentes nas suounidades o, baseadas em imuno-precipitados de «2 ou «4 -sem íi, após aissociaçlo e® subunxdades. Estes resultados sugerem que a «nxca suounidade a é responsável pela determinação da especificidade de ligação do ligando de cada complexo «-$. Ests conceito é agora corroborado pelas observaçSes aqui apresentadas, de que o «5 e o oC4, que estão ambos complexados com 61, medeiam a acesáo a sítios distintas da fibronectina. Isto não p reter-d s ^4' —56— sugerir que a suounidade 15 não é importante na ligação, (nas sus a especificxaade aas interacçâfes recepzar-ligando é determinada par « ou um complexo Ca tlnico)-&. e interessante que, embora as células LAK expressassem abundante «481 na superfície celular, este não parecia ser tm receptor funcionai ç i P1B6 inibia compietamente a adesão ds céiuias LAK a fibronectina. A razão para isso podia ser que as células LmK expressasssn uma forma degradada de s?4 (veja-se a Figura 2). Além disso, porque estão activsdae, as céiuias Lfti soPra-expressam o quando comparadas cem células Ϊ ieucémicas ou ds sangue periférico (Tabela VXi I)» Em outras csiuías. que expressam maiores quantidades d® «Spl, ®m relação a «48 i í K862-1 e H71O80) , ê dominante a adesão via «5èi ao domínio com BO tcj)a que contém RSD (vejam-se as células K562-1, Figura é) . Isto XIBP lica que a regulação da expressão tíe receptores determina a capacidade ds uma célula para reconhecer e se ligar a diferentes sitias da fibronectina- Para além disso, também é pDssivsí que a co—ex pressão dos dois receptores para s. fibronectina possa aumentar a "avidez" de ligação aas células? por exemplo, as células Jurkat e RD expressam adesãc-relacivamente indiferenciada a fibronectina, quando comparadas co® céiuias VT, qu® expressam apenas o «481» « regulação da adesão de células, da fibronectina, é potsncialmente complexa, mesmo sob as condições sais simples possíveis, qu® são assuair qu® o a5Si e o «4Si funcxonam u® independentemente do outro e que não se sobrepãsm durante a interseção com os dois sítios de ligação da fibronectina. variaçdes a partir deste estado simples, proporcionam oportunidades para regulação extremamente sensível da adesão αβ células- Ao nível menos complexo, esta regulação pode ssr grasseiramente categorizada em i) processas que controlam a síntese e/ou a exposição dos sítios de ligação no ligando s ií.) regulação da expressão funcional dos receptores. Estão presen temen te disponíveis exemplos de regulação a imims os níveis e xncíuem a observação de que linfoquinas ® o antiçénio especifico induzem a expressão de a53i em linfócitos T, seguida de adesão

acrescida de células á fibronectina (làayner et. a1_B x988, supra/. niem eissoj c contraio do entreiaçamento da asENA na região I ϊ 2 CS da fibronectina (Komblihtt et ajU 1985, supra) durante a cura ou inTÍasaçào de ferimentos, pode ditar a espec1ficidade da iigaçâe recepior-1igando, em células 7 activadas ou em repouso* Variações a partir do estado simples sio intrigantes mas requer·»® experimentação adicional 5 até mesmo para começar a identificar a multiplicidade de mecanismos potenciais* i

Em conclusão, estas determinações mostram claramente cus iinfócitos 7 cultivados utilizam dois receptores independences durante a ligação à fibronectina, e que i) o «5gi é o receptor para o domínio de adesão de células que contém RSD, e que iij c-í?4?si é o receptor para uma região de adesão de células c-c-terminai carboxi, que contém os domínios Heparina 22 e íilLb:, rara além disso, estes dados mostram que os Iinfócitos Y raanxfestam uma preferência clara por uma região cs heterogeneidade molecular, no IlICS (C8-1), gerada por entreIaçamento alternativo do pré-imRNA da fibronsctina, e que o c4èí. e o receptor para esse sítio de adesão« £MHELOi-a^aiSM-.D£......L·mFmπ3L·JLΈmmΛ^ϋmAm. .......LieosiQ-PQ. heceptgb.....mii...... i

40 CS—1 =, MA RESIãP ΊΕ.3......M.FIBRQWECTINft

Os experimentos seguintes demonstraram o papel do receptor <24isi. e do seu ligando, CS—1, na mediação d® adesão de células 1- a céluias endoteliais, de vasos importantes, cultivadas, s s cei.ui.as encoteliais que txnham sido activadas com uma d iversida.de ae cxtnquinas associadas com a resposta inflamatória, incluindo iL~i, factor da necrose tumoral alfa (FIíTaj e factor da necrose tumor ai beta <FNTsÈ) » Além disso, demonstrou-se a capacidade de anticorpos monocionais e de fragmentos peptídicos par® bloquearei a aderência de iinfócitos ao endotélio, através do receptor »

7.1. hftTERiaiS E PROCESSOS 7.i.í. BiâiEiijm

Os reagentes utilizados foram tal como descritos na Secção supra 7.1.2. çMUjLÊê^umãiMm,Mi^UJLAS. as siurkat C leucemia de células T humanas) ofetivsrara-se be i>r. Paui Conlon (Immunex- Corp» s 3eattle9 sfèj s as Ramos t, leucemia de células B humanas) foram obtidas da American Typa Cu1cure Coilection |Rockvills? MS). As linhas . de células B isí—Á e L.M? i leucócitos de adesão deficiente) 9 prepararam—se por transformação de linfócitos B humanos com vírus de EpsteinHsarr-η linha · de células LAS desenvolveu—se a partir de células B ds um paciente com uma deficiência na famiiia 02 da integrina ás receptores de adesão e foi obtida do Sr» ãahn Harían (Harborview Medicai Cansar, Seattle* NA). As células endotsliais de veia umbilical numana CHUVEs) foras adquiridas à Ce11 Systems? asaufcis, toA- Mantiveram—se as HRJVEs em meio definido Cisento de soro)- também adquirido â Cell Systems Cmeio CS-iOO)- 7.1.3. mnvmm.M......μμι......soía......ototos imummim

IncuParara-se HUVEs com IL-i p i 1 mg/ml) csu, em alguns experimentos5 com FMT o CIO mg/ml)9 durante 6-24 horas- Mo finai o essa incubação lavaram-se as monocamadas de HlIVE a utiliz&ram-—se no íss-cs ds adesão-

7.1.4. SÍNTESE DE PÉFTIBOS CS

Sxntetizaram-se péptidos derivados da região CE—1 da fioroneccina de plasma e purificaram-s® por HPLC íCromstografia uiquitia de Alta Eficiência P CLAE)P de acordo cq@ protocolos padrão do Ur- James Blaks? da Gnccgsn Corp - P Saatcls* &A-Conjugou-se o péptido CB-i coei albumina ds soro de coelho gu KLh? cambem de mcoraa com protocolos padrão do Br= James Slake» Ό péptido RSBS de controlo? obteve-se dos Península Laboratories ÍÔelmcnt7 CA)- 7-1-5-

us anticorpos seguintes foram desenvolvidos neste ísdorstcrio: PiH5P que reconhece o receptcr o20i Csísyner et ai. g 1987- ã . Cell Biol - 105 sí873-11884p Nayner et al. 19S85 J» Csí. I ιίΐ,ΌΪ = r. 107 g ife6i-xS3i 11 Pièsõ» que reconnecs o receocor «c-fíx suaraíg Ρΐΰό, sus reconhece o receptor protótipo «Sái ca rxoroneetxna, descrito por Pytela et al_ íCsii = 40slv2.-lvg< s í-atiu; que reconhece a subunidatíe iis e Ρ4Ηϋ5 çue reconhece a 7-i ii-aSi, utilizando processos total mente descritos por feayner st B,i íivS/ν. a» Celi Bioi = g 105,51373-1S84) e ei Wayner st ai= ic8S 1* Ceii Siel. , 107 g 1881-1871 =, que sSo aqui incorporados, por refsrSncia, na sua totalidade, s se descrevem na Tacsla il = 7.Í.6. teste,...sí,........êBiiis....... €ui tivaram—se células sndo te liais de veia umbilical nuiiria íHuyEs; em placas da #8 alvéolos, como descrito (suor&j. Para ss ffieoir a aderência os linfôeifcos a culturas da kUí€ ar; monacam&aas, «arcaree-se linfócitos com ^a23JLCru4. CSô uCí/nú} curance 2-4 noras, lavaram-se e, a seguir, incubaram-se jLinfóciios com monocaiaatías oe HUVE, na presença ou ausência c-anticorpas inxbxeores ou de péptidos derivados do CS—i o Deis?ou—se que cs Ixnfâcitos aderissem durante 30 minutos, a 37* C. âuosequsntemente, removeram—se as células, r*ão aderentes., í,avance com "P38':. e dissolveram—se as células aderentes s® slS/KsC;-:.: Contaram-se cs com do 3xCr ligado, com um contador οεκ. alguns enoerimentos, ac ti varam-se as células encetellaxs antes do teste de adesão, incubando com IL-i @ il ng/ml i ou Ff-i7‘—.3 i iO ng/rli CCall Systems, Seattle, &Aj , áur&n%s 6—24 horas em isexo definido CS—100= 7.2, .....sgjyLxaiOj, 7.2*1= EEMóIÍEQ-SE.....WEÊBEÈÇ.ίE,..^L·J=I^ÉL·ΣL·SL·ML·

P&CIEMTES DE LAD 2 FORMAIS rara determinar qual c mecanismo que os I£nfúo±cc-=-Litiiisaram durante o extravasamento, de te rmin amos primeiro o renatzpo ss superf s.cxe de 1 infPeitos LAD e normais, em relação aos receptores de integrina* Estes dados estio na Tabela Vil s mostram claramente que as células LAD possuem um fenotipo cs superf^exe da célula normal, em relação âs integrlras que cont-ã® iíi. Uma vez que como esperado, as células £ derivadas do pacienta com i_éõ fora® negativas quanto a &29 isto sugere fo-rtemente cus

Sã 8 Ο Ο '£31X Ο

Ptó'»‘»-:£3-:iÇ2?!iuS! Cíl L·2' ei V VS’s i )

—Ê5i —

Tapais VII

nriaiise de f iuoreecincia oa Expressêo aa Hscsstor da Integrina por Linfõcitos Moriisais $ LíhD ÃmsDãâáã^É^±Àmrss£ÈB£i^i ríS "5ΰ“2Γ sniiccroo Jurkai C Ti Sajnas È h j ST-i LAi »2 P4H9 -i- s- r4Ciú « _e_ i d"V Pi HS 44 4- f-4 ¥ Piáã - - - ~ lA „-r P4S9 Í-++ 4*4 pr-r 4-s- «õ pjLíies “á- 4/ — 4·/ — 4/- a ususrssinsii—se a incensidade da fluoresctnc. ia nissa sscal a logara-ci mica de três décadas £ ®xpri®iu-se Sã! ÍÍÍ1I3SOS5

aroisrarias? com caaa roais s, indicar 50 unidades cssds 0—255 t noaieros de canal #. tis* roais/menos indica uro desvio definic© s reoradiina-vei acima do ruido de fundo <<S0 unidadssj* 1

“02“

Tabela VIII

Adesão de Liníóci-cos Ί & S a Horsocaraatias de HUVE em Repouso e ftetivadas

Linns . de Células Basal Adesão tcpíiíJ^ UKU I B 1 2¥3ãô V^rssv ãY—1 iBi 11572 J.43-SáC; rxanios i B i lõBS xii&e JurKao iTí 741% 352023 ΐ í i Ϊ1 433% 1S93S4 a cpas = coneagens por minuto. Us dados sso de um experimen ts reoresentativo único= i / i

7.2.2. CAPACIOADE DOS LINFÓCITOS PARA ADERIrtEft ή CáL-OLAS gWDOTELIAIS £8¾ REPOUSO E ACTIVADAS

Testaram-se linfócitos marcadas cg m crómio* de diversas xinnas ' de células* quanto á sua capacidade para aderirei quer* a células endotelxais e® rspousa, qusr a células endoteiiaxs ac ti vacas iTabela Víií« Apesar de se ter determinado que todas as ixnnas- de células testadas aderiram* mais ou meros« a endouelio em repouso* determinou—se que a adssão de linfócitos t e £ a endotelio activado por IL-1 ou FNT* era muito maior, por as ractor iMo grande como 10 veses mais. Nlo se determinou cus a adesão de linfócitos de pacientes de LAD a eodotéixc fossa sxanxficatxvamente diferente da que se observou oa^a linhas de células ST—1 * derivadas de células S normais CST-ij. Ivão ss determinou nenhuma diferença entre as linhas tíe células, entre a adesão a endotélio activado por IL—1 varsus FNT. 7.2.3. EFEITOS DE ANTICORPOS ANTI-RECEPTSR MA ASEFêMClA PE„, LÍMFáCITGS. A,_EmTéLlQ, ãusico se testou a capacidade de linfãcitos marcados cor crómio para aderirem a endotélio* na presença de sobnanadantse de nxoradorna. determinou-se que apenas os anticorpos monoclenais orientados para o «481 ou Bi inibiam a atíesSo$ detarmxnou—se que os anticorpos monoclonais orientados para outros receptores. tais cc$c o rscsptor protótipo da fxhroneetina β o receptor «Spl„ nao txnnam praticamente nenhum efeito inibidc-r <Tabela 3). Aã presença de anticorpos monoclonais P4C2 (crientado para o «4Ix) e P4Cjlú (orientado para o |31) * a adesão de linfóciic-s marcados a enootéiio foi completamente anulada, é interessante que a -sdesSt-de células LAD também seja inibida pelo anticorpo anii-a-isl * P4C2j * o que indica que o receptor CDI8 não está envolvido nas oropriedades de aderência determinadas. Além disso* apesar d® os a23x* a53i (Tabela VIII) e B2 <nSo apresentado) serem (Sí-mrsssG-s por ixnfócxtos* anticorpos dessas rsceptorss nâo inibiram a aoe-sao ds linfócitos a BLJVEs basais, ou activados £vs ja—se a faseia IX j. Estes dados mostram que a expressão sa superficis os u® receptor de xntegrina e a ligação de um anticorpo inibidor &

>' i. n-sv Ό&2*ί-ú 7*—113 este nào conduz necessariamen te à xnibição se iigsceo ae· ^infécxtos a endotelio. Isto implica uni papei esçee=.Tico para s na mediação da aaesãe de linfõcitos ao endotéàzo;, cssc primeiro passe do extravasamento= Para além disso e usia vsz qur os anticorpos do «4B1 inibiram a adesão de linfãcitos a células snaatEii£isf xsto sugeriu que o ligando para o s4jíi-, s. soqaãnraa EiLSVr^l' de amino-ácidos (veja-se a Taoeia XI i ) 5 também puassss estar envolvido na dispsdess de lirífõcitos., por interaéGio da icgaç&o cq «4131 a esta sequência, presente num I zoando expresso na suoerfícis do endotéiio.

7 χ 4s9

0/ώ—iiS

sabela IS £?eits os AriticorEscs rionacion&is inibi sérios Eobrs ε Adesão de Linfdcitos a Honocsstaties d@ HtJVE íActxvaaas Dor IL-itó)

Adesão ' i cptã:

Linns cs £siaí*s Anticorpo Especificidade Basal ^•Iè_—íS L-Híi i 6 β SP2 — 19542 1046/2 PMkb «5ei 13633 113696 ri35 e2Bi 19669 909i2 P4C2 «4^1 69 5S 33132 P4C10 Pi õõàO 52352 r\«;iiur= \ t< ,i 6i-‘2‘ - 972 1215/ PIDé αφχ 803 11196 P1B3 42® 1 124 10023 P4C2 ^4®1 456 P4CX0 604 3152 jurm&t iTs SP2 - S3924 372159 Piõà 83956 417568 P1B5 éãSSO 489652 P4C2 S4®1 23108 2l Li’*·*· .2». P4C10 Si 36892 23041=:

7,2.4. PAPEL DO C5-1 COMO LIGANDO 50 g4Bi. tek mãmmMmmjm.....a......mmmm

Avaixou-se a capacidade do 'CS-i de síntese s &s péptidos QsrivadsDS para inibirem a aderincia os linfócitos marcados cor crómio a células endoieliais activadas, utilizando diversos pspcidos. O péptido CS-i de sintsss foi u® forte initidor c:s adesão de linfócitos T ou & a monocamadas de células endoteiiaxs oasais ou activadas (Tabelas K e K2). é interessante que » sequência EILDVP8T tenha sido também o péptido mínimo* necessário para inibir a adesão de iinfácitos a HUVEs a® repouso eu aceivadas (Tabelas X e ΧΪ)« E® alguns casos* tal coso com a ixnha. · de células Ramos 3* a adesão dessas células a HUVEs pSde ser compietamente anulada co® o péptido EiLDVPST, Em experimentos de controlo «.Tabela XI) * a sequência RSOS* que é o ligando p-s.rs c rscepcor protótipo «gSi da fibroosctina. não inibiu a adesão ds nnfocitos a HUVEs em repouso ou activadas. Φ // / i- 4ÍÍ7 3á>j£-*-Ú /ά3-A Aã

~S 7— Í&OSL& X treito ao CS—l e as ráptisas DtrivaotJS qq CS—a na kossso ds Linfócitos a HUVE-s

Linrss oe Ceiuias N2 ao Psprido isSOLlfersCi 2L-51 HCSSãO ÍCpsBI sassi iò â—f-ili 293k i^So rsiatadia 2õS5a 7 ^uve 344 CS—1 ,1/500 2?jj. /2 350 VpSl V-iL·"·*· 42/58 352 EiLõVPST m 2=434 354 GPEILBVPST Hú 572i 9 ríf-iNUS ifcU 2334 Não rslatada 4853 11132 *c.&4. W5 ϋ “ΐ CS-I 1660 2S2S 350 VP3T ND 4588 352 EXLBVPST m 25S4 354 SFEILDVPST m 2235 ãurkSit ϊTi 293íA) Nlo rsiataca 5S0S4 I29Sé4 344 CS-i 2? 568 75772 350 yps? ND 127" 544 352 EILDVPST ND 93058 354 SPEILDVPST ND 89721

Sp?i;=rsfec dstsriBiRSGa íg^·1... >

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fcfsxta do Lb-I ou ds Psptxoos Osrxvaaos ao Cs-jl ou as RSDS na HsasSs ds 2_znfó~±~os a Hu7£S HSSSáO ( CpEi í

Linns ae Céiuias Wâ ao Psptido SecjuSnc ie Basal -ί-ί«_~χΒ jUfKSt t I i — — 16x092 314646 - RSDS 2986S& 337616 344 CS-i 32404 248976 350 VPST 203716 351 LBVPST 166948 w* 21, Lhí*1*í :i«Lí V*·*' 352 EILDVPST 8445á 234796 Í_Ríi i 6 1 - - 44860 71408 - RSDS 70652 102076 344 CS-i. 22776 51560 350 vpst 38176 96860 351 LPVPST 37700 92792 352 EILDVPST 27964 38784 KfisBQS t B Ϊ - - 2724 12936 - RSDS 16720 28104 344 CS-i 1844 5ia0 350 VPST 4168 15320 351 LDVPST 3532 15092 352 EILDVPST 1696 4964 / i 4»9

U/6—xlõ -69-

Taosla Áíi INIBIÇÃO DA ADESÃO BE LlhSFóCITOS A FíBROíyECTíNA £Qm PáPTIDGS DERIVADOS DE CS-1-B12

rerTlDO SEOUiÉNClA INIBIÇÃO CS-i. í- hj.5 DELPQLVTLPHPN - ãl-5 LNSPEILDVPST -§-4-t- 2>ou VPST - bói LDypBT - Õ52 EILBVPST -ΐ—v—1- SPEILDVPS7

—7ύ— 7,J= yiâCoSBSg > rs asrsrfiíxnaçaes experimentaxs ivsia-ss a sscçào ã, suara ; . sugararaia fxrmemente que o sitio de ligação coai elevada afinioada· para nnfocirns T, cia fibronectxna as píasas, se localizava ria regxão CS-i do domínio IliCS» A rsgi-lc CS-I compete-se de 2õ amxno-acidos (Figura 9) . Portanto, era importante determinar a sequência peptídica mínima responsável pela ligação do rscsptsr a4ssi de linfócitos a fibroneetina. A etapa inicial que seguxmas, foi dividir o péptido CS—i em dois péptidos sais pequenos? A13 s Bi2 (Figura 9) e examinar se algum desses péptidos pooia competir com a fíbronectina quanto á adesão ao recepfcor «4í3i e, portanto, xnxbir a adesão de linfócitos a fibroneetina. Os casos ind lesmei araaen te que a actividade inibidora reside no péptido £12 ? derivado aa porção terminal carboxi do CS—1« A etapa seguinte que seguimos, foi investigar a capacidade de péptidos cada vez maia longos, derivados da porção terminai carboxi da B12, para xnxbirem a adesão de linfócitos a superfícies revestidas com fibroneetina e CS-i (conjugado com R3A). Guarita á atísaao de linfócitos a fibroneetina de plasma s CS—i, estes dados Ecstrae que a sequência mínima de amino-ácidos exigida para a ligação da a4íái é &ILDVP8T.

Os leucócitos po1imorfonuc1sados (neutróflios) de pacientes com deficiência na adesão de leucócitos CLADj , têm um defeito na. expressão da subunidade S2 da integrina e5 portanto, não podem utilizar os receptores que cm tenham p2 (LFA—i, lrlac~i. ou ρ iõú/95) na sua adesão ao endotélio vascular. Portanto, os neutrófiios desses pacientes não saie® da corrente sanguínea para passarem para tecidos periféricos. No entanto, os linfócitos l.A2 experimentam de facto diapedese para passarem através tóo enooteixo e podem ser enemtrados em tecidos derivados te pacientes com esse desarranjo. Portanto, xsto implica cus os linfócitos utilizem ura raecanisrao distinto do das integrxnas cua contim &£. ourante a sua passagem da corrente sanguínea para os tecidos periféricos. A série de experimentos seguinte abrange as nossas tentativas para compreender completamente os siscsnxsffics; utxlizaoos pelos linfócitos de sangue periférico durante a

αtapeasse. us experimentas descritas suora revelaram cl aramar; ta o importante papel desempennado pelo reaeptor «46i na sdes&o ss ixnfõeitos a células endoteliais vasculares. >

Através tíe análise de fluorescência, radas as linhas; ds células testadas mostraram expressar α «4pl s/ou o «33i, tende--55 determinado que aderiam a células endotellais cultivadas, oe veia umbilical humana. Determinou—se que esss adesão é bloqueada apenas por anticorpos monoclanais orientadas para o «46 i ? determinou-se que anticorpos orientados para outros racsptores náo fém praticamente nenhum efeito inxbidor, revelando a importância do receptor «481 na interseção adesiva er.tre iinfócitos e endatélXo.

I

Hiérn disso 5 determinou-se que o CS-í tfe s£n isss e páptidas derivados (Tabelas 9, 10 e li) inibem a adesão tís ixnfâcitos a endotélio. Determinou-se que a sequência EILDVFST de amina-àciias é par t icu 1 arman te importante para a i n tsr ac ç Sc. Tsm que enfatizas-—se que não se determinou se o receptor a431 cs ixnfócitos interactua, de facto» com fíbronectina, sobre a superfície tía célula endotelia1» Também é possível que o «iíl reconheça o peptido EXLDVrST, ou uma sequência similar, no contexto de uma outra proteína, que náo a fibronectina.

s» depósito......DAS.....LijHÉg...........M^êLULM fis linhas de células seguintes fora® depositadas na «ICC, Rockville, ϊ?Β, e foram—lhes atribuídos os números de acesso seguintes:

Linhas de Célula- F4C2 r-439 PSE3 ?4CiO áMmsro de Acesso HB-10215 J-sB-102Í3 HB—10212 NB~ 2,0214 ú presente invento nlo será limitado em âmbito peles genes s proteínas enema1if içados ou microrganismos depositados qus nS-o ε-s pretendem mais do que simples ilustraçffes de um aspecto do

/ λ 4ãv S<b24-ú7à-ii-2 —72— invente, &a realidade? a partir da descrição precedente s a as figuras sneKas, tomar-ss-âc evidentes? aos --peritos ' na arte . diversas sodificaçoes do invento? além daqu.si.as que se rios trarás e dssereverá® aqui. este j as incluídas nc rretends-se que tais aodificaç3es ãeibito aas reivindicações apensas.

Claims (1)

1. -73- 3£524-u7í5—iiiS KãlVíNDICAçgfcS li, - rrscssso as preparação as asa composição farmacêutica para s. inibição os aderência tis íinfócixos às células endoxeixais, caracterizado por compreender associar u&é quantioads eficaz os um anticorpo, fragmento de anticorpo» ou s-su Geri vaso, que inibe a aderência de um receptor da tatris extraceiuiar aos Iinfocitos âs células enoofceliais, coai as vexcuio farmacalogicamente aceitável. 2â. - Processo os acordo coo a reivindicação íf caracterizado por o anticorpo, fragmsnto ou derivado se ligarem ao receptor a4 SI» 3s. - Processo de acordo cosi a reivind icação 2L, caracterizado por α anticorpo ser um anticorpo monoclortal. 4ê» - Processo de acordo com a reivindicarão 3, caracterizado por o anticorpo ser o P4C2 produzido peio resrisess. tíeoosixado no ATCC s que possui o número d® acesso riB-i02iS« 5ã„ — Processo de acordo com a reivindicação 3, carac terizatío por o anticorpo ser o P4CÍ0 produzidc pe.no moridosna depositado no ATCC e que possui o número de acesso H&- -10214» stã. — Processo de preparação de uma composição farmacâutica para a inibição da aderência de linfócitos ás células encoreilais, caracterizado por compreender associar uma quantidade eficaz de um péptido que inibe a aderência de iinfocitos ãs células encáoteliais, com um vexcuio farmacologícamente aceitável. 7s. - Processo de acordo com a reivindicação i.- caracterizado por o péptido se ligar a «4· 01» Sã. - Processa de acorda com a reiv indicação 7, caracterizado por o péptido compreender peio menos uma porção da região illCS da fibronectina, ou um seu derivado» vã» - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o péptido compreender peio menos uras porção d-s

   §5·)%0 71 439 5624-076-118 -74- região CS-l da fibronectina, ou um seu derivado. 10§. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracteri-zado por o péptido compreender pelo menos uma porção da sequência EILDVPST, um seu derivado ou uma sequência substancialmente homóloga. llê. - Processo de preparação de uma composição farmacêutica para a inibição da aderência de linfócitos ãs células endoteliais, caracterizado por se conjugar uma quantidade eficaz de um péptido ou de um anticorpo que inibe a aderência de linfócitos ãs células endoteliais com anticorpo ou outros ligandos que dirijam os anticorpos ou péptidos para tecidos específicos. 12§» - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracteri~ zado por o referido péptido ser conjugado com um anticorpo dirigido ãs células endoteliais. 13ê, - Processo de preparação de uma cosmposição farmacêutica para a inibição da aderência de linfócitos a células endoteliais, caracterizado por se associar um anticorpo anti-idiotipo que mirnetiza os receptores da matriz extracelular a401 em linfócitos activados, numa quantidade eficaz para bloquear a adesão de linfócitos activados aos ligandos de células endoteliais reconhecidos pelo anticorpo anti-idiotipo com veículos farmacologica-mente aceitáveis. 14ã, - Processo de acordo com as reivindicações 6-12, caracter i zado por a dosagem de ingrediente activo na composição farmacêutica ser tal que forneça uma concentração de cerca de 10-¾ a 10-¾ de péptido no local da inflamação, 15§. - Processo de acordo com as reivindicações 6-12, carac-terizado por a dosagem de ingrediente activo numa composição destinada a administração tópica estar na gama de 1 ug-1 mg/mX. 16ê - Processo de acordo com as reivindicações 6-12, carac ter izado por a dosagem de ingrediente activo na composição destinada a administração intravenosa, ser tal que forneça 0,7-70 ms/kQ de peso corporal, quando o ingrediente activo é um péptido com um peso molecular de 1 000 a 10 000 Dalton. -75- 71 489 5624-076-118 1.71, - processo de acordo com as reivindicações 1-5 e 11-13, caracterizado por a dosagem de anticorpo, numa composição destinada a administração intravenosa, ser tal que forneça uma dose de 0,5 mg-50 mg/kg, !8§. - Processo de acordo com as reivindicações 1-5 e 11-13, caracterizado por a dosagem de anticorpo, numa composição destinada a administração tópica, ser tal que forneça uma dose de 1 ug-1 mg/ml. J 19§ = - Processo - para a ' pr’eparação" de um anticorpo que se liga a uma molécula de adesão celular, o qual compreende os passos de pôr o anticorpo em contacto com células que apresentam a molécula de adesão celular e detectar qualquer reacção de ligação entre o anticorpo a as células, caracterizado porsefazer contactar o anticorpo com linfócitos que apresentam «4,61 e seleccionar as linhas de células que produzem anticorpos que se ligam ao α4β1 nos linfócitos.