JPH05507362A - 核酸増幅のための要素および方法ならびに付着プローブを使用する検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸増幅のための要素および方法ならびに付着プローブを使用する検出方法 本発明はオリゴヌクレオチドが結合した要素、その要素の作製方法および診断キ ット、ならびにその使用方法に関する０本発明は、特に核酸の診断に向けられる 。

近年、核酸プローブ技術は、研究者が各種疾患またはヒトもしくは動物試験試料 中に少量で存在する有機的生命体もしくは遺伝的特徴の検出へのその価値を見い 出すにつれて急速に進歩してきた。プローブの使用は、相補性の概念に基づ＜、 ＤＮＡは、相補的ヌクレオチド（または、ヌクレオチド対としても知られている ）間で水素結合によって共に結合した２本鎖を有する。

核酸複合体は、通常安定であるが、これらの鎖は水素結合が破壊する条件によっ て分離（または変性）できる、解離された一本鎖は、ヌクレオチドの相補的な配 列をもった他の鎖とのみ再結合できるにすぎない。このハイブリダイゼーション プロセスは、溶液中に存在する両鎖間で生じるか、または固体支持体に結合され た鎖の一つとで生じうる。

有機的生命体または細胞中の標的核酸配列は完全なりＮＡ分子中の非常に小さな 部分にすぎないので、はとんどの標識されたＤＮＡプローブを使用してその存在 を検出することは非常に困難である。多くの研究がほんの少量の標的核酸分子を 検出する方法を見い出すべく行われてきた。

当該技術分野の重要な進歩は、米国特許第４，６８３．１９５号、同４．６８３ ，２０２号および同４，９６５．１８８号明細書に記載されている。これらの特 許明細書は、プライマーが標的核酸１ｍ１（鋳型と考えられる）の鎖とヌクレオ チドボリメリゼーシ町ン剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）およびデオキシリポ ヌクレオシド三リン酸の存在下でハイブリダイズする増幅および検出方法を記載 する。特定条件下でプライマーの３′末端から鋳型に沿ってヌクレオチドが付加 されるに従って、プライマー伸長生成物の形成がもたらされる０次に、これらの 生成物が変性され、他の伸長反応における複数の同一プライマー用の鋳型として 使用される。変性、ハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長のこのサイク ルが多数回（例えば、２５〜３０サイクル）実施された場合、「ポリメラーゼ連 鎖反応」　（またはＰＣＢ　）として知られているこのプロセスは標的核酸のも との量を指数関数的に増加するので、それが容易に検出される。

プローブまたは他の試薬を付着するのに使用される技法の一つは、例えばヨーロ ッパ特許出願公開第３８１５０１号明細書に記載されるように固体支持体上へそ れらを乾燥堆積するにすぎない、より最近では、ポリマー粒子へ付着されたプロ ーブが、熱軟化性の別のポリマーで形成された固体支持体中に融合されている。

従来技術を凌駕する改良を提供するとはいえ、乾燥または融合による捕捉試薬（ 例えば、捕捉プローブ）の固定化は限界を有する。

これらの試薬の付着性は弱い、特に、固定化された捕捉プローブ上の試薬が溶液 中で洗浄されるアッセイでは、ある程度のプローブが移動し、そしてプローブが 洗い流された場合には潜在的なシグナルが失われる。さらに、捕捉プローブの固 定支持体への融合は高温を要するのでプローブの標的核酸捕捉能を低減する可能 性のある備品にとって危険である。

捕捉プローブの喪失に伴うシグナルの低下を最小限に止め高感度アッセイを提供 しながら、捕捉プローブの固定化用の既知手段に随伴する問題点を回避すること が望まれる。

上記問題点は、核酸試薬組成物を堆積したシール可能な支持体を含んでなる要素 において、前記組成物がａ、少なくとも７０℃のガラス転移温度を有する第一ポ リマーからなる平均直径０．１〜３μｍを有する粒子と、それらの粒子に共有結 合したオリゴヌクレオチドとを含む核酸試薬、ならびにす、第一ポリマーのガラ ス転移温度より少なくとも３０″Ｃ低いガラス転移温度を有する第二ポリマーか らなる水不溶性接着剤の混合物からなり、 前記ポリマー性接着剤が１〜２０重量％で組成物中に存在すること、も提供する 。

さらに、核酸試験要素の調製方法であって、Ａ、シール可能な支持体上へ核酸試 薬組成物を堆積する工程であって、前記組成物が、 ａ、少なくとも７０℃のガラス転移温度を有する第一ポリマーからなる平均直径 ０．１〜３μｍを有する粒子と、その粒子に共有結合したオリゴヌクレオチドと を含む核酸試薬、ならびにす、第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも３ ０℃低０ガラス転移温度を有する第二ポリマーを含む水不溶性接着剤の混合物か らなり、 前記ポリマー性接着剤が１〜２０重量％で組成物中に存在し、かつＢ、前記支持 体へ前記組成物を付着させそしてそれを乾燥されるのに十分な温度と時間で堆積 された核酸試薬組成物を加熱する工程、を含んでなる方法も提供する。

さらに、本発明は、（１）前記要素、および（２）前記核酸試薬のオリゴヌクレ オチドと標的核酸のハイブリダイゼーション生成物の検出用検出試薬、を含んで なる紗１ｔｌｒｖ：Ｍキットも提供する。

またさらに、標的核酸の検出方法であって、Ａ４　標的核酸を含むことが予期さ れる被検体を、堆積された核酸試薬のオリゴヌクレオチドが標的核酸に相補的で ある前記要素と接触させて、標的核酸と要素上の核酸試薬とのハイブリダイズし た生成物を形成する工程、および Ｂ、被検体中の標的核酸の存在の指標としてハイブリダイズした生成物の存在を 検出する工程、を含んでなる方法も提供する。

その上、また、標的核酸の増幅および検出方法であって、Ａ、被検体中の標的核 酸を増幅する工程、Ｂ、増幅された標的核酸を、堆積された核酸試薬のオリゴヌ クレオチドが標的核酸に相補的である前記要素お接触させて、増幅された標的核 酸と要素上の核酸試薬とのハイブリダイズした生成物を形成する工程、ならびに 本発明は、核酸の検出に有用な改良された要素を提供する。高シグナルと低バツ クグランドがこの改良された要素とその使用方法の特徴である。被検体中に非常 に少量（例えば、１００マイクロモル程度）で存在する核酸の検出に特に有用で ある。本発明は、捕捉プローブが限定領域に堆積されていて、流体または機械的 な取扱いによって容易に移動しないので診断使用にとって改良された要素を提供 する。従って、標的核酸の捕捉物からの潜在的なシグナルは、十分に限定されて いるので高濃度を示す。

これらの特徴は、要素の固体支持体に堅固に付着した適当な核酸試薬を有する要 素によって達成される。試薬の融合および乾燥に伴う短所は、解消されそして試 薬はアッセイ中に洗い出されない。

本要素は、ポリマー類と固体支持体へ粒状核酸試薬を付着させる接着剤との組み 合わせの使用の結果としてこれらの重要な利点を有する。使用する接着剤の量は 、試薬と核酸が容易に接触しうるように存在する試薬量に応じてＫ１１ｌ！ｆｆ される。試薬は、高感度と支持体への最高の付着を提供するには特に小さな粒子 を担持する。

図は、下記例２で記載するように行った比較アッセイの結果をグラフで示すもの である。

本発明の要素は、１種以上の核酸組成物（それぞれ、水不溶性接着剤と混合状態 の核酸試薬を含む）を堆積したシール可能な支持体を含んでなる。

シール可能な支持体は、熱または超音波処理シール法を使用してそれ自体または 他のシート材料にシール（または融合）しうる樹脂性材料（一般に合成ポリマー ）である、好ましい支持体は、ヒートシール性である。限定されるものでないが 、有用なシール可能な支持体としては、シート、繊維質マットおよび膜が挙げら れ、それらは適当な方法および適当な位置でそれら自体をシールしてシールされ たシート、マットまたは膜の間に溝または空隙を提供できる。支持体表面はある 態様では粗くして核酸組成物の付着を促進することが好ましい。

これらの支持体は、例えば、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリ［４，４’ −（ヘキサヒドロ−４，７−メタノインダン−５−イリデン）ジフェニレンテレ フタレート〕およびポリ（４，４’　−イソプロピリデンジフェニレン−１，１ ，３−）ジメチル−３−フェニル−５，４′−インダンジカルボキシレート）の ようなポリエステル類、ビスフェノールＡポリカーボネート（例、Ｇｅ＋５ｅｒ ａｌＢＩｅｃｔｒｉｃから販売されているＬＥＸＡＮ　（商標））のようなポリ 力−ポネート類、ポリ（ｐ−フェニレンテレフタルアミド）のようなポリアミド 類、４．４′−ジアミノジフェニルエーテルとビロメリン酸無水物のポリイミド 製品のようなボリイミ日りならびに酢酸セルロースおよび酢酸酸セルロースのよ うなセルロースエステル類から構成できる。

−のＢ様では、ポリエチレンシートを周縁でシールして、前記核酸試薬をはじめ とする各種試薬用の空隙を形成する。もう一つの態様では、ポリエチレンとポリ （エチレンテレフタレート）のようなポリエステルのラミネートをヒートシール することができる。ラミネートは、接着層または蒸気障壁層ならびにシール可能 な層などの各種の層をその中に担持できる。他のＩＩＩ様は、当業者にとって容 易に明らかであろう。

本明細書で開示される核酸試薬は、シール可能な支持体上に、その全体にわたっ て均一に堆積されるか、または１箇所以上の限定された領域に堆積される。試薬 は、支持体表面に丸いスポット状で、プリントされた線状で、または他の所望の 形状で限定された領域に存在することが好ましい。−の態様では、数種の核酸試 薬がその要素を使用して複数の標的核酸を同時に検出できるように支持体表面の 分離した限定領域に堆積される。例えば、要素は一連の試薬スポットまたは線を 有することができる。

本発明で使用できる核酸試薬は、少なくとも７０°Ｃのガラス転移温度（Ｔｇ　 ｌ）を存する第一ポリマー（またはポリマー配合物）の粒子からなる。Ｔｇｌは 、７０〜１７５°Ｃであることが好ましく、そして７５〜１４０゛Ｃの範囲内に あることがより好ましい。ガラス転移温度は、ポリマーがガラス状態からゴム状 、流動性または粘性ポリマーに変化する温度をいう。ガラス転移温度の測定方法 は、ハ堕肌Ｕ亜」封コ島加汎ｏｆ　Ｐｏｐ、　ｍｅｒ　Ｅｖａ匡射ｊ土Ｖｏ１． Ｉ（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

１９６６）に記載されている。

本発明で有用な粒子は水性流体に不浸透性で非膨潤性でもある。

これらの特性が要素のシール可能な支持体へ堆積された前記組成物の寸法安定性 を確保する。非膨潤性は、水性流体に粒子を３８℃で２５分間浸漬した後、Ｇｒ ｅｅｎら、Ｊ、Ｐｈｏｔｏ、Ｓｃｉ、、　２０．２０５（１９７２）に記載され る形式の膨潤針で測定した場合に、水性流体中で殆ど膨潤しない（すなわち、１ ０％膨潤未満）粒子を表わすものである。

粒子は球形であることが好ましいが、粒子の最大寸法が後述されるような球形粒 子に対する最大直径を越えない限り同様に使用できる。粒子サイズは実質的に均 一であることも好ましい、限定的には、最大の粒子寸法（例えば、直径）は０． １〜３μｍであるが、０．５〜２μｍの範囲内の直径が好ましい。

これらの粒子は、少なくともそれらの表面上は、オリゴヌクレオチドが共有結合 できる天然または合成材料（後述する）から一般に構成される。一般的に、この ような材料は、オリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体が反応して共有結合を 形成できる反応性基を担持する。

一般的に、この文脈上、アミノ基またはスルフヒドリル基が反応性であるいずれ かの反応性基が利用できる。限定されるものでないが、特に有用な反応性基とし ては、活性ハロゲン、カルボキシ、アミジン、活性２−置換エチルスルホニル、 活性２−置換エチルカルボニル、ビニルスルホニル、ビニルカルボニル、エポキ シ、アルデヒド、スルフヒドリル、アミノ（活性化後）、ヒドラジンおよびスク シンイミドオキシカルボニルのような活性エステルが挙げられる。

好ましい粒子は、活性ハロゲン、活性２−に換エチルスルホニルまたはビニルス ルホニル基を担持する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー類から調製さ れるヨーロッパ特許出願公開第３２３６９２号明細書に記載されるもののような 有機ポリマービーズである。もっとも好ましい粒子は、ヨーロッパ特許出願公開 第４６６２２０号明細書に記載されるような、下記一般式で示されるモノマー類 から調製される反応性カルボキシ基を有する。

ＣＴｏ＝ＣＲ−Ｌ　−ＣＯＯＭ 上式中、Ｒは水素、ハロゲンまたは炭素原子１〜３個のアルキルであり、Ｍは水 素、アルカリ金属またはアンモニウムイオンであり、そしてＬは炭素原子８〜５ ０個、と連結鎖中に酸素、窒素もしくは硫黄原子を有する有機連結基である。

限定されるものでないが、反応性基を担持する有用なエチレン系不飽和重合性モ ノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、ｍおヨヒｐ−（２−クロロエチル スルホニル−メチル）スチレン、ｍおよびｐ−（２−（ｐ−）リルスルホニルオ キシ）エチル−スルホニルメチル〕スチレン、ｍおよびｐ−ビニルスルホニルメ チル−スチレン、Ｎ−（ｍおよびｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）− フェニルコアクリルアミド、Ｉｌ−Ｃ２−（２−クロロエチルスルホニル）エチ ル−ホルムアミドメチル］アクリルアミド、モノ−ｍおよびｐ−ビニルベンジル グルタレート、モノーＰ−ビニルベンジルグルタレート、モノ−２−メタクリロ イルオキシエチルグルタレート、２−（４−カルボキシブチラミド）エチルメタ クリレート、２−（Ｎ’−（５−カルボキシペンチル）−ウレイド〕エチルメタ クリレート、モノ−メタクリロイルペンタ−（オキシエチレン）グルタレート、 モノ−（４−アクリロイルオキシブチル）グルタレート、４−（４−カルボキシ ブチラミド）スチレン、モノ−２−（ｐ−ビニルベンジルチオ）エチルグルタレ ート、モノ−２−（ｍおよびＰ−ビニルベンジルチオ）エチルグルタレート、４ −（４−カルボキシブチラミドメチル）スチレン、モノ−２−（Ｎ−メチル−Ｎ −（４−ビニルベンジル）アミノ）エチルグルタレート、３−（ｐ−ビニルベン ジルチオ）−プロピオン酸、４−　（２−（４−カルボキシブチラミド）エチル チオメチル〕スチレン、４−　（２−（カルボキシメトキシアセタミド）−エチ ルチオメチル〕スチレン、４−〔２−（カルボキシメチルチオアセタミド）エチ ルチオメチル］スチレン、モノ−２−（ｐ−ビニルベンジルチオ）エチルスクシ ネート、４−　（２−（カルボキシメトキシアセトキシ）エチルチオメチル〕ス チレン、モノ−４−ビニルベンジルスクシネート、２−　（４−ビニルベンジル チオ）コハク酸、２−（４−ビニルベンジルチオ）安息香酸、モノ−２−（２− （４−ビニルベンジルチオ）エトキシ〕エチルチオメチルマロネート、七ノーメ タークリロイルペンタ（オキシエチレン）フタレート、モノ−２−（２−（２− （４−ビニルベンジルチオ）エトキシ］エチルチオ）エチルスクシネート、モノ −２−（２−（１−（４−ビニルベンジルチオ）エトキシ〕エチルチオ）エチル フタレート、３−　（４−（４−ビニルベンジルオキシ）ベンジルチオ〕プロピ オン酸および４−　（４−［４−（４−ビニルベンジルオキシ）ベンジルチオ〕 ベンジルチオ）醋酸が挙げられる。

記載した七ツマー類は、ホモポリマーとして重合できるが、それらを１種以上の 他のエチレン系不飽和重合性モノマーと共重合することが好ましい。

より具体的には、本発明で利用できる粒子は、それらの表面が少なくとも、 （ａ）前記の反応性基を担持する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー類 から誘導される反復単位を０．１〜６０重量％、（ｂ）ホモポリマーである場合 には、水不溶性ホモポリマーを提供する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノ マー類から誘導される反復単位を４０〜９９．９重量％、ならびに（Ｃ）ポリマ ーにコロイド安定性を提供する親水性上ツマー類に限定されない前記Ｃａ）およ び（ｂ）成分を特定するもの以外の１種以上のエチレン系不飽和重合性上ツマ− から誘導される反復単位０〜１５重量％、からなるポリマーから構成される。

限定されるものでないが、前記成分（ｂ）に有用なモノマー類としては、ビニル 芳香族１！（例えば、スチレンならびに４−ビニルトルエン、α−メチルスチレ ン、２．５−ジメチルスチレン、４−を−ブチルスチレンおよび２−クロロスチ レンのようなスチレン誘導体類）、アクリル酸およびメタクリル酸のエステル類 およびアミド類（例えば、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、ｎ−ブ チルアクリレート、２−エチルへキシルメタクリレート、ベンジルアクリレート およびＮ−フェニルアクリルアミド）、ブタジェン、アクリロニトリル、ビニル アセテート、ビニルベンジルアセテート、ビニルプロミド、ビニリデンクロライ ドならびに２種以上の重合性基を担持する架橋性モノマー（ビニル基のような、 例えばジビニルベンゼンならびにジーおよびトリアクリレート）が挙げられる。

水不溶性ホモポリマーを提供できる他のモノマー類もまた有用であり、当業者に とって容易に明らかになるであろう。ビニル芳香族モノマーｉが成分（ｂ）とし て好ましい。

限定されるものでないが、成分（ｃ）に利用できるモノマー類としては、非イオ ン性親水性モノマー類、例えばアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−イソプ ロピルアクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエ チルメタルアクリレート、Ｎ−ビニル−２−ピロリドンおよび当業者に容易に明 らかな他のモノマーが挙げられる。加えて、活性メチレン基を担持するモノマー 類、例えば２−アセトアセトキシエチルメタクリレート、およびカチオン性七ツ マー類、例えばＮ、Ｎ、Ｎ−トリメチル−Ｎ−ビニルベンジルアンモニウムクロ ライドおよび３−ヒドロキシエチル−１−ビニルイミダゾリウムクロライドも使 用できる。

成分（Ｃ）としてさらに他の利用できるモノマー類には、例えば米国特許第５， ０８６，１４３号明細書に記載されるようなポリオキシアルキレン側鎖を担持す るものも包含される。限定されるものでないが、代表的なモノマー類としてはペ ンタエチレングリコールモノメタクリレート、エイコサエチレングリコールモノ メタクリレート、ペンタエチレングリコールモノアクリレート、ポリプロピレン グリコールモノメタクリレートおよびポリプロピレングリコールモノメタクリレ ートが挙げられる。

成分（Ｃ）に好ましい七ツマ−は、２−アセトアセトキシエチルメタクリレート である。

各成分（ａ）、　（ｂ）および（Ｃ）の各踵モノマー混合物は、それらの七ツマ ー類が相互に相溶性であり、そして得られた粒子表面に十分な反応性基が存在す る限り共重合できる。

好ましい第一付加ポリマーとしては、ポリ〔スチレンーコーモノ−３−（ｐ−ビ ニルベンジルチオ）プロピオン酸〕またはポリ〔スチレンーコーモノ−２−（ｐ −ビニルベンジルチオ）エチルスクシネート〕が挙げられる。

好ましくは、これらの粒子は成分（ａ）２〜１５重量％、成分（ｂ）８５〜９８ 重量％および成分（ｃ）０〜１０重量％からの付加重合によって誘導される反復 単位からなる。より好ましくは、それらは、成分（ａ）２〜１０重量％、成分（ ｂ）９０〜９８重量％および成分（ｃ）　０〜１０重量％から誘導された反復単 位からなる。

粒子を作製するのに本発明で利用できるコポリマー類は、標準的な乳化重合およ び懸濁重合によって製造できる。

これらの粒子はまた、反応性基が表面で利用できるようにシェルとして前記ポリ マーを有するコアー／シェル粒子であることができる。このような粒子のコアー は、必要な物理強度とガラス転移温度を付与するのに通するどのようなポリマー からも構成でき、そして、通常、シェルポリマーを構成するものと異なる。

オリゴヌクレオチド分子はそれらの粒子に共有結合される。「オリゴヌクレオチ ド」の語は、２個以上（好ましくは３個以上）のデオキシリボヌクレオチド類ま たはりボスクレオチド類からなる分子を意味する。その大きさは、オリゴヌクレ オチドが相補的な標的核酸、それが結合されるポリマー粒子の大きさ、およびい ずれかのスペーサー分子の長さを含む粒子に結合する手段をはじめとする多くの 因子により左右される。

オリゴヌクレオチドは、いずれかの適当な方法によってポリマー粒子に共有結合 される。それらは、粒子表面の反応性基と対応するオリゴヌクレオチドのスルフ ヒドリル基、カルボキシル基またはアミノ基との反応によって直接結合すること ができる。また、オリゴヌクレオチドをビオチニル化または他の修飾により、そ の後、粒子に結合できるその対応する受容体と特異的に結合できる特異的パイン ディング種を付加することができる。アビジン−ビオチン複合体は、例えばヨー ロッパ特許出願公開第１３９４８９号、同１９２１．６８号および同３７０６９ ４号明細書に記載されるように前記目的に使用することが知られている。オリゴ ヌクレオチドへのビオチンの挿入は、ヨーロッパ特許出願公開第９７３７３号明 細書（１９８４年１月４日公開）に記載されるものをはじめとする既知法を使用 して達成できる。

しかしながら、オリゴヌクレオチドに反応性基を提供するか、または粒子の表面 からオリゴヌクレオチドを離す「スペーサーＪ基もしくは「リンカ−」基を提供 するために化学的に修飾することが望ましい、これを実施する方法は、例えば米 国特許第４，９１４，２１０号および国際公開第ＷＯ３９／１１５４８号に記載 されるように周知である。

ポリマー性接着剤を使用して核酸組成物の核酸試薬を要素のシール可能な支持体 へ付着する。それはまた、相互に試薬粒子を付着するようにも作用する。この接 着剤は、粒子の第一ポリマーのガラス転移温度（Ｔｇ＋）より少なくとも３０° Ｃ低いガラス転移温度（Ｔｇｔ）を有する第二ポリマーを含んでなる。好ましく は、ＴｇｚはＴｇ＋より３０〜１２０°Ｃ低い、また、ＴｇＺは９０°Ｃより低 い。より好ましくは、ＴｇＺは一５０〜＋４０゛Ｃの範囲内にある。

接着剤は、通常診断方法および分析方法でさらされる水性流体に不溶性である。

より具体的には、第二ポリマーは、 （ｄ）前記第一ポリマーの成分（ｂ）で使用される１種以上エチレン系不飽和重 合性モノマー類から誘導される反復単位５５〜１００重景％より、 （ｅ）水溶性ホモポリマーを形成するか、または極性基〔例えば、第一、第二お よび第三アミン、ヒドロキシおよびポリ（アルキレンオキシ）基〕、アニオン性 基〔例えば、カルボキシレート、スルホネート、サルフェール、ホスフェートお よびホスホネート〕およびカチオン性基〔例えば、トリアルキルアンモニウムお よびトリアルキルホスホニウム〕ならびに当業者に容易に明らかな他の基に由来 する親水性を付与する１種以上のエチレン系不飽和モノマー類から誘導される反 復単位０〜４５重量％より、そして（ｆ）ポリマー接着剤に架橋を付与する１種 以上のエチレン系不飽和モノマー類から誘導される反復単位より、構成される。

前記成分（ｂ）の第一ポリマー用として記載したモノマー類を成分（ｄ）でも使 用できるが、成分（ｄ）に好ましいモノマーは、アルキルアクリレート類および アルキルメタクリレート類であって、アルキル基が炭素原子１〜８個を有する、 例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、２−エチルヘ キシル、ヘキシルおよびオクチル、であり、そしてアルキル基は１個以上のチオ 、オキシもしくは炭素原子１〜６個のイミノアルキル基で中断されていてもよい ものである。限定されるものでないが、より好ましいモノマー類としては、メチ ルアクリレート、メチルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレートおよびｎ−ブ チルメタクリレートが挙げられる。メチルアクリレートが最も好ましい。

限定されるものでないが、成分（ｅ）に利用できるモノマー類としては、電荷を 有する七ツマ−（カチオン性またはアニオン性）、例えば酸およびその塩、であ り、限定されるものでないが、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、２−ア クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、３−メタクリロイルオキシプロ パン−１−スルホン酸およびそれらの塩、Ｎ−（２−アクリロイルオキシエチル ）　Ｎ、Ｎ、Ｎ　ｈリメチルアンモニウムメトスルフェート、３−ヒドロキシエ チル−１−ビニルイミダゾリウムクロライド、アミノエチルメタクリレート塩酸 塩、Ｎ−（２−アミノプロピル）メタ−アクリルアミド塩酸塩、２−カルボキシ エチルアクリレート、ｐ−スチレンスルホン酸およびそれらの塩、ｍおよびｐ− カルボキシメチルスチレンおよびその塩、ならびに他のエチレン系不飽和重合性 スルホネート、カルボキシレート、サルフェート、ホスホネート、第四級アンモ ニウム塩、ピリジニウム塩、イミダゾリウム塩またはキノキサリニウム塩が挙げ られる。また、第一ポリマーの成分（ａ）について前記したカルボキシ含有モノ マー類（およびそれらの塩）も利用できる。

成分（ｅ）でも有用な非イオン性モノマー類としては、アミン含有モノマー類、 例えばジメチルアミノプロピルアクリレートおよびジエチルアミノエチルメタク リレート、ならびにヒドロキシ含有モノマー類、例えば２−ヒドロキシエチルア クリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２．３−ジヒドロキシプロ ピルアクリレートおよびペンタエチレングリコールモノアクリレートが挙げられ る。

成分（ｅ）で好ましい七ツマー類としては、２−アクリルアミド−２−メチルプ ロパンスルホン酸およびその塩、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩ならび にＮ−（２−アミノプロピル）メタクリアミド塩酸塩が挙げられる。

架橋を付与する成分（ｆ）用のモノマー類は、重合中に架橋するか、またはその 後の化学反応後にそれら自体もしくは追加の架橋剤によって架橋を付与するもの のいずれであってもよい。このようなモノマー類には、多官能性ビニルモノマー 、例えばジアクリレート、トリアクリレート、ジメタクリレートおよびトリメタ クリレート（例えば、エチレンジアクリレートおよびジメタクリレート）Ｍ。

ジビニルベンゼン類、ならびに既知の化学反応により架橋できる活性メチレン基 含有モノマー類が包含される。後者の例としては、２−アセトアセトキシエチル メタクリレート、Ｎ−（２−アセトアセトキシエチル）アクリルアミド、Ｎ−（ ２−アセトアセトキシエチル）アクリルアミド、Ｎ−（２−アセトアセタミドエ チル）メタクリレート、６−（ｍおよびｐ−ビニルフェニル）−２，４−ヘキサ ンジオン、エチルアクリロイルアセテートおよび当該技術分野で既知の他のモノ マーが挙げられる。

成分（ｆ）の好ましいモノマー類としては、２−アセトアセトキシエチルメタク リレート、Ｎ−（２−アセトアセトキシエチル）アクリルアミドおよびＮ−（２ −アセトアセタミドエチル）メタクリレートが挙げられる。

好ましくは、接着の調製に利用できるコポリマー類は、成分（ｄ）７０〜９８重 量％、成分（ｅ）２〜３０重量％および成分（ｆ）０〜ＩＯ重量％から誘導され た反復単位からなる。より好ましくは、それらは、成分（ｄ）８５〜９５重量％ 、成分（ｅ）２〜１５重量％および成分（ｆ）０〜８重量％からなる。

接着剤として好ましい付加ポリマーは、ポリ〔メチルアクリレート−ツー２−ア クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、ナトリウム塩−ツー２−アセト アセトキシエチルメタクリレート〕である。

本発明では、使用されるポリマー性接着剤と核酸試薬の混合物を含んでなる核酸 試薬組成物では、接着剤が乾燥重量で２０％までの量で存在できる。好ましくは 、接着剤は、１〜２０重量％の量で存在し、２〜１０重量％の量がより好ましい 。

場合によって、前記組成物は、他の添加剤、例えば緩衝剤、界面活性剤またはバ インダーを少量、一般的には総組酸物重合の５重量％未満含むことができる。

核酸試薬組成物は、いずれか適当な方法でシール可能な支持体にのせることがで きる。例えば、標準的な装置および方法を使用して支持体上に手動で塗布するか 、ピペットの先端、マイクロシリンジの先端または微量分散ポンプを使用して模 様付けするかスポントし、次いで乾燥することができる。しかし、マイクロシリ ンジを使用して水性懸濁液状態の組成物をシール可能な支持体上へ配置し、次い で乾燥することが好ましい。乾燥は、前記第一ポリマーのガラス転移温度より低 い１０〜８０″Ｃの範囲内で配置された組成物を加熱することで達成される。

支持体の核酸試薬組成物の被覆は、アッセイフォーマントの形式、アッセイ要素 の形状および当業者が容易に予期できる他の因子に応じて相当変動できる０例え ば、組成物をシール可能な支持体に均一に塗布するか、またはそれらの限定され た領域（前述のように）に塗布することができる。限定された領域への組成物の 塗布が好ましい。各種の試薬類を異なる領域に塗布する技法は周知である。ある 例では、試薬類を視覚的に容易に検出するための模様を提供するような限定され た領域に配置できる。

シール可能な支持体を、より親水性になるように予備処理して使用することが好 ましい。このような態様では、核酸試薬組成物が支持体により効率よく付着され る。予備処理は、化学的、電気的または機械的なものであるか、あるいは別のタ イプの処理の組み合わせであることもできる０例えば、化学的処理には、数分間 硫酸中の重クロム酸ナトリウムによる表面のエツチングを行なうクロム酸の使用 を含む。

支持体はまた、希ガスのようなガス状の活性化種で処理することもできる。さら に他の既知方法は高温で二酸化窒素を使用するものである。

電気的処理には、コロナ放電、フレーミング、電極放電法が包含される。

他の予備処理には、同時に化学的および電気的処理を必要とする、例えば反応性 ガスの存在下でラジオ波電磁界による処理がある。

好ましい予備処理としては、コロナ放電処理、クロム酸処理および反応性ガスの 存在下でのラジオ波電磁界処理が挙げられる。コロナ放電が最も好ましい。

前記予備処理に代えまたはそれを補足するものとして、親水性下塗り層として作 用し、そして前記配置された組成物の付着性を向上させる親水性ポリマーを塗布 することにより予備処理することもできる。下塗り層ポリマーおよびそれらの調 製法は当該技術分野で周知である。一般的に、このようなポリマー類は、カルボ キシ、スルホニル、ホスホノ、ホスフィニル、カルボニルおよびヒドロキシのよ うなペンダントアニオン性基または親水性基を１個以上担持する反復単位からな る。このような特徴を存する他の一般的なポリマー類には、限定されるものでな いが、ビニルクロライド、ビニリデンクロライドおよび当業者に容易に明らかな 他のモノマーのようなモノマーに由来する一定のハロゲン含有するものが包含さ れる。

特に有用な下塗り層材料としては、ポリ（アクリロニトリルーコービニリデンク ロライドーコーアクリル酸）、ポリ（メチルアクリレートーコービニリデンクロ ライドーコーイタコン酸）、ポリ（モノメチルイタコネートーコービニリデンク ロライド）、ポリ（モノエチルイタコネートーコービニリデンクロライド）およ びポリ（モノブチルイタコネートーコービニリデンクロライド）が挙げられる。

本発明の要素は、核酸試薬組成物を本明細書で特定されるようなシール可能な支 持体上に堆積させ、次いでその組成物を乾燥させるのに十分な温度と時間堆積さ れた組成物を加熱することによって作製できる。付着に適する温度と時間は逆比 例的に変動しうるが、一般的には、第一ポリマーのガラス転移温度より１０〜８ ０’Ｃ低い温度が使用される。加熱時間は、一般に１０〜４０秒である。

本発明の要素は、下記に詳述される分析方法において、数種のフォーマットで使 用できる。例えば、本発明の要素は実験室や医院において標準的なピペット、ビ ーカーおよびアッセイを実施する際に適する容器を始めとする、かかるアッセイ で既知の他の器具を使用する非常に簡単な製品であることができる。最も加工さ れていない容器は、試験管、キュベント、フラスコまたはビーカーであるが、よ り加工された容器はアッセイを行うために自動化方法を容易にする目的で作製さ れてきた。

また、本発明の要素は使い捨て試験デバイスの一部を組み込んで使用することも できる。

この要素に組み込むのに好ましい容器は、ヨーロッパ特許出願公開第３８１５０ １号明細書に記載されるもののような自蔵式の試験デバイスである。このような 試験デバイスは、化学試験バック、ポーチまたはキュベントとしても当該技術分 野で知られている。それらは、米国特許第４，９０２．６２４号明細書に記載さ れるようにアッセイの実施中に一定の温度特性を提供するように構成されている 。このような試験デバイスは、複数の各種の試薬類、緩衝剤およびアッセイのい ろいろな段階で利用される他の材料を担持する反応室（または、それらがよ（呼 ばれる「ブリスター」）をもつ、この試験デバイスは、本発明の好ましい方法で あるＰＣＢ増幅の各段階を促進させる加熱と冷却を適切、かつ迅速に行うことが できる。他の適当な容器は、本発明の方法の自動化した使用または単回使用に適 するように作製できる。

このような試験デバイスでは、本発明の要素を、標的核酸の検出を行う一連の反 応を促進するように試薬類と流体を通過する特定の室（または「ブリスター」） 内に配置する。この例では、試薬類と流体は要素に固定化された核酸試薬を通し て流れるものと考えられる。要素上の核酸試薬は検出するための標的核酸の「捕 捉」に使用される。要素は、接着剤でそれを固定し、試験デバイスのポリマー壁 に要素を融着するか、または他の都合のよい手段によって試験デバイス中に組み 込むことができる。他の態様では、要素自体で試験デバイスの壁または一体とな った部分を形成できる。

試験デバイスは、流体を移動するための外部加圧源を同時に操作する手段をもつ が、試料が導入された後は、まったく漏れを生じないように完全に密閉されるよ うに構成されていることを意味する自蔵式であることができる。

好ましい態様では、試験デバイスは２枚の比較的薄い柔軟性ポリマー材料のシー ト〔例えば、ヒートシール性または加圧シール性のポリエチレン−ポリ（エチレ ンテレフタレート）ラミネート、具体的には５ＣＯＴＣＩＩＰＡＫ　（商！Ｉ） ヒートシール性フィルムＮｏ、２２９またはＮｏ。

２４１（両者とも３Ｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手筒）〕を含んでなる。

このシートは、加熱または超音波加圧シール法によりそれらの外周に沿って固着 される。米国特許第４，３５２．９２５号明細書に記載されるようなエチレング リコール、ジエチレングリコールとテレフタル酸のコポリエステル類や、米国特 許第４．１２６．４６４号明細書に記載されるようなポリスチレン−ポリイソプ レン−ポリスチレンのブロックコポリマーとポリ（エチレンーコービニルアセテ ート）の混合などの感熱性接着剤も使用できる。

室（空隙）または溝は、一定部位でシートをシールすることによりシート間で形 成され、こうして試薬Ｍおよび流体は、試験デバイス内に保持され、加圧デバイ スを使用することによりそこから移動させることができる。このような室の一つ に本発明の要素は配置される。好ましくは、本発明の要素は、アッセイで使用さ れる試薬類と流体が要素を通って使用済み試薬類と流体を集めるように設計され た貯蔵室中に入るように、他のコンパートメントと通路で関連付けられる状態に 設計される室に配置される。

本発明の要素は、標的核酸の検出用の多種多様な方法で使用できる。それは、被 検体中の１種以上の標的核酸中に存在する１種以上の特定の核酸配列の増幅およ び検出に特に有用である。このような被検体としては、細胞、ウィルス、毛、体 液または検出可能な遺伝子ＤＮＡもしくはＲＮＡを始めとする他の物質が挙げら れる。

本発明は、実施される反応工程に関連して指数関数的な量で怒染源の特異的な核 酸配列を生じさせる上で特に有用である。生成物は、使用された特定のプライマ ー類の末端に対応する末端をもつ個別の核酸複製物であろう、精製されているか または精製されていないどのような核酸源も出発原料として利用できる。核酸混 合物も、必要によって使用できる。複製させる配列は、完全な核酸の一断片であ ることができる。さらに、複数種の二本鎖核酸を増幅し、次いで各特定の核酸用 の対応するプライマーセットと検出手段（前記捕捉試薬類を含む）を使用して同 時に検出することもできる。同−核酸内の複数種の配列を増幅し、そして検出す ることもできる。

検出すべき核酸は、プラスミド、いずれかの起源に由来する天然のＤＮＡまたば ＲＮＡを包含する各種の起源から得ることができる。核酸は、血液、末梢血単核 細胞（ＰＢＭＣ）　、組織物質または既知の方法を使用する当該技術分野で知ら れている他の起源を包含する各種組織から抽出できる。本発明は、ゲノムＤＮＡ 、細菌ＤＮＡ、糸状閑ＤＮＡ、ウィルスｌ２ＮＡで見い出される核酸配列、また は細菌もしくはウィルス感染細胞中で見い出されるＤＮＡもしくはＲＮＡの増幅 および検出にとって特に有用である。

本明細書で開示される方法を使用して、感染症、遺伝病またはガンのような細胞 病に付随する特定の核酸配列の検出または特性決定をすることができる。また、 法医学的な検査およびＤＮＡタイピングにも使用できる。

−の態様では、本発明の要素は、ハイブリダイゼーションアッセイとして知られ ているアッセイの捕捉プローブを提供するのに使用される。ハイブリダイゼーシ ョンアッセイの詳細、それに使用される操作および試薬類は、米国特許第４．． ３５８，５３５号、同４．４８６．５３９号および同４，９２５，７８５号明細 書のような文献に記載されている。

本発明の要素は、ポリメラーゼ連鎖反応（またはＰＣＲ）後の増幅された標的核 酸の「捕捉」にも有用である。　ＰＣＨの詳細も周知である０本発明の実施に際 して有用な検出プローブは、標的核酸と直接的または間接的にハイブリダイズし うる。「間接的」とは、標的核酸と検出プローブの両者に相補的な中間的なオリ ゴヌクレオチド類が存在しうろことを意味する。標識を付着しそしてプローブを 調製するための操作も当該技術分野で周知である。有用な標識としては、放射性 同位体、電子濃厚試薬、発色体、蛍光体、リン光成分、フェリチンおよび他の磁 性体、ビオチンおよび他の特異的パインディング種、化学発光成分ならびに酵素 が挙げられる。限定されるものでないが、有用な酵素としては、グルコースオキ シダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリコシラ ーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられ、そしてそれらは既知の方法でオ リゴヌクレオチドへ結合することができる。このような酵素用の基質および色素 生成組成物も周知である。

標識がペルオキシダーゼのようなより好ましい酵素である場合には、アッセイの ある時点で、過酸化水素および適当な色素生成組成物を加えて検出可能な色素を 生じさせる。例えば、有用な色素生成試薬としては、テトラメチルベンジジンお よびその誘導体類、ならびにトリアリールイミダゾールロイコ色素またはペルオ キシダーゼと過酸化水素の存在下で色素を提供するように反応する他の化合物の ようなロイコ色素が挙げられる。特に有用な色素生成組成物は、米国特許第５． ０２４，９３５号明細書に記載されている。

別の好ましいＬ！ｉ様では、ＰＣＩｉ法のプライマーがビオチニル化されており 、そして増幅された核酸は検出可能に標識されたアビジンまたはその誘導体を使 用して検出される。例えば、アビジンは、酵素と結合されているか、または放射 能成分もしくは前記検出プローブについて記載したもののような他の検出成分を 担持できる。増幅された生成物上のビオチンがアビジンと複合体を形成し、次い で適当な検出試薬および検出法を使用する。プライマー類のビオチニル化は、既 知の操作で行うことができる。

本発明の要素は、要素を使用するための１種以上の試薬類、器具または説明書も 含む診断試験キットに含めることができる。好ましくは、本発明のキットは、要 素中の核Ｍ試薬オリゴヌクレオチドと標的核酸のハイブリダイゼーション生成物 、および標的核酸（ＰＣＲによるかまたは関係に）を検出するための検出試薬を 含む、「検出試薬」とは、単独でまたは協同して検出可能なシグナルを提供する １種以上の独立した反応性物質を意味する。最も好ましくは、検出試薬は、標的 核酸に相補的なＰｃｔ？で使用されるビオチニル化プライマーである。また、検 出試薬はハイブリダイゼーシゴンアッセイで利用可能な水溶性の標識されたオリ ゴヌクレオチドである。

本発明のキットは、限定されるものでないが、洗液、抽出組成物、希釈剤、緩衝 剤、プライマー類、プローブ類、［ｌＮＡポリメラーゼ類およびＰＣＲ試薬組成 物のような他の試薬類および流体を含むことができる。これらのキットの構成物 は、一般的に、適当な条件下で輸送および保蔵するのに適する態様で個別に包装 される。

以下の実施例は、本発明の実施を具体的に説明するために含めるものであって、 本発明をいずれかの方法に限定することを意味しない。すべてのパーセンテージ は、特記しない限り重量基準である。

のための　・および 実施例１および２で使用する核酸試薬は、次のように調製した。

ポリ〔スチレンーコーモノ−２−（ｐ−ビニルベンジルチオ）エチルスジネート 〕（重量比９５：５）のポリマー粒子（平均粒径１．２μｍ）は、既知の乳化重 合法で調製した。これらの粒子に次のオリゴヌクレオチドを結合させた。

配列番号１： ５　’　−Ｘ　−ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡ　ＡＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡ Ｔ−３’上記で、Ｘは、米国特許第４，９６２，０２９号明細書に従って調製さ れ、オリゴヌクレオチドに結合された２つのテトラエチレングリコールスペーサ ー基を有するアミンジオール連結基である。

これらのオリゴヌクレオチド分子を、次のように粒子に結合させて核酸試薬を形 成した。

前記粒子を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液（０，１モル濃度、 ｐＨ６）で２回洗浄した。前記緩衝液（１ｍＬ）で懸濁した粒子の試料（３０μ ｇ）を、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸 塩（！ｌ衝液中１００ｍｇ／ｍＬ液０．１５ｓＬ）とオリゴヌクレオチド〔精製 水中５７．３００／ｍＬ液０．０２８８ｍＬ、１．６５００単位または５５μｇ ）と混合した。この混合物を室温（２０−２５°Ｃ）で１５分間回転させて遠心 した０粒子を水で３回洗浄し、次いで固形物含量０．９％にて精製水で再懸濁し た。

この核酸試薬を、ポリ（メチルメタクリレート−ツー２−アクリルアミド−２− メチルプロパンスルホン酸・ナトリウム塩−ヨー２−アセトアセトキシエチルメ タクリレート（重量比９０：４：６）の接着剤と混合した。得られた組成物は、 約１８％（乾燥重量）の接着剤を含んでいた。この混合物を、下記実施例１のよ うに水性懸濁状でヒートシール可能な支持体にのせて要素を形成した。

実施例２のＰＣＲ法で使用するプライマー類は、次のとおりである。

配列番号２： ５　’　−Ｘ　−ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡ　ＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧ　ＣＣＡＴＧＣ ＡＡＡ　−３’配列番号３： ５　’　−ＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴ　ＧＴＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＴＧＧＴＴＣ−３ ’上記のＸは、米国特許第４，９１４，２１０号明細書の教示に従って調製し、 オリゴヌクレオチドに結合させたビオチンテトラエチレンスペーサー基を表わす 。

実施例３用に、異なる大きさの核酸試薬を、ポリ〔スチレンーコ−３−（ｐ−ビ ニルベンジルチオ）プロピオン酸〕（モル比９７．６　：２．４）を使用して同 様に調製し、そして下記オリゴヌクレオチドを粒子へ同様に結合させた。

配列番号４： ５　’　−ＡＴＴＡＴＣＴＴＴＴ　ＡＴＡＴＴＣＴＡＡＣＣＡＧＧＡＴＴ　−Ｘ 　−３’上記のＸは、３′末端に２つのテトラエチレングリコールスペーサーお よび３−アミノ−１，２−プロパンジオールリンカ−を含む。

実施例３では、ポリ〔ｍおよびｐ−ビニルトルエン（６４：　３６）　−コーメ タクリル酸〕　（重量比９８：２）の粒子も使用した。これらの粒子は、常法の 懸濁重合法または米国特許第３．６１５，９７２号明細書に記載される限定され た凝集操作のいずれかにより調製した。

実施例２用の標的核酸は、旧Ｖ−１の１１領域の１４０ヌクレオチドセグメント であった。

洗液（２５０μＬ）は、リン酸ナトリウム（１０ミルモル濃度、ｐＨ７，４＞、 塩化ナトリウム（１５０ミルモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（１ミリモル 濃度）およびデシルスルフェート（１％）の緩衝液からなる。洗浄は使用前に５ ５℃に予備加熱した。

ＰＣＲで使用したＤＮＡポリメラーゼは、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒ ｍｕｓ　Ｊ」１国竪）から単離した。

ストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの結合物は、Ｚｙｓ＋ｅｄ　 Ｌａｂｓ（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）から入手し、チメロサール防腐剤（０ ，０１％）含有のリン酸緩衝液（ｐＨ７，３）中力ゼイン（０，５％）で１：８ ０００に希釈した。

ロイコ色素組成物は次のように調製した。すなわち、２−　（４−ヒドロキシ− ３，５−ジメトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダ ゾールをリン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中ポリ（ビニルピロリドン ）（２０％）溶液に溶解し色素の０．１％溶液を調製した０次に、この溶液を、 過酸化水素（１０ミリモル濃度）、４′−ヒドロキシアセトアニリド電子移動剤 （５ミルモル濃度）およびジエチレントリアミン−五酢酸キレート剤（１０マイ クロモル濃度）をリン酸ナトリウム緩衝液に含む溶液へ添加して、最濃度１％ポ リ（ビニルピロリドン）およびｏ、ｏｏｓ％ロイコ色素とした。

実施例２用のＰＣＲ反応液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン緩衝 液（１０ミリモル濃度、ｐＨ８）、塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、塩化マ グネシウム（１０ミリモル濃度）およびゼラチン（１０層ｇ）からなる、この溶 液にプライマー類（各１００ピコモル）、ｄＮＴＰ　（各１．５ミリモル濃度） およびＤＮＡポリメラーゼ（７，５単位）を加えた。

実施例３用として、下記溶液をｔＪ４製し、ＰＣＲ試薬を提供した。

ＤＮＡポリメラーゼ用貯Ｒ緩衝液は、最終濃度が緩衝剤（２０ミリモル濃度）、 塩化カリウム（１００ミリモル濃度）、ジチオスレイトール（１ミリモル濃度） 、エチレンジアミン四酢酸（０，１ミリモル濃度）、グリセロール（５０％）、 界面活性剤（各０，５％）、ゼラチン（２００μｇ／＋ｗ［、）となるようにト リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（８吐、１ミリモル濃度、ｐＨ８ ）、塩化カリウム（１３，３２層し、３モル濃度）、ジチオスレイトール（０， ４ｍＬ、　１モル１ｌ１１度）　、エチレンジアミン四節１１（０，１ε社、０ ．２５モル濃度）、グリセロール（２５０社、８０％）、界面活性剤溶液（６， ，６７ｍＬ）　（３０％Ｎ０ＮＩＤＥＴ　（商標）Ｐ−４０非イオン界面活性剤 （Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）および３０％↑−ＥＥＩＪ　（商標）２０非 イオン界面活性剤（ＩＣＩ＾ｍｅｒｉｃａｓ＋　Ｉｎｃ、）含有〕、ならびにゼ ラチン（４ｍＬ、２％）から調製し、水で溶液４００ｓ＋Ｌにした。

第二緩衝液もまた、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリモル濃 度、ｐＨ８，３）　、塩化カリウム（５０ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（ １０ミリモル濃度）、ゼラチン（１０層ｇ）およびグリセロール（７，５％）を 含むように調製した。

第三緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（１０ミリモル濃度） およびＴＷＥＥＮ　（商標）２０非イオン界面活性剤（ｏ、５％）を含めて調製 した。

次に、ＰＣＲ試薬溶液を、第二緩衝液２８８μＬに貯蔵緩衝液１２μＬの混合物 を加え、次いでこの混合物２２０μＬへ第三緩衝液８０μＬを７７０工、最後に ビオチニル化標的核酸をそれへ４０ピコモル濃度になるまで加えることによって 調製した。

実施例１１案■立里 この実施例は、本発明の要素の作製法を例示し、それを本発明の範囲外の要素（ すなわち、核酸試薬が別の方式で支持体上へ付着された要素）と比較する。

本発明の要素は、ポリエチレンとポリエチレンテレフタレートのラミネートであ るＴｙｐｅ　２４１５ＣＯＴＣＨＰＡＫ　（商標）ラミネート（３ＭＣｏ＋ａｐ ａｎｙ　）の試料を固体支持体として使用して作製した。このラミネートのポリ エチレン側を、Ｐｉｌｌａｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　（Ｂａｒｔｌａｎｄ 。

Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）またはＥｎｅｒｃｏｎ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　（Ｍｅｎ ｏａ＋ｏｎｅｅ＋　Ｗｔｓｃｏｎｓｉｎ）のいずれかから入手された常用の処理 装置を使用し、５６〜５９ｄｙｎｅ／ｃａｍ”のレベルでコロナ処理した。

ポリエチレン−ポリ（エチレンテレフタレート）ラミネートシートのポリエチレ ン側を要素支持体上ヘヒートシールして封入された検出溝を形成した。この溝に 、その溝中へ流体を注入するための流人末日と溝から流体を排出するための流出 手段を含めた。

前記接着剤と核酸試薬との組成物を、水による水性懸濁液（２μＬ、試薬の固形 分０．９％、接着剤０．２％）状でコロナ処理した支持体上へ塗布した。この懸 濁液を、検出溝中の支持体の限定された領域に塗布し、次いで支持体の底面と接 触させなから熱アイロン（９５工、３０秒間）で乾燥した。次に、ラミネートシ ートを要素上ヘヒートシールして封入検出溝を形成した。

要素上へラミネートシートをヒートシール前に、物理試験をして、核“酸試薬組 成物がどの程度支持体上へ固定化されたかを測定した。

この試験は、組成物の乾燥堆積物の摩擦と支持体を１８０°折り曲げることより なる９本発明の要素では、試薬が支持体から脱着されないで支持体に緊密に固定 化されていた。これらの物理試験中に支持体から剥離した組成物は非常に少なか った。

接着剤を省略したこと以外は、同じ支持体と同じ核酸試薬を使用して対照要素を 同様に作製した。前記のように、グリシン緩衝液（０４１４１モル濃ｐＨ８，５ ）中の核酸試薬（０，９％固形分懸濁液）をコロナ処理した支持体の限定された 領域に塗布し、乾燥し、次いでラミネートシートを支持体上ヘヒートシールした 。ヒートシール前に、乾燥した試薬を物理的に摩擦し、支持体を１８０°折り曲 げて試薬が支持体にどの程度付着したかを観察した。これらの物理試験中に多量 の試薬が支持体から脱着した。

実施例２　ＰＣＲ法に表止ｉ斐ｉｑ便貝この実施例は、ＨｌシーＩ　ＤＮＡ配列 の増幅と検出に際して、実施例１に記載した要素の使用を例示しそして比較する 。

前記ＰＣＲ試薬溶液に、いろいろな量の前記標的１（ＩＶ−Ｉ　ＤＮＩＩフラグ メンｌ−（０，１００，１０”および１０４コピーまたは分子）を加えた。得ら れた溶液それぞれの総量は１００ｕＬであった。

各溶液を２５０μＬの微量遠沈管に入れ、下記プロトコールの４０サイクルによ りＰＣＲで増幅した。

変性：９６°Ｃに加熱し、３０秒間保持、そしてプライマー／伸長：６８°Ｃに 冷却し、１分間保持。

ＰＣＢに使用した装置は、Ｃｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ　［１ｌｓｅｒから市販さ れているパーキン・エルマーサーモサークラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｂｉｇｅｒ　Ｔ ｈｅｒ＋５ｏｃｙｃｌｅｒ）であった。

最後のサイクル後、溶液を９５°Ｃに加熱し２．５分間保持して得られた二本鎖 生成物を変性した。この加熱された溶液を、固定化された核Ｍ試薬と確実に均一 な接触を行うｎ様で要素（実施例１および対照）の検出構内にそれぞれ注入した 。溶液の注入後、各要素を５分間４２°Ｃでインキュベートし、要素中の試薬の オリゴヌクレオチドに対し相補的な核酸をハイブリダイズさせた。残存流体を、 加圧空気で押し出すか、またはシリンジを使用して吸引することによって除去し た。

前記洗液を各要素に２回注入し、ハイブリダイズしていない物質を除去した。最 後に洗液が除去されたなら、前記ストレプトアビジンとペルオキシダーゼ結合物 を含む溶液（２００μＬ）を各要素に注入し、２分間４２°Ｃでインキュベート した。溶液を除去した後、同様にロイコ色素溶液を注入し、次いでさらに５分間 インキュベートした。

残存流体を除去し、要素中に出現した色素シグナルをスケールＯ〜１０（最も高 濃度）で視覚的に段階分けした。結果を図に示す。両要素のバックグランド（Ｏ コピー数）は、非常に低かった。しかしながら、増幅された標的核酸のアッセイ について、本発明の要素は各濃度の標的核酸でより高いシグナルを与えた。この ことは、要素を繰り返し洗浄しそして数種の流体との接触を伴う検出掻作を通じ て本発明の核酸試薬が良好に維持されることを示す、実施例１に示したように、 対照要素の試料においては、多量の試薬が支持体から簡単に８１１脱着するよう に、アッセイで使用した流体がアッセイ中に試薬を除去したものと考えられる０ 本発明の要素が、標的核酸の低濃度（１００コピー数）の存在に対して高い感度 を示すことは非常に重要である。

実施例３　および　し、−′におしる　なるき　の　Ｍ　′　Ａ　る　・ この実施例は、核酸試薬組成物を含む要素を作製する上で本発明の実例を示すと 共に、その使用を本発明の範囲外の要素の使用と比較する。また、処理済み支持 体の使用と未処理支持体の使用の比較も行う。

ポリ〔スチレンーコ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン酸〕　（モル 比９７．６　：　２．４　、重量比９５：５）水性ポリマービーズ分散液を各種 粒子サイズで調製し、次いで下記に示すオリゴヌクレオチドをそれに共有結合し た。前記配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドを、粒子に２つのテトラエチ レングリコールスペーサー、３−アミノ−１，２−プロパンジオール成分および チミン塩基を介して連結した。オリゴヌクレオチドを、３−アミノ−１，２−プ ロパンジオール成分を介してポリマー粒子に付加させて試薬を形成した。

いろいろな粒子サイズを有する試薬を次のように調製した。

本発明の実施に有用な試薬類は、約１．３μｍの平均サイズの粒子からなり、そ して２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール／エチレン ジアミン四酢酸緩衝液中前記ポリマー接着剤（固形分０．１％）を使用して２． ０％固形分として調製した。

本発明の範囲外の核酸試薬（対照Ａ）は、約８μｍの平均サイズの粒子からなり 、そして２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１゜３−プロパンジオール／エチ レンジアミン四酢酸緩衝液中ポリマー接着剤（固形分０．１％）を使用して４． ０％固形分として調製した。

対照ＢおよびＣは、異なるサイズの粒子混合物を含めた。すなわち、対照Ｂは、 １．３μｍの粒子（２０％）と８．０μｍの粒子（８０％）の混合物であり、そ して対照Ｃは前記両サイズの粒子５０　：　５０　（重量）混合物であった。

これらの調製物を使用して、アッセイ用捕捉プローブとして試薬類を担持する下 記要素を作製した。

これらの要素を、成形ステージジン（または型）でポリ（エチレンテレフタレー ト）／ポリエチレンラミネートのシートを加熱し、シートの一側面に対して引っ 込んだｔｉＩ域が整列するように作製した。

その後、カバーシートをラミネートすることにより、得られたパウチは狭い溝を もっていた。その後、各引っ込んだ部分を適当な試薬類で満たした。これらの引 っ込んだ溝部上にカバーを形成するためにシートをラミネートし、次いで各引っ 込んだ領域とそれから主溝へ連結する溝間にバースト（ｂｕｒｓ　ｔ　）シール を作り封止した。ところで、まず最初に主溝の末端周辺の区画を、８秒間、ＴＥ ＦＬＯＮ　（商標）絶縁プレートに対して０．９５ｃｍのクリアランスでＥｎｅ ｒｃｏｎ　ＤＹＮＥ−Ａ−ＭＩＴＥ（商標）コロナ放電ユニットからのコロナ放 電で処理した０次に、前記試薬調製物（本発明および対照Ａ−Ｃ）を、処理表面 上に直ちに４滴（谷溝は調製物０．９〜１．１μＬを示す）ずつ−列に堆積させ て要素を作製した。堆積された調製物を、室温下の空気流で約２０秒間その支持 体の裏面をアイロンで約９５℃に加熱しながら乾燥させた。

別の組の要素も、コロナ放電処理をしないことを除き同様に作製した。

デバイス中に形成されたブリスター（または室）を所望の試薬類で満たした。各 要素の第一ブリスターを、試験すべき被検体を受容しそして加熱中それを保持す るのに適合させた。第ニブリスターは、前記ストレプトアビジン−西洋ワサビペ ルオキシダーゼ結合物で満たした。第三ブリスターには、１％デシル硫酸ナトリ ウム洗液（１０ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、　１５０ミリモル濃度の塩化 ナトリウムおよび１ミリモル濃度のエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを含有す るリン酸緩衝溶液、ｐ）ｌ　７．４中）を含ませ、そして第四ブリスターには前 記ロイコ色素組成物を含めた。主溝の末端に配置した最後のブリスターは他のも のより大きく、廃液を受容する吸着剤を満たした。

次に、カバーシートをラミネートし、３工程でシールした。最初は、サンドイン チを加圧しそして３種の試料溶液を含有するブリスターと廃液ブリスターの周囲 だけを約１４９℃に加熱することによりシールした。バースト（破裂）シールを 含む試料受容性ＰＣＲブリスターおよび溝の形成を、１６３℃で適当な形状の加 熱ジョー間で試験バックを加熱することで完了した。第三の工程は、上部プレー ト温度を１９９°Ｃとし下部プレートは周囲温度を維持したままで試験バックの まわりを周囲シールを形成し、そしてすべてのブリスター周囲シールを密封した 。完成した試験バック（または要素）中に形成された溝を、ブリスターを含む要 素の部分を横断するローラーの通過が、各ブリスターのシールを順次破裂させて 、各ブリスターから捕捉プローブを含有する区画につながる主導まで存在する溝 に沿って試薬類を押し進めるように配置した。

完成した融着試験要素を使用して、次のように調製した試薬を評価した。

試験デバイス中のブリスターを、ポリマー粒子に共有結合したオリゴヌクレオチ ドの配列に相補的な配列をもつ標的核酸として使用するビオチニル化オリゴヌク レオチド試薬溶液約２０５〜２１０ｕＬで満たし、次いでシールした。ビオチニ ル化標的核酸の配列は、次のとおりであった。

配列番号５： ５　’　−Ｘ　−ＡＡＴＣＣＴＧＧＴＴ　ＡＧＡＡＴＡＴＡＡＡ　ＡＧＡＴＡＡ Ｔ　−３’上記のＸは、ビオチンに結合させるための単一テトラエチレングリコ ール連結基である。　ＰＣＲ反応液中の標的核酸濃度は、４０ピコモル濃度であ るものと信じられる。

この試薬を含有するブリスターを１２０秒間９５〜９８°Ｃに予備加熱し、次い でシールを圧搾破裂させて溶液を核酸試薬含を区画へ押し進めた。検出ブリスタ ー中でオリゴヌクレオチド試薬と捕捉試薬を４２℃５分間のインキュベーション を通じてハイブリダイズし、一方、アビジン−西洋ワサビベルオ牛シダーゼ結合 物を含有するブリスターは３５°Ｃに加熱した。この結合物ブリスターのシール を破裂させ、それが利用可能なビオチニル化試薬と免疫反応する検出区画へ溶液 を向かわした。洗液ブリスターのシール（５５℃３００秒間予備加熱した）を、 破裂させ、洗液を検出区画に向かわして、主溝の清浄と未結合物を検出区画から 除去した。次に、色素生成組成物を含有するブリスターのシールを破裂させ、組 成物を検出区画へ向かわした。インキュベーションを５分間続けて色素を生成さ せ、次いで色濃度スコアーを読み取った。

下記表Ｉに示す色濃度スコアーを、２つの特徴、すなわち「色素スポット品質」 および「色素スポット色彩」について評価した。

「色素スポット品質Ｊは、下記評価の各スコアーに基づいて１〜５までのスコア ーで判断した（より低いスコアーが望ましい）。

１−上質のスポット、剥離や欠陥は視覚的に検出されない、２一点蝕または非常 にわずかな剥離（スポットの２５％未満）、３−わずかな剥離（スポットの約２ ５％）、４−著しい剥離（スポットの２５〜７５％）、５−スポットの完全な剥 離。

「色素スポット色彩」は、カラーチャート（０は濃度がなく、１゜は最高濃度で ある〕に対する液状色素濃度の視覚的な比較により評価した。ここでは、高スコ アーが望ましい、「品質」および「色彩」の総合スコアーは、試薬調製物が付着 性（「品質」）が改善されているか、生じたシグナル（「色彩」）が欠損してい るか、あるいは両者を示す。

ｌ−± 「色素スポット品質」 「色素スポット色彩」 表Ｉに示されるデータから導き出される結論は次のとおりである。

ｌ）コロナ処理しない支持体に担持される要素は、許容できる色素濃度（すなわ ち、感度）を示すが、多くの色素類が洗い流された（すなわち、不十分な付着） 。

２）より大きな粒子を含有する試薬調製物は、不透明性が増し、低いスポット品 質と色彩を示す。

３）最高の「色素スポット品質」のスコアーは、小さな粒子試薬調製物（湿式お よび乾式とも）で達成された。

４）ビーズ（２種）の混合物は、一般に、所期の試薬付着性と色素濃度の組み合 わせを提供しない。

ｙ−死−１ （１）配列番号＝１： （ｉ）配列の特＠： （Ａ）長　さ＝２８ヌクレオチド （Ｂ）型　：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本領 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の型ニブローブオリゴヌクレオチド（ｉｊ）ハイボセティカル二Ｎ 。

（１ｖ）アンチセンス：Ｎ。

（ｖｉ）起　源：合成 （ｖｉ）直接の起源：同じ （ｘ）公開情報：なし くｘｉ　）配列の記述：ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　：　１　：ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡ 　ＡＴＧＡＣＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴ（ｘ）公開情報：なし くｘｉ　）配列の記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　：　５　：ＡＡＴＣＣＴＧＧＴ Ｔ　ＡＧＡＡＴＡＴＡＡＡ　ＡＧＡＴＡＡＴコピー数 要約書 各種フォーマットで核酸の検出に有用な要素が作製された。この要素は、核酸試 薬組成物が堆積されたシール可能な支持体をもつ。

この組成物は、オリゴヌクレオチドが共有結合されたポリマー粒子からなる核酸 試薬混合物である。これらの粒子は、少なくとも７０°Ｃのガラス転移温度を有 する第一ポリマーから調製され、そして平均直径０．１〜３μｍを有する。この 試薬は、支持体に、第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも３０℃低いガ ラス転移温度を有する第二ポリマーからなる水不溶性接着剤を使用して付着して いる。接着剤は、前記組成物の１〜２０重量％で存在する。この要素は、ハイブ リダイゼーシヨンおよび他の核酸アッセイにおいて高悪度で低いバックグランド を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸試薬組成物を堆積したシール可能な支持体を含んでなる要素において、 前記組成物が、 ａ．少なくとも７０℃のガラス転移温度を有する第一ポリマーからなる平均直径 ０．１〜３μｍを有する粒子と、それらの粒子に共有結合したオリゴヌクレオチ ドとを含む核酸試薬、ならびにｂ．前記第一ポリマーのガラス転移温度より少な くとも３０℃低いガラス転移温度を有する第二ポリマーからなる水不溶性の接着 剤、の混合物からなり、 前記ポリマー性接着剤が前記組成物中に１〜２０重量％で存在することを特徴と する要素。 ２．前記支持体が、コロナ放電処理、クロム酸処理または反応性ガスの存在下に おけるラジオ波電磁界による処理で、あるいは前記組成物が堆積される支持体上 に親水性下塗り層を担持させることで付与された親水性表面基を担持する請求の 範囲第１項の要素。 ３．前記ポリマー粒子の平均直径が、０．５〜２μｍである請求の範囲第１項の 要素。 ４．前記第一ポリマーのガラス転移温度が７０〜１７５℃であり、そして前記第 二ポリマーのガラス転移温度が前記第一ポリマーのガラス転移温度より３０〜１ ２０℃低い請求の範囲第１項の要素。 ５．前記接着剤が、前記組成物中に２〜１０重量％で存在する請求の範囲第１項 の要素。 ６．前記第一ポリマーが、 ａ．活性ハロゲン、カルボキシ、アミジン、活性２−置換エチルスルホニル、活 性２−置換エチルカルボニル、活性エステル、ビニルスルホニル、ビニルカルボ ニル、アルデヒド、ヒドラジン、エポキシ、アミノおよびスルフヒドリルからな る群より選ばれた反応性基を担持する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノマ ー類から誘導される反復単位を０．１〜６０重量％から、ｂ．疎水性を付与する １種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー類から誘導される反復単位６０〜９ ９．９重量％から、ならびにｃ．（ａ）および（ｂ）で特定されたもの以外の１ 種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー類から誘導される反復単位０〜１５重 量％から、 なる請求の範囲第１項の要素。 ７．前記第二ポリマーが、 ｄ．疎水性を付与する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー類から誘導さ れる反復単位５５〜１００重量％から、ｅ．親水性を付与する水溶性ホモポリマ ーを形成する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノマー類から誘導される反復 単位０〜４５重量％から、ならびに ｆ．前記第二ポリマーに架橋を付与する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノ マー類から誘導される反復単位０〜１５重量％から、なる請求の範囲第１項の要 素。 ８．前記組成物が前記支持体の限定された領域に堆積された請求の範囲第１項の 要素。 ９．ａ．少なくとも７０℃のガラス転移温度を有する第一ポリマーからなる平均 直径０．１〜３μｍを有する粒子と、それらの粒子に共有結合したオリゴヌクレ オチドとを含む核酸試薬、ならびにｂ．前記第一ポリマーのガラス転移温度より 少なくとも３０℃低いガラス転移温度を有する第二ポリマーからなる水不溶性の 接着剤、の混合物からなる組成物であって、 前記ポリマー性接着剤が１〜２０重量％で存在する組成物を堆積したシール可能 な支持体からなる要素を含んでなる自蔵式試験デバイス。 １０．Ａ．ａ．少なくとも７０℃のガラス転移温度を有する第一ポリマーからな る平均直径０．１〜３μｍを有する粒子と、それらの粒子に共有結合したオリゴ ヌクレオチドとを含む核酸試薬、ならびにｂ．前記第一ポリマーのガラス転移温 度より少なくとも３０℃低いガラス転移温度を有する第二ポリマーからなる水不 溶性の接着剤、の混合物からなる核酸試薬組成物であって、前記ポリマー性接着 剤が前記組成物中に１〜２０重量％で存在する組成物をシール可能な支持体上に 堆積する工程、Ｂ．前記堆積した核酸試薬組成物を前記支持体上に付着させるの に十分な温度と時間加熱する工程、 を含んでなる核酸試験要素の作製方法。 １１．（１）ａ．少なくとも７０℃のガラス転移温度を有する第一ポリマーから なる平均直径０．１〜３μｍを有する粒子と、それらの粒子に共有結合したオリ ゴヌクレオチドとを含み、そのオリゴヌクレオチドが標的核酸に相補的である核 酸試薬、ならびにｂ．前記第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも３０℃ 低いガラス転移温度を有する第二ポリマーからなる水不溶性の接着剤、の混合物 からなる組成物であって、 前記ポリマー性接着剤が前記組成物中に１〜２０重量％で存在する組成物を堆積 したシール可能な支持体からなる要素、と（２）前記要素の核酸試薬のオリゴヌ クレオチドおよび前記標的核酸のハイブリダイゼーション生成物を検出するため の検出試薬、を含んでなる診断試験キット。 １２．前記検出試薬が、前記標的核酸に相補的なビオチニル化プライマーである 請求の範囲第１１項のキット。 １３．Ａ．標的核酸を含有することが予期される被検体を、核酸試薬組成物を堆 積したシール可能な支持体からなる要素であって、前記組成物が、 ａ．少なくとも７０℃のガラス転移温度を有する第一ポリマーからなる平均直径 ０．１〜３μｍを有する粒子と、それらの粒子に共有結合したオリゴヌクレオチ ドとを含み、そのオリゴヌクレオチドが前記標的核酸に相補的である核酸試薬、 ならびにｂ．前記第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも３０℃低いガラ ス転移温度を有する第二ポリマーからなる水不溶性の接着剤、の混合物からなり 、 前記ポリマー性接着剤が前記組成物中に１〜２０重量％で存在する要素とを接触 させて前記標的核酸と要素上の前記核酸試薬のハイプリダイズした生成物を形成 する工程、ならびにＢ．前記被検体中の標的核酸の存在の指標として前記ハイプ リダイズした生成物の存在を検出する工程、を含んでなる標的核酸の検出方法。 １４．Ａ．試験検体中の標的核酸を増幅する工程、Ｂ．前記増幅した標的核酸を 、核酸試薬組成物を堆積したシール可能な支持体からなる要素であって、前記組 成物がａ．少なくとも７０℃のガラス転移温度を有する第一ポリマーからなる平 均直径０．１〜３μｍを有する粒子と、それらの粒子に共有結合したオリゴヌク レオチドとを含み、そのオリゴヌクレオチドが前記標的核酸に相補的である核酸 試薬、ならびにｂ．前記第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも３０℃低 いガラス転移温度を有する第二ポリマーからなる水不溶性の接着剤、の混合物か らなり、 前記ポリマー性接着剤が前記組成物中に１〜２０重量％で存在する要素と接触さ せて前記増幅した標的核酸と要素上の前記核酸試薬のハイプリダイズした生成物 を形成する工程、ならびにＣ．前記被検体中の標的核酸の存在の指標として前記 ハイプリダイズした生成物の存在を検出する工程、を含んでなる標的核酸の増幅 および検出方法。