JPH05508316A - 生きている細胞に生物学的物質を導入するための改良された方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 生きている細胞に生物学的物質を導入するための改良された方法および装置 発明の分野 本発明は、生きている細胞または組織またはこれら両方に生物学的物質を導入す るための改良された方法および装置に関する。

発明の背景 生物学的物質、たとえば、異種ＤＮＡまたはＲＮＡでの衝撃（ｂｏｍｂａ、ｒｄ ｍｅｎｔ）による生きている細胞の形質転換が、１９８４年１１月１３日に出願 された、５ａｎｆｏｒｄ等の米国特許出願０６／６７０．７７１　ｒｌｌｅｔｈ ｏｄ　Ｆａｒ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅｓＩｒ＋ｔｏ　 Ｌｉｖｆｎｇ　Ｃｅ１ｌｓＪに記載されている。細胞および組織へ物質を付与す るための改良装置が、同じ５ａｎｆｏｒｄ等によって１９８８年２月２９日に出 願された米国特許出願０７／１６１．８０７　ｒＢｉｏｌｊｓｔｉｃ　Ａｐｐａ ｒａｔｕｓ　ｆｏｒ　ＤｅｌｉｖｅｒｉｎｇＳｕｂｓｔａｎｃｅｓ　１ｎｔｏ　 Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ　ｉｎ　ａ　Ｎｏｎ−Ｌｅｔｈａｌｌｌａ ｎｎｅｒＪに記載されている。ここに記載されている方法では、適当なサイズの 粒子を、細胞壁または細胞膜あるいはこれら両方を貫通して細胞の原形質、核あ るいは小器官に侵入するに充分に高い速度まで加速している。粒子が生物学的物 質を担持しており、速度が細胞を壊すことなくその壁を貫通するに充分であるな らば、生物学的物質は細胞内に導入される。

この方法では、細胞膜に形成される孔は、マイクロインジェクション操作を用い て形成されるよりも小さくでよいし、数分の１秒間だけ開いていればよい。Ｉ？ Ｎ＾、ＤＮＡのような生物学的物質は、５ａｎｆｏｒｄ等に記載されているよう に、タングステン球体、ラテックス・ビードあるいはフェライト結晶のような不 活性粒子の表面にｔｌＮＡを沈着させるなど種々のメカニズムによって細胞内に 運ばれ得る。液体キャリヤ内のＤＮＡは、ウェルとして用いることができ、ある いは、固形のＤＮＡは粒子そのものを構成し得る。この方法は、多数の細胞に同 に衝撃を与えることができ、個々の細胞を操作する必要がないので、特に有利で ある。

この方法は、Ｊ、Ｐａｒｔ、Ｓｃｉ、ａｎｄ　Ｔｅｃｈ、５：２７〜３７（１９ ８７）に５ａｎｆｏｒｄ等にも記載されており、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎＢｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ　６　：　２２９〜３０２（１９８８）の最近のレビューに５ ａｎｆｏｒｄによって要約されている。ＤＮＡのタマネギ細胞への生物分解付与 が、Ｋｌｅｉｎ等によって、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

胞小器官の形質転換は、最初、Ｊｏｈｎｓｔｏｒ＋等によって小器官形質転換は 、さらに、Ｆａｘ等によってＰＮＡＳ８５ニア２８８〜７２９２（１９８８）、 Ｂｌｏｗｅｒｓ等によってＴｈｅ　ＰｌａｎｔＣｅ１ｌ　１　：　１２３〜１３ ２（Ｌ９８９）およびＤａｎｉｅｌｌ等によってＰＮＡＳ（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ） （１９８９）にも明らかにされている。

この方法の高等植物の形質転換への利用が、５ａｎｆｏｒｄによってＰｈｙｓｆ ｏｌｏｇｉａ　Ｐｌａｎｔａｒｕｓ（ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）（１９８９）ｊ：：お いて再検討されており、さらに数多くの論文において論証されている。さらに、 この衝撃技術を用いるより高等Ｊｏｈｎｓｔｏｎ等の実験（準備中）およびＺｅ ｌｅｒ＋ｉｎ等の実験（準備中）で論証されている。

これら早期の技術に基づいて、生物学的物質を担持している粒子の付与を行う種 々の装置が開発されている。

５ａｎｆｏｒｄ等による装置は、火薬発射で発生した熱ガスが熱ガス衝撃波を生 成し、これが多くの微小発射体を担持している微小発射体を加速する火薬駆動装 置の形で、Ｅ、　’ｆ、　ｄｕ　Ｐｏｒ＋ｔ　ｄｅ　Ｎｕｉｏｕｒｓ　ａｎｄ　 Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｖｉｌ＋ｓｊ、ｎｇｔｏｎ。

ＤＥから市販されている。微小発射体が孔を設けた停止板に衝突し、たとき、微 小発射体は移動し続けて標的細胞に衝突する。ｂ叫ユコ丼ｒ９力↓−リー１ノ復 び一す規−阻：３２０〜３２２（１９８９）で、Ｍｏｒｉｋａｗａ等が、微小発 射体を駆動スルノに加圧窒素ガスを使用する、Ｓａｒ＋ｆｏｒｄ等の技術に基づ く装置を開示している。、］、９９８７１１２月２に出願されたＡｇｒａｅｅｔ ｕｓのヨーロッパ特許出願８７３１０６２．．４　（公告番号０２７０３５６） が微小発射体加速器を記載している。微小発射体が薄い円板である場合、非常に 高い放電を用いて加速され、これが水滴を蒸発させて熱ガスを発生させ、この熱 ガスが火薬発射によつて生じる熱ガスと同様に発射体を駆動する。

Ｄｒ、　Ｌａｕｒｅｉ　ｌ１ｅｔｓが、５ａｎｆｏｒｄ等の特許出願に記載され ていると同じ原理に基づいた、すなわち、粒子ガス流巻き込み式の粒子加速器を 開発した。最後に０ａｒｄ等（１９９０）が、円筒形の微小発射体を加速すべく 圧縮空気を用いるトウモロコシ、米、コムギの細胞における一時的な形質発現を 達成した。Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　９２　：　３３４〜３３９が、 ＤＮＡ被覆微小発射体を推進するためにこのようなエアガンを使用することを記 載している。ポリカーボネート真空室がエアガン銃身および標的物質を収容して いる。

これら種々の装置は細胞および組織へ生物学的物質を移入するにはどのように微 小発射体を加速したら最良であるかについての問題への様々なアプローチを示し ているが、すべて、１つまたはそれ以上の欠陥を持っている。

まず、このように構成した装置の多くは、使用モードについて融通性がない。弾 道法にとっては、種々の能力、設定、形態等を要求する広範囲にわたる用途があ る。現存の装置は、単一の使用モードあるいは単一の用途にとっては最適である が、複数のニーズに適応することはできない。次に、一般に入手できる装置では 、反復可能な結果、すなわち、標的毎の結果および日毎の結果を望むようには得 ることができない。現存の加速器は、性能のばら゛つきが大きい。また、粒子分 散パターンが貧弱であり、標的面積にわｔ＝って均一とならない。現存の装置は 、しばしば、粒子凝集体を効果的にばらすことができず、粒子が分散するどんな 大きさの面積にわたっても制御を行うこともできない。

現存の装置のたいていのものは、嵩高であり、一般に可動性がなく、成る種の獣 医学や医学の用途で必要とされるように手持ち式とすることができない。これに 関連Ｌ７て、入手可能な装置のたいていのものは、標的を真空室内に置く必要が あり、このような真空室よりも大きな標的に用いることができない。用いる標的 がどんなものであろうとも、この加速器は、成る数の細胞に損傷を与えたり、殺 したりして、細胞分裂あるいは細胞分化を悪化させる傾向がある。これは、特に 、標的までの距離が短い必要がある場合、たとえば、医学用途に当てはまる。

したがって、より良好な速度制御、より少ないガス・ブラスト、より少ない音響 ショック、より少ない速度の破砕屑、より低い熱ならびにより低い放射エネルギ を持つことが望ましい。

火薬発射または高電圧放電を用いる装置は、高温を発生する傾向がある。さらに 、高電圧放電は、目つぶし閃光を発生する。これは、紫外線光その他の電離放射 線を発生する可能性がある。これは、形質転換されつつある細胞あるいは付与さ れつつあるＤＮＡに有害である。

細胞または組織あるいはこれら両方の標的に生物学的物質を担持している粒子を 導入する従来の加速法の欠陥の多（は、本発明の方法を利用して解消される。こ の方法は、細胞または組織あるいはこれら両方の表面を貫通し、細胞または組織 あるいはこれら両方の内部に組み込まれるに充分に粒子を細胞または組織あるい はこれら両方を殺すことなく加速する段階と、周囲温度ガスから発生したガス衝 撃波（以後、「冷」ガス衝撃波」と呼ぶ）の力を粒子に加えることによって粒子 加速を行う段階とからなる。この粒子加速法は、さらに、平らな表面の標的側に 粒子を置き、この表面に冷ガス衝撃波を加えて表面、それ故に粒子を加速するこ とを包含する。平らな表面がメツシュである場合、粒子は、オプシ式ンとして、 衝撃波内に捕らえられる。シートが中実であり、その縁で固定されている場合に は、冷ガス衝撃波は、拡張を生じさせるが、膜を破壊することはな（、オプショ ンとして衝撃波から標的を保護しながら粒子を発射する。

あるいは、膜が固定されており、破壊され得る場合、粒子は標的細胞のより広い 範囲にわたって分散させられる。あるいは、生物学的物質をガス衝撃波の経路内 でスクリーン上に分散させてもよい。もし拘束されたスクリーンが標的細胞と中 実の未固定膜（フライングディスク）の間に設置しである場合、ディスクの飛翔 が短距離に制限され、粒子が発射され、標的に向かってスクリーンを通して移動 することができる。

上述の種々の方法を用いる場合、必要に応じて利用できる数多の変更を行うこと ができる。たとえば、「フライングディスク」の使用は、標的の保護と共に非常 に高い粒子速度を得ることができる。粒子が単に衝撃波内に捕らえられただけで は、細胞や組織への損傷はより厳しいものとなる可能性があるが、速度は最高と なる。一方、拡張がスクリーンによって制限される拡張膜を使用した場合には、 細胞損傷は最小となる。破裂可能な膜の場合には、粒子の分散が良好となるが、 細胞損傷を幾分高める傾向がある。

本発明の方法を実施するための装置は、真空を持続できる閉じたハウジングであ り、真空を作用させるための第１ボート、主軸およびこの主軸上に位置する第２ ポートを有し、第２ボートの反対側で主軸を取り囲むスロート部を構成するハウ ジングと、第２ボート内に設置した高圧室であり、そこに収容されたガスを徹底 的に解放してスロート部に向かってガス衝撃波を送る高圧室と、標的に向かって 衝撃波の力によって加速できるようにスロート部内に粒子を位置決めする手段と を包含する。オプションとして、インタフェースをスロート部に固着して、大き な標的を用いるときあるいは真空または衝撃あるいはこれら両方に標的がさらさ れるのを制限しようとしている場合に、標的にスロート部を連結するようにして もよい。本発明は、スロート部内に粒子を位置決めし、発射することについては 融通性を与えるが、それぞれの構成は種々の利点、欠点を有する。

要約すると、本装置は、５つの部分、（ａ）高圧ガス給送システム、（ｂ）高圧 システムから瞬間衝撃波を発生させる機構、（Ｃ）衝撃波を解放、収容、通気す る囲みおよび（ｄ）いくつかの発散機構によって衝撃波の力を利用して微小発射 体加速へガス衝撃を転換する互換性のある挿入体を受け入れることのできるスロ ート領域を有する。

最後に、互換性インタフェースを種々のタイプの生物学的標的、小動物あるいは 小植物から大型動物あるいは植物までの標的に対して、シャーレ等に入れた細胞 に用いることができる。

図面の簡単な説明 本発明は、添付図面を参照してより良く理解して貰えよう。図面において： 第１図は、本発明に従って構成した細胞または組織あるいはこれら両方の標的に 生物学的物質を担持している粒子を導入する装置を含むシステムの概略図である 。

第２図は、第１図の装置の詳細を示す展開横断面図である。

第３図は、特に手持ち式装置として有用である、第１図の装置の別の構造を示す 図である。

第４図は、第１図の粒子加速器のスロート部の代替構造を示す図である。

第５ａ、５ｂ図は、ガス巻き込みモードで作動するように構成した粒子加速器の 一興体例のための初期状態および作動状態を示す、粒子加速器のスロート部の横 断面図である。

第５ａ、５ｂ図は、固定膜として作動するように構成した粒子加速器のスロート 部の横断面図である。

第７ａ、７ｂ図は、捕獲された膜として作動するように構成した、本発明の粒子 加速器のスロート部の横断面図であり、初期状態および作動状態の両方を示す図 である。

第８ａ、８ｂ、８ｃ図は、破裂膜として作動するように構成した粒子加速器の初 期、中間、作動状態を示す、粒子加速器のスロート部の横断面図である。

第９ａ、９ｂ、９ｃ図は、フライングディスクとして作動するように構成した本 発明の粒子加速器のスロート部の横断面図であり、初期、中間および作動状態を 示す図である。

第１０図は、第１図の粒子加速器のノズル部の３つの代替構成を示す図である。

第１１図は、第１図の粒子加速器のノズル部の別の具体例を示す横断面図である 。

第１２図は、本発明の別の具体例に従って構成した、特に大型の標的と一緒に用 いるようになっている粒子加速器の横断面図である。

第１３図は、第１２図の粒子加速器で用いられるバッフルの、線１３−１３に沿 った横断面図である。

第１４．１４ａ、　１４ｂ図は、本発明の別の具体例の付加的な横断面図である 。

好ましい具体例の詳細な説明 第１．２図を参照して、本発明の装置は、５つの部分、すなわち、（ａ）高圧ガ ス給送システム１０、（ｂ）高圧システムから瞬間衝撃波を発生させる衝撃機構 １２、（ｅ）衝撃波を解放、収容、通気する囲みまたはハウジング１４および（ ｄ）互換性のある挿入を行うことができ、発散機構によってガス衝撃波を微小発 射体加速へ転換することのできるスロート領域１６と、（ｅ）種々のタイプの生 物学的標的を狙うオブシゴンの互換性ノズルまたはインタフェース機構１８とを 包含する。

高圧ガス給送システムは、高圧ガス源２０を包含する。

代表的には、ガスはヘリウムである。これは、軽くて高速膨張性があるからであ る。他の好ましい不活性ガス、たとえば、窒素ガスも、所望に応じて使用できる 。また、空気、水素等も用い得る。ガス源２０は、適当なレギュレータ２２と圧 力インジケータ２４を備え、適当な配管２Ｇを通して瞬間ガス衝撃波を発生する 室１２に接続しである。ブリード弁２８と遮断弁３０とが用いられている。後に 説明するように、弁３０はガス源２０をノズルまたはインタフェース１８へ接続 している。

衝撃発生システム１２（詳細は第２図により明瞭に示しである）は、ガスの流量 を制限するように作用する絞り３２を通して配管２６からガスを受け取り、それ によって、破裂付勢機構を安定化すると共に所望圧力に達する前の早期発射を防 ぐようになっている。これは、ガス衝撃発生システムとして作用する。室１２、 ハウジング１４、スロット挿入体１８の構成要素のすべては、特に指定しないか ぎり、真鍮やステンレス鋼のような、高圧あるいは真空に耐えることのできる任 意適当な材料で作るとよい。絞り３２は、他の閉止機構が故障した場合に、発射 後にシステムを通るガス流を制限するのにも役立つ。この絞りがあるために、衝 撃発生システム１２の下部に含まれる高圧室３４を加圧するのに数秒かかる。

反復してこじ開けられる弁を絞りに代え、絞り点を通る流量を調整するようにし てもよい。衝撃発生システム１２内の加圧ガス室３４の寸法は、強力なガス衝撃 波を発生させるに充分な両のガスを収容できるに充分な大きさであるが、通気す る必要のあるガスの量を制限し、生物学的標的にガス衝撃を与えるのに貢献する には充分に小さいものでなければならない。本質的には、この加圧ガス室部分は 参照符号３４で示しである。室３４の体積は、所望に応じて寸法付けることので きるねじ付きスリーブ挿入体３６によって調節できる。

ガフ、？＃ｊ撃波発生ツステム１２は、比較的低圧の領域へ自由に膨張する必要 のある非常に明確番ご定めだ衝撃波面を提供するように設＃１し、である。。適 切なガス衝撃波を発生きせるに適した解放機構は非常に迅速に開がなｄればなら ない。これは、膜の瞬間的な破裂かあるいは特殊な超高速弁を使用するかのいず れかで達成できる。本当に速い高圧弁を利用しないという点で、第１．２図に示 す、破裂可能な膜３８を包含する具体例は好ましい。膜は、衝撃発生システム１ ２を構成するシリンダに螺合したエンドキャップ４０（第２図）によって保持さ れる。このエンドキャップ４０は、その中央部が開口しており、後述するように 標的４２の方向へ下向きにガスが逃げることができるようにしている。膜は、任 意適当な破裂可能な材料、たとえば、Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）ポリイミドフィ ルムやＭｙｌａｒ（登録商標）ポリエステルフィルムであってよい。コレラのタ イプの材料の特性を以下に述べる。５枚の２ミル厚Ｋａｐｔｏｎ（登録商標）膜 の使用ではうまくいった（−例として、２ミル＊Ｋａｐｔｏｒ＋（登録商標）膜 の４〜５層が１２００ｐｓｆのヘリウムを含む）。この構成の下では、加圧され た膜は、かなり外方に変形するが、自発的に破裂することはない。あるいは、よ り弱い膜あるいはより高い圧力を用いて自発的な破裂を行うこともできる。

膜３８の急激な破裂（終局的なものでなければならない）を確保するために、ロ ッド４６の形をした能動的な破裂機構を用いてもよい。ロッドは、衝撃発生シス テム１２の中心にある孔を貫通している。ロッド４６は、鋭い先端を有し、これ が圧力室３６内から膜を破裂させ、ガス衝撃波の外方への自由な膨張と干渉しな いようになっている。

衝撃発生システムの高圧チューブが中央部に孔または絞りを有し、両端により広 い孔を有するように形成してもよい。ロッド４６は、この絞られた部分を貫通す るが、ガスが下方圧力室領域に通わるように中空か、あるいは、溝付きであると よい。上端（ガス源に近い端）で、ロッド４６はより広くなっており（すなわち 、より大きな直径となっており）、発射の差異に、捕らえられ、絞り領域を通し て下方に飛べないようにしている。このより広い端領域では、ロッドは、磁気反 応金属で作ってあり、電気付勢機構５０によって作動させられるソＬ／ノイド４ ８を用い°Ｃ下方に駆動することができる。７衝撃発生システム１２を形成して いる高圧ヂニーブは、上述したように真鍮のような非磁気反応材料で作っである 。ロッド４６の」三方拡大端と絞り部分の間にはスプリングが設けてあり、各発 射サイクルの終わりにロッドがその上方位置へ戻るのを可能あるいは容易にして いる。

ロッド４６がソレノイド４８によって下方に作動させられたとき、その下端（鋭 くなっている）は、圧力室３４内へ延び、膜を貫通してガス衝撃波を発生させる 。ロッドの広くなった部分の基部には、リングシール５６があり、発射の際に、 ロッドの広くなった部分が絞りをシールし、その後にいかなるガスも下方圧力室 ３４（膜の破裂により圧力解放されている）へ逃げるのを止めるようになってい る。上方のガス圧が解放されると、小さいスプリング５２がロッド４６をその当 初の上昇位置へ戻し、下方圧力室３４を再び新しい膜で閉ざし、再加圧すること ができる。

この機構で発生したガス衝撃波は、火薬カートリッジが熱および衝撃の瞬間的な 解放を行う５ａｎｆｏｒｄ等の得たガス衝撃波と異なっているので、重要である 。本発明のガス衝撃発生システムの場合、ガス衝撃波は、周囲温度で加圧ガスか ら発生するガス衝撃波（以後、［冷Ｊガス衝撃波と呼ぶ）であり、紫外線光の観 点からも熱の観点からも（両者共に、生物学的物質を処理するときには望ましく ない）標的領域にある生物学的物質を破壊しないという点で有利である。ガス衝 撃波そのものは、残りのガスを通して伝播する階段関数にほぼ匹敵する急激な圧 力増大を生じさせる。一般的には、急激な圧力増大が生じる伝達領域の幅は、分 子平均自由経路、すなわち、１つの分子が他の分子と衝突する前に移動できる経 路である。本発明にとって必要で望ましい短距離内で粒子の急速加速を行うのに 効果があるのがこの急激な破局的圧力増大である。衝撃波は冷たい。この「冷た い」ということは、組織の生物学的物質に損傷を生じさせないのに充分なほど冷 たいということを意味する。

最良のバーストは、自発的な膜破壊から生じる。これは引張限度で膜が壊れるか らである。これらの膜は、所与の圧力で自発的に破裂するように均一に作るとよ い。

この場合、必要なことのすべては、臨界圧力に達して膜３８が破裂し、ガス衝撃 波が発生して標的４２の方向に伝播するまで圧力室３４を徐々に加圧することで ある。膜は層状であってもよい。各２ミル厚のＫａｐｔｏｎ（登録商標）層は、 多重層を加えた場合に、２７５〜３００ｐｓｉの圧力で壊れる。

金属箔も使用できる。

発生したガス衝撃波は、極めて音が大きく、操作員の聴力にとって潜在的な危険 がある。また、ガス衝撃波は、部分的に抽気されたスペースに自由に膨張できる かぎり、幾分減衰される傾向がある。さらに、ガス衝撃波によって加速される軽 量の粒子は、ガス充満領域を通って移動しなければならない場合にはすぐに速度 が減衰する。これらの理由のために、ハウジング１４が、ガス衝撃波解放領域で 部分真空あるいは完全真空を用いることができるように設けられる。ハウジング は、円筒形であり、２つの部分、上部６０と下部６２とからなる。これら２つの 部分６０．６２は、スナップクリップ６４と適当なＯリング６６とによって結合 され、間をシールされる。衝撃発生システム１２は、円筒形ハウジング１４の主 軸に沿って螺合し、ハウジングの上端に螺合し、ハウジング１４内でシステムの 位置を垂直方向に調節することができるようになっている。

さらに詳しくは、ロッド４６の軸線で構成される室の軸線１１は、ハウジング軸 線１１と一致し、スロート１６およびインタフェース１８を標的４２まで延びて おり、室の軸線の上またはそれを取り囲んでいてガス衝撃波を標的に伝播できる ようにしている。

スロート１６は、ハウジング１４の下半分６２の下部を形成している。この下部 にテーパが付けてあって縮径スロート部１６を形成している。この領域において 、ガス衝撃波のエネルギが微小発射体に伝えられて標的まで加速する。

このエネルギの伝達は本発明によれば種々の機構によって生じるため、この領域 には、使用モードに応じて互換性のある挿入体が置かれる。これらの挿入体は、 個々に所定位置に螺合あるいは固定してもよいし、後述するように予め組み立て たユニットとしてスロット領域の所定位置に落としてもよい。使用される代表的 な挿入体は、スロット１６内に螺合する２つのリング挿入体８２によって保持さ れた成る種の粒子キャリヤ８０を包含する。粒子キャリヤ８０は、第５図から第 ９図に関連して後に説明するように、スクリーン、膜あるいはそれらの組み合わ せのいずれでもよい。後述するように、ノズル／インタフェース１８（第１図） または１８′（第２図）は、スロット領域の端に螺合してもよい。インタフェー ス１８′の下端には、内向きのフランジが設けてあり、第１０．１１図に示すよ うに、種々のアタッチメントを受け入れるようにねじが切っである。

第４図を参照して、ここに示す代替のスロート部は、取外可能な挿入体１００を 包含し、これはスロート部１６′内に滑り込ませ、内向きにフランジ１０２によ って支持される。挿入体１００の内部には、ねじが切ってあり、一対のリング８ ２′を収容するようになっている。挿入体の上端には小さいハンドル８４が設け てあり、取扱いを便利にしている。挿入体１００の下面には、０リング１０４が 設けてあり、挿入体１００まわりの空気の漏洩を防ぐシールを設ける助けとなっ ている。挿入体１００の外面およびスロート部１６の内面にはねじが切ってなく 、挿入体の摺動を容易にしている。この取外可能な挿入体１００は、第５図から 第９図に示すスロット部に対して代替の粒子加速配置のうちのいずれの取扱いも 容易にするのに用いることができる。

図６ａ、６ｂに示す粒子加速器の具体例は、スロート部１６のための固定膜構造 であり、強いけれども弾力性のある材料、たとえば、Ｋａｐｔｏｎ（登録商標） ポリイミドフィルムあるいはＭｙＬａｒ（登録商標）ポリエステルフィルムを包 含する。ポリイミドフィルムは、例外的に強（て耐熱性がある。ポリエステルフ ィルムも同様の特性を有し、広い温度範囲にわたってその引張強さを維持する。

これらのフィルムは、ガス衝撃波の衝撃に耐えるに充分な強さを有する。ここで 用いた「弾力性」なる用語は、必要な使用限度まで破裂することなくガス衝撃波 に耐えることのできる材料を意味する。膜１１０は、その周囲まわりをリング８ ２のような手段によって所定位置に保持される。

これらのリング８２は、対応する溝と隆起（図示せず）を有し、所定位置に膜１ １０を錠止するのを容易にしてもよい。

この錠止は、スロート領域１６にリングを位置させ、間に膜１１０を挟んで互い に締め付けることによって達成し得る。

微小発射体は、膜１１０の外面（図で見て、標的に近いほうの下面）に接着され る。したがって、ガス衝撃波が膜１１０に衝突したとき、膜は拡張するが、破裂 することはなく、微小発射体１１２を標的４２に向かって高速で発射する（第１ 図）。この具体例は、標的への駆動ガスの衝突からの損傷を防ぐのが望ましい場 合に、特にく適している。

膜は、標的上方で良好なシールを形成し、標的を衝撃波から隔離する。ガス衝撃 波の膜への影響、そして、引き続く微小粒子の推進が第６ｂｆｆｌに示してあり 、ここでは、粒子１１２が標的に向かって飛んでいる。

第７ａ、７ｂ図を参照して、第６ａ、６ｂ図の「固定膜」と異なる「捕獲膜」形 態として知られる別の挿入体の具体例が示しである。この場合、第６図に関連し て説明したものと非常に似ているが、薄いスペーサ・リング１２２および好まし くはステンレス鋼または同様の化学的に不活性で無反応の無毒な材料１２０で作 った剛性のスクリーン１２０が捕獲されており、リング８２の間に膜１１０が固 定しである。発射の際、すなわち、ガス衝撃波の発生の際、固定膜１１０はほぼ その最大の範囲まで拡張する。÷の地点（たとえば、スペーサ・リング１２２の 厚さによって制御される）で、固定膜は剛性のスクリーン１２０に衝突する。こ の急激な停止は、第６図の固定膜具体例で生じるよりも、膜の表面からのより良 好な解放、微小発射体のより高い速度および微小発射体１１２のより良好な分散 ならびに解凝集を生じさせる。この機構は、たとえ膜が破裂した場合でも有効で あり、膜およびいかなる膜破片をも捕獲し、ガス衝撃波の大部分を標的からそら せ、安全で比較的穏やかな衝撃モードを与える。より小さいディスクまたは膜を 膜１１０の背面に取り付け、膜の中央を補強し、その破裂の機会を減らしてもよ いし、あるいは、破裂が生じたとしても、それがより小さい膜の周縁のところで 生じ、標的に直接にガスの衝撃が向けられる可能性を減らしてもよい。

第８８．８ｂ、８０図に示す具体例は、「破裂膜」として知られるものであり、 より薄いポリイミドあるいはポリエステルのフィルムであるか、あるいは、先に 述べたものよりも弱い材料（たとえば、アルミ箔）で作ってあって、ガス衝撃波 の衝撃で破裂するようになっている膜１１．０を利用し２ている。破裂の瞬間に 、膜の表面を横切って猛烈な側方剪断力が生じ、この表面から粒子を解放し、非 常に効率良く粒子を解凝集させ、比較的広い面積にわたって粒子を分散させる。

しかしながら、ガス衝撃波のかなりの部分が、なお、抽気された囲い（破裂の前 ）内−はね戻され、標的をガス衝撃波の最悪の部分から守る。この構成は、比較 的厳しい衝撃が許される場合、ｔなわち、より高い速度が必要とされる場合や広 い面積にわｉ、て微小発射体の優れた解凝集、分散が必要とされイ、場６に望ま し、　ｔ、Ｎ　、、も（５，破裂した膜がなんらかの飛翔する破砕屑を生じる場 合には、捕獲′４クリーン些膜１１（）と標的４２の間に設けてもよい。

第９　Ｂ、９ｈ、９（、・図に示す別の具体例は、「フライ゛５グヂイ六クーｊ として知りれるものである１、この具体例では、粒子１１２を備えた通常の膜１ １．０（第７図の具体例Ｔ′用いられるり・イブの破裂可能なものではない）が ２つのリング８２の間に置かれ、リングを位置決めすることによって所望に応じ て高さを調節される。本発明によれば、２ミル厚ポリイミド・ディスクのような 比較的剛性の膜またはディスク１３０が下方のリング８２上に設置されるが、上 のリングには固定されない。この膜は、くぼみを有するリップによって、あるい は、少量の適当な接着剤（すなわち、膜を所定位置に保持するに充分な真空グリ ースの薄膜）で所定位置に単に保持されるだけである。所望に応じて、他のシッ クナーを用いてもよい。心合わせリング１３２がスクリーン１３４を軸線１１（ 第２図）に沿って位置決めしており、これらは、共に、スロート１６内に螺合し た下方リング１３３によって支持される。発射の際、ディスク１１０は、下面に 置いた粒子１１２と共に、そのブラ、ソトホームを持ち上げ、リング支持体１３ ２によってスロート領域の底で所定位置に固定された剛性スクリーン１３４に衝 突するまで妨げられることなくスロートへ飛翔する。

衝撃時、粒子は、第７図の捕獲膜の場合と同様に発射される。

可能な速度は、第７図の捕獲膜の場合よりも高いが、飛翔時にディスクの前方で ガスが漏れる可能性があるため、標的に衝突するガス衝撃波の可能性が存在する 。この領域の内径にぴったり嵌合する飛翔ディスクを使用し７、飛翔距離を比較 的短くすることによって、ガスの衝撃を小さくすることができる。飛翔後の衝突 時に飛翔ディスクのところよりもかなり小さい開放スクリーン領域１３４の（？ ゛持而ごｆイスク１３０を衿座させ、そ、゛こを〉・−ルすること（２よって、 標的領域に伝えられるガス衝撃波のエネルヤが最小限に保たれる。したがって、 比較的高い速度が発（１：：さ−１シるＪとができると共に。標的領域でσ）ガ ス衝撃を減らすご、とができる。

第Ｊ　ｉ３．５５図て・わかるように１ガス巻き込み」と１７゜Ｃ知られる別の 具体例では、適当なメッシュタイプのスクリー゛、１３４を用い１おり、このよ うなスクリーンとし１適当なものは、１．５０　ｐ　ＩＩ開［１を有する５ｗ１ ｓｓ　ＰｎｌｙｅｓｔｅｒＭａｎｎｆｉｌａｌＩｌｅｎｆスクリーニングである 。ごのよ）なスクｒ１−ンは、Ｔｅｔｋｏ、　Ｉｎｃ、、　ｉｎ　Ｅｌｌｌｌｓ ｆｏｒｄ、　ＮＹ、から部品番号゛？〜１５０／４３とし、王人手できる。スク リーン１３４はスロート部１６内のリング８２間に捕獲される。微小発射体は、 ガス衝撃波の経路に設置しであるので、直接にガス衝撃波によって加速される。

微小発射体を含む液滴は、スクリーンまたはメツシュ１３４の中間に置くことが できる。発射時、ガス衝撃波は、液滴を発射して霧化し、その中に微小発射体を 巻き込む。粒子１１２およびガス衝撃波は、−緒になって標的４２に直接衝突す る。この形態は、標的がガス衝撃波の全衝撃を許容できるときに有効である。

いて用いたとき、精密な位置決め（第１０図）、標的面までの飛翔距離の制御、 標的領域にわたるガスまたは真空の制御、真空または衝撃に抗する柔らかい組織 の支え、この領域へ伝えられ得る任意のガス衝撃波の散逸の可能性を可能とする インタフェース１８が必要である。より小さい生物、組織あるいは細胞を衝撃す るとき、シャーレその他の細胞容器を真空を維持し得る室内の適正な距離のとこ ろに設置する普通の機構が必要である。以−トのインタフ丁−ス具体例を用い得 る。

第１０図に示す具体例は、スロート部１６に嵌合するようになっている３段式の ものである。これらの具体例は、ずべＣ、ノズル・インタフ、Ｉ−ス１８（第２ 図）または１８′（第４図）と螺合するようになっている管状のノズル１４４を 有する。ノズルの１バージコン（図の左下）は、通気チューブ１４６を備えでい る。両バージョンは（下の左と右）は、ノズルの下端にあるテーバ付きくぼみ１ ４７と係合するスナップイン式スクリーン１４８（第７図のスクリーン１、２０ に類似している）を有する。インタフェース１８は、真空ポンプ７２に通じる接 続部１４０を備えるか、あるいは、システム内のガスの種類を変え得るように加 圧ガスに通じる接続部１４２を備えるとよい。ノズル１４４の上面にある清１４ ９内にはＯリング１４５が設けてあり、スロート１８の下面に対するシールを行 う。この拡張ノズル形態は、外科手術用途（インタフェースを切開部内に置く必 要がある）に特に適している。このノズルは、衝撃を与えようとしている大きな 表面（たとえば、表皮）上の成る領域への精密な照準を容易にする。ノズルの先 端は、狙った領域に直接押し付けることができる。ノズルの端で、スクリーンま たはメツシュ１４８を前述のように設置して衝撃に抗して組織を支持し、真空が ノズルの内部に付与されたときに組織が上方へ吸引されるのを防ぐことができる 。用途に応じて、種々の形態のノズルのうちの任意のものを所定位置へ螺合させ ることができる。

第１１図に示すように、別の具体例では、Ｌｅｘａｎ（登録商標）ポリカーボネ ートまたは類似の耐破砕性材料で作った透明な室１５０を、ねじ取付具によって ガンのスロート１８の端に取り付けることができる。この具体例（真空を維持す ることができる）は、Ｏリング１５２を有し、このＯリングは、溝１５３内に嵌 合してあって側壁１５４と基板１５６の間のシールを行う。この室は、２つの部 分、すなわち、インタフェース１８に螺合し、０リング１６０によってそれに対 してシールされ得る上半分１５４と、所定位置に摩擦嵌合し、０リングシール１ ５２によってシールされ得る下方プレート１５６とからなる。こうして、室は、 シャーレプレート１５８または任意の小サンプルを挿入するために容易に開ける ことができる。この簡単な室は、ベンチトップ実験室モードで使用できる。

第１２図でわかるように、インタフェースの別の具体例は、特に大型動物あるい は大きな表面に対して作業するようになっている。この具体例では、ガスブラス トの通気そして標的（４２）からのガスブラストのそらせを最大限に可能とする と共に、粒子発射位置から標的衝撃点までの距離を最小にすることができる。こ の具体例の構成は、第１．２図に示すものとほぼ同じであり、異なっているのは 、ハウジング１４の下半分がテーバ付きではなく、一定直径のねじ付きノズル挿 入体１６０を有するということだけである。しかしながら、所望に応じて室１４ ’と一緒に用いてもよい。逆ハウジングの形をした副室１６４とカバー１７０が ハウジング１４′の周縁に嵌合するようになっており、副室１６４の２つの内向 きフランジ片の間に捕獲されたグロメット１６２によつてハウジング１４′の周 縁まわりにシールがなされる。副室１６４の下部すなわちカバ一部１７０は、突 出した比較的剛性があるものとして形成してあり、第１１図の場合と同様に、Ｌ ｅｘａｎ　（登録商標）ポリカーボネートまたは同様の耐破砕性材料で形成した 副室であってもよい。突出部材１７０には、ハウジング１４′の軸線に沿って位 置するように中央部にオリフィス１７２が形成してあり、標的組織が副室内へ吸 い上げられるのを防ぐようにスナップイン式スクリーン１７４を受け入れる形態 となっている。突出部材１７０は、適当なねじ（図示せず）によって副室１６４ に固着してあってもよい。０リング１７６が溝１７７内に設置してあつて真空を 維持するシールとなっている。

突出部材１７０上には、バッフル・プレート１７８（第１３図）が設置してあり 、これは、矢印１８２で示すガス衝撃波の大部分を標的４２からそらせるに充分 な開口１８０と閉じた領域とを有する。第１３図は、第１２図の線１３−１３に 沿った断面図である。グロメット１６２は、副室１６４がハウジングの軸線に沿 って摺動するのを許し、それによって、標的４２の、ガス衝撃波からの距離を調 節することができる。

バッフル１７８は、ガスが下方オリフィス領域から側方へ流れ、排出するのを容 易にし、オリフィス領域に後退ガスが捕らえられるのを防ぐ。もしこのバッフル がないと、ガスが接近する粒子にはね戻されたり、粘性抗力により粒子を減速さ せたりする可能性がある。バッフル・プレートは、ガスおよびガス衝撃波を下方 標的領域から発散させるように作用する。

操作 操作にあたって、細胞、組織を問わず、標的４２を選び、準備する。細胞ブレー ティング、ヘア除去、組織の切開等を除いて、なんら特殊な準備は不要である。

これを行うための特別な手順は本発明の部分ではない。標的および目的に基づい て、最適な微小発射体タイプ、量および寸法を選んで準備し、所定位置に装填し 、所望のスロート組立体形態を選んで正しく位置決めする。最後に、所望のガス 圧を２２にセットする。標的および目的に最も適ったインタフェース組立体１８ を選び、高圧膜を所定位置にシールし、ハウジングを閉じてシールする。次に、 高圧室１２を加圧し、標的をインタフェース組立体に対して所定位置に位置決め し、囲み内の飛翔領域にガス環境すなわち真空度をセットする。次に、ソレノイ ドを付勢してユニットにガス衝撃波を発生させる。次に、真空を解放し、高圧室 への圧力を排出し、必要に応じてプロセスを繰り返す。

ＤＮＡ被覆粒子またはＤＮＡ含有溶液のような生物学的粒子の特別の準備方法は 、ガス巻き込みのために用いられる水またはエタノールいずれかのスラリか最良 であり、他の形態にとっては、ＤＮＡ被覆粒子は、膜面の末端側に塗り広げ、エ タノール内に浮遊させ、乾燥させてから衝撃を与えるのが最良である。ＤＮＡ被 覆粒子の特別な準備法は本発明の部分ではない。ここで用いる粒子なる用語は、 生物学的物質そのものであってもよいし、粒子に生物学的物質を被覆したもので あってもよい。たとえば、Ａｇｒａｃｅｔｕｓ特許出願あるいは５ａｎｆｏｒｄ 等またはＫｌｅｉｎ等に記載されているものを使用できる。

本発明の別の具体例が第３図に示しである。この図では、第１．２図に関連して 説明したガンの必須部分の多（が示してあり、第１．２図の部分に対応する部分 には、二重ダッシュ記号が付けである。第３図の具体例の主要な差異は、寸法が 小さくなっており、外科手術用途に用いるのを容易にするピストル形グリップ２ ０Ｇを有する。

手持ち式ピストル形グリップ２０６は、スイッチ２０４を備え、これらのスイッ チは、ソレノイド作動器４８′と共に弁２８′、３０″、２００を制御する。

ノズル部１８′、スロート部１６″は、第１．２図のスロート部１６に類似して いおり、内ねじが切ってあり、第５〜９図に示すように種々のディスク、スクリ ーン等を受け入れることができる。動物組織にそのまま用いることができるよう に、図示の装置にはこれ以上の取付具は設けていない。図示していないが、第１ ０図の参照符号１４８で示すタイプの拘束スクリーンを用いてもよい。この装置 は、また、真空を制御する弁２００を包含し、ユニットに電力を供給するライン ２０２は、ガス源２０および真空ポンプ７２から高圧を受け取るアダプタである 。このことはさておき、動作は、第１．２図に関連して説明したのと同じであり 、これ以上の説明は不要と考える。

本発明の冷ガス衝撃波発生器は、Ｅ、１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅＮｕｓｏｕｒ ｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｗｉｌｗｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌａｖａｒｅが現在 販売しているＰＤＳ−１θＯＯで用いられる現存の熱ガス衝撃波発生器の代わり に用いることができる。このＰＤＳ−１０００は、ハウジング２１０として第１ ４図に横断面で示す円筒形の２室型装置である。装置の上下の部分は真空源１４ ０に接続しである。標的は、プラットホーム２２０上に置かれる。

このプラットホームは、フロントドアを開いて室内にアクセスするときに装置内 へ滑り込ませることができる。

装置の頂部には、中央開口が設けてあり、この中央開口を貫いて、熱ガス衝撃波 を発生させるのに用いられるカートリッジを送り込む。現存ユニットのカートリ ッジ装置は、ガス衝撃波発生器１２（第２図）と−緒に、取り外し、交換される 。ガス衝撃波発生器のねじ５６は、扁平なディスク状プレート２１４．２１６と 螺合する。これらのプレートは、ＰＤＳ−１０００の現行のバレル組立体を所定 位置に錠止した場合にブラケット１８によって所定位置に錠止される。

この組立体が高圧ガス源に接続することになっているため、操作方法に制限があ る。したがって、プレートは、その周縁まわりに多数のノツチ（図示せず）を有 し、たいていの場合と同様に、多数の回転点で所定位置に錠止され得るようにし てもよい。第２組のプレート２１４′、２１６が下方プレート２１４．２１６に 固着されている。しかしながら、プレート２１４′、２１６′はこの方法では逆 になる。ガス衝撃波発生器は、衝撃波について膜３８（第２図）を取り替えたい ときに取り外され、逆にされ得る。このことは、高圧膜３８の交換を非常に容易 にする。高圧ガス衝撃波発生器の他のすべての特徴は、第１．２図に関連して先 に説明したとほとんど同じのままである。室２１０は、上方プレート２２０を有 し、この上方プレートもフロントドアを開けることによって室２１０に滑り込ま せることができる。この上方プレート２２０は、通常は、ＰＤＳ−１０００の停 止プレート組立体を保持するようになっているが、本発明によれば、スロート部 組立体１６に置き換えられる。このスロート部組立体は、代表的には、要素８２ ．８０（第２図）を含むことになる。一層詳しくは、スロート部組立体１６は、 第４図に示す取外自在の挿入体１００を包含する。したがって、この挿入体は、 以前は停止プレート組立体があったプラットホーム内へ落とし込むだけでよく、 プラットホームは、衝撃室２１０の上下の部分間の仕切りがシールされるときに その機畦を保持することになる。室の下部は、先のように標的室として役立つ。

標的はトレイ２１２によって示しである。これを除いて、この装置の動作は先に 説明したのとほぼ同じである。

上述した方法および装置は、植物、微生物、動物に及ぶ種々の生きている細胞、 組織の形質転換（または医薬品の付与）を行うのに用いることができる。ここに 述べた構成は、外科手術用途および大型生物用途のための手持ち式プローブとし ても、または、試験管培養その他の実験室用途のための不動（ベンチ装着）装置 としても使用するに適している。冷衝撃力源は、生きている生物を担持している 粒子を加速する力を生じさせるのに用いられる。この衝撃力源は、真空を保持す ることのできるハウジング内に収容される。真空は、装置の使用を容易にし、か つ、発生したガス衝撃波の膨張率を最大にすると同時に、ガス衝撃で発生した激 しい騒音から操作員の聴力を保護するのを容易にする。最後に、標的それ自体が 潜在的な致命的衝撃から保護される。

本装置は、極端な加熱なしに、膜のが破裂あるいは同様の手段によって終局的な ほぼ瞬間的なガス衝撃を発生し、所与の容積の高圧室を調節可能な圧力で通気さ せることができ、したがって、衝撃波の強さおよび速度が任意特定の生物学的目 的に適した速度まで微小発射体を加速するのに適したものとなる。このような装 置は、ガス衝撃から使用者を保護し、標的細胞または組織へのガス衝撃を減衰す ると同時に、より良好な粒子飛翔特性を得るために改造した内部ガス環境の使用 を可能とするハウジングを包含する。このハウジングは、オプションとして、比 較的小型の手持ち式「ピストル」または「ワンド」形態とすることも可能であり 、この場合、大型の生きている生物の生物分解処理のためにノズルまたは副室を 表皮、真皮または切開した組織に直接押し付けることができる。

本装置のスロート領域は、固定膜から捕獲膜、破裂膜、フライングディスク、ガ ス巻き込みに及ぶ種々の加速モードで装置を作動させ得る種々の互換性のある組 立体を収容する。

加速された粒子が標的まで経路に沿って飛翔する標的インタフェース領域は、大 型動物から実験室用途までの種々の用途に合わせることのできる互換性インタフ ェースを提供する。このインタフェース領域は、粒子がどのようなガスまたは真 空を通過するかということ、標的までの飛翔距離、標的との衝突前のガスおよび 衝撃の消散および標的の物理的な安定性において融通性を与える。

要約すると、本装置および方法は、比較的安全で、高度の融通性、反復結果を提 供する融通性のある形質転換装置を提供する。本装置は、移動可能であり、正し い挿入体を利用した場合には標的の損傷が少なくなる。また、本装置は、凝集し た粒子の解散と共により良好な粒子分布、分散を可能とする。

細胞または組織あるいはこれら両方の標的に生物学的物質を担持している粒子を 導入するために本発明に従って構成した冷却ガス衝撃波を使用するプロトタイプ 装置（第１．２図）を用いて酵母細胞を形質転換した。こうしてできた変換コロ ニーの数およびそれらの分散パターンをＰＤＳ−１０００を用いて得た結果と比 較した。このＰＤＳ−１０００は、現在、Ｅ、１．ｄｕ　Ｐａｎｔ　ｄｅ　Ｎｅ ｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｈｌｍｆｎｇｔｏｎ、　ＤＥが市販している。火薬駆動式装置は、生物学的物質 を被覆した微小発射体を運ぶマクロ発射体を駆動するのに熱ガス衝撃波を使用す る。マクロ発射体は、中央オリフィスを有する停止プレートに衝突する。この停 止プレートは、マクロ発射体を標的に衝突する前に停止させ、微小発射体がオリ フィスを通過して標的に衝突するようにしている。

５ｇ酵母エキス、１０ｇペプトン、０．０２５ｇアデニンを９００ｗＬの蒸留水 に加え、別に１０ｈＬの蒸留水に２０ｇのグルコースを加え、これら両溶液をオ ートクレーブ処理し、その後に混合することによって成長培地（液体ＹＥＰ培地 ）を調製した。保存培養物から酵母細胞のコロニーを採取し、５０■Ｌの液体Ｙ ＥＰ培地を入れた２５０■Ｌフラスコ内に置いた。酵母細胞は、７２時間、３７ ℃において１５０ＲＯＭで回転する回転シェーカー上に酵母細胞および液体ＹＥ Ｐ培地を入れた２５０■Ｌフラスコを置くことによって成長した。次に、細胞を 遠心力でベレット成形し、上澄み液を捨て、１０１Ｌの水に再懸濁させた。細胞 の濃度は、６００ｎｍで懸濁液の光学密度を測定することによって決定した（１ 単位が約２１１１細胞／ｍＬに等しい）。アミノ酸を持たない３．３５　ｇ酵母 窒素基、０．２３５ｇウラシル・ドロップアウト・アミノ酸プレミックス（以下 のＤ１Ｌフオームをすり合わせ、混合することによって調製したものである。す なわち、０．４ｇのアデニン、０．４ｇのトリプトファン、０．４ｇのヒスチジ ン、０．４ｇのアルギニン、０．４ｇのメチオニン、０．６ｇのチロシン、１． ２ｇのロイシン、０．６ｇのりシン、１、Ｏｇのフエニララニン、４．０ｇのス レオニンを混合したものである。この混合物を暗色のしつかり封をしたびん内に 室温で保存しである）、７．５ｇの寒天およびソルビトール、マンニトールを各 々の最終濃度０．７５Ｍとなるまで加え、別に５０■Ｌの蒸留水に１０ｇのグル コースを加え、これら２つの溶液をオートクレーブ処理し、これらのオートクレ ーブ処理済みの溶液を混ぜ合わせることによって成長培地（ウラシル・ドロップ アウト培地）を調製した。１０８個の細胞をウラシル・ドロップアウト培地を入 れたシャーレ皿上に塗布した。

ＧＴＥ、Ｈａｖｅｓ　Ｓｔ、、Ｔｏｗａｎｄａ、ＰＡから得たＭ−１０タングス テン粒子を、Ｓ、Ａ、　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｒ，Ｂｕｔｏｗ、　Ｋ、　５ｈａ ｒｋ、　Ｊ。

Ｃ，５ａｎｆｏｒｄ共著のｒＭｉｔｏｃｈｏｄｒｉａｌ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａ ｔｉｏｎ　１ｎＹｅａｓｔ　ｂｙ　Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　Ｍｉｃ ｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓＪ、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　：　１５３８〜１５ ４１（１９８８）に記載されテイル手順を用いて、プラスミドＤＮＡ　ＹＥＰ３ ５２で被覆した。５μＬの形質転換用ＤＮＡ（１０ｍｌｉのトリス塩酸塩と１ｍ Ｍのエチレンジアミン四酢酸とからなる緩衝剤内の１　ｌＩｇ／　ｇＬ形質転換 用ＤＮＡ）をＭ−１０タングステン粒子の２５μＬ懸濁液（６０ｍｇ／ｊＬの水 ）と混ぜ合わせ、それに、２５１１Ｌの２．５Ｍ塩化カルシウムおよび５μＬの ０．１Ｍスペルミジンを添加した。この混合物を室温で１０分間装いた。次に、 この混合物を遠心分離にかけ、１０μＬを除いてすべての上澄み液を捨てた。

衝撃の準備の際に、ベレット成形し、被覆した微小発射体を１０ＩＩＬの１．　 Ｏ０％エタノール溶液に再懸濁させ、懸濁液の３μＬを膜上に置き、直径約５− 腫の均等な層を形成するように塗り広げた。エタノールは、室温で蒸発し、乾燥 した粉末が残った。

被覆した微小発射体をウラシル・ドロップアウト培地を含むシャーレ皿上に塗布 したと同じ日に、これらの微小発射体で細胞に衝撃を加えた。この衝撃はＰＤＳ −１０００で行った。頂棚部、底棚部の両方を標的のために用いた。

細胞には、本発明の「捕獲膜」、「破裂膜」および「ガス巻き込み」実施例およ び第５．７．８図に示し、「動作」のところで説明した方法を用いても衝撃を与 えた。

所望のガス（ヘリウム）圧力は、タンク源で高真空レギュレータを用いて選び、 標的への真空作用の付与は前述の標準の弁で制御した。標的は、好ましい実施例 の詳細な説明のところに開示し、第１０図に示すように真空ポンプに接続したＬ ｅｘａｎ（登録商標）室内に置いた。

表１ 巻き込み （１０００ｐｓｉ）　１４９　３５２　Ｌ４９２　６６４　７２３表１は、本発 明の装置と火薬駆動式装置とを用いて形質転換したコロニーの数の比較を示す。

その結果は、５００ｐｓｉ、　１０００ｐｓｉでの「破裂膜」実施例を用いて火 薬駆動式装置の約２倍から３倍のコロニーを産生じたことを示している。本発明 の装置は、また、シャーレ皿の表面にわたってより広く、より均等にコロニーを 分散させた。

火薬駆動式装置は、代表的には、約直径ＩＣＩの、形質転換コロニーがない「デ ッドゾーン」があり、寒天がブラストで吹き飛ばされたところが多い状態の分散 を呈した。

Ｎ２ 例１に記載しであるようなプロトタイプの装置を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ　＊ｅ ｇａｔｅｒｉｕｓを形質転換した。それによッテ生じた形質転換コロニーの数お よび変換コロニーの分散パターンをＰＤＳ−１０００を用いて得たものと比較し た。

５０ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブイヨン培地（１０ｇ（７）ト リプトン、５ｇの酵母エキスおよび５ｇのＮａＣＬを９００■Ｌの蒸留水に加え 、ｐＨをＮａＯＨで７，５に調節し、全体積が１０１００Ｏとなるまで蒸留水を 追加し、その後にオートフレＣｅｎｔｅｒ、　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｆｔ ｙ、　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、　ＯＢから入手可能）のループを接種した。この接種 した培養物を２４時間、２５００ＲＰ１１で回転シェーカ内において培養した。

培養物は遠心力を受け、４０ｍＬの上澄み液は捨てられ、細胞ベレットを残りの 上澄み液に再懸濁させた。細胞の濃度は、６００ｎｍで懸濁液の光学密度を測定 することによって決定した。１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮ ａＣ１および１５ｇの寒天を９００■Ｌの蒸留水に加え、そのｐＨをＮａＯＨで ７．５に調節し、全体積１０００　ｍ　Ｌまで蒸留水を追加し、１８２．２　ｇ のＤ−ソルビトールおよび１３６．６ｇのＤ−マンニトールを加え、オートクレ ーブ処理した後に最終濃度５０ＩＩｇ／ｍＬまでメチオニンの殺菌溶液を加え、 さらに、４ｍＬのり、Ｌ−メチオニンの溶液（１２，５ｍｇ／　ｍＬ）を加える ことによって固形成長培地（固形ＬＢ培地プラスメチオニン、オスモチカム）を 調製した。１０’の細胞を固形ＬＢ培地＋メチオニン、オスモチカムを含むシャ ーレ皿に塗り広げた。細胞を寒天上で乾燥させてから衝撃を与えた。

前述の培地は、Ｂ、　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｓ＋の形質転換の効率に基づいてオス モチカム濃度（ソルビトールとマンニトール）に関して最適化した。オスモチカ ムの濃度を高めると、衝撃直後の細胞の生存率が良（なる。

ＧＴＥ、Ｈａｖｅｓ　Ｓｔ、、Ｔｏｗａｎｄａ、Ｐ＾から得たＭ−１０タングス テン粒子を、５ａｎｆｏｒｄ等によって開示され、例１に述べたような手順を用 いて、ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ、 ５ｔａｔｅ　ｔｌｎｆｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、　ＯＨから得たプ ラスミドＤＮＡ　ＤＮＡ　ｐＵＢｌｌｏで被覆した。このプラスミドｐＵＢ１１ ０は、サイズが４．５ｋｂであり、抗生物質のカナマイシン（Ｋｍ）とネオマイ シン（Ｎ■）に対する抵抗を示す。プラスミドｐＵＢ　１１０は、Ｔ、１ｌａｎ ｉａｔｉｃｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｉｒｔｓｃｈ、Ｊ。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ共著ｒｌｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｆｇ、＾Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ１［ａｎｕａｌＪ　、１９８２に記載されている方法を用いて、Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ株ＩＥＧの２４時間後の培養物から隔離した。プ ラスミドｐＵＢ　１１０は、次に、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配を用いて 精製した。

本発明の装置と共に用いるマクロ粒子も、５ａｎｆｏｒｄ等に記載された方法を 用いて調製した。

細胞は、５ａｎｆｏｒｄ等に記載されているＰＤＳ−１０００で衝撃を与えた。

本発明の「捕獲膜」、「破裂膜」、「フライングディスク」および「ガス巻き込 み」実施例を、「動作」の章で説明し、第５．７．８図に示す手順を用いてテス トした。

静止細胞を上述の培地（固形ＬＢ培地プラスメチオニン、オスモチカム）上に置 き、５ａｎｆｏｒｄ等の火薬駆動式装置かあるいは本発明の装置で衝撃を与え、 １５ｍＬのオーバーレイ培地（４糺のり、Ｌ−メチオニンおよび２ｍＬの硫酸カ ナマイシン（２５ｍｇ／ｍＬ溶液）を１リツトルのオートクレーブ処理したＬＢ ブイヨン培地に各々最終濃度５ｈｇ／＋ＩＬまで加えることによって調製したも の）で覆う。オーバーレイ培地が固化した後、シャーレ皿を３７℃に維持し、形 ンに対して抵抗性を示した。形質転換株は、カナマイシンの存在下で成長する能 力の有無によって選んだ。

１０個の形質転換株を分離し、メチオニンとカナマイシン（１０μｇ　／　ｍ　 Ｌ　）を含む固形ＬＢ培地に接種した。このカナマイシン濃度は、形質転換株を 隔離した衝撃培地およびオーバーレイ培地を含むシャーレ皿内のカナマイシン濃 度とほぼ同じである。プラスミドＤＮＡは、１０個の形質転換株から分離した。

精製したプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｂａ、ｍＨ１内で切り取り、アガロース・ ゲル電気泳動によって可視化した。プラスミドｐＵＢ　１１０は、１つの場所を Ｂａ１Ｈ１で切断した。各形質転換株からの消化されたプラスミドＤＮＡを、Ｈ ｉｎｄＩ［Ｉでラムダファージで消化し、Ｈｆｎｄ■およびＥＣｏＲｌでラムダ ファージで消化した既知のマーカと比較し、また、Ｂａｗｌ　ｌで消化したＢ、 　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＬＥ６から隔離したプラスミドｐＵＢ　１１０と比較した 。形質転換株からの消化されたプラスミドＤＮＡは、Ｂａ■■１で消化したプラ スミドｐＵＢ　ｉｌ、０と同じサイズ（４，５ｋｂ）であった。したがって、形 質転換の存在が、形質転換株として選んだこれらの細胞で確認された。

火薬駆動式ＰＤＳ−１０００装置および本発明の装置によるＬｍｅｇａｔｅｒｆ ｕｍの衝撃の結果が表２に示しである。表３．４は、本発明の種々の実施例を用 いての衝撃実験の結果を形質転換株数の比較一本発明の装置とＰＤＳ−１０００ の比較ＰＤＳ−１０００１６シヤ一レ皿　コロニー無し表　３ 種々の実施例についての形質転換コロニーの数の比較比較操作： ｌ）細胞をＤＮＡと混ぜた後、上記実施例の各々を用いて裸の粒子で衝撃を与え た（１８個のシャーレ皿で衝撃を与えが、形質転換コロニーは見出せなかった） 。

２）細胞をＤＮＡ被覆の粒子と混ぜ、衝撃を与えなかった。

１８個のシャーレ皿を準備したが、形質転換コロニーは見出せなかった。

表　４ 種々の実施例についての形質転換コロニー数の比較破裂膜（８００ｐｓｉ、３ｃ ｍ）　４　２　２　２．７破裂膜（６００ｐｓｉ、３ｃｍ）　１　０　１　０． ７破裂膜（４００ｐｓｉ、　３ｃ■）００００破裂膜（８００ｐｓｆ、５ｃｍ） 　１　０　０　０．７破裂膜（１２００ｐｓｉ、　３ｃ鳳）１　０　０　０．７ 比較操作： 細胞未処理。ＤＮＡと混ぜ合わせ、裸の粒子で衝撃を与えた。細胞に裸の粒子で 衝撃を与え、次いで粒子およびＤＮＡと混ぜ合わせた。細胞をＤＮＡと混ぜ合わ せてからヘリウム衝撃を当てた（粒子無し）。細胞にヘリウム衝撃を与え、ＤＮ Ａと混ぜ合わせた。２０個のシャーレ皿をテストした。形質転換コロニーはなん ら見出せなかった。

表２は、本発明の種々の具体例ではいくつかの形質転換株が観察されたが、ＰＤ Ｓ−１０００では形質転換株がまったく観察されなかったことを示す。表２．３ ．４は、本発明の装置では、時には比較的高い率（シャーレ皿あたりのコロニー ）で形質転換株を生成するのに成功したが、ＰＤＳ−１０００では不可能であっ たことを示している。さらに、最適の条件下では、数千以上までの形質転換率向 上が可能である。このような高い形質転換率を達成するための好ましい条件とし ては、１５時間経過Ｂａｃｉｌｌｕｓ培養物を使用、１０８細胞／シヤーレ皿の 細胞密度、フライングディスク具体例の９００ｐｓｉでの使用、細胞のための浸 透支援として１．０Ｍソルビタールと０．７５Ｍマンニトールを含む細胞成長培 地である。これらの条件の下では、本発明は、５ａｎｆｏｒｄ等の火薬駆動式装 置よりも、シャーレ皿あたりの形質転換株の増大を約１０００倍とする。

例　３ 本発明に従って構成した、細胞または組織あるいはこれら両方の標的に生物学的 物質を担持する粒子を導入するプロトタイプ装置を用いて、ＮＴＩ　Ｎ１ｃｏｔ ｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍタバコ細胞を形質転換した。その結果生じた形質転換 細胞の数およびこれら形質転換細胞の分散パターンを、ＰＤＳ−１０００を用い て得たものと比較した。

ＮＴＩ　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕ菖細胞は、旋回シェイカ上に液体成 長培地（Ｄａｎｉｅｌ１等ＰＮＡＳ、　８７　：１ｌＩ８〜９２．１９９０）内 の浮遊物として成長した。ＮＴＩ細胞系統は、ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏ ｆ　ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎでＧ、＾ｎから得た（　Ｄａｎｉｅｌ１等ＰＮＡＳ、 　８７　：　８８〜９２．１９９０）。ＮＴＩ細胞は、植物に再生する能力を失 っているが、それらの均一性および急速成長の故に有用なモデル系統である。こ れらの細胞は、一般に、３ないし４の細胞培養物のそれぞれに見出された。衝撃 の準備において、１から５■Ｌの細胞懸濁液をブーフナ−漏斗を用いてフィルタ 紙ディスクに集めた。

ＧＴＥ、Ｈａｖｅｓ　Ｓｔ、、Ｔｏｗａｎｄａ、ＰＡから得たＭ−１０タングス テン粒子を、Ｔ、　Ｍ、Ｋｌｅｉｎ、１．　Ｅ、　Ｆｒｏｍｎ、＾。

Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ、Ｄ、Ｔｏｍｅｓ、Ｓ、５ｃｈａａｆ、Ｍ、５１ｅｅｔｅ ｎ、ａｎｄ　Ｊ、Ｃ。

５ａｎｆｏｒｄ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８５：４３０５〜 ４３（１９゜１９８８、Ｔ、Ｍ、Ｋｌｅｆｉｎ、Ｅ、Ｆｒｏｍ＋＋ｉ、Ｔ、Ｇｒ ａｄｚｉｅｌ、ａｎｄ　Ｊ、Ｃ。

５ａｎｆｏｒｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：５５９〜５６３．　１９８ ８、Ｔ、Ｍ。

Ｋｌｅｉｎ、Ｅ、Ｃ，Ｈａｒｐｅｒ、Ｚ、５ｖａｂ、Ｊ、Ｃ，Ｓａｒ＋ｆｏｒｄ 、Ｍ、Ｅ。

Ｆｒｏｍｍ、Ｐ、蓋ａｌｉｇａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　８ ５：８５０２〜８５０３．　１９Ｈ１および５ａｎｆｏｒｄ等に記載されている 手Ｈを用いる形質転換ＤＮＡとして、プラスミドＤＮＡ　ｐＩＢ１５０５（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 、　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

ＮＲＣ５ａｓｋａｔｏｏｎ、　ＣａｎａｄａでＤｒ、　Ｂ１１１　Ｃｒｏｓｂｙ から得たもの）で被覆した。

本発明の装置と一緒に用いるための微小粒子は、例１と同じ手順を用いて調製し た。

β−グルクロニダーゼ遺伝子（Ｇ［ＩＳ）遺伝子をリポータ遺伝子として用い、 プラント細胞における形質転換の率を分析するのに用いた。ＧＵＳ遺伝子は、バ クテリアＥ。

ｃｏｌｔ（Ｒ，＾、Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ等、ＥＭＢｏ、　６　＋　３９０１〜３ ９０７．　１９８７）からクローン生成した。ＧＵＳ遺伝子は、プラント種に通 常は存在しない蛋白質β−グルクロニダーゼの遺伝情報を指定する。ＧＵＳで形 質転換した植物細胞は、物質ｘ　−ｇｌｕｃの存在の下に青色になる。ＧＵＳ分 析を用いて、衝撃付与済みのＮＴＩ植物培養物における過渡的形質発現を検出し た。細胞は、衝撃後、２日で着色した。着色手順は、１［ｃＣａｂｅ等、Ｂｉｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６　：　９２３（１９８ｇ）に記載されている方法を用 いて細胞に１ｍＬの）ｃ−ｇｌｕｅ溶液を添加することからなるものであった。

溶液は、［）ＩＩｓＯに溶解した０、５ｍｇ／ｍＬのｘ　−ｇｌｕｃ、　１０ｗ １［のＥＤＴ＾、１００ｄの燐酸なトリウム、０．５ａｌｌのフェロシアン化カ リウム、０．１％トリトンＸ−１００からなるものであった。細胞は、２４時間 、３７℃で培養し、青色斑点の数を記録した。

細胞を、５ａｎｆｏｒｄ等に開示され、また、Ｔ、　Ｍ、　Ｋｉｅｉｎ、菫、　 Ｅ、　Ｆｒｏｍｓ、＾、　Ｗｅｉｓｓｉｎｇｅｒ、　Ｄ、Ｔｏｎｅｓ、　Ｓ、　 ５ｃｈａａｆ、　Ｍ。

〜５６３．　１９８８、およびＴ、　Ｉｌ、　Ｋｌｅｉｎ、Ｅ、　Ｃ，Ｈａｒｐ ｅｒ、Ｚ。

いるようにＰＤＳ−１０００で衝撃を与えた。本発明の「フライングディスク」 および「ガス巻き込み」具体例を、「操作」の章に記載され、第５．７．８図に 示されている手順を用いて、テストした。

表５は、ＰＤＳ−１０００および本発明の装置を用いてのＮＴＩ細胞の形質転換 の比較を示す。

表　５ 形質転換株数の比較一本発明装置とＰＤＳ−１０００の比較巻き込み　４０６　 ４４０　４７５　４４０．３　３４．５表５は、本発明の装置が、ＰＤＳ−１０ （）（ｌによる熱ガス衝撃波装置と比べて、優れた形質転換率を与えることを示 している。

ＮＴＩタバコ細胞の形質転換について説明したと同じ手順およびプラスミドを用 いてモモ胚子カルスを形質転換した。モモ・カルスについて用いた成長培地（Ｄ ＫＩ培地）は、４．４＋ＨのＢＡＰ、　０．０５１１１１のＩＢ＾、２５％のサ ッカロース、ｐＨ５，８、寒天（０，６〜０．７％）またはＧｉｒｌｆｔｅ（０ ，２５％）からなるものであった。モモ・カルスは、ＵＳＤＡのＤｒ、Ｒａ１ｐ ｈＳｃｏｒｚａによって提供された。モモ・カルスは、未熟胚嚢から得た５年経 過培養物から採取したものであり、自己栄養体であり、成長調整物質依存であり 、体細胞を生成し続けることができるものであった。この場合、モモ・カルスは ＰＤＳ−１０００の３倍の衝撃を受けた。モモ・カルスは、本発明の装置を用い て一回だけ衝撃を与えた。その結果を表６に示す。

表　６ 形質転換株数の比較一本発明装置とＰＤＳ−１０００の比較巻き込み （１２００ｐｓｉ）　？５．０　３２０．０　２０８．０デイスク （１２００ｐｓｉ）　８９．０　１？２．７　２３０．０ＰＤＳ−１０００８６ ，０３４０，０２１５，４（三段衝撃） 表６は、本発明の装置が、ＰＤＳ−１０００で３回連続衝撃によって得ることの できるよりも大きい、遺伝子付与率をただ一回の衝撃で得ることができることを 示している。

さらに、分散の均一性および被覆面積は、ＰＤＳ−１０００を用いて達成したも のよりも優れていることが観察された。

帆−１ 第１図に説明したようなプロトタイプ装置を用いた。

その結果生じた形質転換細胞数および形質転換細胞の分散ばたあんを、ＰＤＳ− １０００を用いて得たものと比較した。

ＧＴＥ、Ｈａ、ｗｅｓ　Ｓｔ、、Ｔｏｗａｎｄａ、ＰＡから得たＭ−１０タング ステン粒子を、５ａｎｆｏｒｄ等の手順を用いて、Ｒ，Ｓ。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｄｕｋｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｄｕｒｈａｍ、　Ｎ ｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａから得たプラスミドＤＮＡ　ｐ［１Ｂｌｕｃで被覆 した。プラスミドｐＨＢ１ｕｃは、拡管の試験管での形質転換に、そして耳、皮 膚および肝臓のその場での形質転換に使用した。これは、ｐｕｃ　１９ベース・ ベクトル内で人間ベーターアクチン・プロモータに溶融させた発光性飛翔昆虫ル シフェラーゼ遺伝子を含有する（ｏｌｅ　冒ｅｔ、Ｊ、　Ｒ，等、Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、。

本発明の装置と一緒に用いるための微小粒子は、ＡｌｆａＪｏｈｎｓｏｎ、Ｍａ ｔｈｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ｍＡ）から販売されており、５ａｎｆｏｒｄ等に記載 されている方法を用いて調製した。

拡管（ａｙｔｏｔｕｂｅｓ’）は、鶏胚から調製した。鶏胚を卵から取り出し、 胸筋を解剖によって取り出し、市販の溶液（ＳａｌＬｔ＋ｅ　Ｇ）の液滴内に置 いた。筋肉は、細断し、９ｍｌの５ａｌｉｎｅ　Ｇ１１　ｍＬのトリプシンの１ ０ｘ溶液（緩衝食塩水内の２．５％溶液）で稀釈した。この混合物に５分間振動 を与え、次に、混合物をピペットに吸い込んだり、吐き出したりすることによっ て撹拌した。次に、混合物をさらに１５分間振動させ、細胞を濾過によって収集 した。細胞は、２０ｍＬのＣＫＩ成長培地（０，５８４ｇ　／　ＬのＬ−グルタ ミン、Ｉｇ／Ｌのグルコース、３．７ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、１５％ウマ血 清および５％胚子エキスからなる市販のダルベツコ改質イーグル培地）に再浮遊 させてから計数した（胚子エキスは、１００ｇの鶏胚を卵から取り出し、断頭し 、１２１、１２ｇ　／　Ｌの塩化ナトリウム、１５．５ｇ／Ｌの塩化カリラム、 １２．７２ｇ／Ｌの塩化マグネシウム、７．８ｇ／Ｌの塩化カルシウム、２ｇ／ Ｌの第二燐酸ナトリウムおよび５．１９ｇ／Ｌの燐酸二水素ナトリウムからなる 培地１００＊Ｌ内で均質化する。このホモジネートを、１００００単位のハイル ロニダーゼを追加した後に１時間冷室で撹拌した。

この混合物を遠心分離にかけて破砕屑を除去し、脂質を上澄み液から除去した。

次に、この上澄み液を濾過によって滅菌した）。次に、細胞を、ｌＸ１Ｏ’細胞 ／ＩＩＬの密度で５０１ｍｍシャーレ皿上に置いた。節管は、５日間保存してか ら衝撃を与えた。

細胞は、櫟準プロトコルを用いてＰＤＳ−１０００で衝撃を与えた。この手順は 、節管を覆っている液体培地を衝撃の直前に除去したという点でのみ改変した。

本発明の「捕獲膜」具体例を、「動作ｊの章に記載し、第５図に示し。

た手順を用いてテストした。培地は、衝撃付与の直後に交換した、っ細胞は、３ ７℃で２４時間培養し、ルシフェラーゼ活性度について分析し、た。

ルシフェラーゼ活性を分析するために、１ｍＬの抽出緩衝剤（１００ｄの憐酸カ リウムＷ衝剤、ｐｆ１７．８．３ｄの塩化マグネシウムおよびｌｆｆ１Ｍｆ７） ＤＴＴからなる）内でブしノートから細胞を掻き落と！７、次に、遠心力によっ てべ１ノ・ット成形した。−ト澄み液を除き、１００μｌ、の抽出緩衝剤お、Ｊ 、び５０Ｉ＋Ｌの崩壊緩衝剤（８，９ｉ［、の０．２５Ｍ１−リス緩衝剤、ｐ、 １１７．８．１０Ｂ、／　ｍＬｉ１ｌ　ｇ　（７）　１．０ｍＬ（７）＊豆トリ ブウ：／抑制剤、０．１＋ｃｌ−ノアブロチニンからなる）を加え、、細胞を６ 秒間、音波破砕によって崩壊させた。細胞屑を遠心力でベレット成形し、上澄み 液をルシフェラーゼ活性度について分析した。

ルシフェラーゼ活性度の分析では、基体、ルシフェリンの存在の下にルシフェラ ーゼ酵素との触媒反応から生じた光（光子）の出力を測定する。こうして生じた 光量（光子数）は、組織から抽出したルシフェラーゼの量に比例する。ルシフェ ラーゼの量は、形質転換細胞の数および各形質転換細胞の生成するルシフェラー ゼの量によって決定される。ルシフェラーゼ活性度が大きければ、それだけ形質 転換がより効率よく行われる。ショット面積あたりの光子の数は、市販の精製ル シフェラーゼを用いて基準曲線を作成することによってショット面積あたりのル シフェラーゼピコグラム数に変換し得る。

表７は、本発明装置とＰＤＳ−１０００の形質転換効率の比較結果を示す。

表　７ （１０，６ｃＩＩ直径）　（１６０＋ｕ＋プレート直径）本発明（衝撃面積あた りのピコグラムルシフェラーゼ）皮膚　耳　節管 （１０，６ｃ１直径）　（１６０＋ｍｓプ１゜ノート直径）表７は、本発明の装 置が、節管について、平均で火薬駆動式装置の約１１倍のルシフェラーゼ活性度 、したがって、形質転換率を得られることを示している。

別のテストでは、微小粒子のコーティングおよび生きている組織のその場での形 質転換のためのＤＮＡでの衝撃の準備を、　ＰＤＳ−１０００を用いて行った。

タングステンの代わりに、金の微小粒子を用いた。用いた全微小粒子は、球形で あり、直径が１〜３μあるいは２〜５μであった（Ａｌｐｈａ　ｐｒｏｄｕｃｔ ｓから入手した製品番号００７６６）。さらに、装置の構成を改造し、真空室の 代わりに、装置の端にノズル（第１０図）を設置して微小粒子を小ツク・ノヂー の組織に送るようにした。皮膚および耳組織については、ノズルを真空ポンプに 接続し、微小粒子が真空中を移動Ｖるようにした。肝臓組織は、真空で損傷を受 Ｕ丁いたので、真空にさらずことはなかまた。

本発明の装置と一緒に用いるための微小粒子は、Ａ１．ｆａ。

Ｊｏｈｎｓｏｎ、１ｌａｔｈｅｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＩｉＡから購入１．．５ａ ｎｆｏｒｆ１等に記載の方法を用いて準備した。

衝撃用の皮膚、耳を調製するために、動物に麻酔をかけ、衝撃を加えようとして いる領域から脱七剤でヘアを除去した５、次に、直径約６璽鎮の領域に衝撃を加 え、動物の麻酔を解いた。２４時間で、動物を犠牲にして衝撃を加えた領域を切 り取った。この組織を、１．４０　ｐ　Ｌの抽出緩衝剤、５０μ！、の崩壊Ｉ！ 衝剤およびｌＯＩ＋Ｌの２％ＮＰ−４０洗剤（市販物）の混合物中で、細断した 。細胞屑を、次に、遠心力でベレット成形し、上澄み液をルシフェラーゼ活性度 について分析した。

肝臓組織を形質転換するために、マウスに麻酔をかけ、腹部を切開して１つの肝 臓葉を露出させた。次に、１０ｍ１面積に衝撃を加えた（真空を付与していない ことを除いて皮膚、耳と同じ）。次に、切開部を閉じ、麻酔を解いた。２４時間 以内に、動物を犠牲にして衝撃付与領域を取り出し、２００＊Ｌの抽出緩衝剤内 で細断し、細胞屑を遠心力でベレット成形し、上澄み液をルシフェラーゼ活性度 について分析した。

表８は、本発明の装置で衝撃を与えた肝臓について得た結果を示している。５ａ ｎｆｏｒｄ等の火薬駆動式装置では、肝臓を形質転換することはできなかった。

表　８ 本発明（破裂ディスク） （衝撃面積あたりのピコグラムルシフェラーゼ）肝臓　１　３　５ 平均　２９３　２４３　５ 平均の標準誤差　１２２　１３３　２．３サンプル数　８　４　３ 要　約　書 ここに記載した方法は、微小発射体を加速するのに「冷」ガス衝撃波を使用する 。この方法では、粒子がガス衝撃波の膨張平面に対して直角な平らな表面上にお いてガス衝撃波を受ける。この方法を実施することのできるいくつかの異なった 装置も記載しである。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１１月２７日

Claims (62)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞または組織またはこれら両方の標的に生物学的物質を担持している粒子 を導入する方法であって、粒子を、細胞または組織またはこれら両方を殺すこと なく細胞または組織またはこれら両方の表面を貫通し、細胞または組織またはこ れら両方の内部に組み込まれるに充分に加速し、 粒子に瞬間的な冷ガス衝撃波の力を与えることによって粒子の加速を行う ことを特徴とする方法。
2. ２．請求項１に記載の方法において、粒子加速を行う段階が、 平らなキャリヤ・シートの標的側に粒子を置き、シートに冷ガス衝撃波を加えて 粒子を加速することを特徴とする方法。
3. ３．請求項２に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着した 弾性膜であり、冷ガス衝撃波が、この膜を拡張させるが破裂はさせず、標的を衝 撃波から保護することを特徴とする方法。
4. ４．請求項２に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着した 弾性膜であり、標的細胞と膜との間に拘束スクリーンを設け、膜が完全に拡張あ るいは破裂する前にスクリーンに対して拘束され、粒子がより良好に発射されて スクリーンを貫いて標的に通るようにしたことを特徴とする方法。
5. ５．請求項２に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着され た弾性膜であり、衝撃波が膜の拡張、破裂を生じさせ得るようになっており、そ れによって、標的細胞のより広い領域にわたって粒子を発射、解凝集、分散させ ることを特徴とする方法。
6. ６．請求項５に記載の方法において、シートが非弾性材料で作ってあることを特 徴とする方法。
7. ７．請求項６に記載の方法において、シートがアルミ箔であることを特徴とする 方法。
8. ８．請求項２に記載の方法において、ガス衝撃波の力を受けるように設置したシ ートが、所定位置にしっかりと固定されておらず、バリヤによって拘束されるま で標的細胞の方向に自由に動き、粒子を標的細胞に向かって動かすように加速さ れることを特徴とする方法。
9. ９．請求項８に記載の方法において、シートがポリイミドフィルムまたはポリエ ステルフィルムで作ってあることを特徴とする方法。
10. １０．請求項８に記載の方法において、シートの拘束を、シートの移動経路にス クリーンを設置することによって行うことを特徴とする方法。
11. １１．請求項１に記載の方法において、平らな表面が、衝撃波の力を通過させて ガス巻き込みによって粒子を加速させ得るスクリーンであることを特徴とする方 法。
12. １２．請求項１１に記載の方法において、衝撃波がスクリーンを通過した後にそ れの邪魔をして衝撃波の力の若干量を標的細胞からそらせることを特徴とする方 法。
13. １３．請求項１に記載の方法において、冷ガス衝撃波を加圧ガスの源を設け、ガ スに対して破裂可能な膜シールを設け、この膜シールを破裂させて細胞の方向へ ガスを終局的に解放することによって形成することを特徴とする方法。
14. １４．請求項１３に記載の方法において、粒子の加速を行う段階が、 平らな表面の標的側に粒子を設置し、この表面に冷ガス衝撃波を付与して粒子を 加速する段階を包含することを特徴とする方法。
15. １５．請求項１４に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着 した弾性膜であり、冷ガス衝撃波が、この膜を拡張させるが破裂はさせず、標的 を衝撃波から保護することを特徴とする方法。
16. １６．請求項１４に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着 した弾性膜であり、標的細胞と膜との間に拘束スクリーンを設け、膜が完全に拡 張あるいは破裂する前にスクリーンに対して拘束され、粒子が発射されてスクリ ーンを貫いて標的に通るようにしたことを特徴とする方法。
17. １７．請求項１４に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着 された弾性膜であり、衝撃波が膜の拡張、破裂を生じさせ得るようになっており 、それによって、標的細胞のより広い領域にわたって粒子を発射、解凝集、分散 させることを特徴とする方法。
18. １８．請求項１７に記載の方法において、シートが非弾性材料で作ってあること を特徴とする方法。
19. １９．請求項１８に記載の方法において、シートがアルミ箔であることを特徴と する方法。
20. ２０．請求項１４に記載の方法において、ガス衝撃波の力を受けるように設置し たシートが、所定位置にしっかりと固定されておらず、バリヤによって拘束され るまで標的細胞の方向に自由に動き、粒子を標的細胞に向かって動かすように加 速されることを特徴とする方法。
21. ２１．請求項２０に記載の方法において、シートがポリイミドフィルムまたはポ リエステルフィルムで作ってあることを特徴とする方法。
22. ２２．請求項２０に記載の方法において、シートの拘束を、シートの移動経路に スクリーンを設置することによって行うことを特徴とする方法。
23. ２３．請求項１４に記載の方法において、平らな表面が、衝撃波の力を通過させ てガス巻き込みによって粒子を加速させ得るスクリーンであることを特徴とする 方法。
24. ２４．請求項２３に記載の方法において、衝撃波がスクリーンを通過した後にそ れの邪魔をして衝撃波の力の若干量を標的細胞からそらせることを特徴とする方 法。
25. ２５．請求項１に記載の方法において、冷ガス衝撃波が、加圧ガス源を設け、ガ スを細胞の方向へ急速に解放することによって形成することを特徴とする方法。
26. ２６．請求項２５に記載の方法において、粒子の加速を行う段階が、 平らなバリヤ・シートの標的側に粒子を設置し、このシートに冷ガス衝撃波を付 与して粒子を加速する段階を 包含することを特徴とする方法。
27. ２７．請求項２６に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着 した弾性膜であり、冷ガス衝撃波が、この膜を拡張させるが破裂はさせず、標的 を衝撃波から保護することを特徴とする方法。
28. ２８．請求項２６に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着 した弾性膜であり、標的細胞と膜との間に拘束スクリーンを設け、膜が完全に拡 張あるいは破裂する前にスクリーンに対して拘束され、粒子が発射されてスクリ ーンを貫いて標的に通るようにしたことを特徴とする方法。
29. ２９．請求項２６に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着 された弾性膜であり、衝撃波が膜の拡張、破裂を生じさせ得るようになっており 、それによって、標的細胞のより広い領域にわたって粒子を発射、解凝集、分散 させることを特徴とする方法。
30. ３０．請求項２６に記載の方法において、ガス衝撃波の力を受けるように設置し たシートが、所定位置にしっかりと固定されておらず、バリヤによって拘束され るまで標的細胞の方向に自由に動き、粒子を標的細胞に向かって動かすように加 速されることを特徴とする方法。
31. ３１．請求項２６に記載の方法において、平らな表面が、衝撃波の力を通過させ て粒子をガス巻き込みによって加速させ得るスクリーンであることを特徴とする 方法。
32. ３２．請求項２６に記載の方法において、衝撃波がスクリーンを通過した後にそ れの邪魔をして衝撃波の力の若干量を標的細胞からそらせることを特徴とする方 法。
33. ３３．細胞または組織あるいはこれら両方の標的に生物学的物質を担持している 粒子を導入する装置であって、真空を維持できる密閉したハウジングであり、真 空を供給するための第１ポートと、主軸線と、この主軸線上に位置する２つの別 のポートとを有し、これら２つの別のポートのうちの一方のポートが粒子の加速 時にスロート部を構成し、このスロート部に対向する第２のポートが加圧ガスを 高圧室に導入するようになっているハウジングと、 第２ポート内に設けてあり、そこに蓄積されたガスを破局的に解放してスロート 部に向かうガス衝撃波を与える高圧室と、 標的に向かう衝撃波の力によって加速できるようにスロート部内に粒子を位置さ せる手段と、スロート部に固着してあってスロート部を標的に連結するインタフ ェースと を包含することを特徴とする装置。
34. ３４．請求項３３に記載の装置において、ハウジングが、小型の可搬性のある部 分的に手持ち式のシリンダであることを特徴とする装置。
35. ３５．請求項３４に記載の装置において、高圧室が中空であり、スロートに向い た部分が破裂可能な膜によってシールしてあることを特徴とする装置。
36. ３６．請求項３５に記載の装置において、高圧室が膜を機械的に破裂させる手段 を包含することを特徴とする装置。
37. ３７．請求項３６に記載の装置において、高圧室が膜に向かうガスの流量を制観 する絞った入口を有することを特徴とする装置。
38. ３８．請求項３５に記載の装置において、破裂手段が電磁作動式であることを特 徴とする装置。
39. ３９．請求項３５に記載の装置において、膜がポリイミドフィルムで作ってある ことを特徴とする装置。
40. ４０．請求項３３に記載の装置において、スロート部内に設置した使い捨てのキ ャリヤ・シートを包含し、粒子がキャリヤ・シートの標的側に置かれるようにな っており、それによって、粒子を衝撃波の力によって標的に向かって推進させる ことができることを特徴とする装置。
41. ４１．請求項４０に記載の装置において、キャリヤ・シートが弾性であり、キャ リヤ・シートの周線を把持することによってキャリヤ・シートをスロート部内に 固着する固定手段が設けてあり、この固定手段が、スロートの軸線に沿って種々 の位置に設置できるようになっていることを特徴とする装置。
42. ４２．請求項４１に記載の装置において、キャリヤ・シートとのずるの間に縁を 固着したスクリーンを包含し、膜の移動を拘束するが、膜の部分的な拡張を許す ようになていることを特徴とする装置。
43. ４３．請求項４０に記載の装置において、キャリヤ・シートが破裂可能であり、 キャリヤ・シートの周縁を把持することによってスロート部内にキャリヤ・シー トを固定する手段が設けてあり、この固定手段が軸線の高さに沿って位置させ得 ることを特徴とする装置。
44. ４４．請求項４０に記載の装置において、膜の周縁を把持する手段によってスロ ート部内に固着されたオプションの破裂可能な膜と、自由に飛翔できるようにし っかり固定していない弾性のキャリヤ・シートと、キャリヤ・シートを止めるが 粒子は移動させ得るスクリーンのような固定されたバリヤとを包含することを特 徴とする装置。
45. ４５．請求項３３に記載の装置において、高圧室が膜を機械的に破裂させる手段 を包含することを特徴とする装置。
46. ４６．請求項４５に記載の装置において、スロート部内に設置したキャリヤ・シ ートを包含し、粒子がキャリヤ・シートの標的側に置かれるようになっており、 それによって、粒子を衝撃波の力によって標的に向かって推進させることができ ることを特徴とする装置。
47. ４７．請求項４６に記載の装置において、キャリヤ・シートが弾性であり、キャ リヤ・シートの周縁を把持することによってキャリヤ・シートをスロート部内に 固着する固定手段が設けてあり、この固定手段が、スロートの軸線に沿って種々 の位置に設置できるようになっていることを特徴とする装置。
48. ４８．請求項４７に記載の装置において、キャリヤ・シートとノズルの間に縁を 固着したスクリーンを包含し、膜の移動を拘束するが、膜の部分的な拡張を許す ようになていることを特徴とする装置。
49. ４９．請求項４６に記載の装置において、キャリヤ・シートが破裂可能であり、 キャリヤ・シートの周縁を把持することによってスロート部内にキャリヤ・シー トを固定する手段が設けてあり、この固定手段が軸線の高さに沿って位置させ得 ることを特徴とする装置。
50. ５０．請求項４６に記載の装置において、膜の周縁を把持する手段によってスロ ート部内に固着されたオプションの破裂可能な膜と、自由に飛翔できるようにし っかり固定していない弾性のキャリヤ・シートと、キャリヤ・シートを止めるが 粒子は移動させ得るスクリーンのような固定されたバリヤとを包含することを特 徴とする装置。
51. ５１．請求項４０に記載の装置において、スロートに固着してあって標的の限ら れた領域に粒子を通過させるノズルを包含することを特徴とする装置。
52. ５２．請求項５１に記載の装置において、インタフェースの開口端を横切って設 置してあり、標的がインタフェース内に引き込まれるのを紡糸するスクリーンを 包含することを特徴とする装置。
53. ５３．インタフェースに真空ポンプに通じるポートを設けたことを特徴とする装 置。
54. ５４．請求項４０に記載の装置において、標的細胞を受け入れるようになってい る閉鎖可能な容器を包含し、この容器が軸線を取り囲んでいることを特徴とする 装置。
55. ５５．請求項４０に記載の装置において、インタフェースに真空ポンプに通じる ポートが設げてあることを特徴とする装置。
56. ５６．請求項４０に記載の装置において、スロート部に設置するようになってい る取り外し自在のスリーブを包含し、このスリーブの使い捨て部分を挿入体内に 設置したことを特徴とする装置。
57. ５７．請求項５６に記載の装置において、スリーブ内に設置したキャリヤ・シー トを包含し、粒子がキャリヤ・シートの標的側に置かれるようになっており、そ れによって、粒子を衝撃波の力によって標的に向かって推進させることができる ことを特徴とする装置。
58. ５８．細胞または組織あるいはこれら両方の標的に生物学的物質を担持している 粒子を導入する装置であって、真空を維持できる密閉したハウジングであり、真 空を供給するための第１ポートと、主軸線と、この主軸線上に位置する第２ポー トと、この第２ポートに対向して主軸線を取り囲むスロート部とを有するハウジ ングと、 第２ポート内に設けてあり、そこに蓄積されたガスを破局的に解放してスロート 部に向かうガス衝撃波を与える高圧室と、 主軸線上に位置しており、ハウジングの外側と密封係合する副室であり、標的に 隣接して位置するようになっている突出部を構成する基部を有し、この突出部が 軸線を取り囲む開口を構成し、この開口が標的組織を支持すべくスクリーンを受 け入れるようになっている副室と を包含することを特徴とする装置。
59. ５９．請求項５８に記載の装置において、副室内に軸線に対して直角に位置した そらせ板を包含し、このそらせ板が軸線に沿った粒子のためのオリフィスを構成 していることを特徴とする装置。
60. ６０．細胞または組織またはこれら両方の標的に生物学的物質を担持している粒 子を導入するための方法であって、細胞の表面を貫通し、細胞または組織または これら両方を殺すことなく細胞または組織あるいはこれら両方の内部に組み込ま れるに充分に粒子を加速する段階と、ガス衝撃波の力を粒子に付与することによ って粒子加速を行う段階と、粒子を平らな表面に設置する段階と、ガス衝撃波を この表面に付与して粒子を加速する段階とを包含することを特徴とする方法。
61. ６１．請求項６０に記載の方法において、平らな表面がその縁を動けないように 固着した弾性膜であり、さらに、標的細胞と膜の間に拘束スクリーンを設置し、 膜を完全に拡張あるいは破裂する前にスクリーンに対して拘束し、発射すべき粒 子をスクリーンを通して標的に移動させ得るようにしたことを特徴とする方法。
62. ６２．請求項６０に記載の方法において、シートがその縁を動けないように固着 した弾性膜であり、衝撃波で膜の拡張および破裂を生じさせ、それによって、標 的細胞の限られた領域に粒子を発射し、解凝集し、分散させることを特徴とする 方法。