JPH05507404A - 母体血液からの胎児細胞の富化のための方法 - Google Patents

母体血液からの胎児細胞の富化のための方法

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JPH05507404A JP91508670A JP50867091A JPH05507404A JP H05507404 A JPH05507404 A JP H05507404A JP 91508670 A JP91508670 A JP 91508670A JP 50867091 A JP50867091 A JP 50867091A JP H05507404 A JPH05507404 A JP H05507404A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 母体血液からの胎児細胞の富化のための方法及歪分豆 本発明は母体血液からの胎児細胞の富化の方法に関する。
光肌生胃員 米国において年間約５３０万人の女性が妊娠し、３８０万人が出産する。世界中 における他の豊かな国において更に１０００万人が出産する。
遺伝病、例えばダウン症候群を伴う胎児を有する有意な危険性を伴うような女性 群においては出産前検査が利用されている。
現在、胎児疾患を診断する唯一の方法は、母体の羊水がら細胞を得ること（羊水 穿刺）又は胎児嚢の表層（絨毛膜絨毛）を得ることにある。これらの方法は費用 がかかり、そして１／２％〜１％の突発性流産の危険性を伴う。突発性流産のた め、このような集成方法は遺伝的障害を有する子供を宿す危険性の高い女性に関 してのみ認められている。例えば、３５歳を超える女性はこの検査を受けること をアドバイスされており、その理由はこの集団においてダウン症候群の危険性は 高いからである。ある程度のこのような女性は突発的流産の危険性のため、これ らの検査を拒む。多数のこのような危険性の高い女性が検査を受けているにもか かわらず、ダウン症＃群を伴う一部の胎児のみが検出される。この危険性の高い 女性はこのような子供を有する女性のわずかな部分を占め、危険性の低い女性集 団が障害児のほとんどを出産している。ダウン症候群を伴って産まれた子供の８ ０％が３５歳以下の「低危険性」群から産まれている。この事態は多数のその他 の遺伝的障害又は疾患でも同様である。
従って、危険な要因を伴うことなく、且つ突発的流産を伴うことなく、全妊娠女 性に有用となりうる安全な方法を提供することによって、この検査のジレンマを 解決しうる検査が所望されている。胎児細胞は妊娠女性の血流に循環しているこ とが知られるが（Ｋｕｌｏｚｉｋａｎｄ　Ｐａｉｙｌｏｗｆｔｚｋｉ、　’Ｆｅ ｔａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍａｔｅｒｎａｌ　Ｃ４ｒｕｌａｔｉｏｎ 　：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　［１ｉｒｅｃｔ　ＡＦＰ−１ｍｌｕｎｏｆ！ｕ ｏｒｅｓｃｅｎｃｅ’　）ｌｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ６２　：　２２１．２ ２４．１９８２を参照のこと）、胎児細胞は低い濃度において存在しており、そ れらを単離するために必要とする方法は非常に難しく且つ時間がかかる。
例えば、Ｈｅｒ　ｔｚｅｎｂｅｒｇらじＦｅｔａｌ　Ｃｅ１ｌＳｉｎ　ｔｈｅ　 Ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　ＰｒｅｇｎａｎｔＷｏｍｅｎ：ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄＥ ｎｒｉｃｈＩｌｅｎｔｂｙＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ＡｃｔｉｖａｔｅｄＣｅ ｌｌ　Ｓｏｒｔｉｎｇ、’　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ　７６　：　１４５３−１４５５＋１９７９３月）は、母体血液中の胎児細胞 を検出するために蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣ５）を用いている。しかしな がら、ここで利用している方法はあまり日常の臨床検査工程には適しておらず、 なぜならＦＡＣ５装置を作動させるには費用及び専門的技術が必要とされるから である。Ｈｅｒ　ｔｚｅｎｂｅｒｇ　らの方法は更に日常の臨床検査にとっての 欠陥を有し、なぜならこれはＩ（ＬＡタイプの検査を必要とするからである。Ｂ ｉａｎｃｈｉ　らじＤｊｒｅｃｔ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｏ　ＤＮＡ 　Ｆｒｏ＋ｍ　ＳｍａｌｌＮｕｍｂｅｒｓ　ｏｆ　Ｆｌｏｗ−５ｏｒｔｅｄ　Ｎ ｕｃｌｅａｔｅｄ　Ｎｅｗｂｏｒｎ　Ｃｅ］Ｉｓ”　Ｑ違ｐ佳α８：　１．９７ −２０２．１９８７）も有核細胞を検出するためにＦＡＣＳ装置を利用している が、その血液サンプルは母体からではなく新生児の賛帯から取っている。
本発明はこのような欠点を解消し、そしてその他の関連する利点を提供する胎児 細胞の富化のための方法を提供する。
光ｙ廊１１２ 本発明は母体からの胎児の有核赤血球系細胞の富化のための方法に向けられてい る。本発明の一観点において、このような方法は；母体血液のサンプルを、胎児 有核赤血球系細胞に特異的に結合することのできる固定化リガンドと、このリガ ンドとこの細胞を特異的に結合させるための条件及び十分なる時間のもとでイン キュベートし；結合していない血液物質を除去し；そしてこの結合細胞をエリト ロボイエチンの存在下においてインキュベートしてこの胎児細胞が優先的に富化 される段階を含んで成る。
本発明の他の観点において、母体血液由来の胎児有核赤血球系細胞を富化するた めの方法であって：母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞と特異的に結 合することのできるリガンドと化学的に結合した第１因子と、このリガンドをこ の細胞に特異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； この細胞を固定化されている第二の因子に吸着させ、ここでこの第二の因子は約 １０’　Ｍ−’以上の親和定数によってこの第一因子と結合することができ；そ してこの結合した細胞をエリトロボイエチンの存在下においてインキュベートし てこの胎児細胞が優先的にされる段階を含んで成る方法を提供する。適切な第− 因子−第二因子結合ベアーには、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトア ビジン、ビオシチン−アビジン、ビオシチン−ストレプトアビジン、メトトレキ セート−ジヒドロホレートリダクターゼ、５−フルオロウラシルーチミジレート シンセーターゼ及びリボフラビン−リボフラビン結合性タンパク質が含まれる０ 本発明のこの観点の一つの態様において、リガンドに化学的に結合されているこ の第一因子はビオチニル化抗体であり、そしてこの固定化されている第二の因子 は固定化アビジンである。
本発明の他の観点において、本方法は：母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球 系細胞に特異的に結合することのできる第一リガントと、この細胞にこの第一リ ガントを特異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとてインキュベートし、 このサンプルをこの第一リガントに特異的に結合することのできる第二リガンド に化学的に結合している第一因子と、この第一リガントにこの第二リガンドを特 異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとてインキュベートし；この細胞を 固定化されている第二因子に吸着させ、ここでこの第二因子は約１０”　Ｍ−’ 以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；結合していない血 液物質を除去し：そして結合している細胞をエリトロボイエチンの存在下におい てインキュベートしてこの胎児細胞を優先的に富化せしめる段階を含んで成る。
ある態様において、この第一リガントは胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合す る抗体である。好ましいＢｍにおいて、この第二リガンドに化学的に結合してい るこの第一因子はビオチニル化抗体である。
このような態様において、この固定化第二因子は固定化アビジンである。
エリトロポイエチンの存在下における結合細胞のインキュベーションの段階に変 わる方法として、本発明の他の観点は＝　（ａ）この結合細胞を、アンモニア及 び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、アンモニウ ムイオンがこの結合細胞において蓄積される条件及び十分なる時間のもとでイン キュベートし；そして（ｂ）蓄積したアンモニウムイオンを含むこの結合細胞を アンモニア及び二酸化炭素の存在下においてインキュベートして、母体血液細胞 の選択的な溶血を生じせしめる段階を含んで成る。更に、本発明はエリトロボイ エチン冨化及び上記の方法、即ち、この細胞をアンモニア及び塩化物イオン並び にカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、アンモニウムイオンがこの結合 細胞において蓄積する条件及び十分なる時間のもとてインキュベートし、次いで 蓄積したアンモニウムイオンを含む結合細胞をアンモニア及び二酸化炭素の存在 下においてインキュベートして母体血液の選択的な溶出を生しさせる方法の両方 の組合せを用いて行うこともできる。これらの二通りの富化方法は逐次的に、そ していづれがの順序で行うことができる。
本発明の他の観点において、母体血液由来の胎児赤血球系細胞を富化する方法で あって：母体血液のサンプルをエリトロボイエチンの存在下においてインキュベ ートしてこの胎児細胞を富化せしめ；この富化細胞を、胎児有核赤血球系細胞に 特異的に結合することのできる固定化リガンドと、この細胞にこのリガンドが特 異的に結合できる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；そして結合 していない血液物質を除去する段階を含んで成る方法を提供する。
他方、本発明の他のＢ様において、この富化された細胞は、それらを、この細胞 に特異的に結合することのできるリガンドに化学的に結合している第一因子と、 この細胞にこのリガンドが特異的に結合できる条件及び十分なる時間のもとでイ ンキュベートし、そしてこの細胞を固定化されている第二因子に吸着させる（こ の第二因子は約１０’　Ｍ−’以上の親和定数によってこの第一因子に結合する ことができる）ことができる。本発明の更なる態様において、この富化された細 胞は、この細胞に特異的に結合することのできる第一リガントとこの富化細胞と を、この細胞にこの第一リガントが特異的に結合することのできる条件及び十分 なる時間のももとでインキュベートすることによって固定化し；このサンプルを この第一リガントに特異的に結合することのできる第二リガンドに化学的に結合 している第一因子と、この第一リガントにこの第二リガンドが特異的に結合する ことのできる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；そしてこの細胞 を固定化されている第二因子に吸着させる（ここで第二因子は約１０’　Ｍ−’ 以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができる）ことができる。
この第−及び第二リガンドの適切な組合せは下記に詳細する。
更に、上記した観点において、本方法は更に（結合していない血液物質の除去の 後に）：この結合細胞をアンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒ ドラーゼインヒビターと、この結合細胞内にアンモニウムイオンが蓄積される条 件及び十分なる時間のもとでインキュベートシ；そして蓄積したアンモニウムイ オンを含むこの細胞をアンモニア及び二酸化炭素の存在下においてインキュベー トして、母体血液細胞の選択的な溶血を生じせしめる段階を含んで成ることがで きる。
本発明の他の観点において、エリトロポイエチンの存在下における母体血液のサ ンプルのインキュベートに変わる方法として、この細胞をアンモニア及び塩化物 イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結合細胞内にア ンモニウムイオンが蓄積される条件及び十分なる時間のもとてインキュベートし 、次いで蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞をアンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させる。
本発明において、抗体、エリトロボイエチン及びトランスフェリンを含む種々の りガントが利用できる。このリガンドは、任意の種々の固相、例えば光ファイバ ー、ビーズ、磁性ビーズ、プレート、皿、フラスコ、メツシュ、スクリーン、固 体ファイバー、膜及びディツプスティック上に固定化していてよい。
本発明の他の観点において、胎児有核赤血球系細胞の染色体の分類のための方法 であって：胎児有核赤血球系細胞をエリトロボイエチンを含む培地の中で、この 細胞において分裂中期が誘発される条件及び十分なる時間のもとでインキュベー トし；この細胞のＤＮＡを固定し；この固定ＤＮＡを染色して染色体が観察でき るようにし；そしてこの染色されたＤＮＡを調べてこの染色体を分類する段階を 含んで成る方法を提供する。
本発明のこれら及びその他の観点は、以下の詳細なる説明を参照することによっ て明らかとなるであろう。
又ユ至庇狙星脱所 本発明は母体由来の胎児有核赤血球系細胞の富化のための方法を提供する。母体 血液は、その他の多数の種類の細胞の他に、成人及び胎児有核赤血球系細胞の両 方を含んでいる。本発明の効果を介して、胎児−ｆ核赤血球系細胞は、母体血液 中における１０６に１個の少なさから、約１０３に１個、そして好ましくは１０ ２に１個の富化濃度まで富化されうる。本発明の内容において、有核赤血球系細 胞は核を、そして一般には赤芽球を、その他の赤血球系先駆細胞と同様に含んで いる。
母体血液は妊婦から、当業界において周知の常用の技術を利用して得ることがで きる。好ましくは末梢血液を、容易に得られる起源、例えば肘前血管から、常用 の静脈穿刺技術によって抜き出す。母体血液を採取したら、これを常用の技術を 利用して凍結させるか又は４°Ｃで最大４〜７日間保存する。種々の抗凝固薬を 必要ならば血液に加えてよく、それにはとりわけＡＣＤ、　ＣＰＤＡ、　ＥＤＴ Ａ及びヘパリンが挙げられる。
次にこの母体血液を本発明に従う選別方法にかけ、ここでは更なる精製、例えば 蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣ３）による精製を伴うことなく、優先的に富化 された胎児細胞を得ることができる。一般に本方法は以下の段階：　（１）この 母体血液を固定化されているリガントと、又はその後固定化するリガンドのいづ れかとインキュベートし、この胎児有核赤血球系細胞をリガンドに結合させ、そ れ故これを固定化させ；　（２）結合していない血液物質を除去し；そして（３ ）胎児有核赤血球系細胞についての結合細胞を優先的に富化させるを含んで成る 。前記した通り、これらの基礎的な段階は択一的な順序において、例えば：　（ １）胎児有核赤血球系細胞に関して母体血液を優先的に富化し；　（２）この富 化した細胞を固定化されているリガンドと、又はその後固定化するリガンドのい づれかとインキュベートし、この胎児有核赤血球系細胞をリガンドに結合させ、 それ故固定させ；そして（３）結合していない血液物質を除去する段階を含んで 成る方法において行うことができる。本発明は、本明細書に参考として組入れた 、題“Ｉ＋ｗｎｕｎｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　Ｄｅｖｉｃｅ　ａｎｄＭｅｔｈｏｄ ″　（代理人のドソケノト番号２０００７２．４０１　）の関連出願に詳細の装 置を利用して行っている。
本発明の一観点において、この母体血液を、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結 合することのできる固定化されているリガンドと、このリガンドへのこの細胞の 結合を可能にする条件及び十分な時間のもとてインキュベートする。一般に、約 １５〜３０分の、４°Ｃ〜３７°Ｃでのインキュベーションが好ましい。もしこ のインキュヘーション段階を、この細胞がカラムを通過する際に行うなら、その 流速は細胞が結合することを可能にする十分なる遅さであるべきである。好まし くは、この細胞を少なくとも１５分かけてこのカラムのへノドに通す。
前記した通り、このリガンドはそれが胎児有核赤血球系細胞と特異的に結合でき るように選ぶべきである。本発明の内容において、このリガンドはもしそれが胎 児有核赤血球系細胞と結合でき、しかも約１０％以上の母体血液細胞と結合する ことがないなら、「特異的結合性」であると定義する。結合した胎児有核赤血球 系細胞数のその他の細胞に対する相対的パーセンテージは、特定のマーカー、例 えばアルファー胎児タンパク質（ＡＦＰ）による分析によって容易に決定できる 。例えば、下記の方法における任意の点にて、胎児細胞の母体細胞に対する相対 的パーセンテージはグルコースオキシダーゼ又は蛍光物質のいづれかのコンジュ ゲート化された抗ＡＦＰ抗体によって測定されうる（Ａ、　Ｋｕｌｏｚｉｋ　ａ ｎｄ　１．Ｈ，Ｐａｗｌｏｗｉｔｚｋｉ、　”ＦｅｔａｌＣｅｌｌｓ　ｉｎ　ｔ ｈｅ　Ｍａｔｅｒｎａ＋　Ｃ４ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　：　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　 ｂｙ　Ｄｉｒｅｃｔ　ＡＦＰ−Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、’　Ｈ ｕｏ＋ａｎ　Ｇｅｎｅｔ、　６２　：　２２Ｌ　１９８２を参照のこと）。
この測定は好ましくは二以上の精製段階を経て行う。
胎児を核赤血球系細胞に特異的に結合するりガントは当業界において知られ、そ れにはエリトロボイエチン（Ａｍｇｅｎ、　Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ。
Ｃａ１ｉｆ、）　、トランスフェリン（Ｓｉｇ＋ｗａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、＋　ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。
Ｍｏ、）及び特定の抗体が含まれる。有核赤血球系細胞を特異的に認識するモノ クローナル抗体が特に好ましい。有核赤血球系細胞に対するモノクローナル抗体 、例えば抗−トランスフェリンレセプター抗体は通常の販売元（Ｂｅｃｔｏｎ　 Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　５ｙｓｔｅｌＩ’ｓ。
Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ＋　Ｃａ１ｉｆ）より入手できる。他方、モノクロ ーナル抗−赤血球抗体、例えばＥＤ−１は当業界に周知の技術を用いて作ること ができる（Ｙｏｋｏｃｈｉ　ら、”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ　ＤｅｔｅｃｔｉｎｇＡｎｔｉｇｅｎｉｃ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　Ｗｉ ｔｈ　Ｒｅ５ｔｒｉｃｔｅｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｏｎ　Ｅｒｙｔｈｒｏｉ ｄＣｅｌｌｓ　：　Ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ　Ｃｏｅ＋ｍ１ｔｔ ｅｄ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｌｅｖｅｌ　ｔｏ　ｔｈｅＭａｔｕｒｅ　Ｅｒｙ ｔｂｒｏｂｌａｓｔ″Ｂｌｏｏｄ　６３　：　１３７６、１９８４を参照のこと ；更にはＨｅｄｄｙ　Ｚｏｌａ　（［）　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏ ｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆハ並旦ｕ並、　ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂ ｏｃａ　Ｒａｄｏｎ、　Ｆｌａ、　１９８７を参照のこと）。
簡単に述べると、細胞を胎児肝臓クローナル赤血球培養物から免疫化のために作 り、そして子孫細胞に関して富化せしめる。これにより、抗原及び第１スクリー ニングのために用いる細胞の集団は未熟な赤血球、中程度に成熟した赤血球及び おそらくばＢＦＵ−Ｅ及びＣＦＵ−Ｅ型の先祖細胞を含みうる。これらの細胞を 静脈内免疫化に用い、次いで肺臓を取り出し、そしてこの肺臓細胞をミエローマ 細胞系、例えばＮＳＩ　と、標準的な技術を利用して融合させる。ここで得られ る融合した細胞又はハイブリドーマ−を、次に常用の技術（Ｙｏｋｏｃｈ　ｉら 、前記を参照このこと）を利用して上記の細胞に対してスクリーンする。
特異的に結合性の抗体全体をリガンドとして用いる必要はない。
より詳しくは、この抗体の結合性領域のみが、胎児有核赤血球系細胞に特異的に 結合するのに必要とされる。従って、本発明においては抗体フラグメント、例え ばＦａｂ又はＦ（ａｂ’　）ｚフラグメントが利用されうる。更に、この特異的 に結合性の抗体の結合性領域を、リガンドとして用いることのできる新たなタン パク質に一体化させることができる（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、’Ｒｅｓｈａｐｉ ｎｇ　Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｆｏｒｔｈｅｒａｐｙ″Ｎａｔｕｒ ｅ　３３２　：　３２３−３２７．　１９８８　；　Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、” ＲｅｓｈａｐｉｎｇＨｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｇｒａｆｔｉｎｇ 　ａｎ　Ａｎｔｉｌｙｓｏｚｙｍｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ’　５ｃｉｅｎｃｅ２３ ９　：　１５３４−１５３６．１９８９　；及びＲｏｂｅｒ　ｔｓ　ら、”Ｇｅ ｒ＋ｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ八へｔｉｂｏｄｙ　ｗｉｔｈ　Ｅｎｈａｎｃｅ ｄ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ａｎｄ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｆｏｒ　ｉｔｓＡｎ ｔｉｇｅｎ　ｂｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”　Ｎａ旦ｒｅ　 ３２８　：　７３１−７３４．１９８７を参照のこと）。
本発明において、結合細胞を他の血液物質から分離させるためにリガンドを固定 化させる。多数の適切な支持体が当業界に知られ、それにはとりわけ、光ファイ バー（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｄａｎｖｅｒｓ。
Ｍａｓｓ）　、ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、 　Ｐｅｎｎ）　、磁性ビーズ（Ｒｏｂｂｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｍｏｕ ｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆ）、プレート、皿及びフラスコ（Ｃｏｒｎ ｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ＋　Ｎ、Ｙ、）　、メソシ ュ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃ ａ１ｉｆ、）、スクリーン及び固体ファイバー（Ｅｄｅｌｍａｎら米国特許第３ ，８４３，３２４号を参照のこと；更に、Ｋｕｒｏｄａら米国特許第４，４１６ ．７７７号を参照のこと）、膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏ ｒｄ、　Ｍａｓｓ、）及びデインブスティックが含まれる。記載したちの以外の 、種々の支持体に関するソースがある。
特に好ましいのは、Ｂｔｏｇｅｌ　Ｐ−６０（商標）　（ＢＩＯＲＡＤ＋　Ｒｉ ｃｈｓｏｎｄＣａｌｉｆ）のような支持体である。Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ−６０（商 標）は多孔性のポリアクリルアミドヒドロゲルビーズである。このビーズは一般 に球形であり、平均して約２５０ミクロンのサイズであり、そして約６０，００ ０ダルトンより大きい分子を排除する平均孔径を存する。
種々の方法が、リガンドを支持体に固定化するのに利用できる。
例えば、リガンド例えば抗体は、当業界に周知の種々の方法によっ：　Ｐａｒｔ 　Ｂ、　Ｗ、Ｂ、　Ｊａｋｏｂｙ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｗｉｌｃｈｅｋ　（Ｗ）　、 Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ頁３０．１９７４を参照のこ と；更には門、Ｗｉｌｃｈｅｋ　ａｎｄ　Ｗ、Ｂａｙｅｒ＠Ｔｈｅ　Ａｖｉｄｉ ｎ−Ｂｊｏｔｉｎ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　ｉｎ　Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａｐ ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ″復望すひよ」士匹セ猥工１７１　：　１−３２．１９８ ８を参照のこと）。これらの方法は、グルタルアルデヒＶ、カルボジイミド、カ ルボニルジイミダゾール、臭化シアン、塩化トシル、ビオチン／アビジン及びビ オチン／ストレプトアビジンの利用を含んでいる。このリガンドを支持体に固定 化させたら、この母体血液をこの固定化リガンドと、このリガンドが細胞に結合 する条件及び十分なる時間のもとてインキュベートさせる。本発明の内容におい て、結合が生ずるための適切な条件は、生理学的緩衝液中での約４°Ｃ〜約３７ ゛Ｃでのインキュベーシランを含む、特に好ましい温度は４℃〜室温の範囲であ る。インキュベーションの時間は細胞に対するリガンドの親和性及び結合活性に 依存し、これは容易に決定されうる。一般に、約１５分〜１時間にわたるインキ ュベーションが好ましい、インキュベーションの後、結合していない血液物質を 除去し、そして本明細書に記載の方法を用いて胎児細胞を富化させる。
本発明の他の観点において、母体血液のサンプルを適切な条件のもとで、第一因 子に化学的に結合させであるリガンドとインキュベートし、その後、固相に固定 化させである第二因子に吸着される。
この第一因子は約１０＠Ｍ−’以上の親和力によってこの第二因子に結合できる べきである。多数の適切な第−因子−第二因子結合ペアーが当業界において周知 である。それらにはとりわけ、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビ ジン、ビオシチン−アビジン、ビオシチン−ストレプトアビジン、メトキトレキ セード−ジヒドロホレートリダクターゼ、５−フルオロウラシルーチミジレート シンセターゼ、リボフラビン−リボフラビン結合性タンパク質、抗体−プロチイ ンＡ、及び抗体−プロチインＧが含まれる。好まい態様において、この第一因子 はビオチンであり、そしてこの第二因子はアビジンである。
前記の結合ベアーのいづれの因子も、第一因子として機能する相補的因子と共に 、第二の因子として働くことができる。更に、第−因子−第二因子結合ペアーの 組合せを利用することができる。例えば、ビオチンはりガントへと結合させ、同 様に支持体に吸着させることもできる。この細胞、リガンド、ビオチン−複合体 及びビオチン支持体−複合体を次にインキュベーション段階を経てアビジンと結 合させることができる。アビジンは多価であり、細胞を固定化せしめる、細胞、 リガンド、ビオチン、アビジン、ビオチン、支持体−複合体の形成を可能にする 。
本発明の一例において、母体血液のサンプルをビオチニル化抗体と、結合が生ず る条件及び十分なる時間のもとてインキュベートする。次にこのサンプルを、固 定化されたアビジンを含む支持体とインキュベートするか、又はそれに通過させ る。このビオチニル化抗体に結合している細胞はこの固定化アビジンに吸着し、 これによって結合していない血液物質からの細胞の分離が可能となる。その後、 結合しいない細胞を除去し、そして胎児細胞を下記の方法を利用して富化させる 。
本発明の他の観点において、胎児有核赤血球系細胞を固定化するのにツーステッ プ法を利用する。簡単に述べると、第一リカ゛ンドを母体血液のサンプルと、前 記した適切な条件のもとでインキュベートする。次に、第一因子に化学的に結合 させである第二リカ゛ンドを加える。この第二リガンドはこの第一リガントに結 合することができる。細胞、第一リガント、第二リガンド、第−因子−複合体を 次に固定化されである第二因子に吸着させ、結合してし）なむ）血液物質からの 分離を可能にさせる。この第−因子−第二因子結合ベアーの代表例は前記した。
この第一リガントの代表例はエリトロボイエチン、トランスフェリン及び特定の 抗体を含む、この第一リカ゛ンドを選んだなら、この第一リガントを特異的に認 識且つ結合する第二リガンドを選ぶ。好ましい態様において、この第二リカ゛ン 口よ抗体、例えば抗−エリトロボイエチン（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ、　Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ。
Ｂ、Ｃ，Ｃａｎｄａ）　、抗−トランスフェリン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ　ｒｎｔｌ 、、　Ｔｎｃ、。
Ｔｅｌｌ１ｅｃｕｌａ、　Ｃａ１ｉｆ、）又は抗イムノグロブリン抗体である。
抗イムノグロブリン抗体は当業界において周知の技術を用０て調製する力）、又 ハ通常ノソースであってとりわけＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓ ｔ、Ｌｏｕｉｓ。
Ｍｏ１．及びＢｅｃｔｏｎ　［１ｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅ ｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆを含むソ ースより入手できる。
好ましいＵ様において、この第一リガントは胎児有核赤血球系細胞を特異的に認 識する抗体、例えば抗トランスフェリンレセプター抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃ ｋｉｎｓｏｎ　ＩｍＩＩｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｍｏｕ ｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ。
Ｃａ１ｉｆ、）である。この抗体を母体血液のサンプルとインキュベートする。
ビオチニル化抗−イムノグロブリン抗体、例えばビオチニル化ヤギ抗−マウスＩ ｇＧ　（第二リガンドであって第一因子に化学的に結合しているもの）を次に加 え、そしてこのサンプルとインキュベートする６次にこのサンプルを、固定化さ れた第二因子（このケースにおいては固定化アビジン）を含む材料のベッドとイ ンキュベートするか又はそれを通過させる。この細胞、抗体、抗−イムノグロブ リン抗体及びビオチン−複合体はこの固定化アビジンに吸着され、これによって 結合していない血液物質のその後の除去を可能にする。
前記した通り、細胞が固定化されたら、結合していない血液物質は除去できる。
ある態様において、この固定化細胞を生理学的緩衝液によってすすいでこの結合 していない血液物質を除去する。この固定化細胞のすすぎは、選んだ支持体の種 類に依存して種々の方法が利用できる。この方法はとりわけ：支持体を洗浄又は フランシュする；この支持体を溶液から磁気的に吸引し、次いで生理学的緩衝液 に再懸濁させる；及び遠心し次いで再懸濁することを含む。種々の生理学的緩衝 液が当業界に知られ、それにはＰＢＳ　、アルブミン例えば生血清アルブミン（ ＢＳＡ）を含むＰＢＳ　、正常食塩水及び細胞培養培地が含まれる。
結合していない血液物質が除去できたら、結合細胞を胎児有核赤血球系細胞に関 して優先的に富化させることができる。前記した通り、少なくとも二通りの択一 的な方法を、独立して又は−緒に利用することができる。もしこの二通りの方法 を一緒に行うなら、いづれの方法をはじめに行ってよい。ある態様において、こ の結合細胞をエリトロボイエチン（Ａ＋ｍｇｅｎ、　Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋ ｓ、　Ｃａ１ｉｆ）の存在下において、選ばれた条件のもとで培養する（Ｅｍｅ ｒｓｏｎら、’ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｒ ｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｔｓ　ｂｙ　Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ　Ｇｒｏｗｔｈ 　Ｆａｃｔｏｒｓ：　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ　ｏｆ 　ＢＦＵ−Ｅ　Ｆｒｏｍ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗ。
Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　ａｎｄ　Ｆｅｔａｌ　Ｌｉｖｅｒ、”Ｂｌ ｏｏｄ　７４　（１）　：　４９−５５．１９８９を参照のこと；更にはＬｉｎ ｃｈ　ら、’５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ＣｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＨｅｍｏｐｏｉｅ ｔｉｃ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｆｅｔａｌ　 Ｂｌｏｏｄ、”　Ｂｌｏｏｄ　５９（５）　：　９７６−９７９．１９８２を参 照のこと）。選ばれる培養条件は一般に、エリトロボイエチン以外のその他のサ イトカインを伴わない標準の細胞培養培地における増殖を含む。これは母体では なく胎児の有核赤血球系細胞を優先的に増殖させる。特に好ましい培地は、２０ ％の牛血清アルブミン及び２Ｕ／鵬ｌの精製した尿ヒトＦＰＯを含むｌ５ｃｏｖ ｅの改良ダルベツコ培地（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ）を含む。
第二の方法において、胎児有核赤血球系細胞を、そのアンモニウムイオンの取り 込み及び母体血液細胞、又はより詳しくは母体赤血球系細胞の溶血に基づいて優 先的に富化させる（一般的には、Ｊａｃｏｂｓａｎｄ　Ｓｔｅ＠ａｒｔ、　’Ｔ ｈｅ　Ｒｏｌｅ　ｏｆ　Ｃａｒｂｏｎｉｃ　Ａｎｈｙｄｒａｓｅ　ｉｎ　Ｃｅｒ ｔａｉｎ　ＩｏｎｉｃＥｘｃｈａｎｇｅｓ　Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｅｒ ｙｔｈｒｏｃｙｔｅ、’　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｐｈ　５ｉｏ１．２５　：５３９− ５５２．１９４２　；及びＭａｒｅｎ　ａｎｄ　Ｗｔｌｓｙ、　”に１ｎｅｔｉ ｃｓ　ｏｆ　ＣａｒｂｏｎｉｃＡｎｈｙｄｒａｓｅ　ｉｎ　Ｗｈｏｌｅ　Ｒｅｄ 　Ｃｅ１ｌｓ　ａｓ　Ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｏｆＣａｒ ｂｏｎ　Ｄｉｏｘｉｄｅ　ａｎｄ　Ａｍｍｏｎｉａ、”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐ ｈａｒｍａｃｏｌｏ　６　：　４３０−４４０゜１９７０を参照のこと）。簡単 に述べると、細胞をアンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニンクアンヒドラ ーゼインヒビターの存在下において、細胞内におけるアンモニウムイオンの蓄積 を可能とする条件及び十分なる時間のもとてインキュベートする。これは一般に 約５〜３０分かかる。この細胞を次にアンモニア及び二酸化炭素の存在下におい てインキュベートし、母体血液細胞の選択的な溶血を起こさせる。
本発明の内容において、多数の化合物がアンモニア、塩化物イオン及び二酸化炭 素の適切な起源としてふるまえる。例えば、アンモニアの適切な起源にはとりわ け、アンモニア及びアンモニウム塩が含まれる。塩化物イオンの適切な起源には とりわけ、ＮａＣｌ、　ＫＣＩ。
ＭｇＣ＋□及びＣａＣＩｚが含まれる。二酸化炭素の適切な起源にはとりわけ、 溶液中の二酸化炭素、炭酸塩及び重炭酸塩が含まれる。
更に、多数のカルボニックアンヒドラーゼインヒビターが当業界において知られ 、とりわけ、はとんど−価の陰イオン、例えばシアニド及びシアネート、−価ス ルフィド、スルホンアミド及びアセタヅールアミドが含まれる（Ｌｉｎｄｓｋｏ ｇら、ｑ　５４　：　５８’Ｌ１９７１　；　Ｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｃｕ１ｌ　Ａ ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、　１５０　：　４３６．１９７ ２；及びＰｏｃｋｅｒ　ａｎｄ　ＷａｔａＩｌｏｒｉ、　Ｂｉｏｃｈｅｎ　１２ 　：　２４７５＋　１９７３を参照のこと）。カルボニックアンヒドラーゼイン ヒビターは生理学的条件のもとで機能するものとして選ぶべきである。好ましい カルボニックアンヒドラーゼインヒビターにはスルファニルアミド（ｓｕｌｆａ ｎｉ　Ｉａｍｉｄｅ）及びアセタゾールアミド（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ） が含まれる。
結合細胞は種々の方法により、富化の後又は前にて遊離させることができる。も し結合細胞を富化の前に遊離させるとき、これらは上記の方法を用いてその後に 富化させることができる。細胞を遊離させる種々の方法が当業界に知られている 。このような一方法において、細胞もサイトカインを伴って又は伴わないで培養 することができる。サイトカイン、例えば■１、−２は細胞を増殖させるが、又 は細胞の表層特性を変えてこれらの細胞もしくはその子孫が支持体から遊離する ことを起こさせることができる。他の方法において、リガンド又は細胞−リガン ト結合の切断が細胞を遊離させうる。種々の切断可能なりガント及び切断酵素が 当業界に知られ、とりわけパパイン及びトリプシンが含まれる。更なる他の方法 において細胞は機械的、重力的又は電磁的力によって遊離されうる。特定の好ま しい方法は機械的攪拌、例えばピペッティング、攪拌、振騰、振動又は音波を介 してのビーズの攪拌である。
本発明の他の観点において、細胞をまず富化し、次いで胎児有核赤血球系細胞の 吸着及び結合していない１履物質の除去を伴う方法を提供する。簡単に述べると 、胎児細胞をまず、母体血液をアンモニア及び塩化物イオン、並びにカルボニッ クアンヒドラーゼインヒビターとインキュベートすることによって富化させる。
アンモニウムイオンの蓄積が可能となる条件及び十分なる時間のもとて細胞をイ ンキュベートさせた後、この細胞をアンモニア及び二酸化炭素で処理して母体血 液細胞の選択的な溶血を起こさせる。胎児細胞は前記した通りエリトロボイエチ ンとのインキュベーションによって、又はエリトロポイエチンと上記の方法、即 ち、細胞をアンモニア及び二酸化炭素で処理する方法の両方を組合せた処理によ っても富化されうる。更に前記した通り、この二通りの方法はいづれの順におい て行ってよい。
以上の方法の後に残った富化細胞を次に任意の上記の方法を用いて固定化するこ とができ、それには：　（１）富化の後に残っている胎児有核赤血球系細胞に特 異的に結合する固定化リガンド；　（２）富化の後に残っている細胞をリガンド に連結しである第一因子とインキュベートしくこのリガンドは胎児有核赤血球系 細胞と特異的に結合することができる）、次いでこの細胞を、固定化された第二 因子に吸着させること（この第二因子は約１０６Ｍ　−１以上の親和定数によっ て第一因子に結合することができる）；及び（３）富化の後に残っている細胞を 第一リガントとインキュベートし、次いで第一リガントに結合することのできる 第一因子に化学的に結合している第二リガンドと、この第二リガンドがこの第一 リガントに結合される条件及び十分なる時間のもとてインキュベートし、次いで この細胞を固定化された第二因子に吸着させる（この第二因子は約１０’　Ｍ− ’以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができる）こと、を含ん でいる。
細胞の固定化の後、結合していない血液物質を前記の方法を用いて除去すること ができる。もしこの細胞をエリトロボイエチンを用いてまず富化させ、次いで結 合していない血液物質を除去するとき、この細胞を、アンモニア及び二酸化炭素 を用いる方法を利用して処理することができる。同様に、もしこれらの細胞をア ンモニア及び二酸化炭素を用いる方法によってまず処理し、次いで結合していな い血液物質を除去するとき、この細胞をエリトロボイエチンによって処理するこ とができる。
母体血液から富化せしめた胎児細胞は、この優先的に富化された細胞を、胎児細 胞に選択的に結合することのできるマーカーとインキュベートすることによって 特徴付けされうる。マーカーは、標的細胞上のその標的が、母体細胞のその量の よりも１０倍以上高いときに選択的に胎児細胞に結合する。種々のマーカーが当 業界において知られ、それには例えばアルファー胎児タンパク質（ｒＡＦＰ　Ｊ 　）に対する抗体（１（ｕｌｏｚｉｋら、”Ｆｅｔａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　ｔ ｈｅ　ＭａｔｅｒｎａｌＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ 　Ｄｉｒｅｃｔ　ＡＦＰ−１ｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ”Ｈｕｍａｎ 　Ｇｅｎｅｔ、　６２　：　２２１−２２４．１９８２を参照のこと）又は抗原 「ｉ」に対する抗体（Ｙ、Ｗ、　Ｋａｕら、”Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏ ｆ　Ｆｅｔａｌ　Ｒｅｄ　ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ　Ｆｒｏｍ　ａ　Ｍｉｘｔｕｒ ｅ　ｏｆ　Ｍａｔｅｒｎａｌ　ａｎｄ　Ｆｅｔａｌ　Ｂｌｏｏｄ　ｂｙ　Ａｎｔ ｉ−ｉ胎児細胞マーカーに対する抗体は、当業界において周知の技術を利用して 標識することができ、そして胎児細胞の存在の検出のために用いられる。
本発明の好ましいＢ様において、本明細書に参考として組入れた題ｒＭｅｔｈｏ ｄｓ　ｆｏｒ　！ｉｅｍｏｖｉｎｇ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｐａｒｔ ｉｃｌｅ　５ｕｒｆａｃｅＪ（代理人ドケント番号２０００７２−４０３）の関 連出願に詳細の方法を介して、リガンドを細胞表層から除去する。このような除 去は前記した通りの特徴付けの前に特に有利でありうる。
前記した通り、富化せしめた胎児細胞は種々の利用性を有する。
例えばインシトゥ（ｉｌｌ　５ｉｔｕ）ハイブリダイゼーションを介して、特定 の遺伝子物質の存在が胎児細胞において検出できうる。同様に、ＤＮＡ又はｌ？ ＮＡ増幅も胎児細胞における特定の遺伝子配列を検出するために用いられうる。
本発明の方法は、細胞の染色体の広がりを顕微鏡のもとで調べる常用の細胞遺伝 学技術による染色体分類を可能とする程度に富化された胎児細胞に関して特に有 用である。
インシトウハイブリダイゼーションは細胞内の特定の遺伝子物質の存在の検出の だめの方法として利用されうる（ＰｉｎｋｅｌらのＰｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ　８５：９１３８−４２．１９８ ８；更にはＨｏｐ＋ｗａｎ　ａｔ　ａｌ、＋”Ｄｅｔｅｃｔｊｏｎ　ｏｆ　Ｎｕ ｓ＋ｅｒｉｃａｌ　Ｃｈｒｏａ＋ｏｓｏｍｅ　Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　 ＢｌａｄｄｅｒＣａｎｃｅｒ　ｂｙ　Ｉｎ　５ｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ ｏｎ、　Ａｍ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｐａｔｈ、’　１３５　（６）　：１．１０５− １１１７．１９８９を参昭のこと〕。簡単に述べると、優先的に富化された細胞 に関する遺伝子物質をまず当業界に周知の技術を利用して露出せしめる。この遺 伝子物質を次に、この遺伝子物質と特異的にハイブリダイズすることのできる標 識化プローブと、ハイブリダイゼーションが生ずる条件及び十分なる時間のもと てインキュベートする（例えば、Ｋ、Ｅ、　Ｄａｖｉｅｓ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅ ｎｅｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ、　ＩＲＬＰｒｅｓｓ＋　０ｘｆｏｒｄ、　Ｕ、 に、　１９８６を参照のこと）。最後に、このハイブリダイズした標識化プロー ブの存在を検出する。好ましい態様において、この遺伝子物質をこの露出段階の 後に変性させる。本発明の内容において、遺伝子物質は完全染色体、ＤＮＡ及び ＲＮＡを含む。
遺伝子物質を増幅及び検出するための種々の方法が当業界に周知である０例えば 、もし存在しているなら、その特定の遺伝子配列を当業界に周知の技術を利用で 増幅させ、次いでこの配列の存在をプローブすることができる（Ｋｏｇａｎら、 ’Ａｎ　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ＦｏｒＰｒｅｎａＬａｌ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｂｙ　Ａｎａｌｙｓｉ ｓ　ｏｆＡｍｐｌｉｆｉｅｄ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ、”　Ｔｈｅ　Ｎｅ ｗ　Ｅｎ　、　Ｊ、　ｏｆ　Ｍｅｄ、　３１７（１６）　：９８５−９９０．１ ９８７　；及び−ｉｔｔ　ａｎｄ　Ｅｒ１ｃｋｓｏｎ、　’Ａ　Ｒａｐｉｄ　Ｍ ｅｔｈｏｄ　ｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　’／−Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ 　ＤＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｄｒｉｅｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ　ｂｙｔｈ ｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ、”　Ｈｕｍａｎ　 Ｇｅｎｅｔ、　８２：２７１−２７４．１９８９を参照のこと）。増幅のための 方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（本明細書に参考として組入れた、Ｍｕｌｌｉｓ ら、米国特許第４，６８３．１９５号；Ｍｕｌｌｉｓら米国特許第４，６８３， ２０２号；及び門ｕｌｌｉｓら米国特許第４，８００．１５９号を参照のこと） 、及びＲＮＡを基礎とする増幅技術（本明細書に参考として組入れた、Ｌｉｚａ ｒｄｉ　ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　ｆｉ：１１９７−１２０２゜１９８８ 　；　ＫｒａｍｅｒらＮａｔｕｒｅ　３３９　：　４０１−４０２．　１９８９ 　；及びＬｏ＋ｎｅ　！　ｉらＣ１１ｎｉｃａｌ亜」譚匹α３５　（９）　：　 １８２６−１８３Ｌ　１９８９　；更にはＫｒａｍｅｒら米国特許第４．７８６ ，６００号を参照のこと）を含む。
ＰＣＢは最も一般的に利用されている、ＤＮＡ配列を増幅させるための方法であ る。簡単に述べると、増幅は適当なプライマー、酵素及びヌクレオチドの反応混 合物への添加、次いで少量の標的ＤＮＡの増幅のための変性とアニーリングの複 数（２０〜８０）の周期を含む。このＤＮＡ混合物を次に電気泳動によって分け 、そして標識化プローブとハイブリダイズし、標的ＤＩＩＡ配列の存在を検出す る。
優先的に富化せしめた胎児細胞は染色体的に分類されることもできる（Ｈｕｍａ ｎ　Ｃｔｏ　ｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｄ、Ｅ、　Ｒｏｏｎｅｙ　ａｎｄ　Ｂ、Ｈ，Ｃ ｚｅｐｕｌｋｏｕｓｋｉ（Ｗ）　、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　Ｕ Ｊ、、　１９８６）。簡単に述べると、好ましい態様において、１０５個の他の 細胞中に少なくとも１個の胎児細胞を含むサンプルを、最終濃度が２０％の仔牛 血清（ＦＢＳ）　（ＨＹＣＬＯＮＥ（商標）　、Ｌｏｇａｎ　ＩＪｔａｈ）及び ２Ｕ／１の高純度組換えエリトロボイエチン（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ＋　Ｂ、Ｃ，、Ｃａｎａｄａ）を含むｌ５ｃ ｏｖｅの改良ダルベツコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　Ｉｓ！ ａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、）中で２−６日培養して、分裂中期における細胞の割合を高 めた。この細胞を次にコルセミド中でインキュベートし、固定し、顕微鏡スライ ドに載せ、トリプシン処理し、そして−ｒｉｇｈｔ染色によって染色した。この スライドはこれによって異常染色体について顕微鏡観察実施例 ■上 ポリアクリルアミドゲルのカルボキシル化１７ｇの乾燥ＢｉｏＨｅｌ　ｐ　−６ ０（商標）　（５０〜１００メ・ンシュ（ウェットで）の粗粒）　（ＢｒＯＲＡ Ｉ）、カタログ番号１５０−１６３０．　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。
Ｃａ１ｉｆ、）を０，５ＭのＮａＨＣＯ３１０，５ＭのＮａｚＣＯｆｆｌ、５１ 　に加えた。このｐＨをＮａ０）１で１０．５に調整し、そしてビーズが損傷し ないように慎重にミキサー（ＲＺＲｒ、　Ｃａｒｆａｍｏ、　Ｗｉａｒｔｏｎ＋ 　０ｎｔａｒｉｏ、　Ｃａｎａｄａ）で約２０〜３０分間攪拌した。この混合物 を次に６０’Ｃの湯浴に入れた。温度が６０°Ｃに到達した後、これを更に２時 間（６０℃）で時折攪拌しながらインキュベートした。次にこの混合物を湯浴か ら取り出し、そして氷冷槽に入れてこの混合物の温度を室温にまで下げた。
このビーズを蒸留水又は脱イオン水で数回、次いでＰＢＳで数回、真空に接続さ れた粗いガラスフィルターを用いて洗った。このカルボキシル化ゲルはＰＢＳ中 で４°Ｃにて保存でき、そしてこれは無菌状態又は防腐剤を伴って１年間安定で ある。
阻ｌ カルボキシル化Ｂｉｏｇｅｌのアビジンコンジュゲート化一定量のカルボキシル 化ＢｉｏｇｅｌからまずＰＢＳを、真空に接続された粗いガラスフィルターを用 いて濾過することによって除（また。次にこのゲルを蒸留水又は脱イオン水で１ ５〜３０分間平衡せしめた。水における平衡化は、このゲルを最初に定量した容 量の約４倍にまで膨潤させる。このゲルを、１＋ｉｌのゲル当り（もとはＰＢＳ 中で測ッた量）　１０＋ｌの蒸留水又は脱イオン水中に再懸濁させた。
２０ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ ＥＤＣ−）ＩＣＩ）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、カタログ番号Ｅ ７７５０．　Ｓｔ。
１、ｏｕｉｓ、　Ｍｏ、）を測ったもとのゲル１１当りに加えた。このｐＨ−Ｉ ＨｃＩの滴下によってず早く５．５に調整した。このｐＩ（を５．５に維持する ように気を付けた：５．０以下又は６．０以上のｐＨはＢｉｏｇｅｌの活性下を 有意に低める。この混合物を５分間攪拌した。
アビジン（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｆａ ！１ｂｒｏｏｋ、　Ｃａ１ｉｆ、）を脱イオン水に１０〜１００　ｍｇ／ｍｌの 間の濃度で溶かした。次に、５００μｇのアビジンをゲル１＋＋１当り（もとは ＰＢＳ中で測った量）にす早く加えた。この混合物を１．５時間攪拌した。次に ２Ｍのグリシンを最終濃度がこの混合物中で０．２Ｍのグリシンとなるように加 え、そして更に１時間攪拌した。
このゲルを数倍容量のＰＢＳで、粗いガラスフィルター及び真空を利用して洗い 、そして０．１％のＮａＮｘを含むＰＢＳ中で４　”Ｃで保存した。
このゲルはおよそ１年間安定である。
炎主 ツーステップ法による母体細胞の免疫吸着細胞の準備 ２０＋１１の血液を妊婦から採取し、そして５０ｍ１の遠心管中の１％の生血清 アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｔｇｗａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌ ｏｕｉｓ、　Ｍｏ、）を含む等容量のＰＢＳに懸濁した。１１１１当りの存核細 胞数を以下の方法で測定した。小分けした混合抗凝血処理した完全血液５０μｌ を３％の酢酸溶液３信１に希釈した。攪拌後、この希釈血液のサンプル７μＩを ヘマサイトメーターの２つの槽それぞれに入れた。細胞を約３分間かけて沈降さ せた後、酢酸によってほとんどが溶解された細胞の核を、改良されたＮｅｕｂａ ｕｅｒルーリング（ＶＷＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ 、　Ｃａ１ｉｆ、）の付いたヘマサイトメーターの槽の４箇所の罫線領域におい て測定した。それぞれの領域は０．Ｉ　Ｘｌ０−’μｌのサンプル容量を占める 。−領域当りの核の平均数に６１　Ｘ　１０’の希釈系数を掛け、１ｍｌの完全 血液当たりの有核細胞数をもとめた。平均値がｅＮ域当り１０個の核よりも小さ かったら、この処理を繰り返したが、ただし５０μｍの血液を１ｍｌのみの酢酸 に希釈し、そしてその結果として新たな希釈系数は２１　Ｘ　１０’とした。
希釈血液の各チューブに５ｍｌのヒストバク　（Ｈ４ｓｔｏｐａｑｕｅ）　１０ ７１０７７（Ｓｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を入れ、そして室温で１５分間 ７００ｇで遠心した。界面にある細胞を集め、そして１％のＢＳＡを含むＰＢＳ で１回洗った。このベレットを１％のＢＳＡを含むＰＢＳ　１００μｍに再懸濁 させた。
抗−トランフニリンレセプター抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＋１＋ ｕ＋ｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ 、Ｃａ１ｉｆ、）２０μ　ｇ／　ｍｌをこの混合物に加え、そして氷の上で１５ 分間インキュベートした。この細胞を次に１％のＢＳＡを含むＰＢＳ　４ｍｌで １回洗い、そして約４００ｇで５分間遠心した。
この細胞を次に１１に慎重に再懸濁し、そして１μｇ／ｍｌのビオチニル化ヤギ 抗−マウスＩｇＧ　（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ＋　Ｂｉｒｖｉｎｇｈ ａ＊、　Ａｌａ、）を加えた。この混合物を氷上で１５分間インキュベートし、 そして前記の通り１％のＢＳＡを含むＰＢＳで２回洗った。
カラムの準備 カルボキシル化Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ　−３０（商標）（前記の通りに調製）を室温 に平衡化し、そしてに９／１．５カラム（Ｐｈａｒ＋ｍａｃｉａ＋　Ｐｉｓｃａ ｔａｉｅａｙ。
Ｎ、Ｊ、　）に総ベッド高さが１ｃｍとなるように充填した。このカラムをｐａ ｓ　、次いで５％のＢＳＡを含むＰＢＳで洗った。このカラムは「プレカラム」 として働く。アビジンカラムはアビジン−コンジュゲート化Ｂｉｏｇｅｔ　Ｐ　 −６０（商標）を含み、これは前記の通りに調製した。
このアビジン−コンジュゲート化カラムを室温に平衡化し、そしてＫ　９　／１ ５カラムに総ベッド高さが４ｃ＋ｉとなるように充填した。このカラムをＰＢＳ で数回、次いで５％のＢＳＡを含むＰＢＳで数回洗った。
細胞の免疫吸着 前記の通りに調製した細胞を５％のＢＳ八を含むＰＢＳに再懸濁して１、ｍｌ容 量となるようにした。この細胞を慎重にこのプレカラムフィルターのゲルヘッド の上に移し入れた。この細胞をプレカラムに通過させ、そして５％のＢＳＡを含 むＰＢＳ　１ｍｌで洗った。ベリスターポンプ（Ｃ（＋］ｅ−ｐａｒＨｒ、　Ｒ ｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＩｌ、）でアビジンカラムからの流速を約１ｍｌ／分にコ ントロールした。細胞のほとんどがこのアビジンカラムヘッドの上に落ちたら、 ５％のＢＳＡを含むＰＢＳ　１〜２ＩＩ１１をこのアビジンカラムの上に加えて 残りの細胞を洗い込んだ。このカラムを５％のＢＳＡを含むＰＢＳ４〜６ｍｌ、 次いでＰＢ５４〜６ｍｌで洗い流した。
アビジンカラムからの吸着細胞の除去 このアビジンカラムを１５１の遠沈管の上に載せた。このカラムのバルブを開け 、そして広い口径の９−インチトランスファーピペットによってこのカラムに１ ５１のＲＰＭＩ　１を加えた。このピペットを、細胞ベッドの機械的攪拌及び再 懸濁のために用いながら、ＲＰＭＩをこのカラムに加え、これによって細胞をこ のゲルマトリックスから離し、そして遠沈管の中へと濾過せしめた。この管を次 に４００　ｇで５分間遠心し、そして以下の培養培地に再懸濁した。
■土 胎児を核赤血球系細胞の優先的富化 エリトロボイエチンによる胎児細胞の富化上記のアビジン−Ｂｉｏｇｅｌカラム から分離せしめた細胞を、最終濃度２０％の仔牛血清（ＦＢＳ）　（ＨＹＣＬＯ Ｎε（商標）　、Ｌｏｇａｎ、　Ｕｔａｈ）及び２Ｕ／ｍｌＯ高純度組換えエリ トロボイエチン（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋νａｎｃｏｕｖ ｅｒ、　Ｂ、Ｃ，＋　Ｃａｎａｄａ）を含むｌ５ｃｏｖｅの改良ダルベツコ培地 （ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、Ｙ、）に再懸 濁させた。細胞を５０Ｘ１０６の有核細胞／ｍｌに希釈し、そしてその２００μ ｍを丸底の９６穴組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ 、　Ｃｏｒｎｉｎｇ＋　Ｎ、Ｙ、）の各ウェルに入れた。
アンモニウムイオン差別化による胎児細胞の富化上記のアビジンカラムから分離 せしめた細胞を２Ｘ１０’個の有核細胞／１以下の濃度に調整した。１容量の細 胞混合物を氷冷し、そして１８容量の０．１８４４ＭのｓＨ，ｃｉ及び２容量の １０ＭＭのアセタゾールアミドを含む２９°Ｃの溶液を加えた。２分後、２容量 の３ｎＭ（２■１１．１ＩｃＯｆｆをすばやく加え、そしてこの混合物全体を３ 分間攪拌した。細胞をＰＢＳで数回、遠心によって洗い、細胞塊を除去した。
炎立 インシトウハイプリダイゼーシゴン 富化細胞を低張溶液（０，０７５ＭのＫＣＩ）に３７°Ｃで１２分間暴露せしめ た。このインキュヘーション中にこのチューブを１回逆さまにして細胞を懸濁状 態に保たせた。新鮮な固定剤（３：１のメタノール：酢酸）　２０滴を細胞に加 え、攪拌し、そして約２５０ｇで８分間遠心した。新鮮な固定剤をこの細胞に加 え、次いで室温で１時間インキュベートした。この細胞を約２５０ｇで８分間遠 心した。新鮮な固定剤を加え、そしてこの処理を更にもう一回繰り返した。最後 に、この細胞を少量の固定剤に再懸濁し、そして４°Ｃで一夜放置した。
翌日、この細胞を攪拌し、そして顕微鏡スライド（Ｂａｘｔｅｒ。
ＭｃＧｒａｉｖ　Ｐａｒｋ、　ＩＩｌ、）に載せた。このスライドはエタノール で洗い、そして蒸留水に浸してあった。このスライドを室温で２日間乾燥させた 。
このスライドを２Ｘの５ＣＣ（０，３０ＭのＮａＣｌ、　０．０３０　ＭのＮａ クエン酸塩〕中の７０％のホルムアルデヒド中で６８°Ｃ〜７０°Ｃに２．５分 間熱した。
このスライドを直ちに水中の７０％のエタノールですすいだ。すすぎの後、この スライドを７０％、９５％そして１００％のエタノール溶液に順にそれぞれ５分 間入れた。各アルコール溶液は≦−２０°Ｃに維持しておいた。このスライドを 風乾させた。
ＰａｇｅらじＳｉｎｇｌｅ　ｃｏｙ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｓ 　ｔｏ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ａｎｄｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｉｏｃｉ　ｏ ｎ　ｈｕ＋ｓａｎ　Ｘ　ａｎｄ　Ｙ　ＣｈｒｏｍｏｓｏＩＩｌｅｓ”　ＰＮＡＳ 　７９：　５３５２−５３５６、１．９８２）の方法に従って、アメリカンタイ プカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）Ｎｏ５７２６１由来のプラスミＦＤＮＡ からプローブを調製した；ただしビオチン−ｄＡＴＰをプローブに一体化せしめ た。スライド当り２５μｌのビオチニル化プローブ（５μｇ／ａ＋１）をマイク ロ遠沈管に入れた。このプローブを７０℃で５分間熱し、そして直ちに氷の上に 置いた。２０μｌのプローブ溶液を各スライドに載せ、そして２２×４０１１１ ｆｆｉのカバースリップで覆った。このスライドを、濡れたペーパータオルを有 する箱に入れ、そして３７°Ｃで１２〜１８時間インキュベートした。
ＩＸのＳＳＣ中の５０％のホルムアルデヒドの溶液を３７゛Ｃに温めた。
このスライドからカバースリップをはずし、そして５０％のホルムアルデヒド溶 液に３０分間浸した。次にこのスライドを２ＸのＳＳＣ溶液に３０分間、ゆっく りとゆらしながら放置し、次いでゆっくりゆらしなからＩＸのＳＳＣに３０分間 放置した。蛍光化アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ＋Ｂｕｒ！ｉｎｇａｍｅ、　Ｃａ１ｉ ｆ、）を１　：　１０００　（１ｕ　ｇ／ｍｌ）に希釈した。このスライドの裏 面及び細胞領域の周辺をぬぐった。２００μｌのアビジン−蛍光物質を各スライ ドに加え、そして箱の中で３０分間室温でインキュベートした。このスライドを 順次１）４ＸＳＣＣにて１０分間ゆらしながら、２）４ＸのＳＣＣ，０，１％の ツイーン２０にて１０分間ゆらさずに、３）４ＸのＳＣＣにて１０分間ゆらしな がらすすいだ。このスライドの裏側及び細胞の周辺頭載をぬぐった。プロピジウ ムヨウ素を含む抗退色剤（１０ａ＋ｌのＰＢＳ、　１００ｍｇのｐ−フェニレン ジアミン、９０ｍ１のグリセロール、ｐＨ８，０，１０μｇ／ｍｌのピロビジラ ムヨウ素）１０μｌを加えた。このスライドにカバースリップをかぶせ、そして ４゛Ｃで保存した。このスライドは必要ならば数日間保存することができる。標 的ＤＮＡは蛍光の存在下によって顕微鏡のもとで観察することができる。
別」− 染色体の分類 富化細胞を１１／ｇのコルセミド（Ｓｔｇｍａ、　ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ＋　Ｍｏ、 ）に３７℃で１時間暴露させた。この細胞に低張溶液（０，０７５ＭのＭＣＩ） を加え、そして３７°Ｃで１２分間インキュベートした。このチューブはインキ ュベーンジン中に一回逆さまにし、細胞を懸濁状態に保った。新鮮な固定剤（３ ：１のメタノール：酢酸）２０滴を細胞に加え、攪拌し、そして約２５０ｇで８ 分間遠心した。新鮮な固定剤をこの細胞に加え、次いで室温で１時間インキュベ ートした。この細胞を約２５０ｇで８分間遠心し、そして再度新鮮な固定剤を加 えた。この処理を更にもう一回繰り返した。最後に、この細胞を少量の固定剤で 再懸濁し、そして４°Ｃで一夜放置した。翌日、この細胞を攪拌し、そして顕微 鏡スライド（Ｂａｘｔｅｒ、　ＭｃＧｒａｗ　Ｐａｒｋ　Ｉｌｌ、）に載せた。
このスライドはエタノールで洗い、そして蒸留水に浸してあった。このスライド を約３〜４日間風乾させ、そして０．００５％のトリプシン（Ｄｉｆｃ。
Ｂａｃｔｏｔｒｙｐｓｉｎ、　ＶＷＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎ ｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｔｆ、）で３０〜３５秒処理した。このスライドを１％の ＦＢＳを含むＰＢＳで２回、次いでＰＢＳのみで洗った。この細胞を−ｒｉｇｈ ｔの溶液（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。
ＳＬ、　Ｌｏｕｔｓ、　Ｍｏ、）で染色し、次いで脱イオン水で２回洗った。こ のスライドを分裂中期細胞について観察し、そして常用の技術によって分類した 。
本発明を例示の目的でその特定の態様について説明してきたが、本発明の範囲を 逸脱することなく改良及び変更が可能であることを当業者は認識するであろう。
従って本発明は添付した請求の範囲によってのみ限定される。
母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化せしめる方法であって＝　（ａ）母体 血液のサンプルを胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することのできる固定化 されているリガンドと、このリガンドをこの細胞に特異的に結合させる条件及び 十分なる時間のもとでインキュベートし；　（ｂ）結合していない血液物質を除 去し；そして（Ｃ）この結合細胞をエリトロポイエチンの存在下においてインキ ュベートして、胎児細胞が優先的に富化されるようにする段階を含んで成る方法 を提供する。
手続補正書（方式） ％式％ １、　事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０２７８９ ２、発明の名称 母体血液からの胎児細胞の富化のための方、法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　セルプロ　インコーホレイティド４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 明細書、請求の範囲、及び要約書の翻訳文７、補正の内容 明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 明細書、請求の範囲及び要約書 の翻訳文　各１通 国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９１０２７８９

Claims (72)

    【特許請求の範囲】
  1. １．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することの できる固定化されたリガンドと、この細胞に前記リガンドを特異的に結合させる 条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）結合していない血液物質を除去し；そして（ｃ）結合した細胞をエリトロ ポイエチンの存在下においてインキュベートしてこの胎児細胞を優先的に富化せ しめることを含んで成る方法。
  2. ２．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することの できる固定化されたリガンドと、この細胞に前記リガンドを特異的に結合させる 条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）結合していない血液物質を除去し；（ｃ）結合した細胞を、アンモニア及 び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結合し た細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもと でイソキニベートし；そして （ｄ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させることを 含んで成る方法。
  3. ３．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することの できる固定化されたリガンドと、この細胞に前記リガンドを特異的に結合させる 条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）結合していない血液物質を除去し；（ｃ）結合した細胞を、アンモニア及 び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結合し た細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもと でインキュベートし； （ｄ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及びユ酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ：そして （ｅ）この結合した細胞をエリトロポイエチンの存在下においてインキュベート して、胎児細胞を優先的に富化させることを含んで成る方法。
  4. ４．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、アンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニック アンヒドラーゼインヒビターと、前記細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積 させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ； （ｃ）溶血後に残っている細胞を、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合するこ とのできる固定化されたリガンドと、この細胞に前記リガンドを特異的に結合さ せる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；そして （ｄ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  5. ５．前記の結合していない血液物質を除去した後、この細胞をエリトロポイエチ ンの存在下においてインキュベートして、胎児細胞を優先的に富化させることを 含む、請求の範囲４に記載の方法。
  6. ６．母体血液からの胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルをエリトロポイエチンの存在下においてインキニベー トして、胎児細胞を富化させ；（ｂ）富化した細胞を、胎児有核赤血球系細胞に 特異的に結合することのできる固定化されたリガンドと、この細胞に前記リガン ドを特異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；そし て （ｃ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  7. ７．前記の結合していない血液物質を除去した後、結合した細胞を、アンモニア 及び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結合 した細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のも とでインキュベートし；そして 蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の存在下 においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させることを含んで 成る、請求の範囲６に記載の方法。
  8. ８．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルをエリトロポイエチンの存在下においてインキュベー トして、この胎児細胞を富化させ；（ｂ）エリトロポイエチン富化細胞をアンモ ニア及び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、前記 細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもとで インキュベートし； （ｃ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ； （ｄ）段階（ｃ）からの富化細胞を、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合する ことのできる固定化されたリガンドと、この細胞に前記リガンドを特異的に結合 させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；そして （ｄ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  9. ９．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、アンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニック アンヒドラーゼインヒビターと、前記細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積 させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ； （ｃ）段階（ｂ）からの富化細胞を、エリトロポイエチンの存在下においてイン キュベートして、この胎児細胞を優先的に富化させ；（ｄ）エリトロポイエチン 富化細胞を、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することのできる固定化リガ ンドと、この細胞に前記リガンドを特異的に結合させる条件及び十分な時間のも とでインキュベートし；そして （ｅ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  10. １０．前記リガンドが、抗体、エリトロポイエチン及びトランスフェリンより本 質的に成る群から選ばれる、請求の範囲１〜９に記載の方法。
  11. １１．前記の結合していない血液物質の除去の段階の後に、固定化された細胞を 遊離させることを含む、請求の範囲１〜９に記載の方法。
  12. １２．前記細胞を機械的撹拌によって遊離させる、請求の範囲１１に記載の方法 。
  13. １３．前記の除去の段階が、結合している細胞の生理学的溶血によるすすぎを含 んで成る、請求の範囲１〜９に記載の方法。
  14. １４．前記生理学的溶血が、ＰＢＳ、アルブミンを含むＰＢＳ、正常食塩水及び 細胞培養培地より成る群から選ばれる、請求の範囲１３に記載の方法。
  15. １５．胎児細胞の優先的な富化の段階の後に、この富化細胞を前記胎児細胞に特 異的に結合することのできるマーカーとインキニベートすることを含む、請求の 範囲１〜９に記載の方法。
  16. １６．前記リガンドが、光ファイバー、ビーズ、磁性ビーズ、プレート、ＩＩＩ Ｉ、フラスコ、メッシュ、スクリーン、固体ファイバー、膜及びディップスティ ックより成る群から選ばれる固相に固定化されている、請求の範囲１〜９に記載 の方法。
  17. １７．前記カルボニックアンヒドラーゼインヒビターが、スルファニルアミド及 びアセタゾールアミドより成る群から選ばれる、請求の範囲２，３，４，７，８ 又は９に記載の方法。
  18. １８．前記塩化物イオンが、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２より 成る群から選ばれる、請求の範囲２，３，４，７，８又は９に記載の方法。
  19. １９．前記アンモニアが、ＮＨ４Ｃｌ及びアンモニウム塩より成る群から選ばれ る、請求の範囲２，３，４，７，８又は９に記載の方法。
  20. ２０．前記二酸化炭素が、溶液中の二酸化炭素、炭酸塩及び重炭酸塩より成る群 から選ばれる、請求の範囲２，３，４，７，８又は９に記載の方法。
  21. ２１．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することの できるリガンドに化学的に結合している第一因子と、この細胞に前記リガンドを 特異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ； （ｃ）結合していない血液物質を除去し；そして（ｄ）結合した細胞をエリトロ ポイエチンの存在下においてインキュベートして、胎児細胞を優先的に富化させ ることを含んで成る方法。
  22. ２２．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、前記細胞に特異的に結合することのできるリガン ドに化学的に結合している第一因子と、この細胞に前記リガンドを特異的に結合 させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ； （ｃ）結合していない血液物質を除去し；（ｄ）結合した細胞を、アンモニア及 び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結合し た細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもと でインキュベートし； （ｅ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させることを 含んで成る方法。
  23. ２３．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することの できるリガンドに化学的に結合している第一因子と、この細胞に前記リガンドを 特異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ； （ｃ）結合していない血液物質を除去し；（ｄ）結合した細胞を、アンモニア及 び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結合し た細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもと でインキュベートし； （ｅ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ；そして （ｆ）結合した細胞をエリトロポイエチンの存在下においてインキュベートして 、この胎児細胞を優先的に富化させることを含んで成る方法。
  24. ２４．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、アンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニック アンヒドラーゼインヒビターと、前記細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積 させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ； （ｃ）溶血後に残っている細胞を、前記細胞に特異的に結合することのできるリ ガンドに化学的に結合している第一因子と、この細胞に前記リガンドを特異的に 結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｄ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；そし て （ｅ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  25. ２５．前記の結合していない血液物質の除去の後、この細胞をエリトロポイエチ ンの存在下においてインキュベートして、この胎児細胞を優先的に富化させるこ とを含む、請求の範囲２４に記載の方法。
  26. ２６．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルをエリトロポイエチンの存在下においてインキュベー トして、この胎児細胞を優先的に富化させ；（ｂ）富化細胞を、前記細胞に特異 的に結合することのできるリガンドに化学的に結合している第一因子と、この細 胞に前記リガンドを特異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュ ベートし； （ｃ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １６Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；そして （ｄ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  27. ２７．前記の結合していない血液物質を除去した後、結合した細胞を、アンモニ ア及び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結 合した細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間の もとでインキュベートし；そして 蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の存在下 においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させることを含んで 成る、請求の範囲２６に記載の方法。
  28. ２８．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルをエリトロポイエチンの存在下においてインキュベー トして、この胎児細胞を富化させ；（ｂ）エリトロポイエチン富化細胞をアンモ ニア及び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、前記 細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもとで インキュベートし； （ｃ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ； （ｄ）段階（ｃ）からの富化細胞を、前記細胞に特異的に結合することのできる リガンドに化学的に結合している第一因子と、この細胞に前記リガンドを特異的 に結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｅ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；そし て （ｆ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  29. ２９．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、アンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニック アンヒドラーゼインヒビターと、前記細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積 させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ； （ｃ）段階（ｂ）からの富化細胞を、エリトロポイエチンの存在下においてイン キュベートして、この胎児細胞を優先的に富化させ；（ｄ）エリトロポイエチン 富化細胞を、前記細胞に特異的に結合することのできるリガンドに化学的に結合 している第一因子と、この細胞に前記リガンドを特異的に結合させる条件及び十 分な時間のもとでインキュベートし； （ｅ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させて、ここで前記第二因子は 約１０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；そ して （ｆ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  30. ３０．前記リガンドが、抗体、エリトロポイエチン及びトランスフェリンより本 質的に成る群から選ばれる、請求の範囲２１〜２９に記載の方法。
  31. ３１．前記の結合していない血液物質の除去の段階の後に、固定化された細胞を 遊離させることを含む、請求の範囲２１〜２９に記載の方法。
  32. ３２．前記細胞を機械的撹拌によって遊離させる、請求の範囲３１に記載の方法 。
  33. ３３．前記の除去の段階が、結合している細胞の生理学的溶血によるすすぎを含 んで成る、請求の範囲２１〜２９に記載の方法。
  34. ３４．前記生理学的溶血が、ＰＢＳ、アルブミンを含むＰＢＳ、正常食塩水及び 細胞培養培地より成る群から選ばれる、請求の範囲３３に記載の方法。
  35. ３５．胎児細胞の優先的な富化の段階の後に、この富化細胞を前記胎児細胞に特 異的に結合することのできるマーカーとインキュベートすることを含む、請求の 範囲２１〜２９に記載の方法。
  36. ３６．前記リガンが、光ファイバー、ビーズ、磁性ビーズ、プレート、ＩＩＩＩ 、フラスコ、メッシュ、スクリーン、固体ファイバー、膜及びディップスティッ クより成る群から選ばれる固相に固定化されている、請求の範囲２１〜２９に記 載の方法。
  37. ３７．前記カルボニツクアンヒドラーゼインヒビターが、スルファニルアミド及 びアセタゾールアミドより成る群から選ばれる、請求の範囲２２，２３，２４， ２７，２８又は２９に記載の方法。
  38. ３８．前記塩化物イオンが、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２より 成る群から選ばれる、請求の範囲２２，２３，２４，２７，２８又は２９に記載 の方法。
  39. ３９．前記アンモニアが、ＮＨ４Ｃｌびアンモニウム塩より成る群から選ばれる 、請求の範囲２２，２３，２４，２７，２８又は２９に記載の方法。
  40. ４０．前記二酸化炭素が、溶液中の二酸化炭素、炭酸塩及び重炭酸塩より成る群 から選ばれる、請求の範囲２２，２３，２４，２７，２８又は２９に記載の方法 。
  41. ４１．第一因子−第二因子結合ペアーが、ビオチン−アビジン、ビオチン−スト レプトアビジン、ビオシチン−アビジン、ビオシチンーストレプトアビジン、メ トトレキセトートージヒドロホレートリダクターゼ、５−フルオロウラシル−チ ミジレートシンセターゼ及びリボフラビン−リボフラビン結合性タンパク質より 成る群から選ばれる、請求の範囲２１〜２９に記載の方法。
  42. ４２．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することの できる第一リガンドと、この細胞に前記第一リガンドを特異的に結合させる条件 び十分なる時間時間のもとでインキュベートし； （ｂ）このサンプルを、この第一リガンドに特異的に結合することのできる第二 リガンドに化学的に結合している第一因子と、この第一リガンドにこの第二リガ ンドを結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキニベートし； （ｃ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ； （ｄ）結合していない血液物質を除去し；そして（ｅ）結合した細胞をエリトロ ポイエチンの存在下においてインキュベートして、この胎児細胞を優先的に富化 させることを含んで成る方法。
  43. ４３．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することの できる第一リガンドと、この細胞に前記第一リガンドを特異的に結合させる条件 び十分なる時間時間のもとでインキュベートし； （ｂ）このサンプルを、この第一リガンドに特異的に結合することのできる第二 リガンドに化学的に結合している第一因子と、この第一リガンドにこの第二リガ ンドを結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｃ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ； （ｄ）結合していない血液物質を除去し；（ｅ）結合した細胞を、アンモニア及 び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結合し た細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもと でインキュベートし；そして （ｆ）蓄積したアンモニウムイオンを含む結合した細胞を、アンモニア及び二酸 化炭素の存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ ることを含んで成る方法。
  44. ４４．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合することの できる第一リガンドと、この細胞に前記第一リガンドを特異的に結合させる条件 び十分なる時間時間のもとでインキュべ−トし； （ｂ）このサンプルを、この第一リガンドに特異的に結合することのできる第二 リガンドに化学的に結合している第一因子と、この第一リガンドにこの第二リガ ンドを結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｃ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ； （ｄ）結合していない血液物質を除去し；（ｅ）結合した細胞を、アンモニア及 び塩化物イオン並びにカルボニツクアンヒドラーゼインヒビターと、この結合し た細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもと でインキュベートし； （ｆ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、胎児細胞以外を選択的に溶血させ；そして （ｇ）結合した細胞をエリトロポイエチンの存在下においてインキュベートして 、この胎児細胞を優先的に富化させることを含んで成る方法。
  45. ４５．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、アンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニック アンヒドラーゼインヒビターと、前記細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積 させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の 存在下においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させ； （ｃ）溶血後に残っている細胞を、胎児有核赤血球系細胞に特異的に結合するこ とのできる第一リガンドと、この細胞に前記第一リガンドを特異的に結合させる 条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｄ）このサンプルを、この第一リガンドに特異的に結合することのできる第二 リガンドに化学的に結合している第一因子と、この第一リガンドにこの第二リガ ンドを結合させる条件及び十分な時間のもとでインキュベートし； （ｅ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；そし て （ｆ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  46. ４６．前記の結合していない血液物質の除去の後、この細胞をエリトロポイエチ ンの存在下においてインキュベートして、この胎児細胞を優先的に富化させるこ とを含む、請求の範囲４５に記載の方法。
  47. ４７．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルをエリトロポイエチンの存在下においてインキニベー トして、この胎児細胞を優先的に富化させ；（ｂ）富化細胞を前記細胞に特異的 に結合することのできる第一リガンドと、この胎児有核赤血球系細胞に前記第一 リガンドを結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；（ｃ） このサンプルを、この第一リガンドに特異的に結合することのできる第二リガン ドに化学的に結合している第一因子と、この第一リガンドにこの第二リガンドを 結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｄ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここでこの第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；そし て （ｅ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  48. ４８．前記の結合していない血液物質を除去した後、結合した細胞を、アンモニ ア及び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、この結 合した細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間の もとでインキュベートし；そして 蓄積したアンモニウムイオンを含む細胞を、アンモニア及び二酸化炭素の存在下 においてインキュベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させることを含んで 成る、請求の範囲４７に記載の方法。
  49. ４９．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルをエリトロポイエチンの存在下においてインキュベー トして、この胎児細胞を富化させ；（ｂ）血液のサンプルをアンモニア及び塩化 物イオン並びにカルボニックアンヒドラーゼインヒビターと、前記細胞内におい てアンモニウムイオンを蓄積させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベー トし； （ｃ）この富化細胞を前記細胞に特異的に結合することのできる第一リガンドと 、この細胞に前記第一リガンドを特異的に結合させる条件及び十分なる時間時間 のもとでインキュベートし；（ｄ）このサンプルを、この第一りかンドに特異的 に結合することのできる第二リガンドに化学的に結合している第一因子と、この 第一リガンドにこの第二リガンドを結合させる条件及び十分なる時間のもとでイ ンキュベートし； （ｅ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；そし て （ｆ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  50. ５０．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、アンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニック アンヒドラーゼインヒビターと、前記細胞内においてアンモニウムイオンを蓄積 させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｂ）この富化細胞を前記細胞に特異的に結合することのできる第一リガンドと 、この細胞に前記第一リガンドを特異的に結合させる条件及び十分なる時間時間 のもとでインキュベートし；（ｃ）段階（ｂ）からの富化細胞を、エリトロポイ エチンの存在下においてインキュベートして、この胎児細胞を優先的に富化させ ；（ｄ）このサンプルを、この第一リガンドに特異的に結合することのできる第 二リガンドに化学的に結合している第一因子と、この第一リガンドにこの第二リ ガンドを結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし； （ｅ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ；そし て （ｆ）結合していない血液物質を除去することを含んで成る方法。
  51. ５１．前記リガンドが、抗体、エリトロポイエチン及びトランスフェリンより本 質的に成る群から選ばれる、請求の範囲４２〜５０に記載の方法。
  52. ５２．前記の結合していない血液物質の除去の段階の後に、固定化された細胞を 遊離させることを含む、請求の範囲４２〜５０に記載の方法。
  53. ５３．前記細胞を機械的撹拌によって遊離させる、請求の範囲５２に記載の方法 。
  54. ５４．前記の除去の段階が、結合している細胞の生理学的溶血によるすすぎを含 んで成る、請求の範囲４２〜５０に記載の方法。
  55. ５５．前記生理学的溶血が、ＰＢＳ、アルブミンを含むＰＢＳ、正常食塩水及び 細胞培養培地より成る群から選ばれる、請求の範囲５４に記載の方法。
  56. ５６．胎児細胞の優先的な富化の段階の後に、この富化細胞を前記胎児細胞に特 異的に結合することのできるマーカーとインキュベートすることを含む、請求の 範囲１〜９に記載の方法。
  57. ５７．前記リガンドが、光ファイバー、ピーズ、磁性ビーズ、プレート、ＩＩＩ Ｉ、フラスコ、メッシュ、スクリーン、固体ファイバー、膜及びディップスティ ックより成る群から選ばれる同相に固定化されている、請求の範囲４２〜５０に 記載の方法。
  58. ５８．前記カルボニックアンヒドラーゼインヒビターが、スルファニルアミド及 びアセタゾールアミドより成る群から選ばれる、請求の範囲４３，４４，４５， ４８，４９又は５０に記載の方法。
  59. ５９．前記塩化物イオンが、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＨｇＣｌ２及びＣａＣｌ２より 成る群から選ばれる、請求の範囲４３，４４，４５，４８，４９又は５０に記載 の方法。
  60. ６０．前記アンモニアが、ＮＨ４Ｃｌ及びアンモニウム塩より成る群から選ばれ る、請求の範囲４３，４４，４５，４８，４９又は５０に記載の方法。
  61. ６１．前記二酸化炭素が、溶液中の二酸化炭素、炭酸塩及び重炭酸塩より成る群 から選ばれる、請求の範囲４３，４４，４５，４８．４９又は５０に記載の方法 。
  62. ６２．第一因子−第二因子結合ペアーが、ビオチン−アビジン、ビオチン−スト レプトアビジン、ビオシチン−アビジン、ビオシチンーストレプトアビジン、メ トトレキセトートージヒドロホレートリダクターゼ、５−フルオロウラシル−チ ミジレートシンセターゼ及びリポフラビン−リポフラビン結合性タンパク質より 成る群から選ばれる、請求の範囲４２〜５０に記載の方法。
  63. ６３．前記の第二リガンドが抗体である、請求の範囲４２〜５０に記載の方法。
  64. ６４．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、ビオチニル化抗−赤血球抗体と、この胎児有核赤 血球系細胞にこの抗体を結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベー トし； （ｂ）この細胞を、表面にアビジンが結合された多孔性材料の充填ベッドに通し 、この多孔性材料の表面上のアビジンにこのビオチニル化抗体を吸着させ、これ によって胎児細胞及び成人細胞をこの多孔性材料に結合させ； （ｃ）この充填ベッドをすすいで、結合していない血液物質を除去し； （ｄ）結合した細胞をこの充填ベッドの機械的撹拌によって遊離し；そして （ｅ）この遊離した細胞をエリトロポイエチンの存在下においてインキュベート して、胎児細胞を優先的に富化させることを含んで成る方法。
  65. ６５．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化するための方法であって： （ａ）母体血液のサンプルを、ビオチニル化抗−赤血球抗体と、この胎児有核赤 血球系細胞にこの抗体を結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベー トし； （ｂ）この細胞を、表面にアビジンが結合された多孔性材料の充填ベッドに通し 、この多孔性材料の表面上のアビジンにこのビオチニル化抗体を吸着させ、これ によって胎児細胞及び成人細胞をこの多孔性材料に結合させ； （ｃ）この充填ベッドをすすいで、結合していない血液物質を除去し； （ｄ）結合した細胞をこの充填ベッドの機械的撹拌によって遊離し； （ｅ）遊離した細胞を、アンモニア及び塩化物イオン並びにカルボニックアンヒ ドラーゼインヒビターと、この遊離した細胞内においてアンモニウムイオンを蓄 積させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；そして （ｆ）この遊離した細胞をアンモニア及び二酸化炭素の存在下においてインキュ ベートして、母体血液細胞を選択的に溶血させることを含んで成る方法。
  66. ６６．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化させ、そして特定の遺伝子物質 の存在を検査するための方法であって：（ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核 赤血球系細胞に特異的に結合することのできる固定化されたリガンドと、この細 胞に前記リガンドを特異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュ ベートし； （ｂ）結合していない血液物質を除去し；（ｃ）結合した細胞をエリトロポイエ チンの存在下においてインキニベートして、胎児細胞を優先的に富化させ；（ｄ ）前記の優先的に富化させた細胞に関する遺伝子物質を露出させ； （ｅ）胎児細胞に関する遺伝子物質を、前記遺伝子物質に特異的にハイプリダイ ズすることのできる標識化プローブと、ハイブリダイゼーションを起こさせる条 件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；そして （ｆ）ハイプリダイズした標識化プローブの存在を検出することを含んで成る方 法。
  67. ６７．遺伝子物質を露出させる段階の後に、この遺伝子物質を変性させることを 含む、請求の範囲６６に記載の方法。
  68. ６８．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化させ、そして特定の遺伝子物質 の存在を検査するための方法であって：（ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核 赤血球系細胞に特異的に結合することのできる固定化されたリガンドと、この細 胞に前記リガンドを特異的に結合させる条件及び十分なる時間のもとでインキュ ベートし； （ｂ）結合していない血液物質を除去し；（ｃ）結合した細胞をエリトロポイエ チンの存在下においてインキュベートして、胎児細胞を優先的に富化させ；そし て（ｄ）富化された胎児細胞に関する染色体を分類することを含んで成る方法。
  69. ６９．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化させ、そして特定の遺伝子物質 の存在を検査するための方法であって：（ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核 赤血球系細胞に特異的に結合することのできるリガンドに化学的に結合している 第一因子と、この細胞に前記リガンドを特異的に結合させる条件及び十分なる時 間のもとでインキュベートし； （ｂ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ； （ｃ）結合していない血液物質を除去し；（ｄ）結合した細胞をエリトロポイエ チンの存在下においてインキュベートして、胎児細胞を優先的に富化させ；（ｅ ）前記の優先的に富化させた細胞に関する遺伝子物質を露出させ； （ｄ）胎児細胞に関する遺伝子物質を、前記遺伝子物質に特異的にハイプリダイ ズすることのできる標識化プローブと、ハイブリダイゼーションを起こさせる条 件及び十分なる時間のもとでインキュベートし；そして （ｆ）ハイブリダイズした標識化プローブの存在を検出することを含んで成る方 法。
  70. ７０．遺伝子物質を露出させる段階の後に、この遺伝子物質を変性させることを 含む、請求の範囲６９に記載の方法。
  71. ７１．母体血液から胎児有核赤血球系細胞を富化させ、そして特定の遺伝子物質 の存在を検査するための方法であって：（ａ）母体血液のサンプルを、胎児有核 赤血球系細胞に特異的に結合することのできるリガンドに化学的に結合している 第一因子と、この細胞に前記リガンドを特異的に結合させる条件及び十分なる時 間のもとでインキュベートし； （ｂ）この細胞を、固定化された第二因子に吸着させ、ここで前記第二因子は約 １０８Ｍ−１以上の親和定数によってこの第一因子に結合することができ； （ｃ）結合していない血液物質を除去し；（ｄ）結合した細胞をエリトロポイエ チンの存在下においてインキュベートして、胎児細胞を優先的に富化させ；そし て（ｅ）この富化した胎児細胞に関する染色体を分類することを含んで成る方法 。
  72. ７２．胎児有核赤血球系細胞の染色体を分類するための方法であって： （ａ）胎児有核赤血球系細胞を、エリトロポイエチンを含む培地中で、前記細胞 における分裂中期を誘発させる条件及び十分なる時間のもとでインキュベートし ； （ｂ）前記細胞のＤＮＡを固定し； （ｃ）この固定したＤＮＡを染色して、染色体を観察できるようにし；そして （ｄ）染色したＤＮＡを調べて、この染色体の分類を行うことを含んで成る方法 。
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