JPH0830704B2 - 核酸増幅のための要素および方法ならびに付着プローブを使用する検出方法 - Google Patents

核酸増幅のための要素および方法ならびに付着プローブを使用する検出方法

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JPH0830704B2
JPH0830704B2 JP4508823A JP50882392A JPH0830704B2 JP H0830704 B2 JPH0830704 B2 JP H0830704B2 JP 4508823 A JP4508823 A JP 4508823A JP 50882392 A JP50882392 A JP 50882392A JP H0830704 B2 JPH0830704 B2 JP H0830704B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明はオリゴヌクレオチドが結合した要素、その要
素の作製方法および診断キット、ならびにその使用方法
に関する。本発明は、特に核酸の診断に向けられる。
近年、核酸プローブ技術は、研究者が各種疾患または
ヒトもしくは動物試験試料中に少量で存在する有機的生
命体もしくは遺伝的特徴の検出へのその価値を見い出す
につれて急速に進歩してきた。プローブの使用は、相補
性の概念に基づく。DNAは、相補的ヌクレオチド（また
は、ヌクレオチド対としても知られている）間で水素結
合によって共に結合した２本鎖を有する。
核酸複合体は、通常安定であるが、これらの鎖は水素
結合が破壊する条件によって分離（または変性）でき
る。解離された一本鎖は、ヌクレオチドの相補的な配列
をもった他の鎖とのみ再結合できるにすぎない。このハ
イブリダイゼーションプロセスは、溶液中に存在する両
鎖間で生じるか、または固体支持体に結合された鎖の一
つとで生じうる。
有機的生命体または細胞中の標的核酸配列は完全なDN
A分子中の非常に小さな部分にすぎないので、ほとんど
の標識されたDNAプローブを使用してその存在を検出す
ることは非常に困難である。多くの研究がほんの少量の
標的核酸分子を検出する方法を見い出すべく行われてき
た。
当該技術分野の重要な進歩は、米国特許第4,683,195
号、同4,683,202号および同4,965,188号明細書に記載さ
れている。これらの特許明細書は、プライマーが標的核
酸鎖（鋳型と考えられる）の鎖とヌクレオチドポリメリ
ゼーション剤（例えば、DNAポリメラーゼ）およびデオ
キシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でハイブリダイ
ズする増幅および検出方法を記載する。特定条件下でプ
ライマーの３′末端から鋳型に沿ってヌクレオチドが付
加されるに従って、プライマー伸長生成物の形成がもた
らされる。次に、これらの生成物が変性され、他の伸長
反応における複数の同一プライマー用の鋳型として使用
される。変性、ハイブリダイゼーションおよびプライマ
ー伸長のこのサイクルが多数回（例えば、25〜30サイク
ル）実施された場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」（また
はPCR）として知られているこのプロセスは標的核酸の
もとの量を指数関数的に増加するので、それが容易に検
出される。
プローブまたは他の試薬を付着するのに使用される技
法の一つは、例えばヨーロッパ特許出願公開第381501号
明細書に記載されるように固体支持体上へそれらを乾燥
堆積するにすぎない。より最近では、ポリマー粒子へ付
着されたプローブが、熱硬化性の別のポリマーで形成さ
れた固体支持体中に融合されている。
従来技術を凌駕する改良を提供するとはいえ、乾燥ま
たは融合による捕捉試薬（例えば、捕捉プローブ）の固
定化は限界を有する。これらの試薬の付着性は弱い。特
に、固定化された捕捉プローブ上の試薬が溶液中で洗浄
されるアッセイでは、ある程度のプローブが移動し、そ
してプローブが洗い流された場合には潜在的なシグナル
が失われる。さらに、捕捉プローブの固定支持体への融
合は高温を要するのでプローブの標的核酸捕捉能を低減
する可能性のある備品にとって危険である。
捕捉プローブの喪失に伴うシグナルの低下を最小限に
止め高感度アッセイを提供しながら、捕捉プローブの固
定化用の既知手段に随伴する問題点を回避することが望
まれる。
上記問題点は、核酸試薬組成物を堆積したシール可能
な支持体を含んでなる要素において、前記組成物が a.少なくとも70℃のガラス転移温度を有する第一ポリマ
ーからなる平均直径0.1〜３μｍを有する粒子と、それ
らの粒子に共有結合したオリゴヌクレオチドとを含む核
酸試薬、ならびに b.第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも30℃低
いガラス転移温度を有する第二ポリマーからなる水不溶
性の接着剤の混合物をからなり、 前記ポリマー性接着剤が１〜20重量％で組成物中に存
在することを、特徴とする要素によって解決された。
さらに、本発明は前記要素を含んでなる自蔵式試験デ
バイスも提供する。
さらに、核酸試験要素の調製方法であって、 A.シール可能な支持体上へ核酸試薬組成物を堆積する工
程であって、前記組成物が、 a.少なくとも70℃のガラス転移温度を有する第一ポリマ
ーからなる平均直径0.1〜３μｍを有する粒子と、その
粒子に共有結合したオリゴヌクレオチドとを含む核酸試
薬、ならびに b.第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも30℃低
いガラス転移温度を有する第二ポリマーを含む水不溶性
接着剤の混合物からなり、 前記ポリマー性接着剤が１〜20重量％で組成物中に存
在し、かつ B.前記支持体へ前記組成物を付着させそしてそれを乾燥
されるのに十分な温度と時間で堆積された核酸試薬組成
物を加熱する工程、を含んでなる方法も提供する。
さらに、本発明は、（１）前記要素、および（２）前
記核酸試薬のオリゴヌクレオチドと標的核酸のハイブリ
ダイゼーション生成物の検出用検出試薬、を含んでなる
診断試験キットも提供する。
またさらに、標的核酸の検出方法であって、 A.標的核酸を含むことが予期される被検体を、堆積され
た核酸試薬のオリゴヌクレオチドが標的核酸に相補的で
ある前記要素と接触させて、標的核酸と要素上の核酸試
薬とのハイブリダイズした生成物を形成する工程、およ
び B.被検体中の標的核酸の存在の指標としてハイブリダイ
ズした生成物の存在を検出する工程、を含んでなる方法
も提供する。
その上、また、標的核酸の増幅および検出方法であっ
て、 A.被検体中の標的核酸を増幅する工程、 B.増幅された標的核酸を、堆積された核酸試薬のオリゴ
ヌクレオチドが標的核酸に相補的である前記要素と接触
させて、増幅された標的核酸と要素上の核酸試薬とのハ
イブリダイズした生成物を形成する工程、ならびに C.被検体中に存在する標的核酸の存在の指標としてハイ
ブリダイズした生成物の検出工程、を含んでなる方法も
提供する。
本発明は、核酸の検出に有用な改良された要素を提供
する。高シグナルと低バックグランドがこの改良された
要素とその使用方法の特徴である。被検体中に非常に少
量（例えば、100マイクロモル程度）で存在する核酸の
検出に特に有用である。本発明は、捕捉プローブが限定
領域に堆積されていて、流体または機械的な取扱いによ
って容易に移動しないので診断使用にとって改良された
要素を提供する。従って、標的核酸の捕捉物からの潜在
的なシグナルは、十分に限定されているので高濃度を示
す。
これらの特徴は、要素の固体支持体に堅固に付着した
適当な核酸試薬を有する要素によって達成される。試薬
の融合および乾燥に伴う短所は、解消されそして試薬は
アッセイ中に洗い出されない。
本要素は、ポリマー類と固体支持体へ粒状核酸試薬を
付着させる接着剤との組み合わせの使用の結果としてこ
れらの重要な利点を有する。使用する接着剤の量は、試
薬と核酸が容易に接触しうるように存在する試薬量に応
じて調節される。試薬は、高感度と支持体への最高の付
着を提供するには特に小さな粒子を担持する。
図は、下記例２で記載するように行った比較アッセイ
の結果をグラフで示すものである。
本発明の要素は、１種以上の核酸組成物（それぞれ、
水不溶性接着剤と混合状態の核酸試薬を含む）を堆積し
たシール可能な支持体を含んでなる。
シール可能な支持体は、熱または超音波処理シール法
を使用してそれ自体または他のシート材料にシール（ま
たは融合）しうる樹脂性材料（一般に合成ポリマー）で
ある。好ましい支持体は、ヒートシール性である。限定
されるものでないが、有用なシール可能な支持体として
は、シート、繊維質マットおよび膜が挙げられ、それら
は適当な方法および適当な位置でそれら自体をシールし
てシールされたシート、マットまたは膜の間に溝または
空隙を提供できる。支持体表面はある態様では粗くして
核酸組成物の付着を促進することが好ましい。
これらの支持体は、例えば、ポリ（エチレンテレフタ
レート）、ポリ〔4,4′−（ヘキサヒドロ−4,7−メタノ
インダン−５−イリデン）ジフェニレンテレフタレー
ト〕およびポリ（4,4′−イソプロピリデンジフェニレ
ン−1,1,3−トリメチル−３−フェニル−5,4′−インダ
ンジカルボキシレート）のようなポリエステル類、ビス
フェノールＡポリカーボネート（例、Gemeral Electric
から販売されているLEXAN（商標））のようなポリカー
ボネート類、ポリ（ｐ−フェニレンテレフタルアミド）
のようなポリアミド類、4,4′−ジアミノジフェニルエ
ーテルとピロメリン酸無水物のポリイミド製品のような
ポリイミド類、ならびに酢酸セルロースおよび酢酪酸セ
ルロースのようなセルロースエステル類から構成でき
る。
一の態様では、ポリエチレンシートを周縁でシールし
て、前記核酸試薬をはじめとする各種試薬用の空隙を形
成する。もう一つの態様では、ポリエチレンとポリ（エ
チレンテレフタレート）のようなポリエステルのラミネ
ートをヒートシールすることができる。ラミネートは、
接着層または蒸気障壁層ならびにシール可能な層などの
各種の層をその中に担持できる。他の態様は、当業者に
とって容易に明らかであろう。
本明細書で開示される核酸試薬は、シール可能な支持
体上に、その全体にわたって均一に堆積されるか、また
は１箇所以上の限定された領域に堆積される。試薬は、
支持体表面に丸いスポット状で、プリントされた線状
で、または他の所望の形状で限定された領域に存在する
ことが好ましい。一の態様では、数種の核酸試薬がその
要素を使用して複数の標的核酸を同時に検出できるよう
に支持体表面の分離した限定領域に堆積される。例え
ば、要素は一連の試薬スポットまたは線を有することが
できる。
本発明で使用できる核酸試薬は、少なくとも70℃のガ
ラス転移温度（Tg1）を有する第一ポリマー（またはポ
リマー配合物）の粒子からなる。Tg1は、70〜175℃であ
ることが好ましく、そして75〜140℃の範囲内にあるこ
とがより好ましい。ガラス転移温度は、ポリマーがガラ
ス状態からゴム状、流動性または粘性ポリマーに変化す
る温度をいう。ガラス転移温度の測定方法は、Techniqu
es and Methods of Polymer Evaluation, Vol.1（Marce
l Dekker,Inc.,New York,1966）に記載されている。
本発明で有用な粒子は水性流体に不浸透性で非膨潤性
でもある。これらの特性が要素のシール可能な支持体へ
堆積された前記組成物の寸法安定性を確保する。非膨潤
性は、水性流体に粒子を38℃で25分間浸漬した後、Gree
nら、J.Photo.Sci.,20,205（1972）に記載される形式の
膨潤計で測定した場合に、水性流体中で殆ど膨潤しない
（すなわち、10％膨潤未満）粒子を表わすものである。
粒子は球形であることが好ましいが、粒子の最大寸法
が後述されるような球形粒子に対する最大直径を越えな
い限り同様に使用できる。粒子サイズは実質的に均一で
あることも好ましい。限定的には、最大の粒子寸法（例
えば、直径）は0.1〜３μｍであるが、0.5〜２μｍの範
囲内の直径が好ましい。
これらの粒子は、少なくともそれらの表面上は、オリ
ゴヌクレオチドが共有結合できる天然または合成材料
（後述する）から一般に構成される。一般的に、このよ
うな材料は、オリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体
が反応して共有結合を形成できる反応性基を担持する。
一般的に、この文脈上、アミノ基またはスルフヒドリ
ル基が反応性であるいずれかの反応性基が利用できる。
限定されるものでないが、特に有用な反応性基として
は、活性ハロゲン、カルボキシ、アミジン、活性２−置
換エチルスルホニル、活性２−置換エチルカルボニル、
ビニルスルホニル、ビニルカルボニル、エポキシ、アル
デヒド、スルフヒドリル、アミノ（活性化後）、ヒドラ
ジンおよびスクシンイミドオキシカルボニルのような活
性エステルが挙げられる。好ましい粒子は、活性ハロゲ
ン、活性２−置換エチルスルホニルまたはビニルスルホ
ニル基を担持する１種以上のエチレン系不飽和重合性モ
ノマー類から調製されるヨーロッパ特許出願公開第3236
92号明細書に記載されるもののような有機ポリマービー
ズである。もっとも好ましい粒子は、ヨーロッパ特許出
願公開第466220号明細書に記載されるような、下記一般
式で示されるモノマー類から調製される反応性カルボキ
シ基を有する。
CH2＝CR−Ｌ−COOM 上式中、Ｒは水素、ハロゲンまたは炭素原子１〜３個の
アルキルであり、Ｍは水素、アルカリ金属またはアンモ
ニウムイオンであり、そしてＬは炭素原子８〜50個、と
連結鎖中は酸素、窒素もしくは硫黄原子を有する有機連
結基である。
限定されるものでないが、反応性基を担持する有用な
エチレン系不飽和重合性モノマーとしては、アクリル
酸、メタクリル酸、ｍおよびｐ−（２−クロロエチルス
ルホニル−メチル）スチレン、ｍおよびｐ−〔２−（ｐ
−トリルスルホニルオキシ）エチル−スルホニルメチ
ル〕スチレン、ｍおよびｐ−ビニルスルホニルメチル−
スチレン、Ｎ−〔ｍおよびｐ−（２−クロロエチルスル
ホニルメチル）−フェニル〕アクリルアミド、Ｎ−〔２
−（２−クロロエチルスルホニル）エチル−ホルムアミ
ドメチル〕アクリルアミド、モノ−ｍおよびｐ−ビニル
ベンジルグルタレート、モノ−ｐ−ビニルベンジルグル
タレート、モノ−２−メタクリロイルオキシエチルグル
タレート、２−（４−カルボキシブチラアミド）エチル
メタクリレート、２−〔Ｎ′−（５−カルボキシペンチ
ル）−ウレイド〕エチルメタクリレート、モノ−メタク
リロイルペンタ−（オキシエチレン）グルタレート、モ
ノ−（４−アクリロイルオキシブチル）グルタレート、
４−（４−カルボキシブチラミド）スチレン、モノ−２
−（ｐ−ビニルベンジルチオ）エチルグルタレート、モ
ノ−２−（ｍおよびｐ−ビニルベンジルチオ）エチルグ
ルタレート、４−（４−カルボキシブチラミドメチル）
スチレン、モノ−２−〔Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ビニル
ベンジル）アミノ〕エチルグルタレート、３−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）−プロピオン酸、４−〔２−（４−
カルボキシブチラミド）エチルチオメチル〕スチレン、
４−〔２−（カルボキシメトキシアセタミド）−エチル
チオメチル〕スチレン、４−〔２−（カルボキシメチル
チオアセタミド）エチルチオメチル〕スチレン、モノ−
２−（ｐ−ビニルベンジルチオ）エチルスクシネート、
４−〔２−（カルボキシメトキシアセトキシ）エチルチ
オメチル〕スチレン、モノ−４−ビニルベンジルスクシ
ネート、２−（４−ビニルベンジルチオ）コハク酸、２
−（４−ビニルベンジルチオ）安息香酸、モノ−２−
〔２−（４−ビニルベンジルチオ）エトキシ〕エチルチ
オメチルマロネート、モノ−メタ−クリロイルペンタ
（オキシエチレン）フタレート、モノ−２−｛２−〔２
−（４−ビニルベンジルチオ）エトキシ〕エチルチオ｝
エチルスクシネート、モノ−２−｛２−〔２−（４−ビ
ニルベンジルチオ）エトキシ〕エチルチオ｝エチルフタ
レート、３−〔４−（４−ビニルベンジルオキシ）ベン
ジルチオ〕プロピオン酸および４−｛４−〔４−（４−
ビニルベンジルオキシ）ベンジルチオ〕ベンジルチオ｝
酪酸が挙げられる。
記載したモノマー類は、ホモポリマーとして重合でき
るが、それらを１種以上の他のエチレン系不飽和重合性
モノマーと共重合することが好ましい。
より具体的には、本発明で利用できる粒子は、それら
の表面が少なくとも、 （ａ）前記の反応性基を担持する１種以上のエチレン系
不飽和重合性モノマー類から誘導される反復単位を0.1
〜60重量％、 （ｂ）ホモポリマーである場合には、水不溶性ホモポリ
マーを提供する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノ
マー類から誘導される反復単位を40〜99.9重量％、なら
びに （ｃ）ポリマーにコロイド安定性を提供する親水性モノ
マー類に限定されない前記（ａ）および（ｂ）成分を特
定するもの以外の１種以上のエチレン系不飽和重合性モ
ノマーから誘導される反復単位０〜15重量％、からなる
ポリマーから構成される。
限定されるものでないが、前記成分（ｂ）に有用なモ
ノマー類としては、ビニル芳香族類（例えば、スチレン
ならびに４−ビニルトルエン、α−メチルスチレン、2,
5−ジメチルスチレン、４−ｔ−ブチルスチレンおよび
２−クロロスチレンのようなスチレン誘導体類）、アク
リル酸およびメタクリル酸のエステル類およびアミド類
（例えば、メチルアクリレート、メチルメタクリレー
ト、ｎ−ブチルアクリレート、２−エチルヘキシルメタ
クリレート、ベンジルアクリレートおよびＮ−フェニル
アクリルアミド）、ブタジエン、アクリロニトリル、ビ
ニルアセテート、ビニルベンジルアセテート、ビニルブ
ロミド、ビニリデンクロライドならびに２種以上の重合
性基を担持する架橋性モノマー（ビニル基のような、例
えばジビニルベンゼンならびにジ−およびトリアクリレ
ート）が挙げられる。水不溶性ホモポリマーを提供でき
る他のモノマー類もまた有用であり、当業者にとって容
易に明らかになるであろう。ビニル芳香族モノマー類が
成分（ｂ）として好ましい。
限定されるものでないが、成分（ｃ）に利用できるモ
ノマー類としては、非イオン性親水性モノマー類、例え
ばアクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−イソプロピ
ルアクリルアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレー
ト、２−ヒドロキシエチルメタ−アクリレート、Ｎ−ビ
ニル−２−ピロリドンおよび当業者に容易に明らかな他
のモノマーが挙げられる。加えて、活性メチレン基を担
持するモノマー類、例えば２−アセトアセトキシエチル
メタクリレート、およびカチオン性モノマー類、例えば
N,N,N−トリメチル−Ｎ−ビニルベンジルアンモニウム
クロライドおよび３−ヒドロキシエチル−１−ビニルイ
ミダゾリウムクロライドも使用できる。
成分（ｃ）としてさらに他の利用できるモノマー類に
は、例えば米国特許第5,086,143号明細書に記載される
ようなポリオキシアルキレン側鎖を担持するものも包含
される。限定されるものでないが、代表的なモノマー類
としてはペンタエチレングリコールモノメタクリレー
ト、エイコサエチレングリコールモノメタクリレート、
ペンタエチレングリコールモノアクリレート、ポリプロ
ピレングリコールモノメタクリレートおよびポリプロピ
レングリコールモノメタクリレートが挙げられる。
成分（ｃ）に好ましいモノマーは、２−アセトアセト
キシエチルメタクリレートである。
各成分（ａ），（ｂ）および（ｃ）の各種モノマー混
合物は、それらのモノマー類が相互に相溶性であり、そ
して得られた粒子表面に十分な反応性基が存在する限り
共重合できる。
好ましい第一付加ポリマーとしては、ポリ〔スチレン
−コ−モノ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオ
ン酸〕またはポリ〔スチレン−コ−モノ−２−（ｐ−ビ
ニルベンジルチオ）エチルスクシネート〕が挙げられ
る。
好ましくは、これらの粒子は成分（ａ）２〜15重量
％、成分（ｂ）85〜98重量％および成分（ｃ）０〜10重
量％からの付加重合によって誘導される反復単位からな
る。より好ましくは、それらは、成分（ａ）２〜10重量
％、成分（ｂ）90〜98重量％および成分（ｃ）０〜10重
量％から誘導された反復単位からなる。
粒子を作製するのに本発明に利用できるコポリマー類
は、標準的な乳化重合および懸濁重合によって製造でき
る。
これらの粒子はまた、反応性基が表面で利用できるよ
うにシェルとして前記ポリマーを有するコアー／シェル
粒子であることができる。このような粒子のコアーは、
必要な物理強度とガラス転移温度を付与するのに適する
どのようなポリマーからも構成でき、そして、通常、シ
ェルポリマーを構成するものと異なる。
オリゴヌクレオチド分子はそれらの粒子に共有結合さ
れる。「オリゴヌクレオチド」の語は、２個以上（好ま
しくは３個以上）のデオキシリボヌクレオチド類または
リボヌクレオチド類からなる分子を意味する。その大き
さは、オリゴヌクレオチドが相補的な標的核酸、それが
結合されるポリマー粒子の大きさ、およびいずれかのス
ペーサー分子の長さを含む粒子に結合する手段をはじめ
とする多くの因子により左右される。
オリゴヌクレオチドは、いずれかの適当な方法によっ
てポリマー粒子に共有結合される。それらは、粒子表面
の反応性基と対応するオリゴヌクレオチドのスルフヒド
リル基、カルボキシル基またはアミノ基との反応によっ
て直接結合することができる。また、オリゴヌクレオチ
ドをビオチニル化または他の修飾により、その後、粒子
結合できるその対応する受容体と特異的に結合できる特
異的バインディング種を付加することができる。アビジ
ン−ビオチン複合体は、例えばヨーロッパ特許出願公開
第139489号、同192168号および同370694号明細書に記載
されるように前記目的に使用することが知られている。
オリゴヌクレオチドへのビオチンの挿入は、ヨーロッパ
特許出願公開第97373号明細書（1984年１月４日公開）
に記載されるものをはじめとする既知法を使用して達成
できる。
しかしながら、オリゴヌクレオチドに反応性基を提供
するか、または粒子の表面からオリゴヌクレオチドを離
す「スペーサー」基もしくは「リンカー」基を提供する
ために化学的に修飾することが望ましい。これを実施す
る方法は、例えば米国特許第4,914,210号および国際公
開第W089/11548号に記載されるように周知である。
ポリマー性接着剤を使用して核酸組成物の核酸試薬を
要素のシール可能な支持体へ付着する。それはまた、相
互に試薬粒子を付着するようにも作用する。この接着剤
は、粒子の第一ポリマーのガラス転移温度（Tg1）より
少なくとも30℃低いガラス転移温度（Tg2）を有する第
二ポリマーを含んでなる。好ましくは、Tg2はTg1より30
〜120℃低い。また、Tg2は90℃より低い。より好ましく
は、Tg2は−50〜＋40℃の範囲内にある。
接着剤は、通常診断方法および分析方法でさらされる
水性流体に不溶性である。
より具体的には、第二ポリマーは、 （ｄ）前記第一ポリマーの成分（ｂ）で使用される１種
以上エチレン系不飽和重合性モノマー類から誘導される
反復単位55〜100重量％より、 （ｅ）水溶性ホモポリマーを形成するか、または極性基
〔例えば、第一、第二および第三アミン、ヒドロキシお
よびポリ（アルキレンオキシ）基〕、アニオン性基〔例
えば、カルボキシレート、スルホネート、サルフェー
ル、ホスフェートおよびホスホネート〕およびカチオン
性基〔例えば、トリアルキルアンモニウムおよびトリア
ルキルホスホニウム〕ならびに当業者に容易に明らかな
他の基に由来する親水性を付与する１種以上のエチレン
系不飽和モノマー類から誘導される反復単位０〜45重量
％より、そして （ｆ）ポリマー接着剤に架橋を付与する１種以上のエチ
レン系不飽和モノマー類から誘導される反復単位より、
構成される。
前記成分（ｂ）の第一ポリマー用として記載したモノ
マー類を成分（ｄ）でも使用できるが、成分（ｄ）に好
ましいモノマーは、アルキルアクリレート類およびアル
キルメタクリレート類であって、アルキル基が炭素原子
１〜８個を有する、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピ
ル、ｎ−ブチル、イソブチル、２−エチルヘキシル、ヘ
キシルおよびオクチル、であり、そしてアルキル基は１
個以上のチオ、オキシもしくは炭素原子１〜６個のイミ
ノアルキル基で中断されていてもよいものである。限定
されるものでないが、より好ましいモノマー類として
は、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、ｎ−
ブチルアクリレートおよびｎ−ブチルメタクリレートが
挙げられる。メチルアクリレートが最も好ましい。
限定されるものでないが、成分（ｅ）に利用できるモ
ノマー類としては、電荷を有するモノマー（カチオン性
またはアニオン性）、例えば酸およびその塩、であり、
限定されるものでないが、アクリル酸、メタクリル酸、
イタコン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパン
スルホン酸、３−メタクリロイルオキシプロパン−１−
スルホン酸およびそれらの塩、Ｎ−（２−アクリロイル
オキシエチル）−N,N,N−トリメチルアンモニウムメト
スルフェート、３−ヒドロキシエチル−１−ビニルイミ
ダゾリウムクロライド、アミノエチルメタクリレート塩
酸塩、Ｎ−（２−アミノプロピル）メタ−アクリルアミ
ド塩酸塩、２−カルボキシエチルアクリレート、ｐ−ス
チレンスルホン酸およびそれらの塩、ｍおよびｐ−カル
ボキシメチルスチレンおよびその塩、ならびに他のエチ
レン系不飽和重合性スルホネート、カルボキシレート、
サルフェート、ホスホネート、第四級アンモニウム塩、
ピリジニウム塩、イミダゾリウム塩またはキノキサリニ
ウム塩が挙げられる。また、第一ポリマーの成分（ａ）
について前記したカルボキシ含有モノマー類（およびそ
れらの塩）も利用できる。
成分（ｅ）でも有用な非イオン性モノマー類として
は、アミン含有モノマー類、例えばジメチルアミノプロ
ピルアクリレートおよびジエチルアミノエチルメタクリ
レート、ならびにヒドロキシ含有モノマー類、例えば２
−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチ
ルメタクリレート、2,3−ジヒドロキシプロピルアクリ
レートおよびペンタエチレングリコールモノアクリレー
トが挙げられる。
成分（ｅ）で好ましいモノマー類としては、２−アク
リルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸およびその
塩、２−アミノエチルメタクリレート塩酸塩ならびにＮ
−（２−アミノプロピル）メタクリアミド塩酸塩が挙げ
られる。
架橋を付与する成分（ｆ）用のモノマー類は、重合中
に架橋するか、またはその後の化学反応後にそれら自体
もしくは追加の架橋剤によって架橋を付与するもののい
ずれであってもよい。このようなモノマー類には、多官
能性ビニルモノマー、例えばジアクリレート、トリアク
リレート、ジメタクリレートおよびトリメタクリレート
（例えば、エチレンジアクリレートおよびジメタクリレ
ート）類、ジビニルベンゼン類、ならびに既知の化学反
応により架橋できる活性メチレン基含有モノマー類が包
含される。後者の例としては、２−アセトアセトキシエ
チルメタクリレート、Ｎ−（２−アセトアセトキシエチ
ル）アクリルアミド、Ｎ−（２−アセトアセトキシエチ
ル）アクリルアミド、Ｎ−（２−アセトアセタミドエチ
ル）メタクリレート、６−（ｍおよびｐ−ビニルフェニ
ル）−2,4−ヘキサンジオン、エチルアクリロイルアセ
テートおよび当該技術分野で既知の他のモノマーが挙げ
られる。
成分（ｆ）の好ましいモノマー類としては、２−アセ
トアセトキシエチルメタクリレート、Ｎ−（２−アセト
アセトキシエチル）アクリルアミドおよびＮ−（２−ア
セトアセタミドエチル）メタクリレートが挙げられる。
好ましくは、接着の調製に利用できるコポリマー類
は、成分（ｄ）70〜98重量％、成分（ｅ）２〜30重量％
および成分（ｆ）０〜10重量％から誘導された反復単位
からなる。より好ましくは、それらは、成分（ｄ）85〜
95重量％、成分（ｅ）２〜15重量％および成分（ｆ）０
〜８重量％からなる。
接着剤として好ましい付加ポリマーは、ポリ〔メチル
アクリレート−コ−２−アクリルアミド−２−メチルプ
ロパンスルホン酸、ナトリウム塩−コ−２−アセトアセ
トキシエチルメタクリレート〕である。
本発明では、使用されるポリマー性接着剤と核酸試薬
の混合物を含んでなる核酸試薬組成物では、接着剤が乾
燥重量で20％までの量で存在できる。好ましくは、接着
剤は、１〜20重量％の量で存在し、２〜10重量％の量が
より好ましい。
場合によって、前記組成物は、他の添加剤、例えば緩
衝剤、界面活性剤またはバインダーを少量、一般的には
総組成物重合の５重量％未満含むことができる。
核酸試薬組成物は、いずれか適当な方法でシール可能
な支持体にのせることができる。例えば、標準的な装置
および方法を使用して支持体上に手動で塗布するか、ピ
ペットの先端、マイクロシリンジの先端または微量分散
ポンプを使用して模様付けするかスポットし、次いで乾
燥することができる。しかし、マイクロシリンジを使用
して水性懸濁液状態の組成物をシール可能な支持体上へ
配置し、次いで乾燥することが好ましい。乾燥は、前記
第一ポリマーのガラス転移温度より低い10〜80℃の範囲
内で配置された組成物を加熱することで達成される。
支持体の核酸試薬組成物の被覆は、アッセイフォーマ
ットの形式、アッセイ要素の形状および当業者が容易に
予期できる他の因子に応じて相当変動できる。例えば、
組成物をシール可能な支持体に均一に塗布するか、また
はそれらの限定された領域（前述のように）に塗布する
ことができる。限定された領域への組成物の塗布が好ま
しい。各種の試薬類を異なる領域に塗布する技法は周知
である。ある例では、試薬類を視覚的に容易に検出する
ための模様を提供するような限定された領域に配置でき
る。
シール可能な支持体を、より親水性になるように予備
処理して使用することが好ましい。このような態様で
は、核酸試薬組成物が支持体により効率よく付着され
る。予備処理は、化学的、電気的または機械的なもので
あるか、あるいは別のタイプの処理の組み合わせである
こともできる。例えば、化学的処理には、数分間硫酸中
の重クロム酸ナトリウムによる表面のエッチングを行な
うクロム酸の使用を含む。
支持体はまた、希ガスのようなガス状の活性化種で処
理することもできる。さらに他の既知方法は高温で二酸
化窒素を使用するものである。
電気的処理には、コロナ放電、フレーミング、電極放
電法が包含される。
他の予備処理には、同時に化学的および電気的処理を
必要とする、例えば反応性ガスの存在下でラジオ波電磁
界による処理がある。
好ましい予備処理としては、コロナ放電処理、クロム
酸処理および反応性ガスの存在下でのラジオ波電磁界処
理が挙げられる。コロナ放電が最も好ましい。
前記予備処理に代えまたはそれを補足するものとし
て、親水性下塗り層として作用し、そして前記配置され
た組成物の付着性を向上させる親水性ポリマーを塗布す
ることにより予備処理することもできる。下塗り層ポリ
マーおよびそれらの調製法は当該技術分野で周知であ
る。一般的に、このようなポリマー類は、カルボキシ、
スルホニル、ホスホノ、ホスフィニル、カルボニルおよ
びヒドロキシのようなペンダントアニオン性基または親
水性基を１個以上担持する反復単位からなる。このよう
な特徴を有する他の一般的なポリマー類には、限定され
るものでないが、ビニルクロライド、ビニリデンクロラ
イドおよび当業者に容易に明らかな他のモノマーのよう
なモノマーに由来する一定のハロゲン含有するものが包
含される。
特に有用な下塗り層材料としては、ポリ（アクリロニ
トリル−コ−ビニリデンクロライド−コ−アクリル
酸）、ポリ（メチルアクリレート−コ−ビニリデンクロ
ライド−コ−イタコン酸）、ポリ（モノメチルイタコネ
ート−コ−ビニリデンクロライド）、ポリ（モノエチル
イタコネート−コ−ビニリデンクロライド）およびポリ
（モノブチルイタコネート−コ−ビニリデンクロライ
ド）が挙げられる。
本発明の要素は、核酸試薬組成物を本明細書で特定さ
れるようなシール可能な支持体上に堆積させ、次いでそ
の組成物を乾燥させるのに十分な温度と時間堆積された
組成物を加熱することによって作製できる。付着に適す
る温度と時間は逆比例的に変動しうるが、一般的には、
第一ポリマーのガラス転移温度より10〜80℃低い温度が
使用される。加熱時間は、一般に10〜40秒である。
本発明の要素は、下記に詳述される分析方法におい
て、数種のフォーマットで使用できる。例えば、本発明
の要素は実験室や医院において標準的なピペット、ビー
カーおよびアッセイを実施する際に適する容器を始めと
する、かかるアッセイで既知の他の器具を使用する非常
に簡単な製品であることができる。最も加工されていな
い容器は、試験管、キュベット、フラスコまたはビーカ
ーであるが、より加工された容器はアッセイを行うため
に自動化方法を容易にする目的で作製されてきた。
また、本発明の要素は使い捨て試験デバイスの一部を
組み込んで使用することもできる。
この要素に組み込むのに好ましい容器は、ヨーロッパ
特許出願公開第381501号明細書に記載されるもののよう
な自蔵式の試験デバイスである。このような試験デバイ
スは、化学試験パック、ポーチまたはキュベットとして
も当該技術分野で知られている。それらは、米国特許第
4,902,624号明細書に記載されるようにアッセイの実施
中に一定の温度特性を提供するように構成されている。
このような試験デバイスは、複数の各種の試薬類、緩衝
剤およびアッセイのいろいろな段階で利用される他の材
料を担持する反応室（または、それらがよく呼ばれる
「ブリスター」）をもつ。この試験デバイスは、本発明
の好ましい方法であるPCR増幅の各段階を促進させる加
熱と冷却を適切、かつ迅速に行うことができる。他の適
当な容器は、本発明の方法の自動化した使用または単回
使用に適するように作製できる。
このような試験デバイスでは、本発明の要素を、標的
核酸の検出を行う一連の反応を促進するように試薬類と
流体を通過する特定の室（または「ブリスター」）内に
配置する。この例では、試薬類と流体は要素に固定化さ
れた核酸試薬を通して流れるものと考えられる。要素上
の核酸試薬は検出するための標的核酸の「捕捉」に使用
される。要素は、接着剤でそれを固定し、試験デバイス
のポリマー壁に要素を融着するか、または他の都合のよ
い手段によって試験デバイス中に組み込むことができ
る。他の態様では、要素自体で試験デバイスの壁または
一体となった部分を形成できる。
試験デバイスは、流体を移動するための外部加圧源を
同時に操作する手段をもつが、試料が導入された後は、
まったく漏れを生じないように完全に密閉されるように
構成されていることを意味する自蔵式であることができ
る。
好ましい態様では、試験デバイスは２枚の比較的薄い
柔軟性ポリマー材料のシート〔例えば、ヒートシール性
または加圧シール性のポリエチレン−ポリ（エチレンテ
レフタレート）ラミネート、具体的にはSCOTCHPAK（商
標）ヒートシール性フィルムNo.229またはNo.241（両者
とも3M Corporationから入手可）〕を含んでなる。この
シートは、加熱または超音波加圧シール法によりそれら
の外周に沿って固着される。米国特許第4,352,925号明
細書に記載されるようなエチレングリコール、ジエチレ
ングリコールとテレフタル酸のコポリエステル類や、米
国特許第4,126,464号明細書に記載されるようなポリス
チレン−ポリイソプレン−ポリスチレンのブロックコポ
リマーとポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）の混
合などの感熱性接着剤も使用できる。
室（空隙）または溝は、一定部位でシートをシールす
ることによりシート間で形成され、こうして試薬類およ
び流体は、試験デバイス内に保持され、加圧デバイスを
使用することによりそこから移動させることができる。
このような室の一つに本発明の要素は配置される。好ま
しくは、本発明の要素は、アッセイで使用される試薬類
と流体が要素を通って使用済み試薬類と流体を集めるよ
うに設計された貯蔵室中に入るように、他のコンパート
メントと通路で関連付けられる状態に設計される室に配
置される。
本発明の要素は、標的核酸の検出用の多種多様な方法
で使用できる。それは、被検体中の１種以上の標的核酸
中に存在する１種以上の特定の核酸配列の増幅および検
出に特に有用である。このような被検体としては、細
胞、ウイルス、毛、体液または検出可能な遺伝子DNAも
しくはRNAを始めとする他の物質が挙げられる。
本発明は、実施される反応工程に関連して指数関数的
な量で感染源の特異的な核酸配列を生じさせる上で特に
有用である。生成物は、使用された特定のプライマー類
の末端に対応する末端をもつ個別の核酸複製物であろ
う。精製されているかまたは精製されていないどのよう
な核酸源も出発原料として利用できる。核酸混合物も、
必要によって使用できる。複製させる配列は、完全な核
酸の一断片であることができる。さらに、複数種の二本
鎖核酸を増幅し、次いで各特定の核酸用の対応するプラ
イマーセットと検出手段（前記捕捉試薬類を含む）を使
用して同時に検出することもできる。同一核酸内の複数
種の配列を増幅し、そして検出することもできる。
検出すべき核酸は、プラスミド、いずれかの起源に由
来する天然のDNAまたはRNAを包含する各種の起源から得
ることができる。核酸は、血液、末梢血単核細胞（PBM
C）、組織物質または既知の方法を使用する当該技術分
野で知られている他の起源を包含する各種組織から抽出
できる。本発明は、ゲノムDNA、細菌DNA、糸状菌DNA、
ウイルスRNAで見い出される核酸配列、または細菌もし
くはウイルス感染細胞中で見い出されるDNAもしくはRNA
の増幅および検出にとって特に有用である。
本明細書で開示される方法を使用して、感染症、遺伝
病またはガンのような細胞病に付随する特定の核酸配列
の検出または特性決定をすることができる。また、法医
学的な検査およびDNAタイピングにも使用できる。
一の態様では、本発明の要素は、ハイブリダイゼーシ
ョンアッセイとして知られているアッセイの捕捉プロー
ブを提供するのに使用される。ハイブリダイゼーション
アッセイの詳細、それに使用される操作および試薬類
は、米国特許第4,358,535号、同4,486,539号および同4,
925,785号明細書のような文献に記載されている。
本発明の要素は、ポリメラーゼ連鎖反応（またはPC
R）後の増幅された標的核酸の「捕捉」にも有用であ
る。PCRの詳細も周知である。本発明の実施に際して有
用な検出プローブは、標的核酸と直接的または間接的に
ハイブリダイズしうる。「間接的」とは、標的核酸と検
出プローブの両者に相補的な中間的なオリゴヌクレオチ
ド類が存在しうることを意味する。標識を付着しそして
プローブを調製するための操作も当該技術分野で周知で
ある。有用な標識としては、放射性同位体、電子濃厚試
薬、発色体、蛍光体、リン光成分、フェリチンおよび他
の磁性体、ビオチンおよび他の特異的バインディング
種、化学発光成分ならびに酵素が挙げられる。限定され
るものでないが、有用な酵素としては、グルコースオキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウリカーゼ、β−ガラク
トシダーゼ、グリコシラーゼおよびアルカリホスファタ
ーゼが挙げられ、そしてそれらは既知の方法でオリゴヌ
クレオチドへ結合することができる。このような酵素用
の基質および色素生成組成物も周知である。
標識がペルオキシダーゼのようなより好ましい酵素で
ある場合には、アッセイのある時点で、過酸化水素およ
び適当な色素生成組成物を加えて検出可能な色素を生じ
させる。例えば、有用な色素生成試薬としては、テトラ
メチルベンジジンおよびその誘導体類、ならびにトリア
リールイミダゾールロイコ色素またはペルオキシダーゼ
と過酸化水素の存在下で色素を提供するように反応する
他の化合物のようなロイコ色素が挙げられる。特に有用
な色素生成組成物は、米国特許第5,024,935号明細書に
記載されている。
別の好ましい態様では、PCR法のプライマーがビオチ
ニル化されており、そして増幅された核酸は検出可能に
標識されたアビジンまたはその誘導体を使用して検出さ
れる。例えば、アビジンは、酵素と結合されているか、
または放射能成分もしくは前記検出プローブについて記
載したもののような他の検出成分を担持できる。増幅さ
れた生成物上のビオチンがアビジンと複合体を形成し、
次いで適当な検出試薬および検出法を使用する。プライ
マー類のビオチニル化は、既知の操作で行うことができ
る。
本発明の要素は、要素を使用するための１種以上の試
薬類、器具または説明書も含む診断試験キットに含める
ことができる。好ましくは、本発明のキットは、要素中
の核酸試薬オリゴヌクレオチドと標的核酸のハイブリダ
イゼーション生成物、および標的核酸（PCRによるかま
たは関係に）を検出するための検出試薬を含む。「検出
試薬」とは、単独でまたは協同して検出可能なシグナル
を提供する１種以上の独立した反応性物質を意味する。
最も好ましくは、検出試薬は、標的核酸に相補的なPCR
で使用されるビオチニル化プライマーである。また、検
出試薬はハイブリダイゼーションアッセイで利用可能な
水溶性の標識されたオリゴヌクレオチドである。
本発明のキットは、限定されるものでないが、洗液、
抽出組成物、希釈剤、緩衝剤、プライマー類、プローブ
類、DNAポリメラーゼ類およびPCR試薬組成物のような他
の試薬類および流体を含むことができる。これらのキッ
トの構成物は、一般的に、適当な条件下で輸送および保
蔵するのに適する態様で個別に包装される。
以下の実施例は、本発明の実施を具体的に説明するた
めに含めるものであって、本発明をいずれかの方法に限
定することを意味しない。すべてのパーセンテージは、
特記しない限り重量基準である。
実施例のための材料および方法 実施例１および２で使用する核酸試薬は、次のように
調製した。
ポリ〔スチレン−コ−モノ−２−（ｐ−ビニルベンジ
ルチオ）エチルスシネート〕（重量比95:5）のポリマー
粒子（平均粒径1.2μｍ）は、既知の乳化重合法で調製
した。これらの粒子に次のオリゴヌクレオチドを結合さ
せた。
配列番号1: ５′‐X-GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-3′ 上記で、Ｘは、米国特許第4,962,029号明細書に従って
調製され、オリゴヌクレオチドに結合された２つのテト
ラエチレングリコールスペーサー基を有するアミンジオ
ール連結基である。
これらのオリゴヌクレオチド分子を、次のように粒子
に結合させて核酸試薬を形成した。
前記粒子を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
緩衝液（0.1モル濃度、pH6）で２回洗浄した。前記緩衝
液（1mL）で懸濁した粒子の試料（30μｇ）を、１−
（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジ
イミド塩酸塩（緩衝液中100mg/mL液0.15mL）とオリゴヌ
クレオチド〔精製水中57.30D/mL液0.0288mL、1.650D単
位または55μｇ）と混合した。この混合物を室温（20-2
5℃）で15分間回転させて遠心した。粒子を水で３回洗
浄し、次いで固形物含量0.9％にて精製水で再懸濁し
た。
この核酸試薬を、ポリ（メチルメタクリレート−コ−
２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸・
ナトリウム塩−コ−２−アセトアセトキシエチルメタク
リレート（重量比90:4:6）の接着剤と混合した。得られ
た組成物は、約18％（乾燥重量）の接着剤を含んでい
た。この混合物を、下記実施例１のように水性懸濁状で
ヒートシール可能な支持体にのせて要素を形成した。
実施例２のPCR法で使用するプライマー類は、次のと
おりである。
配列番号2: ５′‐X-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAA-3′ 配列番号3: ５′‐TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTC-3′ 上記のＸは、米国特許第4,914,210号明細書の教示に従
って調製し、オリゴヌクレオチドに結合させたビオチン
テトラエチレンスペーサー基を表わす。
実施例３に、異なる大きさの核酸試薬を、ポリ〔スチ
レン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチオ）プロピオン
酸〕（モル比97.6:2.4）を使用して同様に調製し、そし
て下記オリゴヌクレオチドを粒子へ同様に結合させた。
配列番号4: ５′‐ATTATCTTTT ATATTCTAAC CAGGATT-X-3′ 上記のＸは、３′末端に２つのテトラエチレングリコー
ルスペーサーおよび３−アミノ−1,2−プロパンジオー
ルリンカーを含む。
実施例３では、ポリ〔ｍおよびｐ−ビニルトルエン
（64:36）−コ−メタクリル酸〕（重量比98:2）の粒子
も使用した。これらの粒子は、常法の懸濁重合法または
米国特許第3,615,972号明細書に記載される限定された
凝集操作のいずれかにより調製した。
実施例２用の標的核酸は、HIV-Iのgag領域の140ヌク
レオチドセグメントであった。
洗液（250μＬ）は、リン酸ナトリウム（10ミルモル
濃度、pH7.4）、塩化ナトリウム（150ミルモル濃度）、
エチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃度）およびデシ
ルスルフェート（１％）の緩衝液からなる。洗浄は使用
前に55℃に予備加熱した。
PCRで使用したDNAポリメラーゼは、サーマス・アクア
ティカス（Thermus aquaticus）から単離した。
ストレプトアビジンと西洋ワサビペルオキシダーゼの
結合物は、Zymed Labs（San Francisco）から入手し、
チメロサール防腐剤（0.01％）含有のリン酸緩衝液（pH
7.3）中ガゼイン（0.5％）で1:8000に希釈した。
ロイコ色素組成物は次のように調製した。すなわち、
２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメトキシフェニル）−
4,5−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾールをリ
ン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中ポリ（ビニ
ルピロリドン）（20％）溶液に溶解し色素の0.1％溶液
を調製した。次に、この溶液を、過酸化水素（10ミリモ
ル濃度）、４′−ヒドロキシアセトアニリド電子移動剤
（５ミルモル濃度）およびジエチレントリアミン−五酢
酸キレート剤（10マイクロモル濃度）をリン酸ナトリウ
ム緩衝液に含む溶液へ添加して、最濃度１％ポリ（ビニ
ルピロリドン）および0.005％ロイコ色素とした。
実施例２用のPCR反応液は、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノ−メタン緩衝液（10ミリモル濃度、pH8）、
塩化カリウム（50ミリモル濃度）、塩化マグネシウム
（10ミリモル濃度）およびゼラチン（10μｇ）からな
る。この溶液にプライマー類（各100ピコモル）、dNTP
（各1.5ミリモル濃度）およびDNAポリメラーゼ（7.5単
位）を加えた。
実施例３用として、下記溶液を調製し、PCR試薬を提
供した。
DNAポリメラーゼ用貯蔵緩衝液は、最終濃度が緩衝剤
（20ミリモル濃度）、塩化カリウム（100ミリモル濃
度）、ジチオスレイトール（１ミリモル濃度）、エチレ
ンジアミン四酢酸（0.1ミリモル濃度）、グリセロール
（50％）、界面活性剤（各0.5％）、ゼラチン（200μg/
mL）となるようにトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン緩衝液（8mL、１ミリモル濃度、pH8）、塩化カリウ
ム（13.32mL、３モル濃度）、ジチオスレイトール（0.4
mL、１モル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（0.16mL、
0.25モル濃度）、グリセロール（250mL、80％）、界面
活性剤溶液（6.67mL）〔30％ NONIDET（商標）P-40非イ
オン界面活性剤（Sigma Chemical）および30％ TWEEN
（商標）20非イオン界面活性剤（ICI Americas,Inc.）
含有〕、ならびにゼラチン（4mL、２％）から調製し、
水で溶液400mLにした。
第二緩衝液もまた、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（10ミリモル濃度、pH8.3）、塩化カリウム（5
0ミリモル濃度）、塩化マグネシウム（10ミリモル濃
度）、ゼラチン（10μｇ）およびグリセロール（7.5
％）を含むように調製した。
第三緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（10ミリモル濃度）およびTWEEN（商標）20非イオ
ン界面活性剤（0.5％）を含めて調製した。
次に、PCR試薬溶液を、第二緩衝液288μＬに貯蔵緩衝
液12μＬの混合物を加え、次いでこの混合物220μＬへ
第三緩衝液80μＬを加え、最後にビオチニル化標的核酸
をそれへ40ピコモル濃度になるまで加えることによって
調製した。
実施例１ 要素の作製 この実施例は、本発明の要素の作製法を例示し、それ
を本発明の範囲外の要素（すなわち、核酸試薬が別の方
式で支持体上へ付着された要素）と比較する。
本発明の要素は、ポリエチレンとポリエチレンテレフ
タレートのラミネートであるType 241 SCOTCH PAK（商
標）ラミネート（3M Company）の試料を固体支持体とし
て使用して作製した。このラミネートのポリエチレン側
を、Pillar Technologies（Hartland,Wisconsin）また
はEnercon Industries（Menomonee,Wisconsin）のいず
れかから入手された常用の処理装置を使用し、56〜59dy
ne/cm2のレベルでコロナ処理した。
ポリエチレン−ポリ（エチレンテレフタレート）ラミ
ネートシートのポリエチレン側を要素支持体上へヒート
シールして封入された検出溝を形成した。この溝に、そ
の溝中へ流体を注入するための流入末口と溝から流体を
排出するための流出手段を含めた。
前記接着剤と核酸試薬との組成物を、水による水性懸
濁液（２μＬ、試薬の固形分0.9％、接着剤0.2％）状で
コロナ処理した支持体上へ塗布した。この懸濁液を、検
出溝中の支持体の限定された領域に塗布し、次いで支持
体の底面と接触させながら熱アイロン（95℃、30秒間）
で乾燥した。次に、ラミネートシートを要素上へヒート
シールして封入検出溝を形成した。
要素上へラミネートシートをヒートシール前に、物理
試験をして、核酸試薬組成物がどの程度支持体上へ固定
化されたかを測定した。この試験は、組成物の乾燥堆積
物の摩擦と支持体を180°折り曲げることよりなる。本
発明の要素では、試薬が支持体から脱着されないで支持
体に緊密に固定化されていた。これらの物理試験中に支
持体から剥離した組成物は非常に少なかった。
接着剤を省略したこと以外は、同じ支持体と同じ核酸
試薬を使用して対照要素を同様に作製した。前記のよう
に、グリシン緩衝液（0.1モル濃度、pH8.5）中の核酸試
薬（0.9％固形分懸濁液）をコロナ処理した支持体の限
定された領域に塗布し、乾燥し、次いでラミネートシー
トを支持体上へヒートシールした。ヒートシール前に、
乾燥した試薬を物理的に摩擦し、支持体を180°折り曲
げて試薬が支持体にどの程度付着したかを観察した。こ
れらの物理試験中に多量の試薬が支持体から脱着した。
実施例２ PCR法における要素の使用 この実施例は、HIV-I DNA配列の増幅と検出に際し
て、実施例１に記載した要素の使用を例示しそして比較
する。
前記PCR試薬溶液に、いろいろな量の前記標的HIV-I D
NAフラグメント（0,100,103および104コピーまたは分
子）を加えた。得られた溶液それぞれの総量は100μＬ
であった。
各溶液を250μＬの微量遠沈管に入れ、下記プロトコ
ールの40サイクルによりPCRで増幅した。
変性:96℃に加熱し、30秒間保持、そして プライマー／伸長:68℃に冷却し、１分間保持。
PCRに使用した装置は、Cetus/Perkin Elmerから市販
されているパーキン・エルマーサーモサークラー（Perk
in-Elmer Thermocycler）であった。
最後のサイクル後、溶液を95℃に加熱し、５分間保持
して得られた二本鎖生成物を変性した。この加熱された
溶液を、固定化された核酸試薬と確実に均一な接触を行
う態様で要素（実施例１および対照）の検出溝内にそれ
ぞれ注入した。溶液の注入後、各要素を５分間42℃でイ
ンキュベートし、要素中の試薬のオリゴヌクレオチドに
対し相補的な核酸をハイブリダイズさせた。残存流体
を、加圧空気で押し出すか、またはシリンジを使用して
吸引することによって除去した。
前記洗液を各要素に２回注入し、ハイブリダイズして
いない物質を除去した。最後に洗液が除去されたなら、
前記ストレプトアビジンとペルオキシダーゼ結合物を含
む溶液（200μＬ）を各要素に注入し、２分間42℃でイ
ンキュベートした。溶液を除去した後、同様にロイコ色
素溶液を注入し、次いでさらに５分間インキュベートし
た。
残存流体を除去し、要素中に出現した色素シグナルを
スケール０〜10（最も高濃度）で視覚的に段階分けし
た。結果を図に示す。両要素のバックグランド（０コピ
ー数）は、非常に低かった。しかしながら、増幅された
標的核酸のアッセイについて、本発明の要素は各濃度の
標的核酸でより高いシグナルを与えた。このことは、要
素を繰り返し洗浄しそして数種の流体との接触を伴う検
出操作を通じて本発明の核酸試薬が良好に維持されるこ
とを示す。実施例１に示したように、対照要素の試料に
おいては、多量の試薬が支持体から簡単に摩擦脱着する
ように、アッセイで使用した流体がアッセイ中に試薬を
除去したものと考えられる。本発明の要素が、標的核酸
の低濃度（100コピー数）の存在に対して高い感度を示
すことは非常に重要である。
実施例３ 処理および未処理支持体を使用し、試薬にお
ける異なる大きさの粒子混合物を使用する比較例 この実施例は、核酸試薬組成物を含む要素を作製する
上で本発明の実例を示すと共に、その使用を本発明の範
囲外の要素の使用と比較する。また、処理済み支持体の
使用と未処理支持体の使用の比較も行う。
ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニルベンジルチ
オ）プロピオン酸〕（モル比97.6:2.4、重量比95:5）水
性ポリマービーズ分散液を各種粒子サイズで調製し、次
いで下記に示すオリゴヌクレオチドをそれに共有結合し
た。前記配列番号４で示されるオリゴヌクレオチドを、
粒子に２つのテトラエチレングリコールスペーサー、３
−アミノ−1,2−プロパンジオール成分およびチミン塩
基を介して連結した。オリゴヌクレオチドを、３−アミ
ノ−1,2−プロパンジオール成分を介してポリマー粒子
に付加させて試薬を形成した。
いろいろな粒子サイズを有する試薬を次のように調製
した。
本発明の実施に有用な試薬類は、約1.3μｍの平均サ
イズの粒子からなり、そして２−アミノ−２−ヒドロキ
シメチル−1,3−プロバンジオール／エチレンジアミン
四酢酸緩衝液中前記ポリマー接着剤（固形分0.1％）を
使用して2.0％固形分として調製した。
本発明の範囲外の核酸試薬（対照Ａ）は、約８μｍの
平均サイズの粒子からなり、そして２−アミノ−２−ヒ
ドロキシメチル−1,3−プロパンジオール／エチレンジ
アミン四酢酸緩衝液中ポリマー接着剤（固形分0.1％）
を使用して4.0％固形分として調製した。対照Ｂおよび
Ｃは、異なるサイズの粒子混合物を含めた。すなわち、
対照Ｂは、1.3μｍの粒子（20％）と8.0μｍの粒子（80
％）の混合物であり、そして対照Ｃは前記両サイズの粒
子50:50（重量）混合物であった。
これらの調製物を使用して、アッセイ用捕捉プローブ
として試薬類を担持する下記要素を作製した。
これらの要素を、成形ステーション（または型）でポ
リ（エチレンテレフタレート）／ポリエチレンラミネー
トのシートを加熱し、シートの一側面に対して引っ込ん
だ領域が整列するように作製した。その後、カバーシー
トをラミネートすることにより、得られたパウチは狭い
溝をもっていた。その後、各引っ込んだ部分を適当な試
薬類で満たした。これらの引っ込んだ溝部上にカバーを
形成するためにシートをラミネートし、次いで各引っ込
んだ領域とそれから主溝へ連結する溝間にバースト（bu
rst）シールを作り封止した。ところで、まず最初に主
溝の末端周辺の区画を、８秒間、TEFLON（商標）絶縁プ
レートに対して0.95cmのクリアランスでEnercon DYNE-A
-MITE（商標）コロナ放電ユニットからのコロナ放電で
処理した。次に、前記試薬調製物（本発明および対照A-
C）を、処理表面上に直ちに４滴（各滴は調製物0.9〜1.
1μＬを示す）ずつ一列に堆積させて要素を作製した。
堆積された調製物を、室温下の空気流で約20秒間その支
持体の裏面をアイロンで約95℃に加熱しながら乾燥させ
た。別の組の要素も、コロナ放電処理をしないことを除
き同様に作製した。
デバイス中に形成されたブリスター（または室）を所
望の試薬類で満たした。各要素の第一ブリスターを、試
験すべき被検体を受容しそして加熱中それを保持するの
に適合させた。第二ブリスターは、前記ストレプトアビ
ジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物で満たした。
第三ブリスターには、１％デシル硫酸ナトリウム洗液
（10ミリモル濃度のリン酸ナトリウム、150ミリモル濃
度の塩化ナトリウムおよび１ミリモル濃度のエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウムを含有するリン酸緩衝溶液、pH
7.4中）を含ませ、そして第四ブリスターには前記ロイ
コ色素組成物を含めた。主溝の末端に配置した最後のブ
リスターは他のものより大きく、廃液を受容する吸着剤
を満たした。
次に、カバーシートをラミネートし、３工程でシール
した。最初は、サンドイッチを加圧しそして３種の試料
溶液を含有するブリスターと廃液ブリスターの周囲だけ
を約149℃に加熱することによりシールした。バースト
（破裂）シールを含む試料受容性PCRブリスターおよび
溝の形成を、163℃で適当な形状の加熱ジョー間で試験
パックを加熱することで完了した。第三の工程は、上部
プレート温度を199℃とし下部プレートは周囲温度を維
持したままで試験パックのまわりを周囲シールを形成
し、そしてすべてのブリスター周囲シールを密封した。
完成した試験パック（または要素）中に形成された溝
を、ブリスターを含む要素の部分を横断するローラーの
通過が、各ブリスターのシールを順次破裂させて、各ブ
リスターから捕捉プローブを含有する区画につながる主
溝まで存在する溝に沿って試薬類を押し進めるように配
置した。
完成した融着試験要素を使用して、次のように調製し
た試薬を評価した。
試験デバイス中のブリスターを、ポリマー粒子に共有
結合したオリゴヌクレオチドの配列に相補的な配列をも
つ標的核酸として使用するビオチニル化オリゴヌクレオ
チド試薬溶液約205〜210μＬで満たし、次いでシールし
た。ビオチニル化標的核酸の配列は、次のとおりであっ
た。
配列番号5: ５′‐X-AATCCTGGTT AGAATATAAA AGATAAT-3′ 上記のＸは、ビオチンに結合させるための単一テトラエ
チレングリコール連結基である。PCR反応液中の標的核
酸濃度は、40ピコモル濃度であるものと信じられる。
この試薬を含有するブリスターを120秒間95〜98℃に
予備加熱し、次いでシールを圧搾破裂させて溶液を核酸
試薬含有区画へ押し進めた。検出ブリスター中でオリゴ
ヌクレオチド試薬と捕捉試薬を42℃５分間のインキュー
ベーションを通じてハイブリダイズし、一方、アビジン
−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物を含有するブリス
ターは35℃に加熱した。この結合物ブリスターのシール
を破裂させ、それが利用可能なビオチニル化試薬と免疫
反応する検出区画へ溶液を向かわした。洗液ブリスター
のシール（55℃300秒間予備加熱した）を、破裂させ、
洗液を検出区画に向かわして、主溝の清浄と未結合物を
検出区画から除去した。次に、色素生成組成物を含有す
るブリスターのシールを破裂させ、組成物を検出区画へ
向かわした。インキュベーションを５分間続けて色素を
生成させ、次いで色濃度スコアーを読み取った。
下記表Ｉに示す色濃度スコアーを、２つの特徴、すな
わち「色素スポット品質」および「色素スポット色彩」
について評価した。
「色素スポット品質」は、下記評価の各スコアーに基
づいて１〜５までのスコアーで判断した（より低いスコ
アーが望ましい）。
１−上質のスポット、剥離や欠陥は視覚的に検出されな
い、 ２−点蝕または非常にわずかな剥離（スポットの25％未
満）、 ３−わずかな剥離（スポットの約25％）、 ４−著しい剥離（スポットの25〜75％）、 ５−スポットの完全な剥離。
「色素スポット色彩」は、カラーチャート（０は濃度
がなく、10は最高濃度である）に対する液状色素濃度の
視覚的な比較により評価した。ここでは、高スコアーが
望ましい。「品質」および「色彩」の総合スコアーは、
試薬調製物が付着性（「品質」）が改善されているか、
生じたシグナル（「色彩」）が欠損しているか、あるい
は両者を示す。
表Ｉに示されるデータから導き出される結論は次のと
おりである。
１）コロナ処理しない支持体に担持される要素は、許容
できる色素濃度（すなわち、感度）を示すが、多くの色
素類が洗い流された（すなわち、不十分な付着）。
２）より大きな粒子を含有する試薬調製物は、不透明性
が増し、低いスポット品質と色彩を示す。
３）最高の「色素スポット品質」のスコアーは、小さな
粒子試薬調製物（湿式および乾式とも）で達成された。
４）ビーズ（２種）の混合物は、一般に、所期の試薬付
着性と色素濃度の組み合わせを提供しない。
配列表 （１）配列番号:1: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：プローブオリゴヌクレオチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源：合成 （vii）直接の起源：同じ （ｘ）公開情報：なし （xi）配列の記述:SEQ ID NO:1: GAGACCATCA ATGACGAAGC TGCAGAAT （２）配列番号:2: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:29ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNAプライマー （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源：合成 （vii）直接の起源：同じ （ｘ）公開情報：なし （xi）配列の記述:SEQ ID NO:2: AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAA （３）配列番号:3: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:28ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型:DNAプライマー （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源：合成 （vii）直接の起源：同じ （ｘ）公開情報：なし （xi）配列の記述:SEQ ID NO:3: TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTC （４）配列番号:4: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：プローブオリゴヌクレオチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源：合成 （vii）直接の起源：同じ （ｘ）公開情報：なし （xi）配列の記述:SEQ ID NO:4: ATTATCTTTT ATATTCTAAC CAGGATT （５）配列番号:5: （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:27ヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：オリゴヌクレオチド （iii）ハイポセティカル:No （iv）アンチセンス:No （vi）起源：合成 （vii）直接の起源：同じ （ｘ）公開情報：なし （xi）配列の記述:SEQ ID NO:5: AATCCTGGTT AGAATATAAA AGATAAT
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヒンクレー，チャールズ カリス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14650, ピッツフォード，ラッチメア コート 23 (72)発明者 ウェルマン，ジェフリー アレン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14615, ロチェスター，ストーン ロード 1544 (72)発明者 ドニシ，ウィリアム ハロルド アメリカ合衆国，ニューヨーク 14615, ロチェスター，スウィート バーチ レー ン 320 (72)発明者 フィンドレー，ジョン ブルース アメリカ合衆国，ニューヨーク 14612, ロチェスター，クロスローズ レーン 148 (72)発明者 ストン，リチャード カルビン アメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，ツウィライト ドライブ 24 (72)発明者 ポンティセロ，イグナツィオ サルバトレ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，コッパー ウッズ 21 (72)発明者 カミンズ，トーマス ジョセフ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14609, ロチェスター，エルムクロフト ロード 176 (72)発明者 ザンダー，デニス ローランド アメリカ合衆国，ニューヨーク 14526, ペンフィールド，ローリング メドーズ ウェイ 35

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】核酸試薬組成物を上方に堆積した支持体を
    含んでなる要素において、前記組成物が、 a.少なくとも70℃のガラス転移温度を有する第一ポリマ
    ーからなる平均直径0.1〜３μｍを有する粒子と、それ
    らの粒子に共有結合したオリゴヌクレオチドとを含む核
    酸試薬、ならびに b.前記第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも30
    ℃低いガラス転移温度を有する第二ポリマーを含む水不
    溶性の接着剤、の混合物を含み、 前記ポリマー性接着剤が前記組成物中に１〜20重量％で
    存在し、そして前記支持体が、コロナ放電処理、クロム
    酸処理または反応性ガスの存在下におけるラジオ波電磁
    界による処理で、あるいは前記支持体上に親水性下塗り
    層を担持させ、該下塗り層上に前記組成物を堆積するこ
    とで付与された親水性表面基を有することを特徴とする
    要素。
  2. 【請求項２】a.少なくとも70℃のガラス転移温度を有す
    る第一ポリマーからなる平均直径0.1〜３μｍを有する
    粒子と、それらの粒子に共有結合したオリゴヌクレオチ
    ドとを含む核酸試薬、ならびに b.前記第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも30
    ℃低いガラス転移温度を有する第二ポリマーを含む水不
    溶性の接着剤、の混合物を含む組成物であって、 前記ポリマー性接着剤が１〜20重量％で存在する組成物
    を上方に堆積した支持体を含み、そして前記支持体が、
    コロナ放電処理、クロム酸処理または反応性ガスの存在
    下におけるラジオ波電磁界による処理で、あるいは前記
    支持体上に親水性下塗り層を担持させ、該下塗り層上に
    前記組成物を堆積することで付与された親水性表面基を
    有する要素を含んでなることを特徴とする試験デバイ
    ス。
  3. 【請求項３】（１）a.少なくとも70℃のガラス転移温度
    を有する第一ポリマーからなる平均直径0.1〜３μｍを
    有する粒子と、それらの粒子に共有結合したオリゴヌク
    レオチドとを含み、そのオリゴヌクレオチドが標的核酸
    に相補的である核酸試薬、ならびに b.前記第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも30
    ℃低いガラス転移温度を有する第二ポリマーを含む水不
    溶性の接着剤、の混合物を含む組成物であって、 前記ポリマー性接着剤が前記組成物中に１〜20重量％で
    存在する組成物を上方に堆積した支持体を含み、そして
    前記支持体が、コロナ放電処理、クロム酸処理または反
    応性ガスの存在下におけるラジオ波電磁界による処理
    で、あるいは前記支持体上に親水性下塗り層を担持さ
    せ、該下塗り層上に前記組成物を堆積することで付与さ
    れた親水性表面基を有する要素、および （２）前記要素中の核酸試薬のオリゴヌクレオチドおよ
    び前記標的核酸のハイブリダイゼーション生成物を検出
    するための検出試薬、 を含んでなることを特徴とする診断試験キット。
  4. 【請求項４】A.標的核酸を含有することが予期される被
    検体を、核酸試薬組成物を上方に堆積した支持体を含む
    要素であって、前記組成物が、 a.少なくとも70℃のガラス転移温度を有する第一ポリマ
    ーからなる平均直径0.1〜３μｍを有する粒子と、それ
    らの粒子に共有結合したオリゴヌクレオチドとを含み、
    そのオリゴヌクレオチドが前記標的核酸に相補的である
    核酸試薬、ならびに b.前記第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも30
    ℃低いガラス転移温度を有する第二ポリマーを含む水不
    溶性の接着剤、の混合物を含み、 前記ポリマー性接着剤が前記組成物中に１〜20重量％で
    存在し、そして前記支持体が、コロナ放電処理、クロム
    酸処理または反応性ガスの存在下におけるラジオ波電磁
    界による処理で、あるいは前記支持体上に親水性下塗り
    層を担持させ、該下塗り層上に前記組成物を堆積するこ
    とで付与された親水性表面基を有する要素とを接触させ
    て前記標的核酸と前記核酸試薬のハイブリダイズした生
    成物を前記要素上に形成する工程、ならびに B.前記被検体中の標的核酸の存在の指標として前記ハイ
    ブリダイズした生成物の存在を検出する工程、 を含んでなることを特徴とする標的核酸の検出方法。
  5. 【請求項５】A.試験検体中の標的核酸を増幅する工程、 B.前記増幅した標的核酸を、核酸試薬組成物を上方に堆
    積した支持体を含む要素であって、前記組成物が a.少なくとも70℃のガラス転移温度を有する第一ポリマ
    ーからなる平均直径0.1〜３μｍを有する粒子と、それ
    らの粒子に共有結合したオリゴヌクレオチドとを含み、
    そのオリゴヌクレオチドが前記標的核酸に相補的である
    核酸試薬、ならびに b.前記第一ポリマーのガラス転移温度より少なくとも30
    ℃低いガラス転移温度を有する第二ポリマーを含む水不
    溶性の接着剤、の混合物を含み、 前記ポリマー性接着剤が前記組成物中に１〜20重量％で
    存在し、そして前記支持体が、コロナ放電処理、クロム
    酸処理または反応性ガスの存在下におけるラジオ波電磁
    界による処理で、あるいは前記支持体上に親水性下塗り
    層を担持させ、該下塗り層上に前記組成物を堆積するこ
    とで付与された親水性表面基を有する要素と接触させて
    前記増幅した標的核酸と前記核酸試薬のハイブリダイズ
    した生成物を前記要素上に形成する工程、ならびに C.前記被検体中の標的核酸の存在の指標として前記ハイ
    ブリダイズした生成物の存在を検出する工程、 を含んでなることを特徴とする標的核酸の増幅および検
    出方法。
JP4508823A 1991-03-21 1992-03-19 核酸増幅のための要素および方法ならびに付着プローブを使用する検出方法 Expired - Lifetime JPH0830704B2 (ja)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
US67305391A 1991-03-21 1991-03-21
US673,053 1991-03-21
US837,772 1992-02-18
US07/837,772 US5380489A (en) 1992-02-18 1992-02-18 Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes
PCT/US1992/002200 WO1992016659A1 (en) 1991-03-21 1992-03-19 Element and method for nucleic acid amplification and detection using adhered probes

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