JPH05507792A - 粒子表面からリガンドを除去するための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 粒子表面からりガントを除去するための方法技術分野 本発明は一般的に、粒子の表面に結合されるリガンドを除去するための方法に関 する。

発明の背景 細胞表面からリガンドを除去することが所望される多くの環境が存在する。たと えば、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｏｒｔｅ ｒ（ＦＡＣ５）により細胞を分類するためには、細胞はまず、リガンド、たとえ ば螢光化されたモノクローナル抗体によりラベルされるべきである。

タッグされた細胞が分類された後すぐに、それらは生物学的アッセイ内に使用さ れ得る。しかしながら、細胞への抗体の結合は、細胞挙動における立体障害又は 変化を引き起こすことができる。たとえば、抗−ＣＯ２抗体の結合は、Ｔ細胞の 活性化及び従ってそれらの挙動における変化を導び（（Ｆａｘなど、、“Ｒｅｇ ｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＰａｔｈｗａｙ　ｏｆ 　Ｔ　Ｃｅ１ｌ　Ａｃｔｉｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ａｎｔｉ−Ｔ３　Ｍｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙど２Ｌ工ｍｍｕｎｏｌｏ　１３６　：　１９４５． １９８６を参照のこと）。

抗体結合細胞に関する類似する問題が、治療目的のために使用される細胞に見出 され得る。抗体によりラベルされた細胞はインビボで差別的に作用することがで き、そして免疫応答、たとえば抗体依存性細胞溶解を引き起こすことができる（ Ｐｅｒｉｍａｎｎ＋　”ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＥｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｌｙｍｐｈ ｏｉｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｉｎ　Ｖｉｒｏ、’　Ａｄｖ、　ｉｎ　Ｉｎ＋ｎｕｎ、　Ｖ ｏｌｕｍｅ　ＩＬＡｃａｄｅｍｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９６９）。

細胞表面から抗体以外のりガントを除去することがまた所望される。たとえば、 成長因子、たとえばＩＬ−２又はＧＭ−Ｃ３Ｆは研究のための細胞を増殖するた めに使用され得るが、しかしそれら自体、研究の目的を妨げる。たとえば、ＩＬ −２により増殖せしめられる細胞は正常なＣｏｎ−Ａ抑制活性を付与しない（Ｐ ａｌａｃｉｏｓ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｌｅｒ、　”Ｔ　ＣａｌｌＧｒｏｗｔｈ　Ｆａ ｃｔｏｒ　Ａｂｒｏｇａｔｅｓ　Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ−Ａ　Ｉｎｄｕｃｅ ｄ　５ｕｐｐｒｅｓｓｏｒ　Ｃｅ１ｌＦｕｎｃｔｉｏｎ、　”　、Ｌ上」シルｌ ユ１５３　：　１３６０．１９８１を参照のこと）。

本発明は粒子表面からリガンドを除去するだめの方法を提供する。

本発明は、従来の方法の欠点を克服し、そしてさらに、他の関連する利点を提供 する。

発明の要約 簡単に言及すれば、本発明は、粒子表面から第２リガンドをその粒子表面を実質 的に影響を与えないで除去するための方法に関する。

１つの観点において、その方法は粒子を支持体上に固定された第１リガンドに暴 露することを含んで成り、ここで粒子はその粒子表面からの第２リガンドの脱着 を可能にする条件下で及びそれを可能にするのに十分な滞留時間、暴露され、そ して前記第１リガンドは、第２リガンドが粒子表面に実質的に影響を与えないで 粒子表面から除去されるように、粒子表面のための第２リガンドの親和性よりも 少なくとも２倍高い第２抗体のための親和性を有する０本発明の範囲内において 、粒子はウィルス、細菌、真菌、寄生体及び細胞から成る群から選択され得る０ 本発明の方法は、暴露の段階に続いて、第１リガンドが固定される支持体を撹拌 することをさらに包含することができる。

本発明の１つの態様においては、第１リガンドはアビジンであり、そして第２リ ガンドはビオチニル化された分子、たとえばビオチニル化されたトランスフェリ ン、ビオチニル化されたＩＬ−２、ビオチニル化された抗−粒子一表面抗体又は ビオチニル化された抗−免疫グロブリン抗体に結合される抗−粒子一表面抗体で ある。

本発明のもう１つの態様においては、第１リガンドは抗−免疫グロブリン抗体で あり、そして第２リガンドは粒子−表面抗体である。

本発明のさらにもう１つの態様において、第１リガンドはプロティンＡ又はプロ ティンＧのいづれかであり、そして第２リガンドは抗−粒子一表面抗体である。

本発明のこれらの及び他の観点は、次の詳細な説明により明らかになるであろう 。

本発明の詳細な説明 上記のように、本発明は粒子表面からのりガントの除去のための方法を提供する 。多くの粒子、特にウィルス、細菌、真菌、寄生体及び細胞が本発明の範囲内で 利用され得る。細胞は、中でも、ヒト細胞、たとえば内皮細胞、腫瘍細胞、膵臓 インスリン細胞、マクロファージ、単球、ＮＫ細胞、８９７３球、Ｔリンパ球及 び造血幹細胞を包含する。代表的なＴリンパ球はＣＤ４’細胞、ＣＤ８’細胞及 び特定のサブセント、たとえばＩＬ−２Ｒ”　、　ＣＤ１９”及びトランスフェ リンレセプター（ＴｒＲ）　”細胞を包含する。造血幹細胞は、分化マーカーを 有する細胞、たとえばＣＤ３４を包含する。

粒子表面に結合されるリガンドは、第２リガンドとして言及される。本発明は、 支持体上に固定された第１リガンドに粒子を暴露することによって粒子から第２ リガンドを除去するための方法を提供し、ここで前記粒子は、その粒子表面から の第２リガンドの脱着を可能にする条件下で及びそれを可能にするのに十分な滞 留時間、暴露される。前記第１リガンドは、第２リガンドが粒子表面に実質的に 影響を与えないで粒子表面から除去されるように、粒子表面のための第２リガン ドの親和性よりも少なくとも２倍高い第２抗体のための親和性を存することも； 本発明の範囲内である。

第２リガンドは、本発明の方法の前、粒子表面に結合されるじｆｍｕｎｏｓｅｌ ｅｃｔｉｏｎ　Ｄｅｖｉｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ、”　（事件整理番号２０ ００７２．４０１）の標記の関連出願及び“Ａ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｅｎｒ ｉｃｈｉｎｇ　Ｆｅｔａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｆｒｏ＠Ｍａｔｅｒｎａｌ　Ｂｌｏｏ ｄ、”　（事件整理番号２０００７２．４０２）の標記の特許出願を参照のこと 、両者とも引用により本明細書に組込まれる）。簡単には、粒子は、粒子表面へ のりガントの結合を可能にする条件下で第２リガンドと共にインキュベートされ る。そのようなインキュベーションは、ＦＡＣ５分析又は螢光顕微鏡のために細 胞をラベルし、細胞挙動を刺激し又は抑制するために、又はアフィニティー精製 のための調製において行なわれる。粒子表面に実質的に影響を与えないで粒子表 面から除去され得る第２リガンドは、細胞表面レセプターに対するレセプター基 質を包含する。たとえばリンホカイン、たとえばＩＬ−１α、　ＩＬ−１β、　 ＩＬ−２，ルー３．　ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，Ｇ門Ｃ３Ｆ。

Ｇ−Ｃ５Ｆ、　Ｍ−Ｃ３Ｆ、　ＩＦＮ−α、　ＩＦＮ−７，ＩＮＦ−α、　ＴＧ Ｆ−β及びそれらのそれぞれの細胞表面レセプターが、本発明の範囲内での使用 のために適切であり、そして当業界において良く知られている。

多くの他のレセプター基質及びそれらのそれぞれの粒子表面レセプターもまた使 用され得、第２リガンドの選択は、対象の標的粒子に依存する。粒子への第２リ ガンドの結合は、通常、粒子上に存在するある成分又は基質に依存する。適切な 第２リガンド−粒子基質対は、次のものを包含する：レクチンー炭水化物（たと えば、小麦胚アグルチニンーＮ−アセチルグルコサミン；及びコンカナバリンＡ −グルコース又はマンノース）；酵素インヒビター−酵素（たとえばオルガノホ スフェート−アセチルコリンエステラーゼ）；結合タンパク質−レセブタ−（た とえばフィブロネクチン−ｇｌｌｌｌｃ、又はコラーゲン−ｇｐｌａ）　；　Ｍ 譬分子輸送タンパク質（たとえばシクロホスファミド−複数薬物耐性タンパク質 ）；ホルモン−レセプター（たとえば、トランスフェリン−トランスフェリンレ セプター）；及びビタミン−結合タンパク質（たとえばビオチン−アビジン）。

粒子表面から除去され得る他の第２リガンドは、粒子表面決定基に対する抗体を 包含する。たとえば、本発明内での使用のために適切なモノクローナル抗体は、 Ｈａｎｓｅｎなど、（Ｉｍｍｕｎｏ　ｅｎｅｔｉｃｓ　１０　：２４７〜２６０ ．１９８０）の方法に従って製造され、又は従来の源、たとえばＡｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ 、　Ｍａｒｇｌａｎｄから購入され、そしてＩａ担持細胞を結合するために使用 され得る。当業者が認めるように、完全な抗体が粒子表面に結合される必要はな い。

より詳しくは、抗体の結合領域のみが、粒子表面に特異的に結合する必要がある 。従って、抗体フラグメント、たとえばＦａｂ又はＦ（ａｂ’　）ｚフラグメン ト、又は導入された抗体結合タンパク質を有する人工的に構成されたタンパク質 （Ｒｅｉｃｈｍａｎｎなど、、　”ＲｅｓｈａｐｉｎｇＨｕＩＩｌａｎ　Ａｎｔ ｔｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ″、Ｎａｔｕｒｅ　３３２　：　３２ ３〜３２７．１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎなど、、　”Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ　 Ｈｕｍａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｇｒａｆｔｉｎｇ　ａｎＡｎｔｉｌｙ ｓｏｚ３＋ｍｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ、”　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９　：　１５３ ４〜１５３６＋　１９８９　；及びＲｏｂｅｒｔｓなど、、　”Ｇｅｎｅｒａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｗｉｔｈ　ＥｎｈａｎｃｅｄＡｆｆｉ ｎｉｔｙ　ａｎｄ　５ｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ｆｏｒ　ｉｔｓ　Ａｎｔｉｇｅｎ 　ｂｙ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒ−ｉｎｇ、’　Ｎａｔｕｒｅ　３２ ８　：　７３１〜７３４．１９８７を参照のこと）が、本発明の範囲内で粒子表 面から除去され得る。

第２リガンドはまた、複合体、たとえばビオチニル化されたレセプター基質、ビ オチニル化された抗体又は抗−粒子表面抗体に結合されるビオチニル化された抗 体であり得る。代表的な複合体は、ビオチニル化されたトランスフェリン、ビオ チニル化されたＩＬ−２、ビオチニル化された抗−粒子一表面抗体、又はビオチ ニル化された抗−免疫グロブリン抗体に結合される抗−粒子一表面抗体を包含す る。

同様に、アビジン化された複合体、たとえばアビジン化されたレセプター基質、 アビジン化された抗体又は抗−粒子表面抗体に結合されるアビジン化された抗体 が利用され得る。多くのそのような複合体は、第２リガンド複合体内の結合親和 性のすべてが粒子表面のための第２リガンドの親和性よりも少な（とも２倍高く ある限り、本発明内への使用のために十分に構成され得る。

第１リガンドはまた、それが粒子表面のための第２リガンドの親和性よりも少な くとも２倍高い第２リガンドのための親和性を有するように選択される。第１リ ガンドの選択は、第２リガンドに依存する。たとえば、第２リガンドがビオチニ ル化されている場合、アビジンは第１リガンドとして機能し、そして支持体上に 固定され得る。他方、第２リガンドがアビジン化されている場合、ビオチンＬｔ 第１リガンドとして機能し、そして支持体上に固定され得る。第２リガンドが抗 体である場合、プロティンＡ、プロティンＧ又は抗−免疫グロブリン抗体が支持 体上に固定され、そして従って、第１１Ｊガントとして機能することができる。

種々の支持体が、第１リガンドを固定するために使用され得、ここでそれは、数 ある中で、中空繊維（八ｓ＋１ｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｄａｎｖｅ ｒｓ＋Ｍａｓｓ、）、ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｗａｒｒｉｎｇｔ ｏｎ、　Ｐａ、）　、磁気ビーズ（Ｒｏｂｂｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｍ ｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｔ、）　、プレート、皿及びフラスコ（ Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ＋　Ｎ、Ｙ、）　 、メツシュ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅ ｗ、　Ｃａ１ｉｔ、）　、スクリーン及び固体繊維（アメリカ特許第３，８４３ ，３２４号（Ｅｄｅｌｓａｎなと）；アメリカ特許第４，４１６．７７７号（Ｋ ｕｒｏｄａなと、、）、膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、、　Ｂｅｄｆｏｒ ｄ。

Ｍａｓｓ、）、及びディツプスチックを包含する。種々の異なった源力く、企画 されたそれら以外の支持体のために存在する。特に好ましく番よ、Ｂｉｏｇｅｌ 　Ｐ−６０”　（ＢＩＯＲＡＤ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆ、）のよう な支持体である。Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ−６０７″は、多孔性ポリアクリルアミドヒ ドロゲルビーズである。そのビーズは、一般的に、球状であり、約２５０ミクロ ンの平均サイズを有し、そして約６０．０００ダルトン以上の分子を排除する平 均孔サイズを有する。

多くの方法が、支持体上に第１リガンドを固定するために使用され得る。たとえ ば、リガンド、たとえば抗体は、種々の方法（Ｊ、Ｋ。

Ｉｒ＋ｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　、−第３４巻、Ａｆ ｆｉｎｉｔ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ。

Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　二Ｄａｒｔ　Ｂ、　Ｗ、Ｂ、Ｊａｋ ｏｂｙ　ａｎｄ　Ｍ、Ｗｉｌｃｈｅｋ　（版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐ３０＋　１９７４　；　Ｍ、Ｗｉｌｃｈｅｃｋ　ａ ｎｄ　Ｗ、Ｂａｙｅｚ。

１↑ｈｅ　Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ　Ｃｏ１１ｌｐｌｅｘ　ｉｎ　Ｂｉｏａ ｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、”Ａａａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、　１７１　：　１〜３２．１９８８を参照のこと）により支持体に直接的に結 合され得る。これらの方法は、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、カルボニ ルジイミダゾール、臭化シアン、塩化トシル、ビオチン／アビジン、及びビオチ ン／ストシブタビジンの使用包含する。

上記のように、粒子は、その粒子表面に実質的に影響を与えないで、第２リガン ドが粒子表面から除去されるように、粒子表面からの第２リガンドの脱着を可能 にする条件下で及びそれを可能にするのに十分な滞留時間、固定された第１リガ ンドに暴露される。粒子表面からの第２リガンドの脱着、及び第１リガンドへの 結合を可能にする第２リガンドのための十分な“滞留時間”とは、本発明の範囲 内で、次のように数学的に表わされ得る：ここで、ｔは必要とされる滞留時間で あり；には、粒子表面からの第２リガンドのための一次解離速度一定数であり； Ｐは、下記等式により定義されるように第１リガンド部位への結合の可能性を示 す： ここで、Ｌは第１リガンド部位の数であり、Ｃは細胞表面部位であり、ｒ２は部 位への平均距離の平方である。

表面から脱着する第２リガンドのための解離定数は、０１ｓｏｎなど。

じＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ａｎｔｉｇｅｎ−Ａｎ ｔｉｂｏｄｙ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　：５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ａ　Ｐａ ｎｅｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉ−Ａｌｂｕｍｉｎ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ、’包ｎ皿凰しハ旦貌旦■　韮：１２９〜１３６．１９８９）の方法 に従って、放射性ラベルされた第２リガンドを用いて容易に測定され得る。簡単 には、粒子表面がまず、放射性ラベルされる割合の第２リガンドにより飽和され る。次に、その表面が、放射性ラベルされていな０第２リガンドを含む新しい溶 液に置かれる。その新しい溶液における放射性ラベルされた第２リガンドの出現 速度は、粒子表面からの第２リガンドの解離のための速度定数を計算するために 使用され得る。

たとえば、細胞表面部位の数は、放射性ラベルされた抗体の使用を通して、又は 定量ＦＡＣ５分析により決定され得、そしてアビジン部位の数は、放射性ラベル されたビオチンにより測定され得る。“部位への平均距離の平方”は、リガンド と個々のそれぞれの部位との間の距離を平方し、部位の合計数にわたって平方さ れた距離を合計し、そして部位の数により割り算することによって計算され得る 。

上記のように、第２リガンドは、粒子表面に実質的に影響を及ぼさないで粒子表 面から除去される０本発明の使用を通して、少なくとも２５％及び好ましくは７ ０％〜９０％の第２リガンドが粒子表面から除去される。さらに、本発明の範囲 によれば、粒子は、９０％以上の細胞表面抗原又はレセプターが残存する場合、 “実質的に影響されない”。この決定は、多くの異なった技法を通して容易に達 成され得る。たとえば、ビオチニル化されたＩＬ−２によりラベルされた細胞は 、結合されたｒＬ−２を除去するためにアビジン被覆された支持体材料に通され る。次に、細胞は、螢光ラベルされた抗−ＩＬ−２レセプター抗体によりラベル され、そしてＦＡＣＳにより分析され、螢光染色の強さが、ビオチニル化された ＩＬ−２に決して暴露されなかった出発細胞の螢光強度の９０％以内であるかど うかが決定される。

本発明のもう１つの観点によれば、第１リガンドへの粒子の暴露の段階に続いて 、第１リガンドが固定される支持体は撹拌される。

好ましい態様によれば、支持体、たとえば固定された第１リガンドを有するＢｉ ｏｇｅｌ”ビーズがカラム内に含まれる。また、ビーズを撹拌するための手段も また、カラム内に含まれる。結合された第２　Ｕガントを有する粒子は、固定さ れた第１リガンドに暴露され、第２リガンドへの第１リガンドの結合をもたらし 、従って、粒子を固定する。外力の適用に基づいて、撹拌のための手段がビーズ を撹拌する。最とも弱い結合は破壊され；第２リガンドのための第１リガンドの 親和性は、粒子表面のための第２リガンドの親和性よりも少なくとも２倍高いの で、粒子−第２リガンド結合がまず、破壊され、粒子表面から第２リガンドが除 かれる。

支持体を撹拌するための手段は、磁気羽根車（Ｐａｒｋｅｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ ｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｃｈｉｃａｇｏ、　ＩＬＬ、）　、磁気ビーズ （Ｒｏｂｂｉｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ＋　Ｃａ１ｉｆ、）、重り　（Ａｓｔｒｏｌｉｔｅ 　Ａ１１ａｙｓ、　Ｃａｍａｒｉｌｌｏ。

Ｃａ１ｉｆ、）　、磁気重り、ピペット及び浮遊フロート（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎ ｃｅｓＣｏｒｐ、、　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　Ｐａ、）を包含する。支持体を 撹拌するための手段にエネルギーを供給する外力は一最的に、カラムの外部に位 置し、そして電気磁気力、重力及び機械力を包含する。電気磁気力は金属又は磁 気ビーズ又は重りのような手段に対して作用することができ、粒子の撹拌及び開 放を引き起こす、電気磁気力は、たとえば磁気撹拌プレート（ＶＷＲ５ｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｉｆ、）又は電気磁気コ イル（Ｒａｄｉｏ　５ｈａｃｋ）により供給される。重力は、たとえば重力が支 持体を撹拌し、それによって粒子の開放を引き起こすように、プレートを振動さ せ、又はカラムを手動的に振盪することによって提供され得る。支持体よりも高 い密度であり又はより浮力がある重りが、ヘッド撹拌に対しこの重力の効果を強 めるためにそのべ・ンドに置かれる。機械力は、たとえば液体力学的リガンド（ ｖ−Ｒ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｉｆ、 ）、渦巻機（ＶＷＲ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｉｆ、）又はソニケータ−（Ｃｕｒｔｉ ｎ　ＭａｔｈｅｓｏｎＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　５ｅａｔｔｌｅ、　Ｗａｓｈ、 ）により供給される。これらの手段を用いて適切なレベルの撹拌を決定するため に、その力のレベルを、支持体が目に見えて動かされるまで、徐々に高める。こ の撹拌のレベルは、特定の適用に適合するように微みように調整され得る（たと えば、非特異的に結合される粒子のみを除去するための低い力又は最っとも堅く 結合された粒子を除去するための強い力）。

次の例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。

拠 五−上 ポリアクリルアミドゲルのカルボキシル化１７ｇの乾燥Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ−６０ ”　（５０〜１００メツシユ（湿潤）、粗いビーズ）　（Ｂ１０１？ＡＤ、カタ ログ番号１５０−１６３０．　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　Ｃａ１ｉｆ、）を、０．５ ＭのＮａＨＣＯｓ／　０．５ＭのＮａ２ＣＯ３溶液１．５１に添加する。そのｐ ＨをＮａＯＨにより１０．５に調節し、そしてビーズに損傷を与えないように約 ２０〜３０分間、ミキサー（ＲＺＲ１＋　Ｃａｒｆａｍｏ、　Ｗｉａｒｔｏｎ、 　０ｎｔａｒｉｏ＋　Ｃａｎａｄａ）により注意して撹拌する。次に、その混合 物を６０°Ｃの水浴に入れる。

混合物が６０’Ｃの温度に達した後、それを時々撹拌しながら、さらに２時間イ ンキュベートする（６０°Ｃで）。次に混合物を水浴から除去し、そして水浴に 入れ、混合物の温度を室温以下にする。

ビーズを蒸留水又は脱イオン水により数回、続いてＰＢＳにより数回、真空に連 結された粗いガラスフィルターを用いて洗浄する。カルボキシル化されたゲルを ４０°ＣでＰＢＳに貯蔵し、そして殺菌され又は保存剤と共に貯蔵される場合、 １年間まで安定している。

Ｕ カルボキシル化されたＢｉｏｇｅｌを接合するアビジンＰＢＳをまず、真空に連 結される粗いガラスフィルターにより濾過することによって測定された量のカル ボキシル化されたＢｉｏｇｅｌから除去する。次にそのゲルを、蒸留水又は脱イ オン水中で１５〜３０分間、平衡化する。水における平衡化は、その前もって測 定された量の約４倍の体積へのゲルの拡張を引き起こす。そのゲルを、それぞれ １（ＰＢＳにおいて前もって測定されたような）のゲルのために１０ｍ１の蒸留 水又は脱イオン水に再懸する。

１０ｎ＋ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド （ＥＤＣ−ＨＣＩ）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、カタログ番号Ｅ ７７５０゜Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ、）を、前もって測定されたそれぞれ− １のゲルのために添加する。ｐＨを急速に、ＨＣＩの滴下により５．５に調節す る。５．５のｐＨを維持するために注意がはられれ；０．５以下又は６．０以上 のｐＨは、Ｂｉｏｇｅｌの有意に低い活性化をもたらす、その混合物を５分間撹 拌する。

アビジン（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｚｙｍｅｓ＋　Ｉｎｃ、、　Ｆａ ｌｌｂｒｏｏｋ、　Ｃａ１ｉｆ、）を、１０〜１００　ｍｇ／　ｍｌの濃度で脱 イオン水に溶解する。次に、１００μｇのアビジンを急速に、それぞれＩｌｌの ゲル（前もってＰＢＳにおいて測定されたような）に添加する。その混合物を１ ．５時間撹拌する。

次に、２Ｍのグリシンを添加し、その混合物中、０．２Ｍのグリシン最終濃度に し、そしてさらに１時間撹拌する。

ゲルを、粗いガラスフィルター及び真空を用いてＰＢＳ数体積により洗浄し、そ して０．１％のＮａＮｔを含むＰＢＳ中に、４　’Ｃで貯蔵する。

ゲルは、約１年間安定している。

五−主 Ｄａｕｄｉ細胞からのビオチニル化された抗−１ａの抗体の除去Ａ、細胞の調製 Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ２１３）を、２８０　ｇで８分間遠心分 離し、そしてｌ×１０′１個の細胞／ｍｌでＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁する。

細胞を、２．５μｇ／ＩＩＩの濃度でビオチニル化された抗−１ａ抗体と共に３ ０分間、４°Ｃでインキュベートする。細胞を、第１回転の後、ＰＢＳ　＋１％ ＢＳＡに再懸濁し、次に第２回転の後、５Ｘ１０’個の細胞／ｍｌの濃度にする ためにＰＢＳ＋５％ＢＳＡに再懸濁する。

Ｂ、アビジンカラム調製 カルボキシル化されたＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−３０”　（上記のようにして調製され た）を、室温に平衡化し、そして１ｃｍの合計ベッド高さのに９／１５カラム（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、）に置く、そのカラ ムをＰＢＳ。

続いてＰＢＳ＋５％ＢＳＡにより洗浄する。このカラムは、′予備カラム”とし て機能する。アビジンカラムは、上記のようにして調製されたアビジン−接合Ｂ ｉｏｇｅｌ　Ｐ−６０ＴＫを含む。そのアビジン−接合Ｂｉｏｇｅｌを、室温に 平衡化し、そして４ｃｍの合計ベッド高さのに９／１５カラムに充填する６次に そのカラムを、ＰＢＳにより、続いてＰＢＳ　＋５％ＢＳＡにより数回洗浄する 。

Ｃ０細胞の免疫吸着 上記のようにして調製された細胞を、予備カラムのゲルペットの上部に静かに移 す。細胞を、予備カラムに通し、そしてＩｎ＋ｌのＰＢＳ＋５％ＢＳＡをアビジ ンカラムに通すことによって洗浄する。螺動性ポンプ（Ｃｏｌｅ−ＰａｒＩｌｅ ｒ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬＬ、）は、アビジンカラムからの流れを約１− １／分の速度に調節する。細胞がアビジンカラムペットの上部にほとんどすべて 入った後すぐに、１〜２ｍｌのＰＢＳ＋５％ＢＳＡを、アビジンカラムの上部に 添加し、残留細胞を洗浄する。そのカラムを４〜６ｍｌのＰＢＳにより洗浄する 。

Ｄ、アビジンカラムからの吸着された細胞の除去アビジンカラムを、１５−１の 遠心分離管の上部に置く。カラムの弁を開け、そして１５ｍ１のＰＢＳを広い経 口の９インチトランスファーピペットによりカラムに添加する。ＰＢＳを、ピペ ットで細胞ベッドを機械的に撹拌し、そして再懸濁し、従ってゲルマトリックス からの細胞の分離を可能にしながら、カラムに添加し、そして遠心分離管中のフ ィルターに添加する０次に、管を２８０ｇで８分間、遠心分離し、そしてペレッ トをｒｓｃｏｖｅｓ”変性ダルベツコ培地＋１０％ウシ胎児血清に再懸濁する。

アビジンゲルへの細胞の暴露の合計時間は、約１５分である。

Ｅ、結果 細胞を、フルオレセイン−標的抗体によりラベルし、そして螢光強度についてＦ ＡＣ３ｃａｎにより分析する。出発細胞、非付着性細胞及びアビジン接合Ｂｉｏ ｇｅｌに付着される細胞を、螢光化されたヤギー抗−マウスＩ　ｇＧ　（Ｔａｇ ｏ　）により染色し、細胞表面上に残存する抗−Ｉａ抗体の量を決定する。付着 細胞は、出発細胞の３０％はどのヤギー抗−マウスＦＩＴＣを結合し、そして非 付着性細胞は、出発細胞の２５％はどのヤギー抗−マウスＦＩＴＣを結合し、７ ０％〜７５％の抗−１ａ抗体が細胞表面から除去されることを示唆する。次に、 付着性及び出発細胞を螢光化された抗−ＨＬＡ−ｄｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　Ｃａ１ｉｆ、）抗体により再染 色し、抗原密度が変えられたかどうかを決定する。

付着性細胞は、出発細胞よりも１６％明るく染色し、これはＩａ抗原（ＨＬＡ− ＤＲ分子）が、抗−Ｉａ抗体が除去されたとしても、細胞上に残存することを示 す。

■−土 細胞表面からビオチニル化されたトランスフェリンの除去Ａ、細胞及びカラムの 調製 ＣＥ門細胞（ＡＴＣＣＮｏ　ＣＣＬ１１９）を、２８０ｇで８分間、遠心分離し 、そして２０　Ｘ　１０”個の細胞を、１００μｌのビオチニル化されたトラン スフェリン（Ｔｅｒｒｙ　Ｆｏｘ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｖａｎｃｏｕｖｅ ｒ＋　Ｂ、Ｃ，）中において、０．３ｍｇ／ｍｌで４°Ｃで３０分間、再懸濁し た。細胞を２８０ｇで８分間、遠心分離し、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡに再懸濁し、そ して再び遠心分離し、次にＰＢＳ＋５％ＢＳＡに再懸濁し、５Ｘ１０’個の細胞 ／−１の濃度にした。

カルボキシル化されたＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−３０”予備カラム及びＰ６０アビジン カラムを、例３に記載されるようにして調製し、そして操作する。

Ｂ、結果 細胞を、フルオレセイン−標的アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ ｅ＋Ｃａ１ｔｆ、）によりラベルし、細胞上のビオチニル化されたトランスフェ リンの量を測定する。細胞を、その細胞上のトランスフェリンレセプターの量を 測定するために、ビオチニル化されたトランスフェリン、次にフルオレセイン− 標的アビジンにより再ラベルする。次に、ラベルの量を、螢光強度についてＦＡ Ｃ３ｃａｎにより分析する。

カラムに結合し、そして約１５分の滞留時間の後、撹拌された細胞は、８７％の ビオチニル化されたトランスフェリンを失った。撹拌の前、６０分間カラム上に 残るそれらの細胞は、それらの表面上で９０％のトランスフェリンを失った。ビ オチニル化されたトランスフェリン、続くアビジン−ＦＩＴＣによる再染色は、 その細胞゛が出発細胞の９７％はどの多くのトランスフェリンレセプターを平均 して有することを示す。

前述から、本発明の特定の態様が、例示目的のために本明細書に記載されて来た けれども、種々の修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明らかであろう。

要約書 本発明は、粒子表面に実質的に影響を与えないで粒子表面から第２リガンドを除 去するための方法を提供し、前記方法は支持体上に固定された第１リガンドに粒 子を暴露することを含んで成り、ここで前記粒子は、その粒子表面からの第２リ ガンドの脱着を可能にする条件下で及びそれを可能にするのに十分な滞留時間、 暴露され、そして前記第１リガンドは、第２リガンドが粒子表面に実質的に影響 を与えないで粒子表面から除去されるように、粒子表面のための第２リガンドの 親和性よりも少なくとも２倍高い第２リガンドのための親和性を有することを特 徴とする特国際調査報告 国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．粒子表面に実質的に影響を与えないで粒子表面から第２リガンドを除去する ための方法であって： 支持体上に固定された第１リガンドに粒子を暴露することを含んで成り、ここで 前記粒子は、その粒子表面からの第２リガンドの脱着を可能にする条件下で及び それを可能にするのに十分な滞留時間、暴露され、そして前記第１リガンドは、 第２リガンドが粒子表面に実質的に影響を与えないで粒子表面から除去されるよ うに、粒子表面のための第２リガンドの親和性よりも少なくとも２倍高い第２リ ガンドのための親和性を有することを特徴とする方法。
2. ２．暴露の段階に続いて、前記第１リガンドが固定される支持体を撹拌すること をさらに含んで成る請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記第１リガンドがアビジンであり、そして前記第２リガンドがビオチニル 化されたトランスフェリンである請求の範囲第１又は２項記載の方法。
4. ４．前記第１リガンドがアビジンであり、そして前記第２リガンドがビオチニル 化されたＩＬ−２である請求の範囲第１又は第２項記載の方法。
5. ５．前記第１リガンドがアビジンであり、そして前記第２リガンドがビオチニル 化された抗−粒子表面抗体である請求の範囲第１又は２項記載の方法。
6. ６．前記第１リガンドがアビジンであり、そして前記第２リガンドがビオチニル 化された抗−免疫グロブリン抗体に結合される抗−粒子表面抗体である請求の範 囲第１又は２項記載の方法。
7. ７．前記第１リガンドが抗−免疫グロブリン抗体であり、そして前記第２リガン ドが抗−粒子表面抗体である請求の範囲第１又は第２項記載の方法。
8. ８．前記第１リガンドがプロテインＡであり、そして前記第２リガンドが抗−粒 子表面抗体である請求の範囲第１又は２項記載の方法。
9. ９．前記第１リガンドがプロテインＧであり、そして前記第２リガンドが抗−粒 子表面抗体である請求の範囲第１又は２項記載の方法。
10. １０．前記粒子がウィルス、細菌、真菌、寄生体及び細胞から成る群から選択さ れる請求の範囲第１又は２項記載の方法。
11. １１．細胞表面に実質的に影響を与えないで細胞表面からビオチニル化された抗 体を除去するための方法であって：前記細胞からのビオチニル化された抗体の脱 着を可能にする条件下で及びそれを可能にする十分な滞留時間、固定されたアビ ジンに前記細胞を暴露することを含んで成り、ここで前記アビジンは、ビオチニ ル化された抗体が細胞表面に実質的に影響を与えないで細胞表面から除去される ように、細胞表面のためのビオチニル化された抗体の親和性よりも少なくとも２ 倍高いビオチニル化された抗体のための親和性を有することを特徴とする方法。