JPH05507944A - 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 顆粒球コロニー刺激因子の肺内投与 先肚凶立１ 本発明は治療用タンパク質の肺内投与に係わり、特に、治療上有効量の顆粒球コ ロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ３Ｆ）を呼吸系を介して全身投与することに係わる。

見咀久１遣 Ｇ−Ｃ３Ｆは、造血を調節するホルモン様糖タンパク質であり、骨髄中に認めら れる正常造血前駆細胞のクローン増殖及び成熟に必要とされる（Ｗｅｌｔｅ　ｅ ｔ　ａｌ、。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、、Ｖｏ　１．８２゜ｐｐ、ｌ　５ ２６−１５３０　（１９８５））、特にＧ−ＣＳＦは、低濃度で存在すると、ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏで使用した場合に野牛顆粒球コロニーの産生を刺激することが知 られている。Ｇ−ＣＳＦは更に好中球移動を増強することも知られている（Ｇａ ｂｒｉ　１ｏｖｅ、Ｊ、、Ｓｅｍ１ｎａｒｐｐｌ−４（１９８９＞）、更にＧ− ＣＳＦは、抗体仲介細胞性細胞障害によって腫瘍細胞を−Ｌ」−−Δ二ｉｔｘ二 ９で殺す好中球の能力を著しく増大し得る（Ｓ、ｏｕｚａ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃ ｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２３２．ｐｐ、６ｌ−６５（１９８６）〕　。

ヒトにおいて、内因性Ｇ−Ｃ８Ｆは血漿中で検出可能である（Ｊｏｎｅｓ　ｅｔ 　ａｌ、、Ｂａ１ｌｌｉｅｒｅ”ｓ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ 、Ｖｏｌ。

２、Ｎｏｌ、ＰＰ、８３−１１１）、Ｇ−Ｃ３Ｆは、線維芽細胞、マクロファー ジ、Ｔ細胞、トロホブラスト、内皮細胞及び上皮ａｒ胞によって産生され、１７ 番目の染色体上に位置する４つのエクソンと５つのイントロンからなる単一コピ ー遺伝子の発現産物である。この遺伝子座の転写は、特異的にグロセコシングさ れて、一方は成熟長がアミノ酸１７７個であり、他方は成熟長がアミノＭｌ　７ ４個である２つの形態のＧ−ＣＳ　Ｆの発現をもたらすｍＲＮＡ種を生成する。

アミノ酸１７４個からなる形態は、ｉｎ　ｖｉｖ旦で特定の生物学的活性が最大 であることが判っている。

Ｇ−ＣＳ　Ｆは種交差反応性であり、ヒトＧ−ＣＳ　Ｆを、マウス、イヌまたは サルのような他の哺乳動物に投与すると、持続的な野牛白血球増加が誘起される ［Ｍｏｏｒｅ　ｅｔａ　１．、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　Ｌ、、 Ｖｏｆ、８４．ｐｐ、７１３４−７１３８（１９８７））。

ヒトＧ−Ｃ３Ｆは多数の供給源から入手し、精製することができる。天然ヒトＧ −ＣＳＦ（ｎｈＧ−ＣＳＦ）は、培養ヒト腫瘍細胞系の上清から単離することが できる１例えば米国特許第４．８１０．６４３号（Ｓｏｕｚａ）（この特許は参 照により本明細書の一部を構成するものとする）を参照すると、組換えＤＮＡ技 術の開発によって、真核宿主細胞の発現産物としてグリコジル化形態のＧ−Ｃ３ Ｆ、及び原核宿主細胞の発現産物として非グリコシリル化形態のＧ−Ｃ３Ｆを工 業規模で生産することが可能となった。

Ｇ−ＣＳＦは、化学療法または放射線療法から生じる造血不良を補償するために 好中球産生を刺激する手段として、癌の治療に有効であることが判っている。Ｇ −ＣＳＦを治療薬として有効利用するには、患者に該タンパク質を全身投与する 必要がある。経口投与も試みられたが、最近では、静脈注射、筋肉注射または皮 下注射による非経口投与がヒトにとって好ましい投与経路であり、治療上十分な 量のＧ−Ｃ３Ｆを血流に送達する唯一の実用的方法であると考えられている。こ れには例えばＴａｋａｄａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕ　ｌ　１．、Ｖｏ　１．３７．Ｎ。

３、ｐｐ、８３８−８３９（１９８９）を参照されたい。

比較的大きい分子を肺内送達することは知られていなくはないが、量的正当性が 実証された例は数件しがない、ロイプロリドアセテート（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ 　ａｃｅｔａｔｅ）は、経口利用度が低い黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ ＲＨ）アゴニスト活性を有するノナペプチドである。動物実験は、ロイプロリド アセテートのエーロゾル製剤を吸入すると血液中に有意なレベルをもたらすこと を示している（Ａｄｊｅｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、７．Ｎｏ、６゜ＰＰ、５６５−５６９（１９９０）； Ａｄｊｅｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　。

ｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、Ｖｏｌ、６３．ｐＰ。

１３５−１４４（１９９０））。

内皮細胞によって産生されるアミノ酸２１個の血管収縮神経ペプチドであるエン トチリン（Ｅｎｄｏｔｈｅ　１　ｉ　ｎ）−１（ＥＴ−１）は、エーロゾルによ ってモルモットに投与すると動脈血圧を低下させることが判った（Ｂｒａｑｕｅ ｔ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉ。

ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ。

１３、付録、５．ｓ、１４３−１４６＜１９８９））。

エーロゾル投与を使用してヒト血漿α１−アンチトリプシンを、その薬剤の一部 が全身循環系に取り込まれる量で原糸に送達し得る可能性が、Ｈｕｂｂａｒｄ　 ｅｔ　ａｌ。

、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏ　１．ＩＩ Ｉ、Ｎｏ、３．ＰＰ、２０６−２１２（１９８９）によって報告されている。

α１−プロテイナーゼ阻害剤をイヌ及びヒツジに肺内投与すると、該物質の一部 が血流中に移動することも判った（Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、、Ｖｏｌ、８４．ＰＰ、１１４５−１１４６（１９８９）〕。

試験動物を用いた実験から、組換えヒト成長ホルモンはエーロゾルにより投与す ると肺から迅速に吸収され、皮下注射によるものと比較してずっと速い成長をも たらすことが判明した（Ｏｓｗｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｅｒｏｓｏ１ｉｚａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｐｒ。

ｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｒｅ５ｐＬｒａｔｏｒｙ 　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ＩＩ。

Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏ１ｏｒａｄｏ、Ｍａｒｃｈ、１９９０〕、肺にエーロゾ ル投与した後の血流中には組換え型のサイトカインγインターフェロン（ＩＦＮ −γ）及び腫瘍壊死因子α（Ｔ　Ｎ　Ｆ−α）も認められた（Ｄｅｂｓ　ｅｔａ ｌ、、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏ　１．１４ ０．ＰＰ、３４８２−３４８８（１９８８））。

１帆立！ヱ 本発明は、Ｇ−Ｃ８Ｆが肺経路によって哺乳動物に全身投与され得るという新規 知見に基づいている。典型的にはこれは、治療上有効量のＧ−ＣＳＦ流を、呼吸 中の哺乳動物の口腔中に導くことにより行われる１重要な、しかも驚くべきこと には、そうすると十分な量のＧ−Ｃ３Ｆが肺内に沈積され、肺から血流中に吸収 され、血中好中球レベルを高める結果となる。更にこれは、吸収を向上するよう に特別に設計された吸収増強剤またはタンパク質誘導体を使用するような特別手 段に顆る必要なしに行われる。　Ｇ−Ｃ３Ｆの肺内投与は、注射によるＧ−ＣＳ 　Ｆの全身送達に代わる健康組織に無害な有効な代替法を提供する。

本発明は、天然Ｇ−Ｃ３Ｆの一次楕遣コンホーメーション（即ち連続アミノ酸残 基配列）の一部または全部を有し、従ってその１つ以上の生物学的特性を有する 任意の精製単離ポリペプチドを使用して冥施し得る。上述の５ｏｕｚａの特許並 びにＷｅｌｔｅら及びＮ１ｃｏｌａらの文献−を含む多数の文書が、Ｇ−ＣＳＦ の生産方法を記述している。

一般に、本発明の実施に有効なＧ−Ｃ３Ｆは、哺乳動物由来の天然単離純粋物、 化学的合成産物、またはゲノムもしくはｃＤＮＡクローニングや遺伝子合成によ って得られた外因性ＤＮＡ配列の原核細胞もしくは真核細胞宿主の発現産物とす ることができる。適当な原核細胞宿主としては種々の細菌（例えばＥ、ｃｏｌｉ ）細胞を挙げることができる。適当な真核細胞宿主としては酵母（例えばＳ、ｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び哺乳動物（例えばチャイニーズハムスター卵巣、サル ）細胞を挙げることができる。使用する宿主に従って、Ｇ−ＣＳＦ発現産物を哺 乳動物または他の真核細胞の炭水化物を用いてグリコジル化してもよいし、非グ リコジル化であってもよい、Ｇ−ＣＳＦ発現産物は、（位置−１に）開始アミノ 酸残基メチオニンを含むことができる０本発明はかかる形態の全てのＧ−ＣＳＦ の使用を考えているが、工業的実現性が最大であることから、特に旦ユｃｏｌｉ 誘導の組換えＧ−ＣＳＦが好ましい。

本発明の実施に使用しようとするものは、限定的ではないが、ネブライザー、投 与量計量式吸入器（ｍｅｔｅｒｅｄ　ｄｏｓｅ　１ｎｈａｌｅｒｓ）及び粉末吸 入器を含む治療用生成物の肺内送達用に設計された広範囲にわたる機械装置であ り、これら全てが当業者には公知である。

本発明の実現に適した市販装！の幾つかの特定の例としては、Ｍａｌｌｉｎｃｋ ｒｏｄｔ　Ｉｎｃ、、Ｓｔ、Ｌ。

ｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｔ製のＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー；Ｍａｒｑｕｅ ｓｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏ１ｏｒａ ｄｏ製のＡｃｏｒｎ　ＩＩネブライザー；Ｇｌａｘｏ　Ｉｎｃ、、Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ、ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ製のＶｅｎｔ ｏｌｉｎ投与量計量式吸入器；及びＦｉｓｏｎｓ　Ｃｏｒｐ、、Ｂｅｄｆｏｒｄ 、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ製の５ｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器を挙げること ができる。

上記全ての装置は、Ｇ−Ｃ３Ｆを分配するのに適した製剤の使用を必要とする。

一般に、かかる製剤は使用する装置のタイプに特定のものであり、適当な噴射剤 と、通常の希釈剤５加えてＧ−ＣＳＦ治療に有効なアジュバント及び／または担 体とを使用することもある０本発明を実施するためにほとんどの一般タイブの肺 内送達装置に使用し得るＧ−Ｃ９Ｆ製剤を以下に記載する。

ネブーイ　−　Ｇ−Ｃ９Ｆ ジェット型または超音波型のネブライザーに使用するのに適したＧ−ＣＳＦ製剤 は典型的には、Ｇ−Ｃ３Ｆを水に溶液１ｍｌ当たりＧ−ＣＳＦ約０　、１〜２５ 　ｍ　ｇの濃度で溶解した溶液からなる。製剤は更に緩衝液及び単糖（例えばタ ンパク質安定化及び浸透圧調節のため）を含むこともできる。使用し得るＭｆｌ ｌ液の例としては酢酸ナトリウム、クエン酸塩及びグリシンを挙げることができ る。ｌＩ衝液は、溶液のＰＨを３〜４の範囲に調整するのに適した組成及びモル 濃度を有するのが好ましい、一般にこれに適した緩衝液のモル濃度は２ｍＭ〜５ ０ｍＭである。使用し得る糖の例としてはマンニトール及びソルビトールを挙げ ることができ、通常は製剤の１〜１０重量％の量で使用する。

ネブライザー用製剤は、エーロゾルを形成する上で溶液たは防止するために、界 面活性剤を含むこともできる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコー ル並びにポリオキシエチレンソルビクン脂肪酸エステルのような種々の慣用の界 面活性剤を使用し得る。量は通常は製剤の０１００１”〜４重量％の範囲とする 。これに特に好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエー トで”　Ｇ−ＣＳ　Ｆ 投与量計量式吸入器に使用するＧ−Ｃ３Ｆ製剤は一般に、界面活性剤によって噴 射剤中に懇濁されたＧ−ＣＳ　Ｆを含む微細粉末からなる。噴射剤は、この目的 で使用される任意の慣用物質、例えばクロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフ ルオロカーボン、ヒドロフルオロカ゛−ボン、または、トリクロロフルオロメタ ン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１．１ ．１．２−テトラフルオロエタンを含む炭化水素、またはこれらの組合せとする ことができる。適した界面活性剤としてはソルビタントリオレート及びタイプレ シチンを挙げることができる。オレイン酸も界面活性剤として有効となり得る。

’　Ｇ−ＣＳＦ 粉末吸入器から分配するためのＧ−ＣＳＦ製剤は、Ｇ−Ｃ３Ｆを含む微細乾燥粉 末からなり、更に、ラクトース、ソルビトール、スクロースまたはマンニトール のような増量剤を、吸入器からの粉末の分配を容易にする量、例えば製剤の５０ 〜９０重量％の量で含む得る。ｍ−ｃｓｐは最も有利には、肺末端に最も効果的 に送達するために平均粒径が１０μｍ（即ちミクロン）以下、より好ましくは１ 〜５μｍの粒状形態に製造すべきである。

本発明は、治療量、即ち全身血液中の好中球レベルを高めるのに十分な量のタン パク質を投与することからなる。

特定のケースにおいて治療上有効な量は、その患者における正常血中好中球レベ ル、治療中の症状または疾患の重さ、好中球減少の程度、患者の体調など、熟練 医師が考慮する種々のファクターに従う、一般に、少なくとも血中好中球数が異 常に低く落ち込んでいる場合には、治療を受けている個体の正常血中好中球レベ ルが回復されるような投与処方に従う、ヒトにおいては、正常血中好中球レベル は、血液１μ！当たり好中球的５０００〜６０００である。ヒトにおいて好中球 数が１０００以下であると、通常重症の好中球減少症の兆候とみなされ、患者が 高い感染の危険性にあると考えられる。化学療法から誘導された好中球減少症を 患う癌患者における臨床試験では、２４時間ごとに３〜５μｇ／ｋｇを皮下注射 投与すると、急性の血中好中球レベル不良を１０００以上に高めるのに有効であ ることが判った、後述する動物を使っての基本実験に基づくと、ヒトを含むほと んどの哺乳動物において肺内送達のための投与量（以降は吸入量と称する）は、 特定の血中好中球レベルに達するのに必要な対応する皮下投与量の３〜１０倍と なることが推定される。

当業者には認識されるように、適当な吸入量を送達するための繰作条件は、使用 する機械装置のタイプに従って変化する。ネブライザーのようなエーロゾル送達 装置においては、投与頻度及び操作時間は主にエーロゾル中の単位体積当たりの Ｇ−ＣＳ　Ｆ量によって左右される。一般に、ネブライザー用溶液中、即ちエー ロゾル中のタンパク質濃度がより高い程、操作時間はより短くてよい、投与量計 量吸入器のような装置は他の装置より高いエーロゾル濃度を与粉末吸入器のよう な他の装置は、所与の１回量の活性物質が装置から完全に放出されるまで使用す るように設計されている。装置に装填された１回量は、１回の投与に分配するの に適正な吸入量のＧ−Ｃ３Ｆを含むように調製される。

Ｇ−ＣＳ　Ｆは、化学療法関連好中球減少症のような好中球不良症状を治療する ことにおいて有効であることが判っているが、Ｇ−ＣＳ　Ｆは、感染に応戦した り、血中好中球レベルが正常値以上に上昇することが医療上有益となり得る他の 異常または疾患を治療することにおいても有効となることぶ期待される。更に研 究がなされれば、後者のケースにおいてＧ−ＣＳＦを投与するのに適当な投与量 に関する情報も得られるであろう０本発明は、Ｇ−ＣＳ　Ｆが注射によって治療 用に投与されているほとんどの場合において健康組織に無害な代替法として適用 可能である。

図面の簡単な説明 図１は、ハムスターにおける血中好中球レベルに及ぼす皮下投与ｒｈＧ−Ｃ８Ｆ の作用を表わすグラフである。

図２は、種々の濃度のｒｈＧ−Ｃ３Ｆ水溶液を使用し、Ａｃｏｒｎｌｒネブライ ザー−またはＵｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー−から生成されたエーロゾルに暴 露した後のハムスターにおける血中好中球レベルの棒グラフである。

図３は、ｒｈＧ−Ｃ８Ｆの皮下投与及びエーロゾル投与から生じた血中好中球レ ベルの比較を示すグラフである。

１亙盈」 上述したように、Ｇ−ＣＳ　Ｆを非経口投与すると、末梢血中の好中球数が増大 することが知られている６組換えヒ）Ｇ−Ｃ３Ｆ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）のエーロゾ ルを吸入しても好中球数が増大することを示す実験を行った。使用したｒｈＧ− Ｃ８Ｆは、アミノ末端メチオニン基を有する全ｈＧ−Ｃ９Ｆポリペプチドを含む 、前述の５ｏｕｚａの特許の図７に示されたアミノ酸配列を有するＥ、ｃｏｌｉ 誘導組換え発現産物であった。これは、該特許に記載されている手順を使用して 製造することができる。

ハムス　−への 種々の量のｒｈＧ−ＣＳＦを皮下投与した後の４〜６週齢の雄のゴールデンシリ アンハムスター（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉ ｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の血液中の好中球数の変化を 測定する実験を最初に実施した。ｒｈＧ−Ｃ３Ｆを殺菌蒸留水で４ｍｇ７ｍ１溶 液に調製し、０．９％無菌生理食塩水で希釈し、直ちに種々の量を、ｌグルー７ ３〜５匹の試験動物からなる１０グループのハムスターの下方背部に皮下注射し た。２４時間後に各ハムスターから、ハロタン麻酔下に心臓穿刺によって血液を 採取した０部分（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）及び全部（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）の 血球数カウントを実施することにより血液中の好中球の数を決定した。図１に示 したかかる実験の結果から、体重１ｋｇ当たり約１００μｇ（μｇ／ｋｇ）まで の投与量においては、ｒｈＧ−Ｃ３Ｆ注射の２４時間後の好中球数は投与量と共 に増大していることが判る。投与量応答曲線は、それ以上の投与量においては横 ばいを示した。

エーロゾル、 ｒｈＧ−Ｃ３Ｆを含むエーロゾルへの吸入暴露を、Ｉｎ−Ｔｏｘ　Ｐｒｏｄｕｃ ｔｓ（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ。

ＮＭ）製の小動物暴露チャンバを使用して実施した。動物チャンバにある中央の １２のボートのみを使用し、動物チャンバのエーロゾル分配マニホールドの端部 ボートは封止した。このようにチャンバを改良すると、ネブライザーによって供 給される空気は、暴露の間に１０匹のハムスターを維持するのに適当となった。

暴露チャンバ内のエーロゾル濃度を測定するために、動物ボートの１つと排気ラ インとからフィルターサンプルを取った。残りの使用可能な動物ボートからエー ロゾルをサンプリングし、ＱＣＭ（石英結晶モニター）カスケードインバクター （Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａｒｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、、５ｉｅｒｒａ　Ｍ ａｄｒｅ、ＣＡ）を用いて粒径分布を暴露の間ずつと定期的に測定した。二〇カ スケードインバクターは２４０ｍｊ！／分しか取り込まず、暴露チャンバ内の気 流パターンを乱すことなくエーロゾルの粒径分布を測定し得る。

動物暴露実験を行なう前に、Ｕｌ　ｔｒａｖｅｎｔネブライザーまたはＡｃｏｒ ｎｌｌネブライザー（いずれもジェット型）のいずれかを使用し、２０ｍｇ／ｍ ｆアルブミン溶液から生成されたエーロゾルの濃度及び粒径分布を暴露チャンバ 内で測定した０表１は、チャンバ内の２つの箇所（ノーズ及び出口）で測定した エーロゾルの粒径分布及び平均アルブミン濃度を示す、ＵｌｔｒａｖｅｎｔはＡ ｃｏｒｎＩＩよりもはるかに小さい粒径のエーロゾルを生成したが、Ａｃｏｒｎ ｌｌはより濃縮されたエーロゾルを生成した。最初の５ｍｌが放出されてエーロ ゾル生成が衰えるまでく操作空気流速に従ってＡｃｏｒｎＩＩにおいては１０ま たは１５分間、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔにおいては２０分間）操作したとき、２つの ネブライザーはおおよそ等量のタンパク質を動物に送達した。

ネブライザーからの吸入暴露の間にエーロゾルによってハムスターに分配された Ｇ−ＣＳＦの推定量は、式：％式％ で決定される。但し、Ｄは吸入量であり、ηは沈積係数（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ 　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）であり、■は通気流速であり、Ｃはエーロゾル濃度で あり、Δｔは操作時間である。エーロゾル濃度測定値（Ｃ）及びネブライザー操 作時間（Δｔ）を、成熟ハムスターにおける安静時通気流速（Ｖ）３０ｍｆ／分 、沈積係数（η）０．５と合わせて使うことにより、ネブライザー用溶液のＧ− Ｃ３Ｆ濃度５ｍｇ７ｍ１〜１０　ｍ　ｇ／　ｍｌで、吸入量は１００．ｕｇ／ｋ ｇ（例えば１００ｇのハムスターにおいては１０μｇ）となることが判った。こ れは、肺内送達によって最高の好中球応答を生み出すと推定された量であった。

Ｇ−ＣＳ　Ｆのハムスターへのエーロゾルエーロゾル暴露を行なうのに使用する 溶液を、１ｍｇ／ｍ１の非イオン性界面活性剤ポリオキシエチレンソルビタンモ ノオレエートを含む無菌蒸留水中で凍結乾燥ｒｈＧ−ＣＳＦを再構成することに より調製した。暴露エーロゾルを生成するためにネブライザーで使用する溶液を 、Ｇ−Ｃ５Ｆを濃度１〜１５ｍｇ／ｍｆで用いて調製した。

各々が１０匹のハムスターからなるグループ（成熟雄ゴールデンシリアン）を、 ｒｈＧ−Ｃ８Ｆを含むエーロゾルに暴露した。ハムスターを閉込め用の試験管内 に入れ、約５分間順応させた０次いで試験管を暴露チャンバ内に挿入し、エーロ ゾル暴露を開始した。暴露後、ハムスターをケージに戻し、餌及び水を自由にと らせた。暴露の２４時間後に血液試料を採取し、皮下注射後の血液試料を評価す るのに使用したのと同じ手順で血中好中球濃度を測定した。

各暴露の闇に、エーロゾル濃度及び粒径分布を測定した。

ネブライザー溶液中の種々の濃度のＧ−Ｃ３Ｆを使用することにより、Ｇ−Ｃ５ Ｆ投与量を暴露ごとに変化させた。

Ｇ−Ｃ３Ｆを含むエーロゾルに暴露したハムスターは、未処置の被検動物及び水 と界面活性剤（ポリオキシエチレンツルとタンモノオレエート）のみを含むエー ロゾルに暴露した被検動物と比較すると、好中球濃度が上昇していることが判っ た０図２は、グラフ中に記載した濃度のｒｈＧ−Ｃ３Ｆネブライザー用溶液から 生成されたエーロゾルに暴露された被検動物において、好中球数の増加が認めら れたことを示している。グラフから判るように、Ｇ−ＣＳＦエーロゾル暴露から 得られる循環好中球レベルは、１　ｍ　ｇ／ｍｌの低いＧ−ＣＳ　Ｆ濃度を用い てさえ（Ｕｌｔｒａｖｅｎｔネブライザー使用）、Ｇ−ＣＳＦを含まないエーロ ゾルに暴露したグループよりも有意に高かった＜ｐ　＜　ｏ　、。

５）、対照に対する好中球レベルの増加の統計的危険率は、他の全てのグループ においてｐ＜０．００１であった。血中好中球レベルの増加は、ネブライザー溶 液中のＧ−Ｃ３Ｆ濃度の増加と濃度５　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌまで相関した。より 濃度の高いＧ−ＣＳ　Ｆネブライザー溶液を用いると、５０μｇ／ｋｇ以上の量 を皮下注射して得られる最大値にほぼ等しい血液１μ！当たり好中球数１５．０ ００の最高応答が認められた。より濃度の低いＧ−Ｃ３Ｆ溶液、例えば５ｍｇ／ ｍ１！の溶液を使用した２つのネブライザーによって得られる好中球応答にはほ とんど差はなかったｅ　５　ｍ　ｇ　／　ｍ１以上のＧ−Ｃ３Ｆ濃度においては 、ＡｃｏｒｎＩＩネブライザーはＵｌｔｒａｖｅｎｔよりも高い好中球応答の増 加を与えた。

界面活性剤を含まない５ｍｇ／ｍｆＧ−Ｃ３Ｆ溶液から生成されるエーロゾルへ の吸入暴露によって引き出されるハムスターにおける好中球応答（９，９１０± ９６０好中球／μｌ）は、界面活性剤を含む皮下注射５０μｇ／ｋｇ（１０，９ ３５±１．３９０好中球／μｍ）または界面活性剤を含まない溶液から調製した 皮下注射５０μｇ／ｋｇ（１０゜２７０±４３０好中球／μｌ）を用いて得られ る結果と有意な差はなかった。これらの値は、エーロゾル試験においては１０匹 の被検動物、また注射においては５匹の被検動物の平均及び標準誤差として記録 したものである。この実験から、界面活性剤は、Ｇ−Ｃ３Ｆ用の水性エーロゾル 製剤の必須成分ではないと結論される。

ハムスター　にお番るＧ−ＣＳＦエーロゾルの゛治療量のＧ−Ｃ９Ｆが肺を介し て効率的且つ経済的に送達され得るか確認するために、暴露の間に被検動物に送 達された量を推定した。送達または沈積量は、被検動物が吸入した薬剤の量と、 エーロゾル粒子が肺内に沈積する効率（沈積係数）との積で表される。ｔＩｋ者 は、エーロゾル暴露後のハムスターの肺から回収されたＧ−Ｃ３Ｆの量を測定す ることにより決定した。

肺内に沈積したＧ−Ｃ３Ｆは、Ａｃｏｒｎｌｌネブライザーによって生成された エーロゾルに暴露した各々４匹ずつの２グループの被検動物において測定した。

エーロゾル暴露の直後に、４匹のハムスターの肺全部を摘出し、３ｍｌの冷たい Ｍ衝生理食塩水を含むガラス製組織粉砕機に入れ、ホモジナイズした。ホモジネ ートを２回遠心し、最終上清を透明な試験管に移し、ラジオイムノアッセイ（Ａ ｍｇｅｎ　Ｉｎｃ、、Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ、ＣＡ）を使用してＧ−ＣＳ Ｆをアッセイした。この手順を使用した対照実験において、既知量のＧ−Ｃ３Ｆ が打ち込まれた肺ホモジネート試料からはＧ−ＣＳ　Ｆの７５％が回収され得る と判断された。エーロゾル暴露後の肺内のＧ−ＣＳ　Ｆの全ての測定値を、肺組 織からの供のＧ−Ｃ３Ｆ回収率（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｃｏｖｅｒｙ）に 対して補正した。

５ｍｇ／ｍ１タンパク質溶液から生成されるエーロゾルに１１分間暴露した動物 グループにおいては、平均３．１±０．３μｇのＧ−ＣＳＦが肺内に沈積され、 ２０ｍｇ／ｍ１溶液から生成されるエーロゾルに１１分間暴露した動物グループ においては、平均２０．０±４．０μｇのＧ−ＣＳＦが沈積した。暴露の間に測 定されたエーロゾル中のＧ−Ｃ３Ｆ濃度及び安静時通気流速（３０ｍＺ／分）を 基にすると、５ｍｇ／ｍｊ！グループの被検動物は２２μｇのＧ−ＣＳ　Ｆ　（ ６８μｇ／Ｉ　Ｘｏ、０３０１７分×１１分）を吸入し、２０ｍｇ／ｍ１グルー プは暴露時間内に６９μｇのＧ−Ｃ８Ｆ（２０８μｇ／ｌ　ｘＯ，０３０１／分 ×１１分）を吸入した。Ｇ−Ｃ８Ｆ吸入量と肺からの回収量とを用いて、肺内の 沈積効率（沈積係数Ｘ１００）は、５ｍｇ／ｍ１グループにおいては１４％、２ ０　ｍ　ｇ　／　ｍ　１グループにおいて好中球濃度の増加をエーロゾル投与量 と相関させるため、エーロゾル暴露後の肺内で測定されるＧ−Ｃ８Ｆから決定さ れた沈積係数を使用して、エーロゾルによって投与されたＧ−Ｃ３Ｆ量を推定し た。

表２は、ネブライザー溶液中の種々の濃度のＧ−Ｃ３Ｆを使用するエーロゾル暴 露において推定された吸入量及び沈積量を示している。Ｇ−Ｃ３Ｆ工−ロゾル濃 度は、暴露の間に回収されたフィルター試料の重量を測定し、その重量を、溶液 中のＧ−ＣＳＦに対する界面活性剤（１ｍｇ／ｍ１）の割合に対して補正した。

吸入量はエーロゾル濃度、安静時通気流速（３０ｍｆｆｉ／分）及び暴露時間（ Ａｃｏｒｎｌ■においては１１分間、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔにおいては２０分間） から計算した。沈積量は、吸入量及び沈積係数測定値（０，２９）から計算した 。

図３は、先に計算した投与レベルでのＧ−ＣＳ　Ｆの皮下投与及びエーロゾル投 与後の好中球応答を示す、エーロゾルを用いて得られた好中球応答を皮下注射に よって得られたものと比較すると、１〜１００μｇ／ｋｇの治療上重要な投与量 範囲において、沈積量は注射におおよそ等しいことが判る。

以上、本発明を特にエーロゾル溶液及びネブライザーの使用に関して説明したが 、生物学的物質を肺内送達するのに適した任意の慣用手段を使用して本発明に従 ってＧ−ＣＳＦを投与し得ることが理解される。実際、投与量計量吸入器もしく は粉末吸入器または他の装置が好ましかったり、特定の要求に最も良く適合する 場合もある。上記説明は、これらの装置の幾つかの使用についての範例である。

他の適用も当業者の能力内にある。従って本発明は、上述の特定の実施ｎｍのみ の適用によって実施することに制限されるとみなさるべき七゛はない。

ＦＩＧ、　１ （１−Ｃ５ｆ−１社ｔ（Ｐｉｈｔ） ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３ 、　要約 顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を、ネブライザー、投与量計量吸入器及 び粉末吸入器を含む種々の肺内送達装置を使用して、肺内投与によって治療上ま たは予防上有効な量で全身に送達することができる０本発明のエーロゾル投与は 、皮下注射による送達に優に匹敵し得る好中球レベルの有意な増加をもたらす、 Ｇ−ＣＳＦは、好中球減少症を治療するよう、及び感染に応戦または感染を予防 するように投与することができる。

国際調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｇ−ＣＳＦを哺乳動物に肺内投与することからなる使用方法。
2. ２．前記哺乳動物が呼吸中に、治療上有効量のＧ−ＣＳＦ流を該哺乳動物の口腔 中に導くことからなる請求項１に記載の方法。
3. ３．Ｇ−ＣＳＦを、医薬的に不活性の担体中にＧ−ＣＳＦを含む医薬組成物の形 態で投与する請求項２に記載の方法。
4. ４．前記組成物が、水性媒質中の溶液または非水性媒質中の懸濁液の形態である 請求項３に記載の方法。
5. ５．前記組成物が乾燥粉末の形態である請求項３に記載の方法。
6. ６．Ｇ−ＣＳＦが１０ミクロンより小さい粒径を有する請求項５に記載の方法。
7. ７．Ｇ−ＣＳＦが１〜５ミクロンの粒径を有する請求項５に記載の方法。
8. ８．Ｇ−ＣＳＦがヒトＧ−ＣＳＦである請求項２に記載の方法。
9. ９．ヒトＧ−ＣＳＦが組換えヒトＧ−ＣＳＦである請求項８に記載の方法。
10. １０．前記組換えヒトＧ−ＣＳＦが、形質転換された真核または原核宿主細胞中 での発現産物である請求項９に記載の方法。
11. １１．前記宿主細胞が原核細胞である請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである請求項１１に記載の方法。
13. １３．Ｇ−ＣＳＦが、肺内投与に適しており且つＧ−ＣＳＦを哺乳動物の肺内に 沈積し得る機械装置から分配される請求項２に記載の方法。
14. １４．前記装置が、ネブライザー、投与量計量吸入器または粉末吸入器である請 求項１３に記載の方法。
15. １５．前記装置がジェット型ネブライザーである請求項１４に記載の方法。
16. １６．前記装置が超音波型ネブライザーである請求項１４に記載の方法。
17. １７．前記哺乳動物がヒトである請求項２に記載の方法。
18. １８．前記投与が、血液１μｌ当たり好中球が１０００を超える血中好中球レベ ルをもたらす請求項１７に記載の方法。
19. １９．前記投与が、血液１μｌ当たり好中球が約５０００〜６０００の血中好中 球レベルをもたらす請求項１７に記載の方法。
20. ２０．好中球減少症を治療するために使用される請求項１に記載の方法。
21. ２１．感染を治療するために使用される請求項１に記載の方法。
22. ２２．感染を予防するために使用される請求項１に記載の方法。