JPH05504069A

JPH05504069A - タイプ１　インターフェロン由来の新規変異体、それらの製造方法及びそれらの適用

Info

Publication number: JPH05504069A
Application number: JP4502503A
Authority: JP
Inventors: マルタル　ジャック; デュグリズ　エリック; ガイ　ピエール; シャルリェ　マディア; シャルピニィ　ジル; レノー　ピエレット; シャウア　ジェラール
Original assignee: アンスティテュ　ナシオナル　ド　ラ　ルシェルシュ　アグロノミクーイ．エン．エル．アー．
Priority date: 1990-11-29
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 1993-07-01
Anticipated expiration: 2018-01-14
Also published as: AU9130591A; CA2074802A1; WO1992009691A1; DE69133340D1; ATE254179T1; EP0513336A1; AU656353B2; EP0513336B1; US5378823A; JP3366947B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】タイプエ　インターフェロン由来の新規変異体、それらの製造方法及びそれらの適用本発明は、組換えＤＮＡ技術によって、酵母から得られるタイプ■インターフェロン（ｔｙｐｅ　Ｉ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ）由来の新規な変異体（ｖａｒｉｅｎｔｓ）に関する。

インターフェロンは、当初、それらのウィルスの複製を阻害する能力によって同定された。それらは種々のグループに分類される蛋白質のファミリーを構成する。現在インターフェロンに提案されている分類は２種の主なタイプに分けられるニーα、ω及びβインターフェロン並びにトロホブラスチン類（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｎｓ）からなるタイプニーγインターフェロンを含むタイプ■ α及びωインターフェロンは、以前それぞれα−■インターフェロン（クラスエ α）及びα−■インターフェロン（クラス■α）という名称で知られており、トロホブラスチン類はα−■インターフェロンに分類され得たものである。

それらの抗ウィルス活性とは別に、インターフェロンは他の機能も保有し得る。

例えば、ウシやヒツジの様なある種の哺乳動物において、トロホブラスチンが妊娠の母体認識（ｍａｔｅｒｎａｌ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）の現象に関与していることが確立されている。

ヒツジのトロホブラスチン又はｏＴＰは、それぞれマータルら（Ｍａｒｔａｌ　ｅｔ　ａｌ）　［Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、、　５６．６３−７３（１９７９）；　Ｐｒｏ、　１０ｔｈ　１ｎｔｅｒｎ、　Ｃｏｎｇｅｒｓｓ　ｏｎ　Ａｎｉｍ、　Ｒｅｐｒｏｄ。

及びＡ、１．、　Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｉｇｎ　（ＵＳＡ）、　１１．５０９　（ショートコミュニケーション）１９８４］及びゴツトキンら（Ｇｏｄｋｉｎｅｔ　ａｌ）　［Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、、　６５．１４１−１５０　（１９８２）］によって発表されており、ヒツジについてはそれは妊娠１２日目と２１日目の間に胎児（ｅｍｂｒｙｏ）により多量産生され、ウシにおいては、それは１６日目と２４日目の間に産生される。それは、異なる対立遺伝子に対応して少なくとも５種のアイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ　）で存在する。

これらアイソフオームは、出願人がアンスティテユ　ナシオナル　ドラ　ルシエルシュ　アグロノミクである国際ＰＣＴ出願公開ＷＯ３９１０８，７０６中に記載されている。トロホブラスチンの分子量は２０ｋＤａであり、その等電点は５゜３から５．５の間であり、各アイソフオームに依存する。

トロホブラスチン類は成る種の反栃動物において最も特徴的なものである。しかしながら、最近の研究により、トロホブラスチン様分子（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｎ−１ｉｋｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）が他の哺乳動物（ウマ、ウサギ）及びヒトにおいて存在している可能性があることが判明している。

胎児によって産生されるトロホブラスチンは、他のインターフェロンの様に、多方面の生物学的活性を保有している。

トロホブラスチン類は、母体による胎児の認識の機構に特に関与している。

はとんどの場合、妊娠期間の長さは、卵巣周期の黄体期のそれをはるかに超える。受精が行われると、ある機構が、黄体の寿命を延ばすため及び卵巣周期のもどりを防ぐために、起こる。反契動物において、胎児はトロホブラスチン（ｏ　Ｔ　Ｐ）の形態で生化学的信号を発する。この物質によって体が、正常な胚発育に必須であるホルモン、即ちプロゲステロンを分泌し続けるようになる。

ゴツトキンら（Ｇｏｄｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ）　［Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、、　７１゜５７−６４　（１９８４）］によって、精製されたｏＴＰの子宮内注射は、レシピエンドサイクル中の雌ヒツジにおいて黄体のプロゲステロンの分泌を数日間長くすることが判明した。

フィンチャーら（Ｆｉｎｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）　ＣＪ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、。

７６、４２５−４３３（１９８６）　］は、天然のｏＴＰの子宮への注射がオキシトシン−またはエストラジオール−誘導黄体融解を数日間遅らせ、またプロスタグランジンＦ２ａ分泌の減少を伴うものであることを見出した。同様の観察が、組換えクラス■αインターフェロン類［ブランチら（Ｐｌａｎｔｅ　ｅｔ　ａｌ）、エンドクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）　１２２．２３４２ −２３４４　（１９８８）；スチュワードら（Ｓｔｅｗａｒｔ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８９）　Ｊ、　Ｒｅｐｒ、　Ｆｅｒｔ、　５ｕｐｐ、　ｐ、１２７−１３８１によってもなされた。

トロホブラスチンは、比較的短期間にのみ胎児によって分泌される：即ち、ウシについては妊娠１６日目から２４日目、ヒツジについては、妊娠１２日目から２２日目である。

もし、母親と胎児が非同期性であるならば、即ち、母親が生理学的にトロホブラスチンに感受的になって、そのような刺激に対応できる前に、胎児がトロホブラスチンを分泌するならば、黄体が退行し胎児は死亡する。この可能性は、受精卵移植（ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　）が企図されているとき特に臨界的である。現在まで、受精卵移植における失敗の割合は、３０％以上である。これは、経済学的見地から損害が太き（、この状況は体外受精の場合において更に著しいものである。

多くの胎児死亡は、胎児の発達の状態及び母体の生理学的な状態が、母体の子宮内への受精卵の移植の時に“同期性（ｉｎ　ｐｈａｓｅ）”ではないと思われる事実によるものと考えられる。加えて、受精卵は移植する前にしばしば凍結され、その結果受精卵によって産生されるトロホブラスチン産生のい（らかの能力が失われる。

トロホブラスチンの抗ウィルス活性は、また例えば上述のＰＣＴ出願８９１０８，７０６や、マータルら（ＭＡＲＴＡＬｅｔ　ａｌ）　［Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　Ａｂｓ、　５ｅｒｉｅｓ、２．３．　（１９８８）コ及びボンツアーら（Ｐｏｎｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）　［Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｒ、１５２．８０１−８０７　（１９８８）　］　ニよッテ発表すレテいる。この出願はまた器官の移植の拒絶を防ぐためのトロホブラスチンの使用を提案している。

これらの性質により、トロホブラスチンの多くの治療用途が想像できる。しかしながらそのような適用の開発は、トロホブラスチンが受胎産物からのみ産生され、それはインビボでの使用に十分な量を産生ずるものではないという事実に直面する。

上述の見地から、妊娠の最初に動物を治療するために大量のトロホブラスチンを入手可能とすることが非常に有利である。組換えＤＮＡ技術のみがこの目的を達成することができる。

ヒツジトロホブラスチン（ｏｖｉｎｅ　ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｎ　）をコードするメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）の大腸菌でのクローニングは、上述のＰＣＴ出願８９１０８．７０６に記載されている。従って、トロホブラスチンを微生物中で産生させることができるキメラな遺伝子をこのｃＤＮＡから構築することを、想像することができる。

にもかかわらず、ヒツジトロホブラスチンをコードするｃＤＮＡの発現における最初の試みは、確定的ではないことが証明された。これら最初の試みは、バクテリア（大腸菌）または酵母（ニス、セレビシアエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　）を用いた。特に、酵母でのヒツジトロホブラスチンの産生を目的とする発現カセットであって、且つ成熟ヒツジトロホブラスチンをコードするｃＤＮＡの５′末端にシグナルペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを含む発現カセットでは、合成が十分なレベルで、得ることができなかった。

さらに、ツエセボら（Ｚｓｅｂｏ　ｅｔ　ａｌ　）　［Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６１、（１３）；　５８５８．　（１９８６）コは、αインターフェロンを、良い条件下で、且つα因子の“プレプロ”システム（“ｐｒｅｐｒｏ″ｓｙｓｔｅｍ）を用いて大量に分泌することができないことを報告している。

加えて、一般的にいえば、タイプエインターフェロンは、互いにジスルフィド橋ｃｙｓｌ−ｃｙｓ９９及びｃｙｓ２９−（４Ｓ１３９を形成して結合している１、２９．９９及び１３９位の４つのシスティン残基の存在によって特徴付けられ、Ｎ末端のシスティン残基は、正確なコンフォメーション構造の維持に必須であると考えられている。

驚くべきことに、本発明者らは、Ｎ末端にシスティンを保有するインターフェロンのｃＤＮＡの５′末端に、付加的なアミノ酸をコードする、或いは例えばジペプチドＡｌａ−Ｐｒｏ又はＡｌａ−Ｇｌｙの様なジ又はトリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを付加すると有利であることを発見した。事実上、コーディング構造の全体が、酵母中で十分に発現され、それによって産生される変異体（ｖａｒｉｅｎｔｓ）は、このフラグメントを欠く構造によってコードされるものよりも多量に分泌される。更に、この方法によって得られる変異体が、天然のインターフェロンと同様の生物学的活性を保持することを確立した。例えば、ヒツジトロホブラスチンのＮ末端にジペプチドを付加すると、天然のトロホブラスチンの抗ウィルス活性、免疫学的活性及び抗黄体融解活性を保持する変異体が得られる。

従って、本発明は、以下の式のいずれかに対応するタイプＩインターフェロンの新規変異体（ｖａｒｉｅｎｔｓ）を提供する：或いは但し、Ｘｌ、Ｘ２及びＸ３は、同−又は相異なってアミノ酸を示し、Ｒｏは、タイプエインターフェロンの成熟形態のアミノ酸配列を示す。

好ましくは、Ｘｌ、Ｘ２及びＸ３は、それぞれ酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸又はアラニン、バリン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システィン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選ばれたアミノ酸を示すのが良（、Ｘｌはプロリン以外のアミノ酸を示す。

タイプエインターフェロンは、特にαインターフェロン（ＩＦＮ−α■）又はω インターフェロン（１’Ｆ　Ｎ−α■）又はトロホブラスチン（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔｉｎ　）を意味するものと理解される。αインターフェロンは、１６６アミノ酸の配列で特徴付けられ、一方ωインターフェロンは、６アミノ酸のＣ末端延長を有している。

与えられた種において、インターフェロン類は一般にある程度の天然の対立種（ａｌｌｅｌｉｃ　ｖａｒｉｅｔｙ　）を示す。例えば、ヒト由来のαインターフェロン類に関しては、少なくとも約１５種の遺伝子が知られており、そのコーディング配列はお互い８５％以上のホモロジーを示す。

有利に、本発明の変異体は、以下の式のいずれかに対応又は但し、Ｒｏ′は、ωインターフェロン又はトロホブラスチンの成熟形態のアミノ酸配列を示す。好ましくは、本発明の変異体は、以下の式のいずれかに対応する：又は但し、Ｒｏ′は、ωインターフェロン或いはウシ又はヒツジ由来のトロホブラスチンの成熟形態のアミノ酸配列を示す。

絶対的な選択として、本発明の変異体は、次の式で表さ又は但し、Ｒｏ　’は、ヒツジ　トロホブラスチンのいずれかのアイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍ　）の成熟形態のアミノ酸配列を示す。

それぞれＴ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４及びＴ５と名付けられたヒツジ　トロホブラスチンのアイソフオームは、ＰＣＴ出願８９１０８，７０６に記載されている。

本発明において、式（■）又は（ＩＸ）の好ましい変異体は、Ｒｏ″′がヒツジ　トロホブラスチンのアイソフオームＴ１からＴ５のいずれかの成熟形態のアミノ酸配列を示す。

第１図には、−例として、１位がシスティン残基で始まり、１７２位のプロリン残基で終わる（−２３から−１のシグナルペプチド）トロホブラスチンのアイソフオームのアミノ酸配列を示す。その中で：・Ｒ５はグルタミン酸、グルタミン又はアルギニン残基、・Ｒ６はアルギニン又はリジン残基、・Ｒ３５はリジン又はアスパラギン酸残基、・Ｒ４４はグルタミン酸又はアスパラギン酸残基、・Ｒ４８はロイシン又はアスパラギン酸残基及び・Ｒ４９はロイシン又はグルタミン残基である。

式（■）又は（ＩＸ）の定義内にある好ましい変異体は次の変異体を含む。

−Ｒがアルギニン残基、Ｒ６がリジン残基、Ｒ３５がアスパラギン酸残基、Ｒ４４かグルタミン酸残基、Ｒ４８がロイシン残基及びＲ４９がグルタミン残基である式（Ｘａ）の変異体、 −Ｒかグルタミン酸残基、Ｒ６かアルギニン残基、Ｒ３５がリジン残基、Ｒかグルタミン酸残基、Ｒ４８がアスパラギン酸残基及びＲ４９かロイシン残基である式（Ｘｂ）の変異体、 −Ｒかグルタミン残基、Ｒがアルギニン残基、Ｒ３５がアスパラギン酸残基及びＲ４４がアスパラギン酸残基である式（Ｘｃ）の変異体及び −Ｒがグルタミン残基、Ｒ６がアルギニン残基、Ｒ３５かアスパラギン酸残基、Ｒがグルタミン酸残基、Ｒ４８が０イシン残基及びＲ４９がグルタミン残基である式（Ｘｄ）の変異体。

更に本発明の主題は、本発明の変異体の発現用カセットにもあり、それは、少なくともニ一本発明の変異体をコードする第１のＤＮＡフラグメント、−シグナルペプチドをコードする第２のＤＮＡフラグメント（該第２のＤＮＡフラグメントは、第１のＤＮＡフラグメントの５′末端に結合している）、 −これらＤＮＡフラグメントが酵母中で発現するのを可能にするプロモーターを含有する。

そのようなカセットは、Ｎ末端側のシグナルペプチド及びＣ末端側の本発明の変異体からなるペプチドプレカーサーの発現を促進することができる。小胞体を通過する間に、シグナルペプチドは、切断によって除去され、成熟形態で変異体を放出する。

本発明の発現カセットに使用するに際して、該第２のＤＮＡフラグメントは、任意のシグナルペプチドをコードすることができるものであり、該シグナルペプチドのＣ末端は、発現カセットを収容する宿主生物のシグナルペプチダーゼによって認識されることができる蛋白質分解部位（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　５ｉｔｅ）を構成している。該シグナルペプチダーゼはシグナルペプチドのＣ末端を切断する必要がある。

本発明において、有利なシグナルペプチドは例えばニーアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−３ｅｒ−Ｉ　１　ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ　１ａ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａ　ｌ　ａ−＾１ａ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ　（蛋白質分解部位に下線を引（）を有するα因子（αｆａｃｔｏｒ　）のプレカーサーのシグナルペプチド、一アミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ− Ａｌａ−＾１ａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−丁ｈｒ−Ａｌａ− ３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ａｌａ　（蛋白質分解部位に下線を引く）を有する酵母β−１，３−グルカナーゼのプレカーサーのシグナルペプチド及びこれらペプチドの機能的誘導体（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｄｅｒｉｖｅｒｔｉｖｅＳ）を含む。

例えば、β−１，３−グルカナーゼのプレカーサーのシグナルペプチドの機能的誘導体は、９０年４月２７日のＰＣＴ出願番号ＦＲ９０１００，３０６に記載されている。

一般的に言えば、本発明の変異体のプレカーサーの発現のためのプロモーターは、酵母中で機能するいかなるプロモーターであってもよく、好ましくは、任意のコーディング配列の良いレベルでの発現を誘導することができるプロモーターがよい。有利なプロモーターとしては、例えば、α因子をコードするＭＦα１遺伝子のプロモーター又はこのプロモーターの機能的誘導体がある。

最後に、本発明の主題は、またニ一本発明の発現カセットによって形質転換された酵母細胞及び一本発明の発現カセットによって形質転換された酵母細胞を培養し、培養上清から本発明の変異体をハーベストする形質転換された酵母細胞中に存在する本発明の発現カセットは、酵母のゲノム中に組み込まれても、又は酵母中で複製することかできるプラスミドによって保持されても良い。後者の場合、プラスミドを選択圧（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）によって酵母内に維持できるようなプラスミド／酵母宿主系を選択することが適当である。有利な選択は、一方は細胞増殖に必須である代謝物に対して栄養要求性である酵母宿主であり、他方はこの栄養要求性を補充できるプラスミドである。

本発明のインターフェロン変異体は、天然のインターフェロンの適用すべてに使用することができ、例えば、抗ウィルス薬、免疫調節薬、抗炎症薬及び抗腫傷薬の製造が挙げられる。それらはまた、抗タイプエインターフェロン抗体の産生を誘導する免疫原としても使用することができる。

加えて、本発明によって得られるトロホブラスチン変異体（これら変異体は、以下一般語ＡＰｒＴと呼ぶ）は、上述のタイプ■インターフェロンの一般的な適用の他に、特に、胎児乃至受精卵（ｅｍｂｒｙｏ）の移植時の生存率を改善するのを目的とする産物の製造及び抗黄体融解剤の製造に使用でき、更に胎児（ｅｍｂｒｙｏ）の発生の初期の段階における生存の診断試薬の製造に使用される。

本発明の好ましい態様としては、ＡＰｒＴは群れ（ｔｒｏｕｐｅａｕｘ　；　ｈｅｒｄｓ　ａｎｄ　ｆｌｏｃｋｓ）を治療して、その受精率を改良するために使用される。

本発明の他の好ましい態様によれば、ＡＰｒＴは、受精卵移植を含む育種動物（ｂｒｅｅｄｉｎｇ　ａｎｉｍａｌｓ）を生殖の種々の技術、特に、凍結保存、体外受精、胎児クローニング（ｅｍｂｒｙｏ　ｃｌｏｎｉｎｇ）及び胎児のトランスジエネシス（ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ　）に関する技術において、胎児（ｅｍｂｒｙｏ）が移植される時の胎児の治療に使用される。

本発明の他の好ましい態様によれば、ＡＰｒＴは、発生の初期の段階における胎児の生存を診断する試薬及びキットの製造に使用される。

そのような診断は、胎児によって産生されるトロホブラスチンのアッセイに基づく。このアッセイは、例えば、免疫学的方法によって行われる。この場合、競合的なタイプの方法において、ＡＰｒＴは抗体産生の免疫原として、又は抗原として使用される。胎児によって産生されるトロホブラスチンは、その抗ウィルス活性によって定量され、ＡＰｒＴはそのようなアッセイにおいて抗ウィルス活性のスタンダードとして使用される。

ＡＰｒＴの免疫的性質は、不妊性が望まれる動物において抗トロホブラスチン抗体の出現を誘導するために利用される。

本発明の主題は、またＡＰｒＴを産生ずる酵母の培養培地からＡＰｒＴを精製する方法にも関し、該方法では、ＡＰｒＴは、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（例えばＤＥＡＥタイプ）で３段階溶出：・０から０．１３５ＭのＫＣＩ勾配・約０．１３５ＭのＫＣＩの無勾配相（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ　ｐｈａｓｅ　）・０．１３５Ｍから０．５ＭのＫＣＩ勾配によって精製され、ＡＰｒＴは０．１３５とＱ、３ＭＫＣｌとの間で集められる。

ＡＰｒＴは、また、逆相クロマトグラフィー又は抗トロホブラスチン抗体を使用してアフイニテイクロマトグラフィーによっても精製することができる。

本発明のより良い理解が、以下の本発明のタイプエインターフェロンの変異体の調製例に関する更なる記載によって得られるであろう。

しかしながら、これら実施例は本発明の主題の例示であって、それを限定するものではないことは自明である。

実施例　１：ヒツジ　トロホブラスチンのＡｌａ−Ｐｒ。

変異体の酵母中での発現のためのプラスミドの構築（ｐＴＧ７９０８）ＰＣＴ出願ＷＯ３９１０８，７０６に記載されている、ヒツジ　トロホブラスチンのプレカーサーをコードするＤＮＡ配列（第１図をも参照）を、ＥｃｏＲＩフラグメントの形態で、エム、ピー、キーニーら（Ｍ、　Ｐ、　Ｋｉｅｎｙ　ｅｔ　ａｌ　）、ジーン（Ｇｅｎｅ）　（１９８３）　２６　：　９１によって文献記載されたベクターＭ　１３　Ｔ　Ｇ　１３１にクローニングする。それにより、ベクターＭ１３ＴＧ７７１が得られる。成熟蛋白をコードするフラグメント、即ち、シグナル配列のないＤＮＡフラグメントを単離することができるために、アマジャムキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｋｉｔ）及び配列が以下の通りであるオリゴヌクレオチド０ＴＧ２１０２ＧＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＴＴＡＣＣＴＡＴを使用して、ＨｉｎｄｌｌＩ部位を、定方向突然変異（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって蛋白の成熟配列の５′末端に作成する。

一本鎖ベクターＭ　１３７　Ｇ　７７１に保有されるトロホブラスチンのアンチセンス鎖を以下のラインエ中に示し、オリゴヌクレオチド０ＴＧ２１０２をライン■中に示す；星印（★）は所望の変異を起こすミスマツチを表す。

ラインＩ　：　ＣＴ　ＣＣＴ　ＡＧＡ　ＧＡＣＣＣＡ　ＡＣＡ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡラインＩＩ　：　ＧＡ　ＧＧＡ　ＴＣＴ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧＴ　ＴＡＣＣＴＡ　Ｔ★★　★ それによってベクターＭ１３ＴＧ７７２０が得られる。

コーディング配列中に導入された点突然変異は、トロホブラスチンのプレカーサーの一２位のロイシン及び−１位のグリシンをそれぞれグルタミン及びアラニンに置き換えるように誘導する。Ｍ１３ＴＧ７７２０を、その後ＥｃｏＲ■で消化し、トロホブラスチンの突然変異されたプレカーサーをコードするＥｃｏＲＩＤＮＡフラグメントを、あらかじめＥｃｏＲＩで切断したベクターｐＴＧ７６９　（特許出願ＥＰ　Ｏ，２５８，１１８に記載されている）に挿入する。それによってベクターｐＴＧ７９０１が得られる。

更に、酵母中でトロホブラスチンを産生ずるために、トロホブラスチンをコードするＤＮＡフラグメントを酵母プロモーターの支配下におかなければならない。

この目的のために、ベクターＭ１３ＴＧ３８４１を用いる。このベクターは、１９９０年４月２８日に出願された出願番号ＦＲ９０１００，３０６のＰＣＴ出願に記載され、特にニーα１因子をコードする遺伝子のプロモーター（ＭＦａｌｐｈａｌ）；一α１因子のプレカーサーのシグナルペプチドをコードすか含まれている。

アマジャムキット及び配列が以下の通りであるオリゴヌクレオチド０ＴＧ２０７２ＴＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＡＣＡＣＴＡＣＡＡＣＡＧＡＡを使用して、Ｓｍａ　Ｉ制限部位を、定方向突然変異にょっに作成する。

ンＩ中に示し、オリゴヌクレオチド０ＴＧ２０７２をライン■中に示す；星印（ ★）は所望の変異を起こすミスマツチを表す。

ラインＩ　ＡＧＧ　ＣＧＴ　ＡＡＴ　ＣＧＡ　ＣＧＡ　ＧＧＴ　ＣＡＧ　ＴＴＧ　ＴＧＡ　ＴＧＴ　ＴＧＴ　ＣＴＴ５イン■　ＴＣＣＧＣＡ　ＴＴＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＣＧＧＧ　ＡＡＣＡＣＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＧＡＡ★　★★ Ｓｍａ　ＩそれによってベクターＭ１３ＴＧ３８６９を得る。コーディング配列中に導入された点突然変異は、グリシンをバリンに置き換えるように誘導する。

ベクターｐＴＧ７９０１をＨｉｎｄｌｌＩで消化して成熟トロホブラスチンをコードするＨｉ　ｎｄｍＤＮＡフラグメントを遊離させ、その後ムングビーンヌクレアーゼ（ｍｕｎｇ　ｂｅａｎ　ｎｕｃｌｅａｓｅ）で処理する。このフラグメントをあらかじめＳｍａ　Ｉで消化されたベクターＭ１３ＴＧ３８６９に挿入する。それによってベクターＭ１３ＴＧ７７４０が得られ、該ベクターは配列中及びフレーム中に：初の２つのコドン、即ち、アミノ酸アラニン及びプロリンをコードするコドン一ヒツジ　トロホブラスチンをコードするＤＮＡフラグメントを含む。

ＭＦａｌｐｈａｌプロモーター、プレ配列に続くアラニン及びプロリンコドン及び成熟トロホブラスチンをコードするＤＮＡ配列を含むベクターＭ１３ＴＧ７７４０由来の５ｐｈＩＤＮＡフラグメントを、あらかじめで５ｐｈＩで消化した酵母ベクターｐＴＧ３８２８　（ＰＣＴ特許出願ＦＲ９０１００，３０６に記載されている）に挿入する。それによってプラスミドｐＴＧ７９０８が得られる。

上述のアマジャムキットベクター及びオリゴヌクレオチド０ＴＧ２６４３を使用し、Ｍ１３７Ｇ７７４０の定方向突然変異を行うことによって、Ｎ末端延長Ａｌａ−Ｐｒ。

をコードする配列をＡｌａ−Ｇｌｙをコードする配列に置換したものが得られる。この方法によって得られるベクターＭ１３ＴＧ７７４５の５ｐｈＩフラグメントを、上述のように、プラスミドｐＴＧ３８２８に挿入し、その結果得られるプラスミドをｐＴＧ７９４１と名付ける。

ジペプチドＡｌａ−Ｐｒｏをコードする配列を欠＜ｐＴＧ７９０４と名付けられたプラスミドを、Ｍ１３ＴＧ７７４０の定方向突然変異によって、即ち、オリゴヌクレオチド０ＴＧ２２９９を使用してｐＴＧ３８２８への５ｐｈＺ制限フラグメントの挿入によって構築した。第２図にｐＴＧ７９０８、ｐＴＧ７９０４及びｐＴＧ７９４１を得るためのプロトコールをまとめる。

実施例　２：酵母による変異体Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｌミーＰｒｏ−トロホブラスチンブ　ＭＡＴａｌｐｈａ、Ｕｒａ３−２５１、−３７３、−３２８．１ｅｕ２−３、−１１２、ｈｉｓ３、ｐｅｐ４−３のサツカロミセス　セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種の酵母株を、酢酸リチウム法［エッチ。

イトウら（Ｈ，ＩＴＯｅｔ　ａｌ）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　（１９８３）　１５３　］によって、プラスミドｐＴＧ７９０８で形質転換し、ウラシ＋ル原栄養株（Ｕｒａ　）を、１０ｇ／ｌのカザミノ酸を加えたＹＮＢＧ培地（１４ｇ／ｌ　酵母窒素ベース（ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ　）　、１０　ｇ　／　ｌグルコース）上で選択する。

実施例１に記載した各種プラスミドによってコードされる異なる変異株の発現レベルを比較するために、これらプラスミドによって形質転換された細胞のクローンを、０Ｄ６００が８から１ｅ単位になるまで、フラスコ内で３０℃で培養し、細胞上清中のトロホブラスチンの産生量を決定した。

プラスミドｐＴＧ７９０４、ｐＴＧ７９０８及びｐＴＧ７９４１によってそれぞれ形質転換された酵母による組換えトロホブラスチンの産生量を、アクリルアミドゲル電気泳動を用い、クマシーブルーによる染色及び標準蛋白調製物（ファルマシア）との比較によって評価した。

結果を以下に示す。

第１表プラスミド　組換えトロホブラスチンｐＴＧ７９０４　０．０６〜０．２５ｐＴＧ７９０８　２〜２．５ｐＴＧ７９４１　１〜１，５これら結果により、２アミノ酸のＮ末端延長の存在が、酵母による組換えトロホブラスチンの産生量において、実質的な増加（４から１０倍）をもたらすことが判明する。

変異体Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｌミーＰｒｏ−トロホブラスチンフィト（ＢＩＯＬＡＦＦＩＴＥ）の２０−Ｌ発酵槽中“フエドーバされ、Ｌｏｇ／ｌのグルコース及びＨＹケース５Ｆ（ＨＹｃａｓｅ　ＳＦ）　（シェフイールド（ＳＨＥＦＦＩＥＬＤ）により販売）を含有するケラペル（ＫＭｐｐｅｌｉ）培地Ｄ［ニー、フイチターら（Ａ、ＦＩＣＣＨＴＥＲｅｔ　ａｌ）　Ａｄｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、（１９８１）　２２．１２３−１８３　］　１２１を、ｐＴＧ９７０８で形質転換された酵母クローンの前培養（ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ）　４　Ｑ　Ｑ　ｍ　１で接種する。この前培養はエルレンマイヤ−（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）中、ＹＮＢＧ選択培地上３０℃で調製させる。発酵が始まる前、接種された培地の○Ｄ６ｏｏは０．２である。発酵は、１０％アンモニア溶液の添加で調節されるｐＨ４，５において、攪拌の調節により一定に保持された飽和圧力の３０％に相当する酸素分圧で、３０℃で行う。グルコース全てが消費された時、ｏＤ６ｏｏを測定しく栄養補給の開始のＯＤ）、３時間の指数段階におけるグルコースの栄養補給を始める。その際、比増殖速度（μ）は０．１時間−１であり、゛加えられたグルコースの量（ＱＳ）は、０．０４５ｇ／ｈ１０Ｄである。

発酵を０Ｄ６ｏｏ＝１００の時に終了し、５０００ｇの遠心でハーベスティングを行う。これによって、変異体Ａｌａ−Ｐｒｏ−ｌミーＰｒｏ−トロホブラスチンる培養上清１３１を得る。

実施例　３：培養上清からの変異体Ａｌａ−Ｐｒｏ　−トロホブラスチンの精製一セミープレパラティブスケールの場合酵母培養上清を、遠心し濃縮後、ウルトラフィルトレージョンセル（アミコン（ＡＭＩＣＯＮ））中、１０ｋＤａ以上の分子を保持するフィルトロン（ＦＩＬＴＲＯＮ　）膜を通して、０゜０５Ｍトリス−塩酸バッファー（ｐ　Ｈ８，２）に対して透析する。ＡＰｒＴの同定は、セミープレパラティブスケールでは、０．０５Ｍトリス−塩酸バッファー　ｐＨ８，２で平衡化されたセミープレパラティブＴＳＫ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ陰イオン交換カラム（１５０ｍｍ　ｘ　２１．５ｍｍ　）を用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）によって行われる。流速は４ｍ１７分である。試料を注入後、９０分間で０から０．１３５Ｍ（０，０５Ｍトリス−塩酸バッファー　ｐＨ８，２）のＫＣＩ勾配の溶出を行い、０．１３５ＭのＫＣＩの無勾配の平坦相（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ　ｐｌａｔｅａｕ　ｐｈａｓｅ　）を３０分間行い、その後８０分間かけて第２の０．５ＭまでのＫＣＩ勾配で溶出を行った。溶出は２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより、モニターされる。ＡＰｒＴに対応するピークは、抗（天然トロホブラスチン）免疫血清（ＡＰｒＴと天然のトロホブラスチンの免疫学的特性の類似性を、以下の実施例４で示す。）を使用して同定し、その後相当する画分を集める。ＡＰｒＴは無勾配の平坦相の終りに出現し、０．１３５Ｍと０．２５Ｍの間に現れる。

第３図（ａ）に、得られた溶出プロフィールを示す。ＡＰｒＴに相当するピークに、斜線を施す。

ＳＯ３の存在下、ポリアクリドアミドゲル電気泳動における見掛けの分子量は、約２１ｋＤａである。第４図に、得られた電気泳動プロフィールを示す（ウェル　ａ：ＡＰｒＴ；ウェル　ｂ：分子量マーカー）。

−製造精製（Ｐｒｅｐａｔａｔｉｖｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）プレパラティブＴＳＫ　ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（２００Ｘ　５５　ｍｍ）で精製を行う。

溶出は、以下の条件下、流速２５ｍ１／分で、０．０５Ｍトリス−塩酸バッファー　ｐＨ８，３中のＫＣＩ勾配にて行う。

一８０分間の０から０．１３５ＭのＫＣＩ勾配−４０分間の０．１３５Ｍの無勾配相 −１２０分間の０．１３５Ｍから０．５ＭのＫＣＩ勾配溶出プロフィールを、第３図（ｂ）に示す。斜線のピークが、ＡＰｒＴに相当する。

実施例　４　：　ＡＰ　ｒＴの免疫学的特性と天然のトロホブラスチンのそれらとの比較ＡＰ　ｒＴと天然のトロホブラスチンの免疫学的交差反応の存在を、抗−トロホブラスチンポリクローナル抗血清及びヨウ素−１２５−標識したトロホブラスチン調製物を用いて、ＰＣＴ出願８９１０８．７０６に記載のプロトコールに従って、ラジオイミノアッセイ（ＲＩ　Ａ）によって評価する。

この様な条件下で得られるＲＩＡ阻害カーブ（１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅｓ　）を第５図に示す；希釈のＬｏｇを横座標に示し、対応するＩｏｇｉｔ＝Ｌｏｇ　（Ｂｏ／１−Ｂｏ）を縦座標に示す（Ｂｏは、一定の濃度の抗−トロホブラスチン抗血清における結合したトロホブラスチンの最大濃度を示す。） −（・）コントロールニ天然のトロホブラスチンの精製した調製物；Ｙ＝−０，９５７２Ｘ　−０，２３４１直線回帰係数＝０．９９５７（Ｘ）ＡＰｒＴを分泌する酵母の培養培地（１がら１／１００希釈）：Ｙ＝−０，９３７２Ｘ　−０，９２１直線回帰係数＝０．９９９６ −（朶）実施例１に記載したようにして得られたＡＰｒＴの調製物（１から１／４０ｏｏ希釈）；Ｙ＝−０，９３４１Ｘ　−２，４１直線回帰係数＝０．９９５５これらカーブは相互に平行であり、それによって、ＡＰｒＴの免疫学的特性が天然のトロホブラスチンのそれに類似することを示している。

実施例　５：抗ウィルス活性の試験ＡＰｒＴの抗ウィルス活性を、ラ　ボンナロディーレ及びロープ（ＬＡ　ＢＯＮＮＡＲＤＩＥＲＥ　ａｎｄ　ＬＡＵＤＥ）　［インフエクションアンド　イミニチイ（丁ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、　３２゜２８−３１．　（１９８１）　Ｅによって記載されたプロトコールに従って、水庖性口炎ウィルスの存在下、ＭＤＢＫ（マシン　ダービイ　ボビン　キト＝イ（Ｍａｄｉｎ　Ｄａｒｂｙ　Ｂｏｂｉｎｏ　Ｋｉｄｎｅｙ）　）細胞、ウシ腎臓細胞株を用いて測定する。

得られる結果を、ヒトの参照スタンダードに換算して、タイターが１００ＯＩＵのブタαインターフェロンを参照のインターフェロンとして用いた結果と比較する。

抗ウィルス活性についてのこの試験の結果により、酵母培養培地上清（０，８Ｘ１０　ＩＵ／ｍｇ）　、精製したＡＰｒＴ　（０，５５Ｘ１０　１Ｕ／ｍｇ）及び天然ノド０ホブラスチン（０，７ｘｌＯＩＵ／ｍｇ）（トロホブラスチンの量はラジオイミノアッセイによって決定される。）については、均等的な活性であることが明らかとなる。

実施例　６：インビボでのＡＰｒＴの抗黄体融解活性の証明動物及びホルモン処理３０頭のプレアルペスーデュースッド　ブレッド　雌ヒツジ（Ｐｒ６ａｌｐｅｓ −ｄｕ−３ｕｄ　ｂｒｅｅｄ　ｅｗｅｓ）について実験を行った。発情周期を、３００ｍｇの１７α−アセトキシ−９α−フルオロ−１１β−ヒドロキシプロゲステロン（サールインターヘット（ＳＥＡＲＬＥ、■ＮＴＥＲｖＥＴ））を含浸した腟海綿によって、同期性化した。これら海綿を１４日間静置し、取り外した日（１４日）に、雌ヒツジに、５００ｆＵのＰＭＳＧ　（妊娠雌鳥血清ゴナドトロピン）を筋肉内に注射し、４８時間後に雌ヒツジは新しい周期を始める（０日）。

子宮内カテーテルの挿入雌ヒツジを麻酔にかけ、その後白線で開腹し、オペレーターは子宮に接近して、インディアンインキ（Ｉｎｄｉａｎ　１ｎｋ）を使用して、黄体にマークする。

内径が０．０７６ｍｍ。

外径が０．１６５ｍｍ、長さが７０ｃｍの滅菌カテーテル（シラスティック（ＳＩＬＡＳＴＩＩＣ）　ダウ　コーニング（ＤＯＷ　Ｃ０ＲＮＩＮＧ）　）の一方の末端に短いスリーブを取り付け、カテーテルが子宮の角、実質的には、子宮卵管の接合点にとどまれることが可能なようにする。開いたところを腸線糸（ラボラトリエ　ブルウ＝　：ｙ−（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ　ＢＲＵＮＥＡ［Ｊ）　）にクリンプした針で閉じる。巾着縫合をカテーテルの挿入開口の周囲に行い、装置が恒久的に配置されるようにする。

シルク（ラボラトリエ　ブルウニュ（Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ　ＢＲＵＮＥＡＵ））にクリンプされた針でなされた安全縫合で、カテーテルを広いじん帯に取り付ける。他方の末端を、アマ糸で閉じ、ループを作成して、右側の腹部の壁に穴を開けた後、オペレーターがループを引いてカテーテルを取り出せるようにする。シラスティック　チェック　リング（ＳＩＬＡＳＴＩＣｃｈｅｃｋ　ｒｉｎｇ　）を、カテーテルの突出を制限し、腹部の壁内停止として機能すへ＜、子宮内端（ｉｎｔｒａｕｔｅｒｉｎｅ　ｅｎｄ）から３０ｃｍのところに配置する。約４０ｃｍの長さが子宮内注射をするオペレーターに自由に使用できる。カテーテルの腹部出現開口（ａｂｄｏｍｉｎａｌ　ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ　ｏｒｉｆｉｃｅ　）の回りになされた縫合によって装置の丈夫さが増強される。

カテーテルの挿入は周期の第９日から第１１日になされる。

子宮内注射雌ヒツジを３グループに分ける。子宮内注射を周期の第１０日から第１２日の間に始め、８日間にわたり一日二度行う。ＡＰｒＴを５０．０００　ＩＵ／ｍｌのペニシリンＧ及び０．２％のＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）を含有する生理食塩水中に溶解する。注射される溶液の容量は１ｍｉである。

・グループＡ：これは１０匹の雌ヒツジからなるコントロール群であり、−日２回、５０，０ＯＯＩＵ／ｍｌのペニシリンＧを含有する生理食塩水（ｏ、９％ＮａＣ１）に溶解した０、２％ＢＳＡ（フラクションＶ　ジグ７　（Ｓｉｇｍａ））溶液１ｍｌを与える。

・グループＢ：このグループは８匹の雌ヒツジがらなり、−日２回１７０μｇのＡＰｒＴを投与された。

・グループＣ：このグループは４匹の雌ヒツジからなり、−日２回８０μｇのＡＰｒＴを投与された。

・グループＤ＝５匹の雌ヒツジが一日２回３４０μｇのＡＰｒＴを与えられる。

実験の最後に、雌ヒツジ全てを、一方ではカテーテルが所定位置にとどまっているかどうか確認するため及び他方では各グループにおいてインディアンインキでマークした黄体（ｃｏｒｐｕｓ　ｌｕｔｅｕｍ　）　（又は黄体（ｃｏｒｐｏｒａ　１ｕｔｅａ　）　）の有無をモニターするために診査の開腹を行う。

プロゲステロンのラジオイミノアッセイ動物の血液を、抗凝固剤を使用せず、バキュティナーチューブ（ベクトンーデッキンソン（ＢＥＣＴＯＮ−Ｄ工ＣＫ工Ｎ５ＯＮ））を使用して頚静脈から取る。血清のプロゲステロン濃度を、ヘイマンら（Ｈｅｙｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）　［Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、、　７０．５３３−５４０．　（１９８４）　］によって記載されたプロトコールに従って、抽出すること無く直接ラジオイミノアッセイによって決定する。トリチウム−標識プロゲステロン及び特異的抗プロゲステロン免疫血清（パスツール　アンステユチュート（ＰＡＳＴＥＵＲｌＮ５ＴＩＴＵＴＥ）　’）をこのアッセイで使用する。

コントロールグループＡでは、末梢血中のプロゲステロン濃度は、第１４日から全ての雌ヒツジにおいて突然減少し、発情後筒１５日と第１７日の間では、０．５ｎｇ／ｍ１以下にまでレベルが下がる。このグループの周期の平均期間は、１５．２±０．３日である。−日当たり８０μｇのＡＰｒＴの投与は（グループＣ）、この期間を延長しない。

グループＢ（１７０μｇ／日）では、グループＡに比べ、血中のプロゲステロン濃度がゆっくり下がるのが、周期の１４日目に見られる。８匹の内７匹が、この段階でプロゲステロンレベルが、ｌｎｇ／ｍ１以上を示しくこれに対し、グループＡでは１０匹の内４匹であった）、周期の第１５日では、８匹のうち５匹か、まだプロゲステロンレベル１ｎｇ／ｍ１以上を示す（これに対しグループＡでは１０匹の内２匹であった）。

このグループにおいて、黄体融解はグループＡに比べて平均２日遅れる。

グループＤでは、３４０μｇ／日の投与量でのＡＰ　ｒＴの子宮内投与が、５匹のうち４匹が、正常周期の期間を越えて黄体の機能を良（維持する（雌ヒツジ番号、９０３７．９４３１．９４５８及び９０５３でそれぞれ２５．３２．４５及び６４日）。

異なるグループ間のプロゲステロン分泌の比較平均プロファイルを第６図に示し、これにより、明らかにグループＤでは黄体活性の著しい持久性を示すことが判明する。

（■）グループＡ加えて、開腹による外科的なモニタリングの間、新しく形成された黄体は、上述のグループＤの４匹のヒツジの中で観察されなかったことより、測定された血液プロゲステロンレベルは、ＡＰｒＴ注射の前の周期的な黄体の持続に対応することが判る。

ＡＰｒＴの可能な副作用を探すために、試験グループの雌ヒツジの平均温度を毎日測定した。

グループＡのコントロールの動物の温度と他のグループの動物の温度の間には差が認められなかった。

より一般的にいえば、行動妨害（食欲減退等）は、コントロールに比べ、ＡＰｒＴで処理した動物には観察されなかった。同様のことが血液の状況（ｐｉｃｔｕｒｅ）　（赤血球、白血球、血小板）および血清トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）レベルについてもあてはまる。

一筋肉内注射同様な実験を、筋肉内にＡＰｒＴを注射して行った。

一つの雌ヒツジグループ（Ｅ）には、−日２回ＡＰｒＴ溶液注射を行った（２ｍｇのＡＰｒＴ／日、朝１　ｍ　ｇ　ｓ夜１ｍｇ）。

コントロールの雌ヒツジグループ（Ｆ）には、ＢＳＡ溶液注射を行った（２ｍｇ／日、朝１ｍｇ、夜１ｍｇ）。

グループＥの動物の黄体活性の持続は、（子宮内注射により処置を受けた）グループＤの動物で観察されるものと同じである。

観察される唯一の副作用は、グループＦに比ベグループＥの動物の平均温度がわずかに上昇したことのみである。

対照的に、行動の修飾（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　）は観察されず、血液の状況および血清トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）レベルの修飾は行われない。

以前行った実験により、天然のトロホブラスチンの抗黄体融解活性が示されたが、トロホブラスチンがそれ自身で黄体融解を阻害するのに十分であることを断言することはできず、トロホブラスチンの異なるアイソフオーム（ｉｓｏｆｏｒｍｓ）の役割を決定できなかった。今、記載した実験によって、一種類のアイソフオームから得られるＡＰ　ｒＴは、Ｎ末端に２つのアミノ酸を付加するにも拘らず、適当な投与量で、黄体融解を阻害するのに十分であることが示される。最後にプロリン毒性を示す徴候は観察されない。

実施例　７：ＡＰｒＴの免疫抑制特性の証明これら特性を、４つのタイプの試験によって、証明される作用の異なる様式を証明するニーマウス、ヒト、またはヒツジリンパ球の増殖に対する作用によって評価される抗有糸分裂活性、−混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のインビトロでの試験によって評価される、細胞融解の移植片拒絶反応に関する阻害活性一インビボでの局所の移植片拒絶反応（宿主反応に対する局所の移植片）に関する阻害活性、 −主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）の抗原に独立なＮＫキラーリンパ球の群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に関する免疫調節活性１）フィトヘマグルチニンによって活性化されたマウスリンパ球の増殖に対するＡＰｒＴの作用マウスリンパ球を、Ｃ３Ｈ／ＨｅまたはＢａ１ｂ／ｃマウスの膵臓から、ボッター（Ｐｏｔｔｅｒ）中で混合し、ＲＰＭＩ　１６４０培養培地中で１５００ｒｐｍ、１０分間２回洗浄することにより得る。最後に、単離されたリンパ球を、１０％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）が加えられた同培養培地中で混合し、終濃度５×１０６細胞／ｍｌとした。細胞培地は、５００ｍ　ｌのＲＰＭ１１６４０　（ギブニア（ＧＩＢＣＯ）　）　＋５ｍｌのペニシリンＧ／ストレプトマイシン（ギブコ）＋５ｍｌの７．５％重炭酸ナトリウム（ギブコ）＋５ｍｌのグルタミンで構成されている。

ウェルあたり、５μｇ　／　ｍ　ｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（ウェルカム（ＷＥＬＬＣＯＭＥ）　）で活性化された６×１０５リンパ球を含有する培養培地１００μｌを、３μｇ／ｍ　ｌ　（＝１０８ｒ　Ｕ／ｍｇ）の濃度のＡＰｒＴ溶液１００μｌまたは培養培地１００μｌ　（コントロール）と共に、９６ −ウェル　マイクロテスト　プレート中、３７℃で４８時間、空気／Ｃ０２（９５％１５％）の雰囲気下、インキュベートする。

リンパ球増殖を、トリチウム化チミジン（ｔｒｉｔｉａｔｅｄ　ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ　）の取り込みを測定することによって評価する。

２５μｍの［３Ｈ］チミジン（０，０４ｍＣ１／ｍｌ）を各ウェルに加え、細胞を２４時間後にハーベストし、フィルター（グラス　マイクロファイバー　フィルター上（Ｇｌａｓｓ　Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｅ　Ｆｉｌｔｅｒｓ）　−Ｇ　Ｆ　Ｍ−ワットマン（ＷＨＡＴＭＡＮ））上に置く。乾燥後、フィルターを１ｍｌのシンチレーション液（エコンフロア−（ＥＣＯＮＦＬＵＯＲ）　）を加えたチューブ内に入れる。放射能活性をβ−ラジエーションカウクンー（ベックマン（ＢＥ（ＪＭＡＮ）　）で測定する。

結果を第７図に示す。これによって、ＡＰｒＴは、かなり顕著に（５５％）ＰＨＡ処理マウスリンパ球の増殖を抑制することが判る。

Ａ：コントロールＢ：ＡＰｒＴｃｐｍての放射能活性を縦座標にプロットする。フィトヘマグルチニンＡ　（ＰＨＡ）で活性化されたヒトまたはヒツジリンパ球の存在下、ＡＰｒＴは、同様にリンパ球の複製を抑制する。この阻害は、ＡＰｒＴの細胞毒性によるものではない。なぜなら、細胞の生存度はＡＰｒＴによって影響を受けないからである。このことは、トリパンブルー又は５１Ｃｒの存在下、リンパ球をインキュベートすることによって示される。

２）混合リンパ球反応でのＡＰｒＴの作用混合リンパ球反応を、ウェルあたり、５×１０８個／ｍｌのＣ３Ｈ／Ｈｅ応答細胞（ｒｅｓｐｏｎｓｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ）を含む１５０μｌの培養培地を、１，８００ｒａｄｓ／ｍｌで放射線照射された５×１０６の同質遺伝子（讐ｓｏｇｅｎｅｉｃ　）又は同種異系（ａｌ　ｌｏｇｅｎｅｉｃ）の刺激細胞とインキュベートすることよによって行った。

Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス細胞を同質遺伝子の反応（ｉｓｏｇｅｎｅｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）に使用し、Ｂａ１ｂ／ｃマウス細胞を同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　）の反応に使用する。３μｇ／ｍ　ｌ　（１０８Ｉ　Ｕ／ｍｇ）の濃度のＡＰｒＴ又は培養培地（コントロール）１００μｌを、３７℃で９６ウエルマイクロテスロプレート（ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）３０７２）のウェル毎に加え、培養物を空気／Ｃ０２（９５％１５％）気体雰囲気下、４日間放置した。

混合リンパ球反応の間に産生される細胞毒性のあるリンパ球によるリンパ球溶離を、トリチウム化チミジンの取り込みを測定することによって評価する。リンパ球をサンプリングしフィルター上に置く前に、２５μｍの［３Ｈコチミジンを加える。フィルターの放射能活性を、シンチレーションカウンターで測定する。

結果を第８図に示す。

Ａ：コントロールＢ：天然トロホブラスチンＣ：ＡＰｒＴｃｐｍでの放射能活性を縦座標にプロットする。

２種のマウス株（Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ３Ｈ／Ｈｅ）起源のリンパ球の２種の方法の培養において、ＡＰｒＴは、産生された細胞毒性細胞（ＣＴＬ）によるマウスリンパ球の溶解を９０％程度阻害する。

３）局所の移植片拒絶反応２　μｇ　／　ｍ　ｌの割合のＡＰｒＴを、Ｂａ１ｂ／ｃマウス起源の同種異系の膵臓細胞の懸濁液に加え、それをＦ□（Ｂａ１ｂ／ｃマウス）レシピエンドマウスの後ろ足の足底のパッドに注射する。

他方の後ろ足を、コントロールとして使用し、ＡＰｒＴを含まない膵臓細胞を注射する。腋窩のリンパ球の神経節を（マウスのグループに依存して）４〜６日後に取りだし、重量を測定する。これら神経節の細胞を取りだし、ＰＨＡで活性化し、これら細胞の［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定する。

結果を第９図（ａ）及び第９図（ｂ）に示すが、これにより、ＡＰｒＴで処理した細胞中の小リンパ管（ｌｙｍｐｈａｔｉＣ）の神経節の重量が、コントロールの細胞に比べ減少し、ＡＰｒＴで処理した足の腋窩の神経節由来の細胞のトリチウム化チミジンの取り込みは、コントロールの細胞の場合よりも低いことが判る。

この結果により、ＡＰｒＴは、ヒツジ種から非常に離れた種（マウス）においてさえも、インビボでの移植片拒絶反応を阻害することが示される。

４）ＮＫ細胞による細胞溶解に対するＡＰｒＴの作用に５６２細胞（ヒト赤白血症株）を１０分間１．８０Ｏｒｐｍで遠心し、０．５ｍｌの５１Ｃｒをペレットに加えた。

細胞／ｍｌの１度で同培養培地に再懸濁する。

マイクロタイトレージョンプレートで、３タイプのインキュベーションを行う：即ち、一１００μｌの標識されたに５６２細胞＋１００μｍの５０〜１００倍以上濃縮されたヒトリンパ球＋濃度が３μｇ／ｍ　ｌ　（１０８ｒ　Ｕ／ｍｇ）のＡＰｒＴ又は培養培地（コントロール）１００μｍ、これにより実験培地の放射能活性のある蛋白質（ｅｘｐ、　ｒａｄ、　ｐｒｏｔ、　）が決定できる、−１００μ ｍの標識されたに５６２細胞＋２００μＩの４Ｎ　ＨＣＩ、これにより培地総量の放射能活性のある蛋白質（ｔｏｔ、　ｒａｄ、　ｐｒｏｔ、　）が決定できる、−１００μｍの標識されたに５６２細胞＋２００μｌの培養培地、これにより天然の培地の放射能活性のある蛋白質（ｎａｔ、　ｒａｄ、　ｐｒｏｔ、　）が決定できる、である。

４時間のインキュベーション後、１００μｌの上清を各ウェルから取り、５１ｃｒ−標識蛋白質の遊離による放射能活性を、ｃｐｍでガンマーラジエーションカウンターを用いてカウントする。

結果を、試料の細胞溶解の平均パーセントとして表し、以下の式によって計算する：ｃｐｍ　ｅｘｐ、ｒａｄ、ｐｒｏｔ、　−ｃｐｍ　ｎａｔ、ｒａｄ、ｐｒｏｔ。

％溶解＝□ Ｃｐｍ　ｔｏｔ、　ｒａｄ、　ｐｒｏｔ、　−Ｃｐｍ　ｎａｔ、　ｒａｄ、　ｐｒｏｔ。

第１０図に、得られた結果を示す。

Ｃ：ＩＦＮ−アルファＤ：ＩＦＮ−ガンマこれにより、明らかにＡＰｒＴは、ＮＫ細胞によるに５６２標的細胞の細胞溶解を活性化することが判る。

このＮＫ細胞による細胞溶解の活性化は、クラスＩのヒトαインターフェロンを使用して観察されるものと同様であり、参照ヒトγインターフェロンのそれよりも低い。

上述より明らかなように、本発明は、より明確に記載されたこれら実施の方法、態様及び出願方法に限定されず、それどころか、本発明の視野または範囲から外れること無く、この分野の専門家が考えるすべての変異体をカバーする。

ＦＸＧＵＲ三　二ＧＣＣＴにＧ　ＧＡＣＡＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＧ　ＧＡＣＣＡＧ　Ｃ’：ＣＴＧＣＡＣＴ　ＧＧＡ　ＣＴＣ３３６本ＧＵＲＥ　ｌ　ｆ綬禮）ＭＷ　（ｋＤａ）ｒ：Ｇ″ＯＲＥ　６Ｆ工ＧＵＲＥ　９コントロール　ＡＰｒＴＦＸＧＵＲｌ、９ｂＦ工ＧＵＲＥ　１０要約書本発明は、以下の式：（但し、Ｘ工、Ｘ２及びＸ３は、同−又は相異なってアミノ酸を示し、Ｒｏは、タイプＩインターフェロンのアミノ酸配列を示す。）のいずれかで表されるタイプ■インターフェロン新規変異体、酵母中でそれらを発現可能とするカセットに関し、また、本発明は、該カセットによって形質転換された酵母から該変異体を産生ずる方法及びそれらの適用にも関する。

国際調査報告 −１，−＾−＝ｗｂ−ｗ−，ＰＣＴ／ＦＲ９＋１００９５３ｂ＋ｅ＋−ＡＰｔ” ｅｍｅ＃ｍ、ＰＣＴ／ＦＲ９１１００９５３国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の式：Ｘ１−Ｒ０（Ｉ）或いはＸ１−Ｘ２−Ｒ０（ＩＩ）或いはＸ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｒ０（ＩＩＩ）（但し、Ｘ１、Ｘ２及びＸ３は、同一又は相異なってアミノ酸を示し、Ｒ０は、タイプＩインターフェロンの成熟形態のアミノ酸配列を示す。）のいずれかに対応するタイプＩインターフェロンの変異体。
２．Ｘ１、Ｘ２及びＸ３が、それぞれ酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸又はアラニン、バリン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンからなる群から選ばれたアミノ酸（但し、Ｘ１はプロリン以外のアミノ酸を示す）を示す請求項１に記載の変異体。
３．式：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｒ０（ＩＶ）又はＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｒ０′（Ｖ）（但し、Ｒ０′は、ＩＦＮ−αＩＩ又はトロホブラスチンクラスのＩＦＮである。）で表される請求項１又は２のいずれかに記載の変異体。
４．式：Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｒ０′′（ＶＩ）又はＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｒ０′′（ＶＩＩ）（但し、Ｒ０′′は、ヒツジトロホブラスチンのアイソフォームのいずれかの成熟形態のアミノ酸配列を示す。）で表される請求項３に記載の変異体。
５．Ｒ０′′′がヒツジトロホブラスチンのアイソフォームＴ１からＴ５のいずれかの成熟形態を示す、請求項４に記載の変異体。
６．Ｒ０′′′が、１位がシステイン残基で始まり、１７２位のプロリン残基で終わる、ヒツジトロホブラスチンのアイソフォームの一般的なアミノ酸配列を示し、その中で：・Ｒ５はグルタミン酸、グルタミン又はアルギニン残基・Ｒ６はアルギニン又はリジン残基・Ｒ３５はリジン又はアスパラギン酸残基・Ｒ４４はグルタミン酸又はアスパラギン酸残基・Ｒ４８はロイシン又はアスパラギン酸残基及び・Ｒ４９はロイシン又はグルタミン残基である請求項４に記載の変異体。
７．−Ｒ５がアルギニン残基、Ｒ６がリジン残基、Ｒ３５がアスパラギン酸残基、Ｒ４４がグルタミン酸残基、Ｒ４８がロイシン残基及びＲ４９がグルタミン残基である式（Ｘａ）の変異体、 −Ｒ５がグルタミン酸残基、Ｒ６がアルギニン残基、Ｒ３５がリジン残基、Ｒ４４がグルタミン酸残基、Ｒ４８がアスパラギン酸残基及びＲ４９がロイシン残基である式（Ｘｂ）の変異体、 −Ｒ５がグルタミン残基、Ｒ６がアルギニン残基、Ｒ３５がアスパラギン酸残基及びＲ４４がアスパラギン酸残基である式（Ｘｃ）の変異体及び −Ｒ５がグルタミン残基、Ｒ６がアルギニン残基、Ｒ３５がアスパラギン酸残基、Ｒ４４がグルタミン酸残基、Ｒ４８がロイシン残基及びＲ４９がグルタミン残基である式（Ｘｄ）の変異体から選ばれる請求項６に記載の変異体。
８．請求項１から７のいずれかに記載の変異体の発現用カセットであって、少なくとも： −該変異体をコードする第１のＤＮＡフラグメント、−シグナルペプチドをコードする第２のＤＮＡフラグメント（該第２のＤＮＡフラグメントは、第１のＤＮＡフラグメントの５′末端に結合している）、−これらＤＮＡフラグメントが酵母中で発現するのを可能にするプロモーターを含有する発現用カセット。
９．第２のＤＮＡフラグメントが、α因子のプレカーサーのシグナルペプチド又は酵母β−１，３−グルカナーゼのプレカーサーのシグナルペプチド又はこれらペプチドの機能的誘導体をコードすることを特徴とする請求項８に記載の発現カセット。
１０．該プロモーターが、ＭＦα１遺伝子のプロモーター又はこのプロモーターの機能的な誘導体である請求項８又は９のいずれかに記載の発現カセット。
１１．請求項８から１０のいずれかに記載の発現カセットによって形質転換された酵母細胞。
１２．請求項１１の酵母細胞を培養し、培養上清から該変異体を回収することを含む、請求項１から７のいずれかに記載の変異体の産生方法。
１３．請求項１２の方法であって、・０から０．１３５ＭのＫＣ１勾配での溶離・０．１３５ＭのＫＣ１の無勾配相・０．１３５Ｍから０．５ＭのＫＣ１勾配での溶離からなる陰イオン交換クロマトグラフィー技術により、０．１３５Ｍから０．３ＭのＫＣ１の間で該変異体を集めることによって、該変異体を培養上清から精製する方法。
１４．医薬又は診断試薬の製造への、請求項１から７のいずれかに記載のタイプＩインターフェロンの変異体の適用。
１５．該インターフェロン変異体が、抗炎症、抗ウィルス、抗腫瘍、免疫調節、又は抗黄体融解薬の製造に使用される請求項１４に記載の適用。
１６．該インターフェロン変異体が、免疫原性組成物の製造に使用される請求項１４に記載の適用。
１７．使用されるタイプＩインターフェロンが、請求項５から７のいずれかに記載のＡＰｒＴである請求項１４から１６のいずれかに記載の適用。
１８．胎児を移植する際の胎児の治療のための、請求項５から７のいずれかに記載のＡＰｒＴの適用。
１９．胎児の生存の診断を、それらの発生の初期の段階に可能とする試薬製造のための請求項５から７のいずれかに記載のＡＰｒＴの適用。